KR102382257B1

KR102382257B1 - 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102382257B1
Application number: KR1020200034661A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 술타나 타마나; 호반하이; 이선영
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2022-04-05
Also published as: KR20200112746A

Abstract

본 발명에 따른 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법은, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol), 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 히알루론산(hyaluronic acid)을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 교반하는 단계; 및 상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔 및 이의 제조방법 이용하면, 가교제 없이도 안정적인 겔 매트릭스를 형성하며 우수한 유착 방지 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명은 우수한 생분해성, 기계적 안정성, 열 민감성 및 세포 독성이 없는 우수한 유착방지용 하이드로겔을 제공할 수 있는 장점이 있다.

Description

유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔 및 이의 제조방법{Novel thermosensitive cellulose based hydrogel for post-surgical peritoneal adhesion prevention and preparation method thereof}

본 발명은 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

복부 골반 수술 후 조직 유착은 전 세계에서 가장 흔한 결과 중 하나이다. 따라서, 수술 후 복막 유착으로 인한 만성 통증, 장 폐쇄, 불임 및 사망률을 예방하는 것은 중요한 과제이다. 수술 후 복막 유착(post-surgical peritoneal adhesions, PPA)으로 인한 복잡한 병인(만성 통증, 장 폐쇄, 불임 및 사망률)을 예방하는 것은 중요한 과제이다.

생명을 위협하는 PPA를 극복하기 위해, 약물 전달과 같은 약리학적 치료는 복강에서의 약물 동력학 또는 신속한 약물 제거로 인한 제한된 치료효과로만 사용되어 왔다. 따라서, 조직 유착 방지 전략을 촉진하기 위해, 고체 필름, 액체 용액 및 하이드로겔의 개발에 많은 연구가 집중되어왔다. 일반적으로 이들 필름 또는 액체 장벽은 중요한 접착 기간 동안 외상화된 표면을 주변 조직으로부터 분리시킴으로써 작용한다. 이들 중 일부는 상업적으로 이용 가능하지만, 현재까지 임상 요구의 모든 측면을 만족시키지 못하고 있으며, 가장 중요하게는, 부적절한 분해 기간, 손상된 표면 전체를 덮기가 어려워 고체 필름(Seprafilm^TM)의 광범위한 임상 적용을 제한하고 있다. 반면, 수술 후 상처 부위로부터 복부 내 다른 부위로 대부분의 폴리머 용액(Adept^TM)을 퍼뜨리면 생체 내에서 유착 방지 성능을 저하시켰다.

이러한 측면에서, 주사 가능한 하이드로겔은 이들 필름 및 용액 기반 장벽과 관련된 장애물을 최소화하는데 효과적이며, 이는 적용 동안 조직 표면의 기하 구조를 준수할뿐만 아니라 최소한의 침습성을 갖는다는 이점이 있다.

그러나, 인 시투(in situ) 가교성 하이드로겔은 겔화 시간이 길고 치료부위에 공급하기 위한 외부장치가 필요하기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 화학적 가교제는 세포독성 또는 부작용을 유발함으로써 스캐 폴드의 생체 적합성을 방해 할 수 있다. 하지만, 열감응성 중합체의 "수성 용액"으로부터 제조된 주사용 하이드로겔은 화학적 변형없이 체온에서 겔화될 수 있기 때문에 대안으로 제시되고 있다.

메틸 셀룰로오스(MC)는 염의 존재하에 37℃에서 겔화될 수 있는 전형적인 온도-반응성 수용성 천연 중합체라는 점에 주목할 만하다. 따라서, 이 독특한 상전이 특징은 열감응성 하이드로겔 제조를 위한 매력적인 후보이다. 히알루론산(HA)은 결합 조직의 세포외 매트릭스에 널리 분포되어있다. 저분자량 HA는 뼈 및 피부 조직 공학 응용 분야에서 광범위하게 사용되며, 단독 또는 다른 물질과 가교된 고 분자량 HA는 높은 점도로 인해 접착 형성을 감소시키기 위해 사용되어왔다. 그러나 결과는 일치하지 않으며 다른 연구와도 충돌된다. 일부 연구에 따르면 HA의 긍정적인 효과와 다른 보고서는 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 의한 빠른 분해(반감기, 1-3 일)로 인해 HA 적용 후 접착력을 감소시킬 수 없음을 나타냈다. 또 다른 수용성 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)은 윤활 효과를 통한 세포 및 박테리아 부착 방지를 위해 동물에서 테스트하였다. 그러나, 낮은 점도로 인해 수술 부위를 덮기 위해서는 많은 양의 PEG가 요구되는 문제점이 있었으며, 불충분한 기계적 강도는 변형된 HA 하이드로겔 시스템과 조합된 PEG와 관련된 현저한 결점으로, 쥐 모델에서 불량한 유착 방지 효능을 초래하였다. 스캐폴드의 이러한 불안정한 기계적 성질은 나노 물질의 통합을 통해 균형을 이룰 수 있다. 이와 관련하여, TEMPO(2, 2, 6, 6-테트라 메틸피페리딘-1-옥실라디칼) 산화된 나노 셀룰로오스(TOCN)는 무독성의 비용 효과적인 특성을 유지하기 위한 유망한 셀룰로오스 중합체이다. 최근 연구에 따르면 TOCN은 강제 압력을 억제하여 스캐 폴드의 견고성을 향상시킬 수 있다고 밝혀졌다.

따라서 세포 독성, 기계적 불안정성, 부적절한 분해, 수술 부위 누출 및 간접비 문제와 같은 상업용 하이드로겔 장벽의 단점을 극복하기 위해서는 수술 후 유착 방지 및 복강경 치료에서 쉽게 사용할 수 있는 새로운 제품을 개발해야하는 필요성이 요구된다.

한국등록특허 100552954 B1

본 발명은 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol), 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 히알루론산(hyaluronic acid)을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 교반하는 단계; 및 상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함하는 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법은, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol), 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose), 히알루론산(hyaluronic acid)을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 교반하는 단계; 및 상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함한다.

상기 혼합물을 제조하는 단계는, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol), 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose) 및 히알루론산(hyaluronic acid)을 1:0.3:2:0.05~0.45 중량비로 혼합할 수 있다.

상기 교반하는 단계는, 상기 혼합물을 10~60분 동안 1차 교반하는 단계; 상기 교반된 혼합물에 가압멸균수를 첨가한 후 2차 교반하는 단계; 상기 2차 교반된 혼합물을 냉각한 후 3차 교반하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose)는 침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔은 상기한 방법에 따라 제조된다.

본 발명에 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔 및 이의 제조방법 이용하면, 가교제 없이도 안정적인 겔 매트릭스를 형성하며 우수한 유착 방지 효과를 나타낸다.

