KR20230057167A - 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔, 그의 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents
케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔, 그의 제조방법 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 케라틴과 피브리노겐이 결합되어 있는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 이용하여 조직을 재생하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 재생에 관여하는 세포의 부착과 결합된 피브린의 세포 결합 및 케라틴의 창상 치유 능력을 위한 고유의 부착 모티프를 포함하는 잠정적인 매트릭스로 인하여 의약 및 생물공학 분야에 유용하게 응용될 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 케라틴과 피브리노겐이 결합되어 있는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔, 그의 제조방법 및 이를 이용하여 조직을 재생하는 방법에 관한 것이다.
구강의 외상성 손상은 비전형적이며 종종 조절되지 않는 출혈과 염증에 의해 수반된다. 주사 가능한 하이드로겔은 간단한 제형, 최소 침습 기술 및 위치 특이적 전달(site-specific delivery) 덕분에 구강 손상 치료를 위해 널리 연구되었다.
상기 주사 가능한 하이드로겔의 비정형적 결함 때문에, 생체 역학적 특성이 우수한 주사 가능한 하이드로겔이 구강 손상 치료에 적합한 플랫폼이다.
인모 케라틴 생체재료는 창상 치유 및 출혈 조절에 효과적인 것으로 알려져 있고, 피브리노겐은 조직 복구를 위해 창상 치유 중에 널리 사용된다.
최근에는 주사형 폼이 각광을 받고 있으며, 단순한 제형, 최소 침습 기술, 위치 특이적 조치가 가능하다. 그러나 종래의 이식 가능하게 미리 형성된 피브린 하이드로겔은 단백질 백본의 디자인 가능성에 대한 제한 때문에 기계적 강도 특성이 약하고, 다공성 및 부착 특성이 부족하다.
따라서, 피브린 하이드로겔은 단독 사용시 스캐폴드의 수축을 증가시키고 지속적인 성장을 지원하지 않으며, 상대적으로 강하고, 이식시 다루기가 어려운 문제점이 있다.
본 발명자들은 구강 치은 진피의 기저층에 관여하는 인간 치은 섬유아세포(HGF) 원을 이용한 네트워크 형성을 통하여 창상 치유의 상승적인 촉진 효율을 테스트하였고, 인간 치은 섬유아세포(HGF)의 증식과 재생 잠재력을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 케라틴이 피브린 고분자에 의해 가교되고, 주사가능한 새로운 형태의 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 케라틴이 피브린 고분자에 의해 가교되고, 주사가능한 새로운 형태의 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 케라틴이 피브린 고분자에 의해 가교되고, 주사가능한 새로운 형태의 하이드로겔의 용도를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 케라틴과 피브리노겐이 결합되어 있는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 케라틴은 인모 유래일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 케라틴과 피브리노겐이 2~4 : 1의 몰비로 결합되어 있을 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 케라틴과 피브리노겐이 3 : 1의 몰비로 결합되어 있을 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 주사가 가능할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 조직 재생을 가속화할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 조직은 구강 조직일 수 있다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 케라틴에 무수 숙신산을 적가하여 카르복실화 케라틴을 제조하는 단계; (b) 상기 카르복실화 케라틴에 피브리노겐을 첨가하고, 카르보디이미드/N-히드록시숙신이미드의 존재하에 커플링 반응시켜 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액을 니들이 있는 이중 챔버 주사기의 일측에 채우고, 트롬빈 용액을 상기 니들이 있는 이중 챔버 주사기의 반대쪽에 채운 후, 상기 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액 및 트롬빈 용액이 채워진 주사기를 실온에서 천천히 유리판에 압출시키는 단계를 포함하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 (b) 단계에서, 상기 카르복실화 케라틴 : 상기 피브리노겐이 2~4 : 1의 몰비가 되도록 상기 피브리노겐을 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 카르복실화 케라틴 : 상기 피브리노겐이 3 : 1의 몰비가 되도록 상기 피브리노겐을 첨가할 수 있다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 손상된 조직에 주입하는 단계를 포함하는 조직 재생방법을 제공한다.
본 발명에 따른 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 생체 내에서 물리적 장벽으로 성공적으로 이루어질 수 있으며, 내부 지혈제는 세포 이식 후 염증 세포의 침윤을 방지할 수 있는데, 이러한 특성은 구강 조직이 조작된 하이드로겔로서 임상적 잠재력을 제공할 수 있다.
