JP6869518B2 - スルホン化セルロースナノファイバーを含むハイドロゲル - Google Patents
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Description
スルホン基を0.1〜7ミリモル/gで備えるスルホン化セルロースのナノファイバーと、ゼラチン、キトサン、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン及びその誘導体からなる群より選ばれる、第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーの少なくとも一種を、重量比1:99〜70:30で含むハイドロゲル。
スルホン化セルロースは、下記式(1)に示すグルコース単位の3位と4位の間が開環されて、スルホン化された構造を含むセルロースである。
第一級アミノ基を有する生分解性ポリマー(以下「生分解性ポリマー」と略する)は、ヒトの体内又は体表面において、加水分解、酵素分解、微生物分解等により分解可能なポリマーであり、第一級アミノ基を有するものである。但し、第一級アミノ基に加えて、スルホン基と反応し得る第二アミノ基、第三級アミノ基があってもよいことはいうまでもない。このような好ましい生分解性ポリマーの例としては、キトサン等の多糖類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン等のポリペプチド、フィブロネクチン等の糖タンパク、エラスチン等の繊維類、及びこれらの誘導体が包含され、これらの遺伝子組み換え体であってもよい。これらのうち、ポリペプチドが好ましく、中でもゼラチン又はその誘導体が最も好ましい。
GltnNH−CHR1R2 (3)
上式において、「Gltn」はゼラチン残基であり、R1は炭素数1〜11のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数1〜11のアルキル基である。Nは、ゼラチン中の主としてリジン(Lys)のε−アミノ基由来である。好ましくは、R2が水素原子である。該誘導体は、アルキル基を有するので、組織への接着性に優れ、足場材料としても好適である。
ハイドロゲルは、水を含むゲルを意味する。本発明のハイドロゲルは、sCNFと生分解性ポリマーを重量比1:99〜70:30、好ましくは10:90〜40:60、で含む。ここで、重量比は乾燥状態での重量の比である。ハイドロゲル中の水分量は、特に制限されないが、典型的には、該ハイドロゲルの重量の50〜99重量%で適宜調製されることが好ましい。特に、ハイドロゲルをカテーテルでデリバリーする場合、水分量が90〜99重量%であることが好ましい。
例えば、手術等において、短時間で硬い塞栓を形成したい場合には、ゼラチン水溶液のpHを9〜10にすることが好ましい。
本発明のハイドロゲルにデリバリーしたい各種薬剤、タンパク質等を配合し、これらの局所デリバリー担体、又は徐放性デリバリー担体として使用してもよい。薬剤としては、例えばステロイド等の抗炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子等の成長因子が挙げられる。
本発明のハイドロゲルは、医療用インジェクタブルハイドロゲルとして好適に使用される。例えば、脳動脈瘤治療、冠動脈塞栓療法、心筋梗塞治療に用いることができる。心筋梗塞は、血管の閉塞によって心筋組織が壊死する不可逆的な病態であり、梗塞後には心機能の低下や不整脈によって心不全に陥る可能性がある。生体活性を付与したハイドロゲルを足場として梗塞部位に注入することで、心室壁を厚く保ち、ネクローシスや炎症反応、心筋リモデリングを抑制するとともに、周囲からの細胞浸潤を誘導し、新生血管を形成させることで、組織の再生を促進させることができると期待される。更には、細胞や機能性タンパク質を内包してデリバリーすることで、膵島デリバリー治療や増殖因子のデリバリーなどの適用も期待される。その他、本発明のハイドロゲルを、ハイドロキシアパタイトやリン酸カルシウムなどの人工骨に混合することでインジェクタブルな人工骨として、創傷被覆材として、また生体組織用の接着剤としての用途も考えられる。
<スルホン化セルロースナノファイバー(sCNF)の調製>
非特許文献1を参考にして、表1に示すスルホン化セルロース1〜8を合成し、スルホン化セルロースナノファイバー(sCNF1〜8)を得た。