또한, 우수한 생분해성, 기계적 안정성, 열 민감성 및 세포 독성이 없는 우수한 유착방지용 하이드로겔을 제공할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 각 원료 물질(TOCN, HA, PEG) 및 (B) HA 함량이 상이한 하이드로겔 3개 (HA 0.05, HA 0.25 및 HA O.45) 푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier transform infrared spectroscopy), (C) TOCN, HA, PEG 및 MC의 X-선 회절 분석 (XRD), (D) 상이한 하이드로겔의 XRD 분석, 및 (E) 템포-산화 나노셀룰로오스(TOCN)의 투과 방출 현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 동결 건조 및 탈수 하이드로겔의 주사 전자 현미경 이미지, (B) 하이드로겔의 기계적 강도 (C) 탄성계수 및 (D) 실온 및 체온에서 HA 0.25 하이드로겔의 총 강도를 나타낸 것이다.
도 3는 (A) 4 ℃ (sol-state) 및 37 ℃ (gel-state)에서 HA 0.25 하이드로겔의 상 전이, (B) 하이드로겔(hydrogel)의 온도 감도 및 형성 메커니즘 (C) HA 농도가 증가함에 따라 상이한 하이드로겔의 시험관 내 바이알 반전 방법 및 겔화 시간 감소, 및 (D) 유변학적 분석을 통해 측정된 HA 0.25 하이드로겔의 겔화 시간을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로겔을 10 unite/㎖ 히알루로니다아제를 함유하는 37 ℃ SBF 용액에 2주간 침지시킨 후 (A) 시험관내 분해, (B) 겔의 중량 손실 거동, 및 (C) 실온에서 HA 0.25 하이드로겔의 주입성 및 37 ℃에서 겔 강성, (D) 실온에서 상이한 하이드로겔의 점도(겔 상태)를 나타나낸 것이다(SBF = Simulated body fluid, 유사체액).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로겔에서 (A) RBMSC, (B) L929 세포를 MTT 분석으로 세포독성 평가, 및 (C) 상이한 유형의 하이드로겔에서 청색 형광 L929 세포 형태의 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 결과는 평균 ± SD (^***P <0.001, ^**P <0.005, ns = 중요하지 않음)로 표시하였다.
도 6는 (A) 트립판 블루 분석을 사용하여 48 시간 동안 인큐베이션 한 후 상이한 하이드로겔 샘플에 대한 L929 섬유아세포 부착의 평가, (B) 상이한 하이드로겔 그룹의 시험 관내 용혈 분석, (C-D) 래트에서의 피하 이식 후 7 일 및 14 일에 HA 0.05, HA 0.25 및 HA 0.45 하이드로겔의 생체 내 분해를 나타낸 것이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 쥐 측벽 결함-맹장 마모 모델 및 하이드로겔 적용으로, 7일 및 14일에 음성 대조군(염수로만 처리된 쥐)에서 유착이 관찰되었다. (B) HA 0.25 하이드로겔의 유착 방지 메커니즘을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 음성 대조군, HA 0.25 하이드로겔, 양성대조군(상업적 방벽)의 쥐 모델에서 7일 및 14일 수 장관 유착 점수를 평가한 것이다. (B) 음성 대조군, HA 0.25 하이드로겔, 양성 대조군(상업적 방벽)에서 맹장벽(cecal wall) 및 복막(peritoneum)을 조직학적 분석결과이다. 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 및 마손트리 크롬 (MT)은 염색을 통해 2주 처리 후 음성 대조군에서 강한 유착을 확인하였고, HA 0.25 및 상업용 하이드로겔(양성대조군)로 처리 된 쥐에서는 유착이 발견되지 않았으며, 맹장과 복벽의 상태는 정상적인 건강한 쥐의 상태와 유사하였다. 또한, 음성 대조군 샘플에 맹장과 복부의 세포벽 사이에 침착된 콜라겐을 통해 강한 유착을 확인하였다. AW = 복벽(Abdominal wall), CE = 맹장 점막(cecal mucosa). ME = 중 피층(mesothelial layer).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) HA 0.25 하이드로겔 및 상업용 겔로 처리된 쥐의 복벽의 SEM 이미지 결과로, 14 일에 상업용 겔과 비교하여 HA0.25 하이드로겔 처리한 쥐에서 재상피화(remesothelialization)가 우수함을 보여준다. (C) 14 일째 정상적인 건강한 쥐의 복벽 및 (C) 14 일 후 심장, 간, 비장 및 신장의 조직 학적 검사는 건강한 쥐와 비교하여 HA 0.25 하이드로겔로 처리 된 쥐에서 세포 독성 검사를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 온도 감응형 하이드로겔의 제조공정이다.

이하 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 하이드로겔의 제조방법은 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG), 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose, TOCN), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose, MC), 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 상기 혼합물을 교반하는 단계, 및 상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함한다.

또한, 상기 혼합물을 제조하는 단계는, PEG, TOCN, MC, HA를 1:0.3:2:0.05~0.45 중량비로 혼합할 수 있다.

상기 교반하는 단계는, 상기 혼합물을 10~60분 동안 1차 교반하는 단계와, 상기 교반된 혼합물에 가압멸균수를 첨가한 후 2차 교반하는 단계와, 상기 2차 교반된 혼합물을 냉각한 후 3차 교반하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 TOCN은, 침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 수득된 것일 수 있다.

<실시예 1> 재료의 준비

고 분자 히알루론산(hyaluronic acid, HA; Streptococcus equi에서 분리; 2 × 10⁶ 내지 2.4 × 10⁶ Da), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose, MC; 88 × 10³ Da의) 및 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG; 10 × 10³Da) 은 시그마-알드리치(미국)에서 구입하였다.

시험관내(in vitro) 분석은 Gibco ™ 트립신 -EDTA, Gibco ™ 최소 필수 배지 알파 (α-MEM) (Thermo Fisher Scientific, USA), Gibco ™ 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT; Thermo Fisher Scientific, 미국), 디메틸 설폭사이드 99.5 % (DMSO; Daejung Chemicals & Metals CO., 대한민국), Gibco ™ 소태아혈청(FBS) 및 Hyclone ™ RPMI 1640 배지(GE Healthcare 생명 과학, 미국)를 사용하여 수행 하였다.

쥐 골수중간엽 줄기세포 (Rat bone marrow mesenchymal stem cells, RBMSC)를 공개된 방법에 따라 분리 하였다. L929 섬유 아세포 (LFC) 계통은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다.

생체내(in-vivo) 분석에는 실험 동물 센터(다윤, 한국)로부터 9 주령 Sprague-Dawley 계통의 쥐(Rattus norvegicus))를 구매하여 사용하였다. 각 쥐는 각 200 내지 250g였다. 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 프로토콜 및 지침에 따라 수행되었으며, 연구계획은 한국 순천향대 학교 동물 윤리위원회의 승인을 받았다.

<실시예 2> TOCN의 준비 및 하이드로겔의 제조

침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 TEMPO 매개 산화에 의해 1% 농축 TOCN을 제조하였다. 표 1에 열거된 각각의 샘플 유형을 유리 병에 옮긴 후 수조(85℃)에 침지시키고 15 분 동안 강하게 교반하면서 가열하였다. 가압멸균수를 첨가하여 원하는 농도를 수득하였다. 현탁액을 20 분 동안 교반한 후 아이스 박스(0 ℃)에서 냉각한 후 현탁액이 투명한 용액이 될 때까지 연속 교반을 수행하였다(도 10). 용액을 최종적으로 4 ℃에서 저장한 후 1.25 M 염화나트륨을 첨가하여 겔화하였다.