상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 재생에 관여하는 세포의 부착과 결합된 피브린의 세포 결합 및 케라틴의 창상 치유 능력을 위한 고유의 부착 모티프를 포함하는 잠정적인 매트릭스로 인하여 의약 및 생물공학 분야에 유용하게 응용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 구강 조직 재생을 위한 KRT-FIB 하이드로겔(KFH)의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 KRT-FIB 전구체의 합성 스킴을 나타낸 것이고, 도 2의 (b)는 KRT, FIB 및 KF 전구체의 TGA 다이어그램을 나타낸 것으로서, 각 화살표는 주요 체중 감소가 시작되는 온도를 나타낸다. 도 2의 (c)는 KRT, FIB, 및 KF-1, 3, 6 전구체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 KRT-FIB 하이드로겔(KFH 하이드로겔) 제조 및 THR-유도 피브린 가교 메커니즘의 개략도를 나타낸 것이고, 도 3b는 THR이 있거나 없는 FIB 및 KF 전구체의 겔화 이미지를 나타낸 것이며, 도 3c는 다양한 KRT:FIB 몰비를 갖는 KFH 시료의 디지털 사진으로서, 흰색의 탁한 FIB-H는 하이드로겔의 KRT 함량이 증가함에 따라 점차 갈색을 띠고 투명해진다.
도 4는 THR 유도 하이드로겔의 특성화 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 (a)는 서로 다른 KRT 구성을 갖는 하이드로겔의 겔화 이미지, 도 4의 (b)는 주파수 스윕의 증가에 따른 복소 점도의 변화, 도 4의 (c)는 저장 모듈러스이고, 도 4의 (d)는 주파수에 따른 손실 모듈러스를 나타낸 것으로서, 모든 측정은 대조군으로 FIB 결합 하이드로겔(FIB-H)을 사용하여 수행하였다.
도 5의 (a)는 KFH-3 하이드로겔이 니들이 막히지 않고 통과할 수 있어, 높은 주입성을 갖는다는 것을 나타내고, 도 5의 (b)는 37℃에서 DW에서 KFH-3 및 FIB-H의 팽창 역학, 도 5의 (c)는 다른 배율에서 KFH-3 및 FIB-H의 디지털 사진 및 SEM 이미지(스케일 바 = 각각 500μm 및 50μm)를 나타낸 것이다.
도 6은 FIB-H 및 KFH-3에서 3D 세포 캡슐화에 대한 세포 부착, 증식의 특성화 결과를 나타낸 것이다. 세포 생존력 분석, FIB-H 및 KFH-3 하이드로겔에 매립된 인간 치은 섬유아세포(HGF)는 캡슐화 후 24시간 후에 calcein_Am(녹색)/ethidium homodimer(빨간색) LIVE/DEAD 분석으로 염색되었다.
도 6의 (a) 및 (b)는 저배율(스케일 바=200um) 및 (c) 및 (d)는 고배율(스케일러 바=100um) 로 표시된다. 도 6의 (e) 및 (f)는 실험 3일 후 DAPI/팔로이딘(F-액틴) 염색으로 표지된 캡슐화된 HGF 세포의 공초점 사진(스케일러 바 = 100um)을 나타낸 것으로서, (f)는 배양 3일 후, 세포가 신장되고 KFH-3 하이드로겔에서 상호 연결된 네트워크를 형성하는 것을 알 수 있다.
도 2의 (a)는 KRT-FIB 전구체의 합성 스킴을 나타낸 것이고, 도 2의 (b)는 KRT, FIB 및 KF 전구체의 TGA 다이어그램을 나타낸 것으로서, 각 화살표는 주요 체중 감소가 시작되는 온도를 나타낸다. 도 2의 (c)는 KRT, FIB, 및 KF-1, 3, 6 전구체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 KRT-FIB 하이드로겔(KFH 하이드로겔) 제조 및 THR-유도 피브린 가교 메커니즘의 개략도를 나타낸 것이고, 도 3b는 THR이 있거나 없는 FIB 및 KF 전구체의 겔화 이미지를 나타낸 것이며, 도 3c는 다양한 KRT:FIB 몰비를 갖는 KFH 시료의 디지털 사진으로서, 흰색의 탁한 FIB-H는 하이드로겔의 KRT 함량이 증가함에 따라 점차 갈색을 띠고 투명해진다.
도 4는 THR 유도 하이드로겔의 특성화 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 (a)는 서로 다른 KRT 구성을 갖는 하이드로겔의 겔화 이미지, 도 4의 (b)는 주파수 스윕의 증가에 따른 복소 점도의 변화, 도 4의 (c)는 저장 모듈러스이고, 도 4의 (d)는 주파수에 따른 손실 모듈러스를 나타낸 것으로서, 모든 측정은 대조군으로 FIB 결합 하이드로겔(FIB-H)을 사용하여 수행하였다.
도 5의 (a)는 KFH-3 하이드로겔이 니들이 막히지 않고 통과할 수 있어, 높은 주입성을 갖는다는 것을 나타내고, 도 5의 (b)는 37℃에서 DW에서 KFH-3 및 FIB-H의 팽창 역학, 도 5의 (c)는 다른 배율에서 KFH-3 및 FIB-H의 디지털 사진 및 SEM 이미지(스케일 바 = 각각 500μm 및 50μm)를 나타낸 것이다.
