KR102618226B1 - 의학 용도를 갖는 신규한 하이알루론산계 하이드로겔 - Google Patents

의학 용도를 갖는 신규한 하이알루론산계 하이드로겔 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서 상처 및 다른 상황에서 인시추 겔화를 위한 신규한 하이알루론산계 물질이 제공되며, 이 물질은 생체 적합성이며, 바람직한 겔화 동력학을 가진다. 얻어진 하이드로겔은 바람직한 유동학적 특성을 가진다. 본 발명은 의학적 적용을 위한 바람직한 동력학을 가지며, 바람직하고, 조정 가능한 물리적 특성을 갖는 가교된 하이알루론산 하이드로겔을 형성하기 위한 신규한 시약을 포함한다. 또한 본 명세서에서 상처 치유 및 다른 의학적 상황에서 본 명세서에 개시된 신규한 물질을 이용하는 방법이 제시된다.

Description

의학 용도를 갖는 신규한 하이알루론산계 하이드로겔{NOVEL HYALURONIC ACID-BASED HYDROGELS HAVING MEDICAL APPLICATIONS}
우선권 적용에 관한 언급:
본 출원은 2015년 6월 11일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/174,171호(발명의 명칭: Novel Hyaluronic Acid-based Hydrogels Having Medical Applications)에 대한 우선권의 유익을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인시추(in situ) 겔화될 수 있는 중합체-기반 시스템은 기관, 결합 조직, 근육, 힘줄 및 막의 수술적 또는 외상적 혼란을 치료함에 있어서 잠재적으로 유용하다. 더 나은 상처 치유를 위한 조직 접근(tissue approximation)을 달성하기 위해 내부 상처(예를 들어, 바늘 구멍, 괴사 공간, 관절염 구멍)를 효과적으로 밀봉 또는 봉합할 수 있는 주사용 물질이 바람직할 수 있다. 이러한 시스템은 5가지 중대한 필요조건: 안전성, 효능, 유용성, 비용, 및 규제 승인을 충족하여야 한다. 특히, 그들은 기저 조직, 생체적합성 및 생분해성 및 보관 안정성을 갖는 적절한 부착을 나타내어야 한다. 입수 가능한 미국 FDA-승인 물질 중에서, 하이알루론산(HA)은 중요한 역할을 한다. 살아있는 유기체에 존재하는 HA는 세포외 및 세포주위 기질에서 주로 발견되며, 고도로 수화되고, 생체적합성이며, 비면역원성이다. 이들 특징은 천연 효소(하이알루로니다제)에 의한 그의 분해 능력에 따라, 재생 의약에서 그것을 기질 성분 또는 점성-보충 요소로서 잠재적으로 유용하게 만든다.
주사 가능한 HA계 물질은 임의의 형상의 결함 내로 충전되고, 인시추로 가교될 수 있다. 공지된 가교 가능한 HA 물질은 천연 조직에 대한 양호한 접착을 나타내어, 양호한 물리화학적 맞물림 및 점착성 중합체-조직 계면을 얻는다. 하기와 같은 인시추 겔화 가능한 HA계 물질을 설계하기 위해 다수의 화학이 사용되었다: 아민과 알데하이드 기 사이의 시프(Schiff) 반응(예를 들어, 문헌[Tan, H., et al., Controlled gelation and degradation rates of injectable hyaluronic acid-based hydrogels through a double crosslinking strategy. J Tissue Eng Regen Med, 2011. 5(10): p. 790-7]에 기재된 바와 같음); 티올과 다이아크릴레이트 또는 다른 마이클-유형 억셉터(Michael-type acceptor) 간의 마이클-유형 첨가(예를 들어, 문헌 문헌[Dong, Y., et al., Thermoresponsive hyperbranched copolymer with multi acrylate functionality for in situ cross-linkable hyaluronic acid composite semi-IPN hydrogel. J Mater Sci Mater Med, 2012. 23(1): p. 25-35]에 기재된 바와 같음); 할로아세테이트에 대한 친핵성 치환(예를 들어 문헌[Serban, M.A. and G.D. Prestwich, Synthesis of hyaluronan haloacetates and biology of novel cross-linker-free synthetic extracellular matrix hydrogels. Biomacromolecules, 2007. 8(9): p. 2821-8]에 기재된 바와 같음); 이황화 브릿지의 형성(예를 들어, 문헌[Shu, X.Z., et al., Disulfide-crosslinked hyaluronan-gelatin hydrogel films: a covalent mimic of the extracellular matrix for in vitro cell growth. Biomaterials, 2003. 24(21): p. 3825-34]에 기재된 바와 같음); (메트)아크릴 잔기에 대한 유리 라디칼 광중합(예를 들어, 문헌[Park, Y.D., N. Tirelli, and J.A. Hubbell, Photopolymerized hyaluronic acid-based hydrogels and interpenetrating networks. Biomaterials, 2003. 24(6): p. 893-900]에 기재된 바와 같음); 아자이드와 알킨 사이의 호이겐스(Huygens) "클릭(click)" 반응; 및 카테콜로의 효소적 산화 후에 자발적으로 가교되는 페놀(티라민)(예를 들어, 문헌[Jin, R., et al., Enzyme-mediated fast in situ formation of hydrogels from dextran-tyramine conjugates. Biomaterials, 2007. 28(18): p. 2791-800]에 기재된 바와 같음).