샘플 (Sample name)	약어 (Short name)	PEG (%)	TOCN (%)	MC (%)	HA (%)
PEG:TOCN:MC	HA 0	1	0.3	2	0
PEG:TOCN:MC:HA	HA 0.05	1	0.3	2	0.05
PEG:TOCN:MC:HA	HA 0.25	1	0.3	2	0.25
PEG:TOCN:MC:HA	HA 0.45	1	0.3	2	0.45

<실시예 3> 메틸 셀룰로오스의 치환도 분석

메틸 셀룰로오스의 치환도(degree of substitution, DS)는 ¹³C NMR 을 수행하여 분석하였다. 샘플을 80℃에서 DMSO-d6에 용해시키고 (약 10 내지 30 g / L의 농도), Bruker의 Avance III 400 MHz 분광계(프랑스, 위스 부르크)를 이용하여 분석하였다.

<실시예 4> TOCN의 카르복시산염(carboxylate) 함량 분석

TOCN의 카르복시산염(carboxylate) 함량은 전기 전도도 적정을 이용하여 분석하였다. 오븐 건조된 TOCN 50㎎(m)을 0.01M HCL 15㎖에 첨가하였다. 양성자화를 촉진하고 15 분 동안 반응을 계속하고, 이어서 잘 분산된 현탁액을 제조하고 탈이온수 20 ㎖를 첨가하였다. 상기 현탁액을 정정 용기로 옮긴 후 농도를 알고 있는 0.05 M (CNaOH) 표준 NaOH 용액으로 적정하였다. NaOH의 부피 (V₁)를 기록하고 다음의 식을 사용하여 총 카르복시산염(carboxylate) 농도(C, mmol/g)를 계산 하였다(수학식 1)

<실시예 5> TOCN의 나노 구조 및 결정화도(crystallinity) 분석

TOCN 현탁액의 직경은 국립 나노-패브 센터(대전, 한국)에서 투과 전자 현미경(TEM)으로 측정하였다 기계에 부착된 JEM-2100F HR 현미경(JEOL Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 직경을 시각화하여 분석하였다. TOCN의 결정화도(백분율)는 X- 선 회절법(XRD, Ni 필터링 된 CuK 방사선을 갖는 Rigaku RINT 2000)을 이용하여 반사 모드로 측정하였다.

<실시예 6> 구조, 결정학 및 형태학적 분석

개별 물질(TOCN, MC, PEG 및 HA) 및 하이드로겔 (HA 0.05, HA 0.25, HA 0.45) (4 ℃)의 화학 조성은 푸리에 변환 분광법 (FTIR) (Thermo Scientific Nicolet iS10, OMNIC 7.3 소프트웨어)으로 분석하였다.

또한, 각각의 원료 및 제조된 하이드로겔의 결정화도(crystallinity)는 XRD 패턴으로 측정하였다(X- 선 회절계, λ = 1.541 nm, 40 kV, 200 mA, MiniflexII, 일본). 하이드로겔과 동결 건조된 하이드로겔의 HA의 표면 형태 및 확인은 에너지-분산 X- 선 분광법(EDXS)이 장착된 주사 전기 방사 현미경(SEM, JSM-6701F, JEOL, 일본)을 사용하여 분석하였다. 하이드로겔을 확인하기 위해, 하이드로겔을 먼저 2% 글루타르 알데히드(Glutaraldehyde)로 고정시킨 다음 알코올 탈수(50-100 %) 및 임계점 건조를 수행하였다. 백금 코팅 후, 동결 건조된 하이드로겔과 탈수된 하이드로겔을 체크하였다.

<실시예 7> 겔의 강도 분석

하이드로겔의 기계적 강도 및 탄성 계수는 범용 시험기 (Unitech, R & B, Korea)를 사용하여 측정하였다. 먼저, 하이드로겔을 1.5 ㎝ 직경 x 1 ㎝ 높이의 원통형 플라스틱 몰드에 주입 한 후, 겔이 있는 몰드를 37℃ 인큐베이터로 옮겨 고체 및 안정한 겔이 형성될 때까지 보관하였다. 이어서, 고체 겔을 몰드에서 조심스럽게 제거하고 기계적 강도를 측정하였다. 안정한 겔 샘플에 100㎏ 로드 셀을 사용하여 압축력을 가하였다. 이때, 크로스 헤드 속도는 1 ㎜ / 분이었다. 또한, 겔의 액화를 방지하고자, 실험 내내 장치 주변 온도를 37 ℃로 유지하였다.

<실시예 8> 상전이/감응성 행동 분석

가역적 졸-겔 상 전이는 시험관이 제어된 온도 (37 ℃)에서 10 초 동안 반전될 때 유동성 또는 비유동 원리에 기초한 바이알 반전법(vial inversion method)으로 측정하였다. 스톱워치를 사용하여, 점성용액이 고체가 될 때까지의 겔 형성 시간을 측정하였다. 겔화 시간은 또한 회전 레오미터(rotational rheometer, ARES-G2, TA instrument LTD)를 사용하여 측정하였다. 먼저, 0.4 ㎖ 하이드로겔을 37℃ 레오미터에 적용하고 상부 플레이트를 1 mm의 갭 크기로 낮추었다 (주파수 : 1 Hz, 변형률 : 1 %, 측정 형상 : 25 mm 플레이트). 그 후, 저장(G ') 및 손실 계수 (G')는 시간의 함수(0-600 초)로 측정하였다. 저장 탄성률 (G ')은 주로 탄성 현상을 설명하고 손실 탄성률 (G ")은 점성을 나타낸다. 겔화 시간은 저장 모듈러스가 손실 모듈러스 (G '> G ")보다 높은 시간으로 간주된다 (G '> G').

<실시예 9> 시험관내(In vitro) 분해 및 팽창 분석

경화된 하이드로겔을 페트리 디시에 넣고, 10 units/㎖의 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 포함하는 5㎖의 유사체액(SBF, pH 7.4, 37℃)에서 배양하였다. 37℃의 14일 동안 인큐베이션 하였으며, 배지(medium)는 2일마다 보충하였다. 하이드로겔의 인큐베이션 전 중량(W₀) 7, 14일 후의 중량(W_t)를 측정하였으며, 하기의 수학식2에 의해 중량감소 비율을 나타낼 수 있다. 중량 측정 전 페트리 디시에서 SBF는 제거하였다.

중량감소 비율은 수학식 2와 같이 계산하였다.

다른 하이드로겔 그룹의 팽창 거동(swelling behavior)을 PBS를 사용하여 평가하고 최대 24 시간 동안 계속 확인하였다.

<실시예 10> 점도 측정

Brookfield 점도계를(DV-II + Pro LV, MA)(스핀들 번호 27)를 이용하여 실온 (25℃)에서 상이한 전단 속도(1.7, 3.4, 5.1, 6.8, 8.5, 10.2, 11.9 및 13.6)로 점도를 측정하였다. 접시에 겔을 주입하고, 왕복형 진탕기를 37℃, 80 RPM을 유지하면서 실온에서의 주입가능성을 측정하였다. 60초 후 겔의 상태를 평가하였다

<실시예 11> 시료 멸균 및 시험관 내( in vitro ) 세포 독성 분석

보관하는 동안 오염을 방지하기 위하여 위해 제작된 샘플을 완전히 덮어두었다. 나중에, 자외선 C 방사선(2 시간)에 노출시켜 샘플을 최종 멸균하였다. RBMSC 및 L929를 10 % FBS 및 1 % PS(각각 페니실린 및 스트렙토 마이신 100 U/㎖)를 함유하는 α-MEM 및 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양하였다.