도 6은 FIB-H 및 KFH-3에서 3D 세포 캡슐화에 대한 세포 부착, 증식의 특성화 결과를 나타낸 것이다. 세포 생존력 분석, FIB-H 및 KFH-3 하이드로겔에 매립된 인간 치은 섬유아세포(HGF)는 캡슐화 후 24시간 후에 calcein_Am(녹색)/ethidium homodimer(빨간색) LIVE/DEAD 분석으로 염색되었다.
도 6의 (a) 및 (b)는 저배율(스케일 바=200um) 및 (c) 및 (d)는 고배율(스케일러 바=100um) 로 표시된다. 도 6의 (e) 및 (f)는 실험 3일 후 DAPI/팔로이딘(F-액틴) 염색으로 표지된 캡슐화된 HGF 세포의 공초점 사진(스케일러 바 = 100um)을 나타낸 것으로서, (f)는 배양 3일 후, 세포가 신장되고 KFH-3 하이드로겔에서 상호 연결된 네트워크를 형성하는 것을 알 수 있다.
본 발명의 제1 구현예는 케라틴과 피브리노겐이 결합되어 있는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 제공한다.
케라틴은 표피 부속물 구조(epidermal appendageal structures)의 머리카락, 손톱, 뿔, 발굽, 양모, 깃털 중 어느 하나에 중간 필라멘트로 결합하는 불용성 단백질을 말하고, 케라틴은 특히 상피 조직에서 중요한 구조 및 보호 기능을 하다.
본 발명자들은 최근에 고유의 생체 활성, 생체 적합성 및 물리적 특성으로 인한 상처치유에 매우 매력적인 인간 모발 유래의 케라틴 단백질을 보고하였다. 그 연구에서, 케라틴은 모발 부속물에서 추출한 천연 단백질 그룹이다. 특히, 상기 케라틴은 세포 부착(adhesion) 모티프 leu-asp-val(LDV)를 함유하는데, 이는 케라틴이 세포 부착 및 지지를 위한 세포외 기질로서 기능할 수 있다는 것을 시사하고 있다. 그러나 케라틴 하이드로겔에 대한 종래의 연구는 양모 케라틴 또는 깃털 케라틴으로 제한되어 있다.
또한, 인모(human hair) 케라틴 결합의 하이드로겔, 특히 주사 가능한 하이드로겔은 구강조직 생성에 관하여 널리 연구되지 않았다.
조직 공학의 발전은 구강 점막을 복구하는 천연 단백질 결합 생체 재료의 응용 분야에 대한 관심을 증가시키고 있다. 일반적으로 천연 고분자를 사용한 생체재료(biomaterials)는 세포 및 주변 조직과 생체 적합성이 매우 높고, 염증이 덜하다.
상기 생체재료의 종류로는 젤라틴, 알부민, 셀룰로오스, 히알루론산, 피브리노겐, 알지네이트, 키토산을 포함한다. 특히, 피브리노겐은 회복 세포 활성을 자극할 수 있고, 창상 치유 및 조직 복구를 위한 혈관 형성 및 항염증 모두에 잠재력을 나타내기 때문에, 선천적 창상 치유 과정에서 널리 사용된다. 피브리노겐은 혈관 신생 및 뼈 재생의 조절에서 핵심 단백질이다.
고분자 하이드로겔의 3차원(3D) 구조를 요구하는 성공적인 조직 재생에는 세포의 생리활성 물질을 전달하는 운반체로서의 세포외 기질(ECM) 기능일 수 있기 때문에 구강 조직 재생의 발전에 필수적이다.
조직 복구에 사용된 재료 플랫폼은 전형적으로 트롬빈에 의해 생산되는 피브린 하이드로겔이다. 피브리노겐은 트랜스글루타미나제 인자 XIII와 칼슘 이온이 피브린의 존재시 피브린으로 변환된다.
현재 이용 가능한 많은 피브린 하이드로겔은 출혈 예방 및 창상 치유 촉진에 사용되는 첫 번째 생체물질인 피브리노겐과 트롬빈으로부터 제조된다.
최근에는 주사형 폼이 각광을 받고 있으며, 단순한 제형, 최소 침습 기술, 위치 특이적 조치가 가능하다. 주사 가능한 하이드로겔은 생체 적합성, 쉽게 조작하고 불규칙한 모양으로 조정할 수 있는 기계적 및 생화학적 특성을 지녀야 하다. 주사 가능한 특성을 가진 이러한 하이드로겔은 비침습성 수술 성공의 핵심이다.