앞서 공지된 가교 기질은 연골 대체 및 수술 후 문제의 방지로부터 생체치료의 제어된 방출까지의 다양한 방법으로 사용되었다. 이들 앞서 공지된 변형은 일반적으로 하이알루로니다제에 대한 HA 민감성을 보존하며, 따라서, 하이드로겔의 효소-매개 분해를 허용한다. 그러나, 이들 앞서 개발한 반응 물질의 겔화 동력학 및 생체적합성은 최적이 아니다. 일부 예에서, 공지된 HA 변형 및 시약은 일부 세포독성을 나타내었다. 공지된 조성물에 의한 다른 문제는 동력학에 의해 제시되되, 일부 경우에 겔화가 일어나기 전에 표적 공간의 적절한 충전을 가능하게 하기에 겔화가 너무 빠르게 진행된다. 겔화 속도는 원칙적으로 중합체 전구체의 양 및/또는 가교제 농도에 대한 작용에 의해 제어될 수 있다. 그러나, 이는 얻어진 겔의 기계적 특성에 유해하게 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 그의 치료적 값에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 더 균일한 가교 및 구멍 충전을 가능하게 하기 위해 더 느린 동력학으로 저항성 겔을 형성할 수 있고, 생물의학적 용도에 이상적인 HA계 인시추 겔화 시스템에 대한 당업계의 지속적 필요가 남아있다.
본 명세서에서 상처 및 다른 상황에서 인시추 겔화를 위한 신규한 HA계 물질이 제공되며, 이 물질은 생체 적합성이며, 바람직한 겔화 동력학을 가진다. 얻어진 하이드로겔은 바람직한 유동학적 특성을 가진다. 본 발명은 의학적 적용을 위한 바람직한 동력학을 가지며, 바람직하고, 조정 가능한 물리적 특성을 갖는 가교된 HA 하이드로겔을 형성하기 위한 신규한 시약을 포함한다. 또한 본 명세서에서 상처 치유 및 다른 의학적 상황에서 본 명세서에 개시된 신규한 물질을 이용하는 방법이 제시된다.
본 명세서에서 상처 및 다른 상황에서 인시추 겔화를 위한 신규한 하이알루론산계 물질이 제공되며, 이 물질은 생체 적합성이며, 바람직한 겔화 동력학을 가진다. 얻어진 하이드로겔은 바람직한 유동학적 특성을 가진다.
본 발명은 의학적 적용을 위한 바람직한 동력학을 가지며, 바람직하고, 조정 가능한 물리적 특성을 갖는 가교된 하이알루론산 하이드로겔을 형성하기 위한 신규한 시약을 포함한다. 또한 본 명세서에서 상처 치유 및 다른 의학적 상황에서 본 명세서에 개시된 신규한 물질을 이용하는 방법이 제시된다.
도 1. 도 1은 CBT와 D-Cys 사이의 액상 "클릭" 반응을 도시한다. 점선은 하이알루론산 중합체 골격을 나타낸다.
도 2A, 도 2B 및 도 2C. 도 2A는 HA-CBT와 HA-D-Cys 접합체(둘 다 표준 식염수 용액 중에서 2%)의 등몰(5% ㏖) 조합물을 혼합하는 것에 의해 얻어지는 겔의 동력학 진동 유동학적 특성규명을 도시한 도면. 도 B는 겔의 동력학 진동 유동학적 특성 규명을 도시한 도면. 도 2C는 전단 속도의 함수로서 겔의 정상 상태 전단 점성률을 도시한 도면.