第一段階として、セルロースを原料としてアルデヒド化セルロースを作製した。1gのろ紙粉末(ADVANTEC、メッシュ:40−100、繊維長:150−400μm)を撹拌子で撹拌しながら100mLの超純水に分散させた。得られた分散物に、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)をセルロース中のグルコース単位のモル数に対して0.5〜2当量の割合で、それぞれ添加した。遮光しながら、オイルバス中50oCで4時間撹拌することによって、グルコース単位中の3位と4位の間で開環することによって、アルデヒド化セルロースを調製した。反応物を減圧濾過することによって未反応物を含む水溶液を除去し、超純水で洗浄した。この操作を3回繰り返すことで洗浄を行い、最後に凍結乾燥することで、アルデヒド化セルロースの乾燥粉末を得た。生成されたアルデヒド基量を、中和滴定法によって定量した。
過ヨウ素酸ナトリウムを用いた開環反応によって、セルロースの結晶性がどのように変化するかを評価するため、X線回折測定(XRD)を行った(図1、左図)。XRD測定の結果より、グルコース単位の開環割合の増大に伴ってセルロース由来のピーク(14.6、16.5、22.8o)が減少しており、結晶性が低下することが示された。アモルファス構造由来の18oのピークと22.8oの比から結晶化度を算出したところ、もともと90%であった結晶化度が開環反応に伴って徐々に減少し、グルコース単位の7%を開環したsCNF1では83%の結晶化度、30%を開環したsCNF2では70%の結晶化度、40%を開環したsCNF3では68%の結晶化度であった(図1、右図)。開環割合が62%のsCNF4では23%まで結晶化度が減少しており、分解性が向上していることが予測される。このように、開環反応を制御することで、セルロースの結晶性及び分解性が制御できることが示された。
各スルホン化セルロースナノファイバーを超音波ホモジナイザーで処理した後、スルホン基量を滴定法により測定した(表1)。ピロ亜硫酸ナトリウムの量がアルデヒド基に対して、それぞれ、0.05〜0.5当量であったときのスルホン化セルロースナノファイバーのスルホン基量を図2に示す。同図から分かるように、開環割合とアルデヒド基量が同じであってもピロ亜硫酸ナトリウムの量を変化させることでセルロースナノファイバー中のスルホン基量を制御することができた。
ピロ亜硫酸ナトリウムがアルデヒド基の50モル%のsCNF3、及び150モル%仕込みのスルホン化セルロースナノファイバーは、超音波処理によって機械的に細断することで図3の電子顕微鏡写真に示すようなsCNFを調製することができた。
sCNFの生分解性を、グルコース単位の開環割合が7%のsCNF1及び62%のsCNF4を用いて、37℃において調べた。各sCNF100mgを、5mLのPBS(pH=7.4)に分散し、24時間ごとに不溶解性物の重量を測って、重量減少を測定した。比較として、原料セルロース(ろ紙粉末、ADVANTEC社)を用いた。図4に結果を示す。sCNF1は1日で約5%、sCNF4は約15%減少した。このように生分解性は、グルコース単位の開環割合に依存するので、他のsCNFはsCNF1と4の間の値となると予測される。これに対して、原料セルロースは1日ではほとんど重量が減少しなかった。
各sCNFとゼラチンからなるハイドロゲル(sCNFゲル)を合成した。2.5重量%のsCNF3の分散液(超純水、pH=7)と37oCに加温した20重量%のブタ皮アルカリ処理ゼラチン(新田ゼラチン社)溶液(0.1Mホウ酸バッファー、pH=8.5)を、ボルテックスミキサーを用いて、素早く等量混合することでsCNFゲル3を調製した。混合した瞬間からゲル化反応が始まり、数分以内には図5の写真に示すようにゲル化した。同様にして、sCNF1、2、4、7についてもsCNFゲルを得た。得られたsCNFゲル3を凍結乾燥して液体窒素に浸漬後粉砕して、ゲルの断面を電子顕微鏡で観察した。図6に電子顕微鏡写真を示す。同図から、sCNFゲルが約10〜80μm径の孔を有することが分かる。図6において、高倍率の写真(左)は、孔の壁部分の拡大である。
得られたハイドロゲルの力学特性を評価するために、粘弾性測定装置(Rheoplus、アントンパール社)を用いてsCNFゲルの粘弾性評価を行った(図7)。5重量%のsCNF3の分散液(超純水、pH=7)と37oCに加温した20重量%のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液(0.1Mホウ酸バッファー、pH=8.5)を50μLずつ素早く混合して得られた溶液100μLを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径10mmの円盤状の治具で固定し、10oCから測定を開始し、1分に1oCずつ昇温しながら50oCまで測定を行った。測定時の周波数は1Hz、ひずみは1%で実験を行った。