세포독성 분석은 MTT 분석을 위한 표준 시험 프로토콜을 사용하여 수행하였다[ISO10993-5 : 2009 (E)]. 먼저, 하이드로겔 (0.5 ㎖)을 각 웰에 첨가하고 고체가 될 때까지 인큐베이션 하였다. 이어서, RBMSC, L929 (1㎖, 5 x 10⁴ 세포 / ㎖)의 현탁액을 24- 세포 배양 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 37 ℃에서 일정한 시간(1일, 3일, 7일 및 14일) 동안 배양하였다.

1일, 3일, 7일 및 14일 배양 후, MTT 용액 (100 ㎕의 5 mg /㎖)을 샘플에 첨가 한 후 4 시간 동안 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 그 후, 1㎖의 DMSO를 각각의 웰에 첨가하고 이를 회전 진탕기로 옮기고 1 시간 동안 유지시켜 포르마잔 결정을 용해시켰다. ELISA 리더 (Infinite F50, TECAN, Austria)를 사용하여 595 nm에서의 흡광도를 측정 하였다 (A₅₉₅). 배양 플레이트의 세포 현탁액은 양성 대조군으로, 고조성 배지(hypertonic media)의 세포는 음성 대조군으로 하여 계산하였다.

세포 생존율은 수학식 3과 같이 계산하였다.

하이드로겔 상의 L929 섬유아세포의 증식 능력은 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM, FV10i, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 세포 핵은 Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, USA)에 이용하여 염색하였다. 이미지는 FV10i-ASW 3.0 뷰어 소프트웨어를 사용하여 얻었다.

<실시예 12> 하이드로겔에 대한 세포접착 분석

겔을 통한 섬유아세포(fibroblast) 부착 및 침투는 조직 부착 방지 연구에 중요한 부분이다. 따라서, 세포 접착 분석을 사용하여 겔에 대한 세포 반응을 추가로 수행 하였다.

먼저, 0.5 ㎖의 액체 하이드로겔을 24- 세포 배양 플레이트에 놓고 고체 겔 형성을 위해 인큐베이터에 두었다. 이어서, L929 세포의 5 × 10⁴ 세포를 겔의 상부에 시딩 후, 배지를 첨가하고 (1 ㎖), 세포 배양 조건 하에서 24 시간, 28 시간 동안 배양하였다. 특정 간격으로, 고체 겔을 웰 플레이트로부터 조심스럽게 제거하고 트립신 처리 하였다. 트리판 블루 염색 후, 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하고 계산하였다.

<실시예 13> 하이드로겔의 혈액 적합성 분석

하이드로겔의 시험 관내 생체 적합성을 평가하기 위해 용혈 분석(hemolysis assays)을 추가 수행하였다. 상이한 HA 농도를 갖는 ㎖의 하이드로겔을 10 ㎖의 멸균 정상 식염수에 용해시키고 37 ℃에서 48 시간 동안 인큐베이션 하였다. 이후에 토끼 전혈 0.2㎖를 첨가 한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 하였다. 이어서, 샘플을 2000 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상청액의 540 nm 흡광도(A)를 측정하였다. 이때, 2차 증류수 및 생리 식염수는 각각 양성(positive control) 및 음성 대조군(negative control)으로 사용하였다.

용혈 비율(hemolysis ration)을 수학식 4와 같이 계산하였다.

<실시예 14> 생체 내( In vivo ) 분석

14.1 하이드로겔의 생체 내 분해

하이드로겔의 생체내 안정성, 생분해성을 확인하고자, 상이한 농도 HA를 포함하는(HA 0.05, HA 0.25 및 HA 0.45) 하이드로겔을 22- 게이지 바늘을 통해 쥐에서 등으로 투여하고 2 주 동안 (각 그룹에서 2 마리의 쥐, 매주 6 마리) 평가 하였다. 특정 주에, 쥐를 안락사 시키고 하이드로겔을 둘러싼 조직을 수집하고 조직학적 관찰을 수행하였다.

14.2 생체내 유착 방지 분석

실험 모델은 48 마리의 쥐(200~250g의 수컷 Rattus norvegicus)를 3개의 그룹(각 그룹당 16마디, 주당 8마리)으로 할당하여 실험모델을 준비하였다.

그룹 1 (sample barrier)

: HA 0.25 하이드로겔로 덮은 그룹)(1.5 x 1.5 ㎠)

그룹 2 (no barrier)

: 유착 대조군, 식염수 용액으로만 세척한 그룹

그룹 3 (commercial barrier)

: 양성대조군, 상업적 하이드로겔((HyFence, CHA Bio & Diostech (서울))을 이용하여 덮은 그룹

무균 기술을 사용하여 쥐의 복부 중앙을 5㎝의 중간선 절개를 수행하였다. 메스 칼날로 복벽(1.5 x 1.5 ㎠)과 맹장(1 x 1 ㎠)의 표면을 조심스럽게 긁어 냈으며, 천공하지는 않았다. 이어서, 3 ㎖의 HA 0.25 하이드로겔 (4 ℃)을 부상 부위에 주사한 후 복부와 복막은 봉합사로 봉합하였다. 그 후, 쥐를 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근 할수 있는 주변 환경 조건에서 감금하였다. 1주 또는 2주 후, 쥐를 디에틸 에테르로 안락사 시키고, 절개부를 다시 열고 유착(Adhesion, 표 2 참조), 염증, 섬유증 및 혈관신생(vascularization) 점수를 검사하였다(표 2).

추출된 복부 및 복막 조직을 고정시켰다. 5 ± 2 ㎛ 파라핀 포매된 조직 섹션을 사용하여 조직학적 및 Masson의 트리 크롬 분석을 수행하였다.

유착부분(%) Adhesion area (%)	등급 Grade	유형 Type
0	None	유착 없음(none)
0-25	I	얇음(Thin), 무혈관(avascular), 투명(transparent)
25-50	II	두툼함(Thick), 무혈관(avascular), 불투명(opaque)
50-75	III	두껍고 불투명한 미세혈관(Thick and opaque capillaries), 예리한 절개 필요(requiring sharp dissection)
75-100	IV	두껍고 불투명한 큰 혈관(Thick and opaque, large vessels), 예리한 절개 필요(requiring sharp dissection)

14.2 생체내 급성 독성 및 재상피화 분석

하이드로겔에 의해 유발될 수 있는 부작용에 대해 수술 부위의 일반적인 상태(활동, 행동, 에너지, 모발, 대변 및 호홉), 물, 음식 섭취, 사망률, 치유방법을 모니터링 하였다. 14 일째에 주요 기관(폐, 간, 심장 및 신장)을 병리학적으로 시각화, 고정 및 분석하였다(H&E staining). 14 일 후, HA 0.25 하이드로겔로 처리된 쥐의 복부 표면의 상태 및 치유 정도(remesothelialization)를 평가하고 SEM을 통해 정상적인 건강한 쥐와 비교 하였다.

<실시예 15> 통계 분석

실험적 특성 분석 (동물 연구 제외)을 위해 각 그룹에 대해 5 개의 샘플이 고려되었다. 그래프 패드 프리즘 5를 사용하여 분산 분석 (ANOVA)을 수행 하였다. 데이터는 ^**P < 0.05; ^***P<에서 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.