도 3. 도 3은 HA 또는 HA-접합체와 함께 인큐베이션 후에 인간 상피 케라틴세포의 생존도를 도시한 도면. HA(막힌 정사각형), HA-CBT(막힌 원) 및 HA-D-Cys(막힌 삼각형). 오차막대는 n=6에 대해 평균 ± SD를 나타낸다.
도 4. 도 4는 48시간에 걸쳐 단백질-부하 겔로부터의 BSA 및 IgG 방출을 도시한 도면.
제1 양상에서, 본 발명의 범주는 HA계 겔화 가능한 시스템을 포함한다. 일 양상에서, 본 발명은 작용화된 중합체의 두 상보성 용액을 이용하여 공간(예컨대 상처 또는 주형) 내에서 하이드로겔을 생성하는 방법을 포함하되, 얻어진 하이드로겔은 공간을 적절하게 충전하도록 허용하는 바람직한 동력학으로 형성되고, 얻어진 하이드로겔은 공간의 경계를 따르며, 지속 가능하고, 생체 적합하며, 분해 가능하다. 다른 양상에서, 본 발명은 2개의 용기 또는 구획을 포함하는 키트를 포함하되, 2개의 용기 또는 구획은, 혼합될 때, 바람직한 동력학을 갖는 의학적으로 유용한 하이드로겔을 생성하는 작용화된 중합체의 용액을 보유한다. 다른 양상에서, 본 발명의 범주는 작용화된 중합체의 두 상보적 용액을 이용하는 외부 또는 내부 상처의 치유를 포함하되, 혼합된 용액은 바람직한 동력학을 갖는 이러한 형성에 의해 의학적으로 유용한 하이드로겔을 형성할 것이다. 다른 양상에서, 본 발명의 범주는 한 쌍의 용액을 이용하는 의약을 제조하는 방법을 포함하며, 각각의 용액은 상보성 작용화된 중합체를 포함하고, 용액의 상기 쌍은 혼합될 때 하이드로겔을 형성할 것이다. 본 발명의 인시추 겔화 가능한 시스템은 다음과 같은 다양한 성분을 포함한다.
골격 중합체. 본 명세서에 기재된 조성물, 키트 및 방법은 혼합될 때 의학적으로 유용한 하이드로겔을 생성하는 작용화된 중합체의 두 용액의 용도를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시형태는 작용화된 HA 중합체를 포함한다. 본 발명의 조성물에서 이용된 HA 중합체는 임의의 분자량, 예를 들어 10 내지 2,500kDa의 HA 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 HA 중합체는 분자량이 200 내지 300kDa, 예를 들어 분자량이 250kDa인 HA 중합체를 포함한다.
본 발명의 범주는 HA 대신 사용될 수 있는 상이한 중합체, 예를 들어, 천연 중합체, 예컨대 수용성 변형 및 비변형 다당류, 예컨대 키틴 및 키토산, 알긴산염, 전분, 덱스트란 및 펙틴을 추가로 포함한다. 추가적으로, 합성 중합체, 예를 들어 폴리HPMA, "클릭 가능한(click-able)" 모이어티의 결합을 허용하는 다른 중합체와 공중합된 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드), 폴리(N,N-다이에틸아크릴아마이드), 폴리(N-비닐카프롤락탐), 클릭 가능한 모이어티의 결합을 허용하는 공중합된 폴리(에틸렌 글리콜)가 HA 대신에 사용될 수 있다.
본 발명의 작용화된 중합체는 단분산, 실질적으로 균일한 중합체를 포함할 수 있거나, 또는 다분산, 혼합된 분자량 중합체를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 상보성 용액은 동일한 중합체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상보성 용액은 각각 상이한 중합체 종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체 용액은 작용화된 중합체(예를 들어, 용액 중에서 2 이상의 중합체)의 균일한 혼합물을 포함한다.