ゼラチンは30oC付近に相転移温度(ゲル化温度)を有しているため、低温ではゲル、30oC以上では溶解し液状となる。これは温度上昇によって水素結合が開裂するためである。一方で、sCNFゲル3においては、30oC以上でも相転移は起こらず、生体組織の温度である37oCにおいても1kPaという高いせん断弾性率を示しており、ゼラチンのみの場合と比較して1000倍増加した。これは、sCNF3とゼラチンとの間で相互作用が働くことで、ネットワーク構造が形成されたためであると考えられる。このことより、sCNFとゼラチンを組み合わせることで、ゲル化が起こり、37oCでも高い弾性率を有するゲルが作製できることが分かった。
sCNFゲルの作製条件と力学特性の関係を明らかにするために、sCNF及びゼラチンの濃度の影響を調べた。0.5〜2.5重量%のsCNF3の溶液(超純水、pH=7)と、1〜30重量%のゼラチン各溶液を50μLずつ素早く混合して得られた溶液100μLを粘弾測定装置のステージにのせ、直径10mmの円盤状の治具で固定し、37oCにおける粘弾性特性を評価した(図8)。測定時の周波数は1Hz、ひずみは1%で実験を行った。図8に示すように、sCNF及びゼラチンの濃度を増加させるとせん断弾性率が増加した。sCNF及びゼラチンそれぞれの濃度を調整することで、数Paから1000Paまで幅広く力学特性を変化させることができた。
sCNF3の2.5重量%溶液(超純水、pH=7)と、20重量%のゼラチン溶液のpHを8〜10に変えて、ゲル化速度への影響を調べた(図9)。pH=8では5分でゲル化するものの、ハイドロゲルのせん断弾性率が平衡に達するまでに6時間必要とした。一方pH=9及びpH=10のゼラチン溶液を用いると即座にゲル化し、10分以内にせん断弾性率が1kPaに達した。
2.5重量%のsCNF3の溶液(超純水、pH=7)と、20重量%のゼラチン溶液を50μLずつ素早く混合して得られた溶液100μLを粘弾測定装置のステージにのせ、直径10mmの円盤状の治具で固定し、37oCで5分ごとにひずみを1%と1000%へ変化させることでチキソトロピー性を評価した。1000%ひずみによってゲルがいったんは破壊され弾性率が低下したが、1%のひずみに戻すと、再び弾性率が回復していた(図10)。これは、本発明のハイドロゲルの結合様式が可逆的なものであることを示す。これに対して比較対象として、末端N‐ヒドロキシスクシンイミドで修飾されたカルボキシル基を有する4分岐ポリエチレングリコール(ペンタエリスリトール−ポリ(エチレングリコール)エーテルテトラスクシンイミジル グルタレート、Mw=20,000)でゼラチンを架橋したゲル(以下「PEG−G」又は「PEGゲル」という)で同様の実験を行った(図11)。その結果、3サイクル後には、貯蔵弾性率が元の20%程度まで低下していた。一方で、本発明のハイドロゲル(sCNF−G)は3サイクル後も貯蔵弾性率が元の値まで回復しており、チキソトロピー性を有していることが示された。
高い分子量を有するフルオロセイン(FITC)で蛍光ラベル化されたデキストラン(Mw=2,000,000Da)を用いて、ゲルの透過性試験を行った(図12)。2.5重量%のsCNF3の分散液(超純水、pH=7)と37oCに加温した20重量%のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液(0.1Mホウ酸バッファー、pH=8.5)を素早く50μLずつ混合して得られた溶液100μLを24ウェルトランスウェルインサート(コーニング社)内に添加し、1日ゲル化させた後、超純水2mLを加えて1日かけて膨潤させた。比較として上記PEG−Gを同様に処理した。その後、1mg/mLのFITC−デキストラン(Mw=2,000,000Da,流体力学半径〜50nm)を200μL添加し、プレート側には1mLのPBSを添加した。所定時間ごとに50μLの溶液をインサート下側から取り出し、50μLのPBSを補充した。得られた溶液の蛍光強度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定し、検量線から透過率を評価した。その結果、分子ゲル(PEG−G)と比較して、sCNFゲル3は50nmという巨大な分子をより透過させることが明らかとなった。また、速度定数は、sCNFゲルが6.4×10−5h−1、PEG−Gが1.6×10−5h−1となっており、約4倍透過性に優れることが示された。