<분석>

<시험예 1> 치환도, 카르 복실 레이트, 구조 및 결정화도

치환도(degree of substitution, DS)는 중합체의 용해도, 안정성을 결정하는 주요 구조적 요소이다. 일반적으로, DS가 1.3 내지 2.5 인 MC는 수용성인 반면, DS> 2.5를 갖는 MC는 유기 용매에 가용성이다. 본 발명의 실시예에서 사용된 MC의 DS는 1.7로 측정되었다. 따라서 상기 MC는 물에 쉽게 용해되어 온도감응성(thermo-sensitive) 하이드로겔을 제조할 수 있다. 또한, 개질된 셀룰로오스의 카르복실 레이트기의 양과 결정도는 친수성, 분해 및 세포 적합성 특성에 중요한 역할을 한다. TOCN는 카르복실 레이트 함량은 1.5 mmol / g이고 결정도는 60.23 %로 확인되었다.

도 1A 및 B는 개별 폴리머와 세 가지 하이드로겔의 FT-IR 스펙트로 그램이다. 3417, 1639 cm^-1에서 넓은 피크는 셀룰로오스 중합체의 카르 복실산기의 -OH 및 C= O 스트레칭(stretching)에 의한 것이다. 3340, 1121 cm^-1의 밴드는 각각 PEG의 -OH 및 C-O-C 스트레칭(stretching)에 해당한다. 2883 cm^-1에서의 피크는 메틸기의 -CH 스트레칭에 해단한다. 글루쿠론산의 C = O 연신에 대한 1607 cm^-1 및 HA 골격의 C-O-C 연신에 대한 된 1045 cm^-1에서의 피크는 또한 FT-IR 스펙트럼에서 명확하게 발견되었다.

FTIR 그래프에서, 개별 재료의 모든 특성 피크는 HA 0.05, HA 0.25 및 HA 0.45 하이드로겔에서 관찰되었으며, 이는 제조 동안 완벽한 동화 작용을 나타냈다 (도 도 B). HA 0.45의 경우, -OH 스트레칭(stretching)에 대한 피크 강도가 넓어졌으며 이는 HA 0.25보다 더 높은 카르복실기를 나타냈다. HA에 대한 카보닐 스트레칭 C = O 및 N-H의 피크는 예리하고 길어 HA 0.05 및 HA 0.25 하이드로겔에 비해 HA 0.45 하이드로겔에서 더 많은 HA의 양을 나타낸다. C-O-C 및 C = O에 대한 피크의 선명도는 HA가 증가함에 따라 증가하였으며, 이는 셀룰로오스의 카복실산 그룹과 PEG의 하이드록실 그룹과 HA 사이에 에스테르 결합 형성 가능성을 나타낸다.

이전 연구에 따르면 TOCN의 많은 수의 -COOH 그룹은 화학적 가교 (crosslinking) 없이 키토산과 아미드 결합을 만들 수 있다. 따라서, 발명에서 제조 동안 셀룰로오스의 -COOH 기와 PEG의 히드록실기 사이에 에스테르 결합을 형성하는 것이 또한 가능하다.

XRD 스펙트로그램 (그림 1C-D)은 원료 폴리머 (MC, HA, TOCN 및 PEG) 및 HA 0.05, HA 0.25 및 HA 0.45 하이드로겔의 결정학적 특성을 분석하였다. HA는 XRD 분석에서 무정형(amorphous) 특성을 확인하는 날카로운 피크를 생성하지 않았다. PEG의 결정 구조를 시사하는 2θ = 19.2 ° 및 23.2 °에서 2 개의 강한 피크가 나타났다. 28 ° 및 42 °의 피크는 TOCN에 대한 것이다. 2θ = 19.2 ° 및 23.2 °에서 나타나는 피크는 MC의 반결정질(semi crystalline) 특성을 나타냈다. 이러한 전체 특징적인 피크는 HA 0.05, HA 0.25 및 HA 0.45 하이드로겔에서 나타났다.

<시험예 2> 형태학적 관찰

하이드로겔의 형태학적 변화는 물리적 특성과 행동에 대한 통찰력을 제공한다. 또한 이러한 형태학적 변화는 어플리케이션(application)에서 팽창, 분해 및 삼출물(exudates) 흡수에 관여한다. TEM 이미지는 섬유 직경이 3.87 ± 0.982 nm 인 TOCN의 나노 섬유 네트워크를 보여 주었다(도 1E). 동결 건조 및 탈수된 하이드로겔 샘플의 표면 구조의 차이가 도 2A에 도시되어 있다. 동결 건조된 하이드로겔 및 탈수된 하이드로겔의 표면 구조는 HA 농도에 의존적이었다. 모든 동결 건조된 하이드로겔은 다공성 네트워크 구조를 나타냈다. HA 0.05 하이드로겔은 치밀하고 매우 단단한 구조를 나타냈다. 기공 크기가 HA 0.45 하이드로겔에서 더 커지는 HA 0.25 하이드로겔로부터 비교적 균일한 기공 크기 분포를 갖는 스펀지 유사 조직을 수득하였다. 이상적으로, 하이드로겔의 높은 팽윤 용량은 동결 건조시 스캐폴드와 같은 매우 거대 다공성 다공성 스펀지를 생성한다. 이 경우, 증가된 HA의 팽윤 기준은 HA 0.45 하이드로겔에서 거대 다공성 구조를 나타낸다. 탈수된 하이드로겔의 SEM은 HA 0.05 하이드로겔의 거친 표면 특징을 나타내었고, 하이드로겔의 HA 함량을 증가되면(HA 0.45) 매끄러운 표면이 형성되었다. 또한, XRD 스펙트럼(도 1C-D)은 미가공 중합체 및 3 개의 하이드로겔의 결정학적 특성을 나타냈다. HA는 비정질 특성을 확인하는 날카로운 피크를 생성하지 않았다. 하이드로겔에서, PEG 및 MC의 결정도 피크는 HA 첨가시 감소하였고, 이는 SEM에서 HA 0.45 하이드로겔의 부드러운 특징을 입증하였다. 한편, EDXS 이미지에서 탄소(C), 산소(O) 및 질소(N)의 점진적인 증가는 3 개의 하이드로겔의 HA 함량의 점진적인 증가를 나타낸다. 푸리에 변환 적외선 분광법에 의해 모든 중합체의 통합이 또한 확인하였다 (도 1A-B).

<시험예 3> 겔의 강도 분석

기계적 성질의 부족은 조직 공학 응용에서 하이드로겔의 주요 한계 중 하나입니다. 합성 중합체와 천연 중합체의 통합에 의해 만들어진 하이브리드 하이드로겔은 상당한 기계적 성질과 유연성을 가진다. 또한 TOCN의 기계적 강도가 우수하다. 본 실시예에서 TOCN은 카르복실 함량이 1.5 mmol / g이다. 카르복실 레이트 함량이 0.05에서 1.5 mmol / g으로 증가한 경우, 생성된 중합체는 높은 기계적 강도를 나타냈다. TOCN의 나노 섬유 구조는 TEM에 의해 확인되었다(도 1E).