가교 화학. 본 발명의 하이드로겔은 상보성 반응성 기를 갖는 중합체의 2개의 별개의 세트를 작용화시킴으로써, 그리고 후속적으로 반응성 기가 축합을 야기하는 조건하에서 작용화된 중합체의 두 세트를 혼합하고, 중합체를 가교시키며, 하이드로겔을 생성함으로써 제조된다. 본 발명의 가교 반응성 기는 바람직하고 조정 가능한 반응 동력학을 갖는 생리적 조건 하에서 용이하게 결합을 형성할 수 있고, 생리적으로 적합한 겔을 형성하는 상보성 "클릭 화학"의 다양한 쌍을 포함한다. HA 중합체는, 예를 들어, 글루쿠론산 및 N-아세틸-글루코사민의 교번의 단위로 이루어지며, 각각의 글루쿠론산 단위는 반응성 기가 접합될 수 있는 하나의 카복실산기를 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 이용되는 상보성 가교 반응성 기는 사이아노벤조티아졸(CBT) 및 D-시스테인(D-Cys)이다. 이들 두 모이어티 사이의 클릭 반응은 다른 내용으로부터 당업계에 공지되어 있으며, 반딧불이에서의 빛-생성 메커니즘에서 어떤 역할을 한다. 유리하게는, CBT 및 D-Cys 축합 반응은 세포독성 또는 자극 부산물의 형성을 회피한다. L-시스테인은 D-시스테인으로 치환될 수 있다.
CBT 및 D-Cys 모이어티의 다양한 변형 또는 치환은 당업계에 공지된 바와 같이 이루어질 수 있다. 예를 들어, CBT-모방체는 CBT 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 나이트릴(R-CN)은 시스테인과 반응하여 다이하이드로-티아졸 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 공유 결합을 통해 처음 연결된 나이트릴기는(나이트릴은 또한 벤조나이트릴에서와 같이 벤젠 고리와 같은 중합체 상에 공유 결합된 모이어티 상의 치환체 일 수 있음) D-Cys 접합 중합체와 반응하여(여기서 D-Cys은 공유 결합을 통해 중합체에 연결됨), 다이하이드로-티아졸 결합을 형성할 수 있다. 주목할 만한 예는 벤조나이트릴 및 사이아노티아졸이고, 후자는 티아졸에 융합된 벤젠 고리 없이 CBT와 동일한 테터를 형성한다.
D-Cys의 -SH 또는 -NH2 기 중 하나와 반응하는 분자를 포함하는 D-Cys와 반응하는 비-CBT 모방체가 또한 CBT 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 유리 -SH(티올)기는 이황화 결합을 형성하는 D-Cys의 -SH기와 반응할 수 있다. 그러나, 이 결합은 환원 및 알칼리성 조건에서 용이하게 가수분해된다. 또한, 알켄 모이어티는 소위 "마이클 티올렌" 첨가를 통해 -SH와 반응성이다. 더 나아가, D-Cys의 -SH (티올)기는 -COOH(카복실)와 반응되어 티오에스터 결합을 형성할 수 있다. 마찬가지로, -SH기는 할로겐화알킬(예를 들어, 다이브로모/다이클로로 에탄)과 반응하여 티오에터 결합을 형성한다. D-Cys의 유리-NH2(아미노) 기는 또한 다양한 기와 반응할 수 있다: 당업계에 공지된 바와 같이 카복실(아마이드 결합을 형성하기 위함), 알데하이드(이민 결합을 형성하기 위함, 후속적 환원에 의해 2차 아민으로 전환됨), 케톤(이민 결합, 후속적 환원에 의해 3차 아민 결합으로 전환됨), 할로겐화 알킬(2차 아민 결합을 형성하기 위함).
또한 CBT와 반응할 D-Cys의 모방체가 반응성 기로서 사용될 수 있다. D-Cys 모방체는 (3R)-3-아미노-4-설파닐부탄산, (4R)-4-아미노-5-설파닐펜탄산 및 당업계에 공지된 다른 것을 포함한다.