sCNFを細胞培養液中に分散させ、培養細胞に与えることで、細胞機能に与える影響をin vitro試験で評価した。L929マウス線維芽細胞(理研)は、RPMI1640培地(10%ウシ胎児血清、1%ペニシリンストレプトマイシン)を用いて37oC、5%CO2のインキュベーターで培養した。5×103個のL929細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間培養した。その後、sCNF3を12.5μg/mLの濃度で懸濁した培地をL929細胞に添加し、培養を継続した。sCNFを添加した日を0日目として、1、2、3日後に細胞数カウンティングキット(WST−8、DOJINDO)を用いて細胞数を定量し、3日後のサンプルに関しては、固定と脱水処理を行った後に、SEM観察を行った(図13上段)。sCNFは基板上に集積してフィルムのような構造を形成しており、細胞の足場として接着に関与していることが示唆された。
細胞数については、sCNFを添加した細胞は未添加のサンプルと同様に増殖しており、有意な差はみられなかった(図13下段)。
2.5重量%のsCNF3の分散液(超純水、pH=7)と37oCに加温した20重量%のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液(0.1Mホウ酸バッファー、pH=8.5)を100μLずつ素早く混合して得られた溶液200μLを48ウェルプレートに添加し、1日ゲル化させた後、超純水2mLを加えて1日かけて膨潤させた。得られたゲルを1時間のUV照射によって滅菌処理した。1x104個のヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC、Lonza社)又は2x104個のヒト皮膚由来線維芽細胞(NHDF、Lonza社)をゲル上に播種し、HUVECはEGM−2培地で、NHDFはFGM培地(Lonza社)で、それぞれ、37oC、5%CO2のインキュベーターで24時間培養した。その後、位相差顕微鏡によって観察を行った(図15、×40)。どちらの細胞もゲル表面に良好な接着・伸展が確認された。本発明のハイドロゲルは高い細胞接着性と親和性を有していることが示された。
37oCに加温した20重量%のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液(0.1Mホウ酸バッファー、pH=8)に1x105個のNHDFを混合したものと、2.5重量%のsCNF3の分散液(超純水、pH=7)を素早く100μLずつ混合して得られた溶液200μLを48ウェルプレートに添加し、ゲル化させた。3分間静置後に、FGM培地を1mL添加し37oC、5%CO2のインキュベーターで培養した。その後、位相差顕微鏡によって観察を行った(図16、×40)。ゲルに内包されたNHDFはゲル内部でも良好な接着及び伸展をしている様子が確認された。本発明のハイドロゲルは、細胞の内包が可能であることから、細胞デリバリーに応用できることが示された。
表1に「6」と記載したのと同様の方法により作製し、スルホン基量が0.5mmol/gであるsCNFの2重量%の分散液(超純水、pH=7)と37oCに加温した20重量%のブタ皮アルカリ処理ゼラチン(新田ゼラチン社)溶液(0.1Mホウ酸バッファー、pH=8.5)とを、ボルテックスミキサーを用いて、素早く等量混合し、厚さ1mmのシリコンモールドへ入れ、4℃で24時間インキュベートすることでsCNFハイドロゲルを調製した。上記ハイドロゲルをPBS中で24時間洗浄した後に、10mmのパンチで打ち抜き、1mg/mLのFluorescein isocyanateでラベル化されたウシ血清アルブミン溶液に浸漬し、24時間37℃でインキュベートした。次に、PBSで3回洗浄後、100μg/mLのコラゲナーゼ溶液でゲルを溶解し、96ウェルプレートに移し、蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。ハイドロゲルに吸着したアルブミンの量は検量線から算出した。
これは負に帯電したスルホン基とアルブミン中の正に帯電した部分が静電相互作用したためであると考えられる。このことから、本発明の実施形態に係るハイドロゲルは体内のサイトカインや増殖因子を吸着することで体内で機能を発現すると期待される。
本実験は、物質・材料研究機構の動物実験安全委員会に承認された実験計画に基づいて行われた。マウス(C57BL/6J、メス、6−8週齢)を2.5%イソフルランによる吸入麻酔下で、背部の毛を剃り70%エタノールで消毒した後に、背部皮下に直径5mm厚さ1mmのディスク状のハイドロゲルを埋入した。
表2には、使用したハイドロゲルの「試料名称」と、上記ハイドロゲルに含まれるsCNFの作製方法、スルホン基量をまとめて示した。