3 가지 유형의 하이드로겔의 기계적 특성 및 탄성 특성은 도 2B-C에 확인하였다. 기본적은 하이드로겔의 기계적 안정성은 TOCN의 첨가와 관련이 있으며, 구체적으로 MC (TOCN-MC 하이드로겔)의 첨가시 현저하게 증가된다. TOCN-MC 및 HA 0의 경우, 겔 강도가 거의 유사하여 겔 강도에서 PEG의 역할이 없음을 확인하였다. 그러나, 수용성 HA를 첨가하면 강도가 저하된다.

인간의 경우 복부는 정상적인 복부 내압이 약 5-14 mmHg (667-1866 Pa) 인 유압 시스템으로 작동한다. 본 발명 따른 하이드로겔은 높은 압축률을 유지하기에 충분히 견고하여 신체 내부의 움직이는 복부 표면에 적용하기에 적합하다.

<시험예 4> 상전이 및 온도감응성 거동 분석

겔화 시간은 유착 방지를 위한 주사용 하이드로겔의 적용에 중요한 영향을 미친다. 겔화 속도가 너무 빠르면 겔화 전에 손상된 표면을 완전히 덮을 수 없지만 겔화 시간이 길면 작동 시간이 길어지고 감염 위험이 높아질 수 있다.

하이드로겔에서 HA의 효과를 더 잘 이해하기 위해, 바이알 반전법에 의해 다양한 HA 농도(0, 0.05, 0.15, 0.25, 0.35 및 0.45 % w/v, 표 3)를 갖는 상이한 하이드로겔을 평가 하였다

실험결과, 모든 투명한 하이드로겔은 바이알 내에서 4 ℃에서 자유롭고 빠른 흐름을 나타냈다. 37℃ 수조에서, 바이알 내의 투명한 용액은 상이한 시간에 고체 불투명 겔로 완전히 전환되었다. 바이알을 기울이거나 역 위치로 유지한 후에도 하이드로겔의 강성은 유지되었으며, 하이드로겔의 겔화 시간은 HA 농도에 비례하였다. 가장 높은 겔화 시간은 PEG가 겔화에 영향을 미치지 않음을 나타내는 TOCN-MC 및 HA 0 하이드로겔로 확인되었다. HA 0.05 하이드로겔의 경우, 겔화를 달성하기 위해 52 ± 5.35 초가 필요하였고, HA 0.45 (31 ± 1.41 초)에 대해 가장 낮은 겔화 시간이 요구되었다. HA 0.25 하이드로겔의 경우, 겔화 시간은 44 ± 3.56 초 였다. 37 ℃에서 레오 미터를 사용하여 HA 0.25 하이드로겔의 겔화 시간을 추가로 확인하였다. 겔화 점은 약 40 ± 2 초에 달성되었다(도 3D).

높은 농도에서, 고 분자량 HA(예를 들어, > 0.1 mg / ㎖에서 5 MDa)의 용액은 본질적으로 점탄성인 분자 사슬 사이의 무작위 수소 결합을 통해 얽힌 분자 네트워크를 형성한다. 본 발명에서 1 차 겔화는 염의 존재하에 MC에 의해 수행되었다. 구체적으로는, 저온 MC에서는 소수성 메톡실기와 주변 수의 반응에 의해 수용성이 된다. 온도가 상승하면 물 분자는 염 이온으로 이동하여 MC의 소수성 측 그룹이 응집되고 클러스터와 같은 사슬 간 겔의 3D 네트워크가 형성된다. 나노 셀룰로오스와 PEG는 또한 MC와 수소 결합을 형성하고 겔화 동안 역할을 수행한다(도 3B). 본 발명에서, HA 0.25의 시험관 내 겔화 시간은 40 ± 2 초인 것으로 나타났으며, 이는 조직 유착의 위험을 낮출 수 있다.

<시험예 5> 시험관 내의 분해 및 팽창 분석

현재, 임상적 유착 방지제의 조정 가능한 생분해 기간(3-14 일)이 필요하다. 3 가지 유형의 하이드로겔의 형상 변화 및 분해 백분율은 도 3A 내지 3B에서 확인할 수 있다. 시간 의존성 팽창비는 또한 도포된 영역 근처의 혈액 및 다른 액체의 분해, 침지에 직접적인 영향을 미치기 때문에 확인되었다.

HA 0.05 하이드로겔은 가장 높은 팽창 현상을 나타냈다. 더 높은 기공을 갖는 하이드로겔은 더 큰 팽창 특성을 이끌어냅니다. 또한, 다양한 농도의 HA (0 내지 0.45 w/v HA)를 갖는 하이드로겔의 분해(정량 및 정성)에서 히알루로니다아제(hyaluronidase enzymes)의 역할을 정확하게 이해하기 위해 분석을 수행하였다. 시험관내 분해 동안, 하이드로겔은 히알루로니다제 함유 SBF에서 상이한 분해 동역학을 나타낸다. HA 함량이 높을수록 SBF 용액을 함유하는 효소에서 하이드로겔 분해 속도를 가속화 시킴을 확인하였다. HA 0.45 하이드로겔 (98.57 ± 0.58 %)은 14 일 후에 거의 모두 분해되었으며, 가장 낮은 분해 속도는 HA 0 및 HA 0.05로 14일 후에도 원래의 형태를 유지하였다. HA 0.25 하이드로겔의 경우, 겔의 83.91 ± 4.52 %가 14 일 이내에 분해되었다. 고 분자량 HA는 높은 수용성 프로파일을 나타내므로 겔 강도가 낮아졌다(도 4A-B). 본 발명에서는 이러한 문제를 해결하고자, 화학적 변형이 아닌 TOCN을 직접 첨가하여 기계적 강도를 향상시켰다(도 2B). 그러나 하이드로겔에서 HA의 최대 수용해도 (HA 0.45)는 TOCN에 의한 기계적 강도를 초과하엿다. 이러한 이유로, 하이드로겔의 분해 속도는 HA 농도에 비례하였다 (도 4B).

본 발명에서 사용된 TOCN 중합체의 카르복실 함량은 1.5 mmol / g이었다. 카르복실레이트 수준을 0.05 내지 1.5 mmol / g으로 증가 시키면 스캐폴드의 기계적 강도가 향상되었다. 이러한 이유로, HA 0.05 하이드로겔 매트릭스는 콤팩트 한 표면을 생성하여 SBF에 의한 분해에 대해 기계적인 저항성(mechanically resistant) 이 나타남을 확인하였다. 또한, 치환률이 높은 제품을 포함하는 용액은 매우 부드럽다. 따라서, 결정성이 낮은 섬유는 HA 0.45 하이드로겔의 분해를 증가시킬 수 있다.

상기의 분설결과를 통해, HA 0.05 하이드로겔과 비교하여 HA 0.25 및 HA 0.45 하이드로겔은 더 높은 생분해성을 가짐을 확인하였다.

<시험예 6> 점도측정

본 발명의 하이드로겔은 장기가 지속적으로 움직이는 복막 내부에 투여하는 유착방지제에 적용하는 것을 목표로 한다. 따라서 유착용 하이드로겔은 양호한 주사성, 최적의 생체 분해성 및 적당한 점성을 가지는 것이 바람직하다.