하이드로겔의 유동학적 특성. 상처-충전 및 유사한 적용에서 유용하게 되도록, 본 발명의 하이드로겔은 피하 압력을 견뎌 내기에 충분한 기계적 강도를 가져야 하는 한편, 환자에 대한 손상을 피하고, 편안하게 되도록, 주위 조직에 의해 이동하고 변형되기에 충분히 가요성이어야 한다. 일반적인, 상처 충전을 위한 바람직한 하이드로겔은 유동학적 특징을 가질 것이되, G'(물질의 탄성 또는 고체-유사 반응을 설명하는 저장 탄성률)은 G"(물질의 점성- 또는 액체-유사 반응을 기재한 손실 탄성률)보다 더 높다. 일부 실시형태에서, G"보다 10배 내지 102배인 G'이 바람직하다. 추가로, 체내 적용을 위해, 전단박화 특성(점성도가 전단속도에 따라 감소됨)을 갖는 하이드로겔이 바람직하고, 따라서, 겔이 이동하는 경계를 갖는 공간 내에 위치될 때, 겔은 더 부드러워지며, 경계의 이동은 더 빠르게 되어, 따라서 경계가 이동할 수 있게 한다. 의학적으로 사용되는 하이드로겔은 또한 경계의 움직임이 감소될 때 그의 탄성 특성을 바람직하게 회복할 것이다. 따라서, 더 일반적으로는, 그의 점성이 전단 속도에 의해 이상적인 히스테리시스(hysteresis) 주기를 겪게 되어야 한다. 또한 시간 및 기계적 자극에 따라 그의 G' 및 G" 비를 유지하여야 하며, 즉, 분해되지 않아야 한다.
반응 동력학. 가교 반응의 동력학은 하이드로겔의 의학적 적용에서 매우 중요하다. 상처 치유에서, 구멍, 틈 및 다른 공동, 예컨대 수술적 절개, 괴사성 또는 절개된 병변 및 관절염 공동을 충전하기 위한 생체 적합성 하이드로겔의 형성이 바람직하다. 이전에 공지된 HA계 하이드로겔은 고도 반응성 기를 이용하여 형성되고, 이러한 물질에 의해 얻은 하이드로겔은 종종 중합체 혼합물이 표적 공동의 복잡한 형상을 충전시키기에 너무 빠르게 형성되는 한편, 겔화가 일어난다. 그러나, 본 발명의 신규한 하이드로겔 조성물은 유리하게는 온화한 반응 동력학을 가지며, 즉, 겔화는 너무 빠르게 일어나지 않아서 액체 전구체 용액이 실제 상처의 복잡하고 불규칙적인 기하학적 구조를 침윤하는 것을 허용하되, 그들은 표적 공간에 정확하게 맞는 강한 하이드로겔을 서서히 형성하고, 예를 들어, 겔화는 생리적 조건(예를 들어, 37℃에서 pH 7.4) 하에서 15 내지 45분에, 예를 들어 30분에 완료된다.
하이드로겔 형성의 겔화 동력학은 HA 중합체 골격에 대한 현수 반응성 기의 양을 달리함으로써 조정될 수 있다. 예를 들어, (HA 상의 카복실기의 몰농도 양에 비해) 0.5 내지 6.5% 몰 사이에서 작용화된 HA 중합체가 사용될 수 있고, 몰 백분율 또는 몰 비율은 반응성 기에 의해 변형된 HA의 카복실산의 백분율이다. 예를 들어, 약 5% 몰 반응성 기로 작용화된 HA 중합체가 사용될 수 있다. CBT에 의해 HA 카복실의 포화가 증가됨에 따라, CBT의 소수성 특성에 기인하여 중합체는 덜 가용성이 된다. 6.5 내지 7% 초과의 CBT인 중합체는 불용성이 되며, 하이드로겔의 형성에 적합하지 않다. HA-CBT를 더 친수성으로 변형시키기 보다는, 반응성 모이어티의 더 큰 포화가 요망된다면, 더 친수성의 CBT 모방체 또는 치환체가 사용될 수 있다. D-Cys에 대해, 농도의 증가는 Cys-Cys 반응 정도를 증가시켜서, 안정하지 않은 이황화 결합을 형성한다. 따라서, 일부 실행에서, 10% 초과의 D-Cyst 농도는 바람직하지 않다.
CBT 모방체, CBT 치환 및 D-Cys의 변형된 형태는 CBT 및 D-Cys 대신에 이용될 수 있고, HA 중합체의 반응성 기 는 3가지 이상의 상이한 반응종의 혼합물을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일반적으로, HA 중합체 상의 반응성 기의 백분율은 겔화 과정 속도를 지시하며, 반응성 기에 의한 더 큰 포화는 더 큰 겔화를 잠재적으로 야기할 것이다. 그러나, 반응 동력학은 복잡하며, 비선형 방식으로 진행될 수 있다는 것이 이해된다. 마찬가지로, 상기 기재한 바와 같이, 얻어진 하이드로겔의 유동학적 특성은 반응성 기 포화도에 의해 영향 받으며, 포화가 더 클수록 더 뻣뻣한 겔을 야기한다.