본 발명의 제1 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔에서, 상기 케라틴은 인모 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제1 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔에서, 상기 케라틴과 피브리노겐이 2~4 : 1의 몰비, 바람직하게는 3:1의 몰비로 결합되어 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제1 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 주사가 가능할 수 있고, 조직 재생을 가속화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제1 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔에서, 상기 조직은 구강 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제2 구현예는 (a) 케라틴에 무수 숙신산을 적가하여 카르복실화 케라틴을 제조하는 단계; (b) 상기 카르복실화 케라틴에 피브리노겐을 첨가하고, 카르보디이미드/N-히드록시숙신이미드의 존재하에 커플링 반응시켜 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액을 니들이 있는 이중 챔버 주사기의 일측에 채우고, 트롬빈 용액을 상기 니들이 있는 이중 챔버 주사기의 반대쪽에 채운 후, 상기 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액 및 트롬빈 용액이 채워진 주사기를 실온에서 천천히 유리판에 압출시키는 단계를 포함하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 구강 조직 재생을 촉진하기 위하여, 피브린 고분자에 의해 가교된 새로운 주사 가능한 케라틴 결합 피브리노겐(KRT-FIB) 하이드로겔(KFH)을 개발하였다(도 1 참조). KFH의 균질적인 형성을 위하여, 인모 유레 KRT 단백질이 손쉬운 커플링 반응을 통하여 FIB 단백질과 공유 결합된다.
본 발명의 제2 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔의 제조방법의 상기 (b) 단계에서, 상기 카르복실화 케라틴 : 상기 피브리노겐이 2~4 : 1, 바람직하게는 3:1의 몰비가 되도록 상기 피브리노겐을 첨가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
생성된 KRT-FIB 전구체(KF 전구체)는 THR의 존재 하에 가교 결합되어 다공성 KFH 하이드로겔을 형성한다. 3:1의 KRT:FIB 몰비의 KFH 하이드로겔이 유변학적 측정과 주입 성능에 의해 최적화되었으며, 팽윤 거동 및 표면 형태를 조사하였다. 우수한 세포 생존력, 증식 및 이동/세포-세포 상호작용 결과는 주사 가능한 KFH 하이드로겔이 높은 임상적 응용성과 함께 구강 조직 재생용으로 유망한 플랫폼임을 의미한다.
본 발명의 제3 구현예는 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제3 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물은 약제약학적으로 허용되는 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 희석제로는 약제학적으로 허용되는 수성 유체, 예를 들어 약제학적인 등급의 탈이온수 또는 특정 이온 및/또는 완충제를 함유한 약제학적인 등급의 수용액이다.
본 발명의 제3 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물은 부형제를 더 포함할 수 있는데, 상기 부형제로는 인간 알부민, 만니톨 및 아세트산 나트륨을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제3 구현예에 따른 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물은 안정화제를 더 포함할 수 있는데, 상기 안정화제로는 아스코르브산, 아스코르브산 나트륨, 아스코르브산의 기타 염, 또는 산화방지제를 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
(1). 재료
케라틴(KRT) 단백질은 인모(human hair)에서 추출되었으며, 자세한 절차는 본 발명자들의 이전 연구(Journal of Industrial 388 and Engineering Chemistry 2019, 73, 142-151)에 설명되어 있다.
인간 혈장 피브리노겐(FIB)(Merckmillipore, USA) 및 인간 혈장 트롬빈(THR)(Calbiochem, USA)을 사용하여 피브린 겔을 제조하였다. Dubecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 입수하였다. 카르보디이미드/N-히드록시숙신이미드(EDC/NHS), 트리스 완충식염수(TBS), 수산화나트륨(NaOH)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
인간 치은 섬유아세포(HGF)는 ScienCell Reasearch Laboratories(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 모든 화학 물질은 추가 정제 없이 사용되었다.
(2). 계측 및 분석
일련의 KRT-FIB 전구체(KF 전구체)의 열적 특성 및 상응하는 하이드로겔(KFH 하이드로겔)은 질소 가스 흐름 및 온도 범위 20~600℃, 가열 속도 10℃/min 하에서 열중량 분석(TGA, SDT Q600, TA Instruments, USA)으로 측정되었다.
하이드로겔의 향태는 금 코팅된 주사 전자 현미경(SEM, S-4700, Hitachi, Japan)으로 관찰되었다. 하이드로겔의 유변학적 특성은 ARES-G2 레오미터(TA Instruments, New Castle, USA)을 사용하여 직경 8 mm의 평행판 지오메트리로 37℃에서 조사되었다.
(3). KRT 단백질의 석시닐화(KRT-COOH)
100mL PBS(pH 6-7)에 용해된 KRT(200mg) 용액에 PBS에 용해된 25mg의 무수 숙신산을 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 및 증류수(DW)에 대해 4시간 동안 교반하였다. 그런 다음 정제된 KRT-COOH를 동결건조하고 나중에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
(4). EDC/NHS 커플링 반응을 통한 KRT-FIB 전구체(KF 전구체)의 합성
일련의 KRT-FIB 전구체(KF 전구체)를 합성하기 위하여, 다른 양의 KRT-COOH(0, 5, 10, 30, 60 mg)가 EDC/NHS의 존재하에 활성화되었다. 먼저 EDC 19.25mg을 100mL PBS 중 KRT-COOH의 용액에 첨가하였다. 그런 다음 상기 혼합 용액에 22 mg의 설포-NHS를 첨가하고 실온에서 15분간 교반하였다. 62.5 μL의 2-메르카포에탄올을 적가하였다.