図18は、埋植から14日後のハイドロゲルを埋植していない組織(コントロール)とハイドロゲルを埋植した組織の組織切片のヘマトキシリン・エオシン(HE)染色の画像である。なお、図18中、黒色の破線で囲まれた範囲は、埋植したハイドロゲルを示している。なお、図18中のスケールバーは1mmに対応する。
図19は、各ハイドロゲルを埋植してから各日数後のHE染色画像である。なお、図19中、白色の破線はホストの組織とハイドロゲルとの境界を示しており、破線で挟まれた範囲は、ハイドロゲルを示している。また、上記破線で挟まれた範囲において、黒色に見える部分は、ハイドロゲルであり、灰色に見える部分は、浸潤した細胞と細胞が産生した細胞外マトリックス成分である。なお、図19中のスケールバーは、300μmに対応する。
図20は、ハイドロゲル内に浸潤した細胞の分布を定量したものである。0は組織とハイドロゲルの境界、1はゲルの中央部分を表している。
図21は、各ハイドロゲルに浸潤した細胞の深さを定量したものである。
図22、及び、図23は、埋植から14日後のビメンチン抗体及びCD31抗体を用いた免疫染色画像である。図中、ビメンチン染色では黒色で見える部分が線維芽細胞、CD31染色では黒色で見える部分が管腔構造を有するものが血管内皮細胞である。なお、図22、及び、図23中のスケールバーは、100μmに対応する。
図24は、ビメンチン染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図25は、CD31染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図26は、CD31染色画像から管腔構造の数を定量した結果である。
図27は、埋植から14日後のCD163抗体及びCD68抗体を用いた免疫染色画像である。なお、図27中のスケールバーは100μmに対応する。
図28は、CD163染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図29は、CD68染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図30は、CD163染色画像から得られた陽性細胞の面積とCD68染色画像から得られた陽性細胞の面積の比を表したものである。
Claims (10)
- スルホン基を0.1〜7ミリモル/gで備えるスルホン化セルロースのナノファイバーと、ゼラチン、キトサン、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン及びその誘導体からなる群より選ばれる第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーの少なくとも一種を、重量比1:99〜70:30で含むハイドロゲル。
- 該第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーが、ゼラチン又はその誘導体である、請求項1記載のハイドロゲル。
- 該スルホン化セルロースのナノファイバーがスルホン基を0.1〜2ミリモル/gで備える、請求項1又は2記載のハイドロゲル。
- 該ゼラチンもしくはその誘導体がアルカリ処理された動物由来もしくは魚由来である、請求項2又は3記載のハイドロゲル。
- 該ゼラチンもしくはその誘導体が低エンドトキシン化ゼラチンである、請求項2〜4のいずれか1項記載のハイドロゲル。
- 該誘導体が、下記式(3)で示される構造:
GltnNH−CHR1R2 (3)
(上式において、Gltnはゼラチン残基であり、R1は炭素数1〜11のアルキル基であり、R2は水素原子又は炭素数1〜11のアルキル基である)
を含むゼラチン誘導体である、請求項2〜5のいずれか1項記載のハイドロゲル。 - 該スルホン化セルロースのナノファイバーを含む第1剤と、該第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーを含む第2剤からなる2剤型の形態で供される請求項1〜6のいずれか1項記載のハイドロゲル。
- 該第1剤が該スルホン化セルロースのナノファイバーの分散液であり、該第2剤が第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーの水溶液である、請求項7記載のハイドロゲル。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のハイドロゲルを含む、医療用インジェクタブルハイドロゲル。
- 血管塞栓材である、請求項9記載の医療用インジェクタブルハイドロゲル。
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