도 4D는 전단 속도에 대한 3 개의 하이드로겔의 점도를 나타낸 것이다. 점도 HA 0.45는 전단 속도에 반비례하며, HA 0.25과 HA 0.05 하이드로겔의 경우, 전단 속도가 증가함에 따라 점도는 거의 일정하였다. 하이드로겔이 주위 실온에서 투여됨에 따라, 전단 속도를 증가시킬 때 안정성뿐만 아니라 적당한 점도를 갖는 겔이 바람직하다.

일반적으로, 초기 단계 (HA 0.45)에서 고점도 하이드로겔 (도 4C)은 주입 부위로부터 겔의 압출을 제한할 수 있다. 고점도 하이드로겔은 주사 부위로부터 겔의 압출을 제한할 수 있으므로 복강경 수술 중에 어려움이 발생한다. 도 4D는 HA 0.25 하이드로겔의 주사성을 나타낸다. 겔은 주입으로부터 용이하게 압출되었고 페트리 디쉬상에서 37 ℃에서 안정적이었다. HA 0.25 하이드로겔을 체온에서 페트리 디쉬 상에 완벽하게 부착시키고 전단 응력 변화하에서 안정하게 유지하였다. 따라서, HA 0.25 하이드로겔은 이동성 복강에 적용하는 동안 빠른 유동에 저항할 수 있음을 확인하였다.

<시험예 7> 시험관 내 세포독성 및 세포접착 분석

도 5A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로겔상의 (A) RBMSC, (B) L929 세포의 14일간 세포독성을 평가한 결과이다. HA 0.25 하이드로겔의 경우, 생존력율이 14 일 동안 안전한 수준으로 유지되었다 (^**P <0.005). HA 없이 제조된 하이드로겔(HA 0) 및 0.05 % HA (HA 0.05) 하이드로겔은 14 일 배양 기간 동안 과도한 증식을 나타냈으며, 이는 유착 방지 용도로 바람직하지 않다.

분석결과, 고분자량 HA의 수준이 증가함에 따라 농도 의존적 방식으로 세포 생존율이 감소함을 확인하였다.

배양 5 일 후 평균 세포 생존율이 70% 이상이면 생체 물질은 세포 독성이 아닌 것으로 간주된다. 또한, 세포 독성 평가는 7 일 및 14 일에 상이한 유형의 하이드로겔에서 L929 세포 증식 능력을 관찰하였다. 이들 샘플 중에서도 세포 형태 및 수에 있어서 상당한 차이가 발견되었다. 도 5C를 참조하면, HA를 함유하지 않은 하이드로겔 샘플 (HA0)에서 7 일 및 14 일 모두 표면에 융합성(confluent) 세포 클러스터가 형성되었다. 반면, 세포 확산 형태의 점진적인 감소는 증가함에 따라 발견되었다. 하이드로겔에서 HA 농도가 증가함에 따라 세포 확산 형태의 점진적인 감소가 발견되었다. HA 0.45의 경우, 하이드로겔 표면의 세포는 다각형 형태(polygonal morphology)를 사라지고, 14 일째에 하이드로겔에 부착할 수 없어 결국 증식에 실패 하였다.

상기 결과를 바탕으로, HA 0.45 하이드로겔과 같이 독성이 없었으며 HA 0.05 또는 HA 0 하이드로겔과 같은 과도한 세포 증식이 없어 HA 0.25 하이드로겔은 유착 방지막(adhesion barrier) 하이드로겔로서 적합함을 확인하였다.

도 6A는 상이한 하이드로겔 그룹에서 섬유아세포의 접착 능력을 나타낸다. HA 0.45 하이드로겔에서 나머지 하이드로겔과 비교하여 낮은 접착력 및 세포 이동 부족이 확인하였다.

일부 연구에 따르면, 겔 기질에서의 세포 성장은 주로 계면 전하 및 배지의 등장성에 의존적이라고 보고되었다. HA 0.05 하이드로겔에서, 적은 양의 HA는 다른 하이드로겔과 비교하여 가장 높은 TOCN 노출을 초래한다. 생체 적합성 및 기계적으로 안정한 TOCN 중합체에서 이러한 최대 COO- 기의 수는 세척 저항 용량을 생성함으로써 안정한 겔을 만드는 데 도움이 된다.

일반적으로, 세포는 삼투로 인해 고장성(hypertonic) 배지에서 성장할 수 없으며, 이는 궁극적으로 세포 막의 수축 및 세포 용해를 초래한다. 본 시스템에서, NaCl 염의 첨가에 의해 온도감응성(thermosensitive) 현상이 달성되었다. 다량의 염은 고장성(hyper tonicity) 하이드로겔의 형성에 기여했다. 따라서, 세포 증식 속도는 다양한 정도로 중단되었다. 그러나, HA 농도가 낮고 (HA 0.05) HA가 없는 경우(HA 0), 생체 적합성 TOCN을 사용한 세척 저항 용량(washout resistance capacity)은 세포 배양 플레이트보다는 세포 부착 및 증식을 촉진시켰다.

또한, 높은 점성의 HA (HA 0.45)의 존재는 겔의 생분해 속도를 증가시켰다 (도 4A-B). 이러한 특성은 시딩(seeding)된 세포에 대한 공급원을 제공하지 못하여 배양 14 일 후 HA 0.45 하이드로겔의 세포독성으로 초래하였다.

<시험예 8> 시험관내 혈액 적합성 분석

신규 생체 물질은 동물 또는 인체에 적용되고 혈액과 직접 또는 간접적으로 접촉되기 때문에 제제화를 위해서는 세포 증식 능력 및 우수한 혈액 적합성이 필요하다. 평균 용혈 비율이 5% 미만이면 생체 물질이 안전한 것으로 판단한다.

본 발명의 실시예에 따른 모든 하이드로겔은 양성 대조군 (100 % 용혈률을 나타내는 증류수)과 비교하여 용혈율이 3 % 미만으로 현저하게 낮아 혈액접합성이 우수하였다(도 6B).

<시험예 9> 생체내 분석

9.1. 생체내에서 하이드로겔의 분해 분석

생체내의 하이드로겔 분석결과는 시험관내 분해 결과와 유사하게 HA의 함량이 증가함에 따라 쥐에 피하 주사 후 하이드로겔의 분해가 빠르게 진행되었다. 결과적으로, HA 0.45 하이드로겔은 다른 2 개의 주사 가능한 하이드로겔(HA 0.05 및 HA 0.25)과 비교하여 더 많이 분해되었다(도 6C-D). 투여 후, 하이드로겔 중 어느 것도 흐르지 않았으며 주사 부위에서 안정성을 나타내, 본 발명의 하이드로겔의 온도감응성을 확인하였다.

9.2. 생체내에서 하이드로겔의 분해 분석

수술 후 복부 유착은 3 내지 14일 이내에 발생된다. 수술 후 복부 유착 방지제는 손상된 조직에서 3 내지 14일 동안 장벽의 역할 및/또는 과도한 조직, 혈관 형성을 방지하도록 설계될 필요가 있다. 실험 2 주 후, 조직 유착 정도를 등급화하고 평균화하였다 (표 4). HA 0.25 하이드로겔 또는 양성 대조군으로 처리된 모든 쥐는 실험 내내 맹장과 복벽 사이의 조직 유착이 발생하지 않았다. 그러나, 상업적 하이드로겔의 눈에 보이는 잔여물은 실험 7 일 및 14 일 후에 양성 대조군에서 발견되었다(도 7A). 반면, HA 0.25 처리군은 7일 및 14일째에서 복강에서 하이드로겔이 완벽하게 제거되었음 확인하였다.