이어서, 10X PBS(5ml)을 첨가하여 생성된 혼합물의 pH를 7.0으로 조정하고, FIB 100mg을 실온에서 교반하면서 상기 혼합 용액에 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 진행시키고 Tris를 첨가하여 ??칭하였다.
1N NaOH를 첨가하여 상기 ??칭된 용액의 pH를 8.0으로 증가시켰다. 생성된 KF 전구체 용액을 MWCO=25,000g/mol인 투석막(Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)에 놓고 3일간 투석하였다. 그런 다음 정제된 KF 전구체를 동결건조하고, 나중에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
(5). SDS-PAGE 전기영동
KF 전구체의 형성을 확인하기 위하여, 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 모든 시료(KF-1, 3, 6)는 150V에서 90분 동안 4% 스태킹 및 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색된 전기영동 밴드와 함께 7% Tris 289 아크릴아미드 런닝 젤에서 실행되었다.
(6). KRT-FIB 하이드로겔(KFH 하이드로겔)의 제조
상이한 KRT 함량(KF-1, 3, 6)을 갖는 상응하는 KF 전구체(KF-1, 3, 6)를 사용하여 일련의 KRT-FIB 하이드로겔(KFH-1, 3, 6)을 제조하였다. 먼저, 각 KF 전구체 용액(20 mg/mL) 및 THR(5 IU/mL), CaCl2(2.5 mg/mL)을 준비하였다. KF 전구체 용액 2mL을 18G 니들(직경=1.3mm)이 있는 이중 챔버 주사기의 일측에 로드하고, THR 용액 0.1mL을 반대쪽에 로드하였다. 미리 채워진 주사기를 실온에서 천천히 유리판에 압출시켰다.
대조군으로 FIB 용액(20 mg/mL)으로 하기와 동일한 절차에 따라 FIB 결합 하이드로겔을 제조하였다. 주입 성능을 평가하기 위하여, 이중 챔버 주사기에 미리 채워진 KF 전구체 및 THR 용액을 DW와 유리판 위에 주입시켰다.
(7). 팽윤율 측정
중량 변화를 통해 KFH-3와 FIB-H 하이드로겔의 팽윤율(swelling ratio)을 평가하였다. 먼저, 원기둥 모양의 하이드로겔 시료(직경 x 높이 = 5 x 2mm)을 준비하고, 공기로 건조시켜 시료의 건조 중량(Wdry)을 측정하였다. 그런 다음 시료를 실온에서 탈이온수(DW)에 침지시키고, 습윤 시료의 무게(Wwet)를 일정한 온도에서 측정하였다.
모든 측정은 3회 수행하였으며, 팽윤율(%)을 하기의 식에 따라 계산하였다.
(8). 세포 배양
1차 인간 치은 섬유아세포(HGF) 세포는 ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 세포를 폴리-L-라이신이 코팅된 플라스크(ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA, USA))에서 2%(v/v) 소 태아 혈청, 섬유아세포 성장 보충제 및 페니실린(100U/ml)-스트렙토마이신(100μg/ml)이 보충된 섬유아세포 배지(FM)에서 증식시켰다.
5% CO2와 함께 37°C의 가습 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 배양 배지는 2일마다 교체하였다. 4~7 계대의 HGF를 실험에 사용하였다.
(9). 세포 캡슐화
피브리노겐 하이드로겔을 대조군으로 사용하여 HGF의 캡슐화 시험으로 KFH 하이드로겔의 생체 적합성을 평가하였다. 간단히 말해서, HGF 세포는 5×105 cells/mL 밀도의 배지 용액에 현탁되었다.
그런 다음 세포 현탁액(200μL)을 동일 부피의 피브리노겐 용액 또는 THR이 있는 KRT-FIB 용액에 혼합하였다. 겔 형성 후 2%(v/v) 소 태아 혈청, 섬유아세포 성장 보충제 및 페니실린(100U/ml)-스트렙토마이신(100μg/ml)을 첨가하였다. 그런 다음, HGF가 내장된 하이드로겔을 가공될 때까지 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2로 유지시켰다.
(10). 세포 생존력
Live/dead 분석을 사용하여 캡슐화된 HDF 세포의 생존 가능성을 조사하기 위하여 Live/dead assay가 사용되었다. 시료의 캡슐화 직후 및 3일 후 배양후의 시료를 37℃에서 30분 동안 calcein-AM/ethidium homodimer 용액에서 배양하였다.
calcein-AM/ethidium homodimer Live/dead assay를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 생존력을 정량화하였다. 세포 형태는 형광 현미경(IX71; Olympus Life Life Science; Tokyo, Japan)을 사용하였다.
(11). 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)
HDF 세포를 지혈성 생체물질에 접종하였다. 3일 배양 후 캡슐화 세포를 고정하고, rhodamine-phalloidin (Invitrogen) 및 2-(4-아미디노페닐)-1H 인돌-6-카르복사미딘(DAPI)으로 염색하여 F-액틴 필라멘트와 세포 핵을 각각 시각화하였다.
Airyscan 2(Carl Zeiss, Jena, Germany)와 함께 LSM 980을 사용하여 형광 이미지를 얻었다. 40x 대물렌즈와 슬라이스 두께 및 총 두께 205μm를 가진 침지 렌즈로 imaging setup을 측정하였다.
형광 방출 강도를 사용하여 전체 부피의 하이드로겔 이미지를 얻고, 이미지 가공 소프트웨어((ZEN black software, Germany)를 사용하여 3D 볼륨으로 결합시켰다.
(12). 통계 분석
통계 분석은 유의성을 위한 Tukey’s post-hoc analysis와 함께 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 수행되었다. 0.05보다 작은 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 레올로지 및 이미지 분석을 위하여, Origin(Origin Software, San Diego, CA)에서 통계적 유의성을 분석하였다.
2. 실험 결과
(1). KRT-FIB 전구체(KFs)의 합성
케라틴(KRT)과 피브리노겐(FIB)은 모두 친수성 단백질이지만, 트롬빈(THR)의 존재하에서 균질한 하이드로겔에 통합될 수 없다. 이러한 도전에 답하기 위하여, 공유 결합된 KRT-FIB 전구체(KF 전구체)가 손쉬운 커플링 반응으로 합성된다.
인모 유래의 KRT 단백질은 말단 작용기로서 카르복실산을 도입하기 위하여 먼저 석시닐화되어 도입된다. 생성된 KRT-COOH의 카르복실기는 EDC/NHS 반응을 통해 FIB 상의 아민기에 대한 결합을 가능하게 하다.
KRT 및 FIB의 다양한 몰비로 일련의 KF 전구체가 제조되었고, 1:1, 3:1 및 6:1 몰비의 KRT:FIB인 KF-1, KF-3 및 KF-6으로 약칭된다.
이러한 KRT 및 FIB의 직접적인 결합은 상 분리 없이 잘 정의된 KRT-FIB 하이드로겔(KFH 하이드로겔)을 용이하게 하다. SDS-PAGE는 반응하는 동안 KT 전구체의 분자량 변화를 연구하기 위해 수행되었다(도 2의 b 참조).
40 kDa 미만의 KRT 단백질은 FIB의 젤과 밴드에 나타나지 않고, 350 kDa에서 나타난다. 결합(conjugation) 후, KRT의 분자량은 크게 증가하고 KT 전구체에 해당하는 두꺼운 밴드가 350 kDa보다 높게 위치하다. 500 kDa보다 큰 전구체는 폴리아크릴아마이드 겔을 통과할 수 없고, 스태킹 겔 상단에 위치하는데, 이는 500kDa보다 큰 분자량을 갖는 KF 전구체가 형성됨을 의미한다.
또한, KRT 결합의 효과는 열중량 분석(TGA)을 사용하는 열적 특성으로 평가된다. 도 2c는 대조군으로 KRT 및 FIB 단백질과 대비되는 가열에 따른 KF 전구체의 중량 손실에 대한 TGA 데이터를 보여준다.
KF 전구체의 경우 주요 중량 손실은 259℃에서 시작하였다. 상기 온도는 KRT 단백질(266℃)보다 낮지만, FIB 단백질(202℃, 첫 번째 곡선)보다는 높은데, 이는 KRT 도입에 의해 하이드로겔 형성을 위한 FIB의 열 안정성이 향상됨을 의미한다.
(2). KRT-FIB 하이드로겔의 제조 및 유변학적 연구
겔화율은 주사용 하이드로겔의 중요한 매개변수이다. 느린 겔화는 비표적 부위에 전구체의 측면 퍼짐을 유발하는 반면에, 빠른 겔화는 주사기의 엉킴 형성으로 인해 니들을 막게 된다.
고효율과 함께 빠른 겔화를 입증하기 위하여, KRT-FIB 하이드로겔(KFH 하이드로겔)이 THR 유도 가교를 통해 제조된다(도 3a 참조). THR 존재시, 피브리노펩티드 A/B의 절단에 의해 FIB 단백질이 피브린 단량체로 분해된다.
피브린 단량체 상에 존재하는 α 사슬의 N-말단 단편("knobs"로 알려짐)은 β/γ 사슬의 상보적인 C-말단("hole"로 알려짐)과 결합하고, 피브린 단량체는 분자간 상호작용을 통해 중합된다. 이러한 THR 매개 knob-hole의 상호작용을 통하여 피브린 폴리머에 의해 가교된 KFH 하이드로겔의 3D 네트워크 구조가 가능해 진다(도 3b 참조).
다양한 KRT:FIB 몰비를 갖는 일련의 KFH 하이드로겔이 제조된다(도 3c 참조). 5unit/mL의 THR의 존재시, KRT-FIB 전구체의 겔화가 자발적으로 발생하여 1분 이내에 완료된다.