음성 대조군의 동물에서 복부와 맹장 사이의 분리를 위해 날카로운 절개를 필요로 하는 두꺼운 섬유질 조직 교량의 조밀하고 강한 유착이 관찰되었다. 유착 심각도 점수는 음성 대조군(염수만으로 처리됨)에서 7 일 보다 14 일에 더 높았다.

유착 정도	7일			14일
유착 정도	음성대조군 (without barrier) (n=8)	HA 0.25 (n=8)	양성대조군 (commercial barrier) (n=8)	음성대조군 (without barrier) (n=8)	HA 0.25 (n=8)	양성대조군 (commercial barrier) (n=8)
IV	4 (50%)	0	0	6 (75%)	0	0
III	4(50%)	0	0	2 (25%)	0	0
II	0	0	0	0	0	0
I	0	0	0	0	0	0
0	0	8	8	0	8	8

복막에 대한 외과적 외상은 섬유소 용해에서 지속적인 불균형을 유발한다. 따라서, 분비된 피브린 분해의 항상성은 손상되어 피브린 밴드의 발달을 초래한다. 그런 다음 세포외 매트릭스 분자, 특히 콜라겐이 점진적으로 퇴적되어 영구 섬유질 결합 조직이 형성된다. 따라서, 콜라겐 침착은 복막 유착 형성의 주요 원인으로 간주된다.

H & E와 Masson의 trichrome으로 염색한 조직학적 섹션을 분석하여 수술 부위에서 재생된 콜라겐의 분포와 밀도를 측정하였다. 도 8B는 실험의 첫 번째 및 두 번째 주 동안, 음성 대조군 (배리어 없음) 그룹은 맹장과 복벽 표면 사이에 강력하고 풍부한 청색 착색된 조밀한 콜라겐 섬유 및 적색 염색된 근육을 나타냈다.

또한, 콜라겐 침착, 맹장 평활근 및 복부 골격근의 상태는 HA 0.25 하이드로겔에 의한 성공적인 유착 방지를 나타내는 건강한 쥐의 조건과 유사하였다. 상업적 장벽의 잔류물이 7 일 및 14 일 모두에서 발견되었지만(도 7A), 조직학적 검사에서, 겔은 절편을 위해 샘플을 제조하고 세척될 때까지 보이지 않았다. 본 발명에서, 상업적 장벽(1,4- 부탄디올디 글리시딜 에테르(BDDE)에 의해 가교된 히알루론산)은 열에 민감한 하이드로겔이 아닌 투명한 겔이었다. 그것은 물에 용해될 수 없으며 복부에 장기간 존재한다. 이러한 특성으로 인해 수술 후 7 일과 14 일에 겔의 존재를 확인하였다(그림 7A). 체류 시간이 연장된 하이드로겔은 지혈을 변경하고 안전성과 효능을 방해할 수 있다. 또한, 미반응의 가교제는 표적 부위에 남아있고 주변 세포주에 대한 독성을 유도할 수 있다.

음성 대조군, HA0.25 및 양성 대조군의 복부 근육 조직은 분산된 대식세포, 호중구 및 혈관 침투성을 확인하기 위해 추가 분석을 수행하였다. H & E 염색 된 슬라이드는 다른 그룹과 비교하여 음성 대조군에서 가장 높은 염증, 섬유증 및 혈관신생(vascularization)을 나타냈다 (도 8A).

중요하게는, 검사된 두 제형 모두 외과적 외상 후 유착 형성의 예방에 효과적이었으며, HA 0.25는 상업용 겔 단독 보다 더 효과적인 것을 확인하였다. 상업용 제품에 비해 HA 0.25 하이드로겔의 탁월한 장점은 가교제가 전혀 없고 안정적인 겔 매트릭스를 형성하며 화학적 가교 없이도 우수한 유착 방지 효과를 나타낸다.

하이드로겔에서 HA를 사용하는 근거는 비응고 효과, 섬유 조직 형성 감소 및 섬유소원에 대한 장벽 효과에 기초한다. 또한, 이 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)은 섬유의 콜로이드 3 차원(3D) 네트워크를 형성하며, 이는 코팅 효과 및 복막 중배엽의 CD44 수용체의 포화를 통한 피브린 형성의 억제를 통해 유착 장벽으로서 추가로 작용한다. 또한, 고분자량 PEG는 겔 표면 상에 섬유아세포 부착을 강하게 억제시켰다. PEG는 두 가지 주요 메커니즘을 통해 작동한다.

먼저 고점도 PEG는 손상된 표면을 덮고 근처 장기의 부착을 방지한다. 둘째, PEG의 삼투압은 염증 반응 및 피브린 분해를 감소시킨다. 본 발명에서, PEG 함유 하이드로겔에서 HA 수준의 증가는 상승적으로 섬유아세포의 부착 및 증식을 억제함을 발견하였다.

9.3. 생체내에서 급성 독성 분석 및 재상피화(remesothelialization)

HA 0.45 하이드로겔은 14 일의 세포 독성 분석 동안 섬유아세포에 독성을 나타냈다(도 5A-C). 따라서, 최적화된 HA 0.25 하이드로겔로 처리된 동물에서 생체 장기(폐, 간, 심장 및 신장)에 대한 세포 독성의 유무를 평가하고 확인하였다. 중요한 기관의 조직학적 검사는 HA 0.25 하이드로겔로 처리된 쥐와 건강한 쥐에서 이상이 없는 것을 확인하였다(도 9C). HA 0.25 하이드로겔 처리 후 치유역학을 결정하기 위해 복부 표면 형태를 SEM에 의해 평가하였다(도 9A). 이미지는 실험 내내 복막 표면에서 상처 치유 및 재상피화를 보장함으로써 지속적인 개선을 나타냈다. 14 일 후, HA 0.25 하이드로겔 처리된 샘플의 복막은 건강한 쥐의 복막과 유사하였다(도 6B). 따라서, 조직학적(도 C) 및 SEM 평가(도 9A-B)는 HA 0.25 하이드로겔이 안전하고, 무독성이며, 유착 방지를 보장하면서 지속적인 치유를 촉진하는 것을 확인할 수 있다.

Claims

폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol), 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose), 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose) 및 히알루론산(hyaluronic acid)을 1:0.3:2:0.05~0.45 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
상기 혼합물을 교반하는 단계; 및
상기 교반된 혼합물에 염화나트륨을 첨가하여 겔화시키는 단계를 포함하는, 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 다공성 하이드로겔의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 교반하는 단계는,
상기 혼합물을 10~60분 동안 1차 교반하는 단계;
상기 교반된 혼합물에 가압멸균수를 첨가한 후 2차 교반하는 단계; 및
상기 2차 교반된 혼합물을 냉각한 후 3차 교반하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 다공성 하이드로겔의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 템포-산화매개-나노셀룰로오스(Tempo-oxidized nanocellulose)는 침엽수 표백 크라프트 펄프로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 다공성 하이드로겔의 제조방법.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 유착방지 온도감응형 셀룰로오스 기반 다공성 하이드로겔.