임상적으로 허용되는 주입 성능을 달성하기 위하여. 하이드로겔은 다음과 같은 임상 생리학적 특성을 고려하여 설계되어야 한다: 1) 전단 박화 거동(shear-thinning behavior); 2) 변형에 저항할 수 있는 충분한 강도; 3) 상응하는 손실 계수 G”보다 더 높은 저장 모듈러스 G'.
주사 가능한 응용 분야에 대한 이러한 기계적 특성을 확인하기 위하여, 171 KF 결합 하이드로겔(KFH-1, 3, 6)의 유변학적 측정이 수행된다. 첫째, KFH 하이드로겔의 복소 점도(complex viscosity)의 변화가 37℃에서 진동 주파수 스윕(oscillatory frequency sweep)으로 측정된다(도 4의 a 참조).
복소 점도는 주사 가능한 플랫폼의 설계에서 고려해야 할 중요한 매개변수이다. 주입하는 동안 전단 응력의 변화에 반응할 뿐만 아니라, 주입 후 조직 내 변형에 저항하는 하이드로겔의 능력을 측정하기 때문이다.
도 4의 a에 도시된 바와 같이, 하이드로겔은 주파수 스윕이 증가함에 따라 복소 점도가 지속적으로 감소함을 보여주는데, 이는 전단박화 점탄 거동(shear-thinning viscoelastic behavior)을 나타낸다. 또한, KFH 하이드로겔의 복소 점도는 FIB에 대한 KRT의 몰비가 증가함에 따라 점차적으로 증가하다. 이 결과는 KF 하이드로겔이 니들 압출을 통한 주입에 적합하고, 점도가 KRT 함량에 의해 조절될 수 있음을 보여준다.
탄성 및 점성 거동을 좀 더 연구하기 위하여, 주파수 의존성 저장(G') 및 KF 하이드로겔의 손실 모듈러스(G")를 검사하였다(도 4의 b-d 참조). 상수 G' 및 G" 값, 및 낮은 tan δ(G”/G'의 비율, tan δ <1)는 KFH 하이드로겔의 겔과 같은 거동을 나타냈다.
G' 값이 강성이 증가함에 따라 KRT 함량에 비례하기 때문에, KF-3 전구체(KRT:FIB의 몰비 = 3:1)로 제작된 KFH-3 하이드로겔이 선택되어 추가적인 연구에 사용된다.
이러한 유변학적 결과는 주사 가능한 플랫폼으로서 KFH 하이드로겔의 큰 잠재력을 시사하다.
(3). KFH-3의 주입 성능 및 팽윤 거동
KFH 하이드로겔의 주입 성능(injectable performance)을 알아보기 위하여, 압출 실험을 수행하였다. KF-3 전구체와 THR 용액이 채워진 이중 챔버 주사기를 손으로 천천히 DW와 유리판에 압출시켰다(도 5의 a 참조).
KFH-3 하이드로겔은 18G 니들을 통해 부드럽게 통과하여, 즉시 젤 같은 구조를 유지하다. 이러한 우수한 주입 성능은 KFH 하이드로겔이 불규칙한 결함의 충전을 용이하게 함을 의미한다.
도 5의 a에서 볼 수 있듯이, 잘 정의된 하이드로겔은 물에 용해되지 않고 팽윤된다.
동적 팽창 역학을 입증하기 위해 KFH-3 및 FIB-H 하이드로겔을 물에 24시간 동안 침지시켜 중량 변화를 분석하였다(도 5의 b 참조). KFH-3 하이드로겔의 팽윤율은 FIB-H 하이드로겔보다 거의 6배 이상 높은데, 이는 하이드로겔의 팽윤율이 KRT의 도입으로 크게 개선됨을 의미한다.
이러한 하이드로겔의 수분 흡수능과 팽윤 동역학은 다공성에 의해 조절될 수 있다. SEM 이미지는 비다공성 FIB-H에 비하야, KFH는 직경이 10-100 μm인 고 다공성 구조(>95% 공극율)를 가지고 있음을 보여준다(도 5 참조). 이러한 결과는 KFH 하이드로겔의 팽윤율이 하이드로겔의 다공성 형태에 크게 의존함을 의미한다.
(4). 케라틴 결합 피브린 하이드로겔의 세포독성 연구에 있어서의 HGF 생존력 및 케라틴 결합 피브린 하이드로겔의 3D 세포 캡슐화
다공성은 또한 조직 재생을 위한 하이드로겔의 중요한 특성 중 하나이다. 다공성 하이드로겔은 세포 성장과 혈관 형성에 필요한 공간을 제공하다. 상호 연결된 경로를 통한 효율적인 영양소와 산소의 수송은 세포 증식, 이동 및 세포-세포 접촉 비율을 촉진한다.
세포 부착 및 증식의 세포독성 분석은 LIVE/DEAD assay에 의해 인간 치은 섬유아세포(HGF)를 이용하여 연구되었고, 상기 제조된 하이드로겔이 무독성임을 확인하였다. 또한, 본 발명들은 HGF가 캡슐화된 KFH 하이드로겔에서 증식하고 분산되는 형태를 보이는 것을 관찰하였다.
HGF 세포를 사용한 팔로이딘(phalloidin) 염색의 세포 상호작용 연구는 생물학적 유체의 상당한 자유 흐름과 세포 이동 및 KFH 하이드로겔 내부의 성장을 입증하였다.
고유의 상호 연결된 다공성 구조를 갖는 KFH-3 하이드로겔은 고 세포증식, 세포 생존력을 나타낸 반면에 비다공성 FIB-H 하이드로겔은 KFH-3 히드로겔보다 더 낮은 세포 적합성을 나타내었고(도 6의 f 참조), FIB-H 하이드로겔에서 분산(spreading) 감소가 관찰되었다(도 6의 e 참조).
특히, 10μm 미만의 작은 기공을 가지는 하이드로겔은 세포 이동과 영양소 확산을 제한하기 때문에 조직 공학의 적용에 바람직하지 않다. 따라서, FIB-H는 작은 기공과 큰 불균일을 기지며, 각 표면 면적이 달라진다. 배양 3일 후, 케라틴이 있는 하이드로겔의 생세포 밀도도 케라틴이 없는 하이드로겔보다 높았다(도 6의 a-d 참조). 그 결과, KFH-3 하이드로겔은 FIB-H 하이드로겔에 비하여 세포 증식 유도, 부착 면적이 유도되었다(도 6의 b, d 참조).
본 발명에서 개발된 하이드로겔은 시험관 내 3D 환경에 요구되는 다공성과 미세 구조를 가지며, 생물학적 유체의 자유로운 흐름 및 물질 내부의 세포 이동과 성장을 가능하게 한다.
3. 결론
본 발명에서 개발된 주사용 KFH 하이드로겔의 특징은 케라틴의 가교 밀도에 따라 다공성과 점도를 조절하여 직접 환자의 상처에 주입할 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명자들은 HGF 캡슐화를 위하여 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔 및 주사 가능한 주사기와 결합된 치료 수단을 사용하여 조직 재생을 촉진할 수 있는 가능성을 보여주었다.
게다가, 본 발명자들은 HGF가 증식하고 캡슐화된 KFH 하이드로겔의 확산 형태를 나타내는 것을 관찰하였다. 이는 KRT-FIB 가교에 의해 제조된 KFH 하이드로겔의 세포 적합성이 개선될 수 있음을 의미한다.
결론적으로, 본 신규 케라틴 결합 하이드로겔의 생화학적 및 기계적 특성이 의약 및 생물공학 분야에의 응용 가능성을 시사하는 수많은 연구에 사용될 것이다
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (12)
- 케라틴과 피브리노겐이 결합되어 있는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔.
- 제1항에 있어서, 상기 케라틴은 인모 유래인 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔.
- 제1항에 있어서, 상기 케라틴과 피브리노겐이 2~4 : 1의 몰비로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔.
- 제3항에 있어서, 상기 케라틴과 피브리노겐이 3 : 1의 몰비로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔.
- 제1항에 있어서, 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 주사가 가능한 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔.
- 제1항에 있어서, 상기 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔은 조직 재생을 가속화하는 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔.
- 제6항에 있어서, 상기 조직은 구강 조직인 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔.
- (a) 케라틴에 무수 숙신산을 적가하여 카르복실화 케라틴을 제조하는 단계;
(b) 상기 카르복실화 케라틴에 피브리노겐을 첨가하고, 카르보디이미드/N-히드록시숙신이미드의 존재하에 커플링 반응시켜 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액을 니들이 있는 이중 챔버 주사기의 일측에 채우고, 트롬빈 용액을 상기 니들이 있는 이중 챔버 주사기의 반대쪽에 채운 후, 상기 케란틴 결합 피브리노겐 전구체 용액 및 트롬빈 용액이 채워진 주사기를 실온에서 천천히 유리판에 압출시키는 단계를 포함하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계에서, 상기 카르복실화 케라틴 : 상기 피브리노겐이 2~4 : 1의 몰비가 되도록 상기 피브리노겐을 첨가하는 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 카르복실화 케라틴 : 상기 피브리노겐이 3 : 1의 몰비가 되도록 상기 피브리노겐을 첨가하는 것을 특징으로 하는 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 포함하는 조직 재생용 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 케라틴 결합 피브리노겐 하이드로겔을 손상된 조직에 주입하는 단계를 포함하는 조직 재생방법.
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| KR20110097728A (ko) | 2010-02-25 | 2011-08-31 | 경북대학교병원 | 생분해성 합성고분자와 공중합을 통한 세포주사형 하이드로겔 및 이의 제조방법 |
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2021
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