하이드로겔의 형성. 상보성 반응 작용화된 중합체는 별개의 용액에서 유지되고, 저장될 수 있다. 중합체-반응성 기 접합체는 10 내지 150mM의 몰농도로 물, 생리식염수(normal saline)(예를 들어, 약 0.9% 식염수) 및 생리적으로 적합한 완충제, 예컨대 PBS 또는 다른 인산염 완충제 중에서 안정하다.
HA 접합체는 0.1 내지 10 중량%(% w/w), 예를 들어, 5% w/w의 농도에서 용액 중에서 존재할 수 있다. 일반적으로 더 농축된 용액은 빠르게 겔화하는 한편, 더 묽은 용액은 겔화를 위해 더 장시간의 기간을 필요로 하지만, 그러나 겔화의 복잡성은 이것이 항상 그렇지 않을 수도 있다는 것을 의미한다.
하이드로겔 형성 시, 작용화된 중합체의 두 상보성 용액은 혼합될 수 있으며, 이어서, 표적 용기, 주형, 표면 또는 공동에 적용될 수 있다. 일반적으로 바람직한 주사 전에 용액을 빠르게(예를 들어, 몇 초 내에) 사전 혼합하거나 또는 인시추 혼합을 막는 계면을 피하기 위해 표적 공간 내로 유동하는 것이 바람직할 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 두 용액을 별개로 저장할 수 있고, 사용자의 작동 시, 두 용액을 혼합된 상태로 제공할 수 있는 임의의 장치를 포함한다. 예를 들어, 상기 장치는 선택적으로 혼합 챔버 또는 혼합 디스펜서 팁을 갖는 이중 원통형 주사기를 포함할 수 있되, 상보성 작용화된 용액은 두개의 원통에서 별개로 저장되고, 후속적으로 혼합된 형태로 배출될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 제1 반응성 기로 작용화된 중합체의 제1 용액 및 제2 반응성 기로 작용화된 중합체의 제2 용액을 포함하는 키트를 포함하되, 제1 반응성 기와 제2 반응성 기는 서로 접촉될 때 결합을 형성할 수 있고, 예를 들어 제1 반응성 기 및 제2 반응성 기는 CBT 및 D-Cys를 포함한다.
하이드로겔 형성 동력학은 가교 결합 형성을 가속화시키기 위해 에너지의 공동 투여에 의해 변형될 수 있다. 겔화 동력학을 가속화시키기 위해 이용될 수 있는 예시적인 에너지 공급원은 전기, 기계, 음향 또는 열 에너지를 포함한다.
하이드로겔의 의학적 적용. 본 발명의 하이드로겔은 다양한 의학적 내용에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 실행에서, 본 발명의 범주는 국소로 적용되는 상처-봉합 아교로서 본 명세서에 기재된 하이드로겔의 용도를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 하이드로겔은, 예를 들어, 용액 중에서 반응성 기의 농도 또는 반응물 중합체의 농도를 증가시킴으로써 더 빠른 반응 동력학(예를 들어, 5 내지 15분에 완료되는 겔화)을 갖도록 조정될 수 있다. 다른 실행에서, 본 발명의 범주는 피하 상처 또는 다른 체내 공동, 예컨대 절단, 수술적 절개 등을 충전시키기 위한 본 명세서에 기재된 하이드로겔의 용도를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 반응물은 공동을 완전히 침윤시키기 위해 그리고 고형화 전에 이러한 공동의 복잡한 경계를 확인하기 위해 상보성 HA 중합체 혼합물의 가교를 허용하기 위하여 더 느린 속도로(예를 들어, 15 내지 45분에 완료됨) 겔로 전환될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 상처 또는 분해 조직에서 대체 연골로서 본 명세서에 기재된 하이드로겔의 용도를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은, 예를 들어 의학적 이식물, 세포 배양 스캐폴드 및 기타 물체에서 사용을 위해 정확한 형상 및 치수를 갖는 제조 물품을 생성하기 위한 주형 내에서의 본 발명의 하이드로겔의 형성을 포함한다.
본 명세서에 개시된 하이드로겔을 이용하는 방법은 인간, 예를 들어 상처 치유 또는 다른 치료가 필요한 인간 환자에게, 또는, 예를 들어 수의학 또는 연구와 관련하여 임의의 다른 동물 종에게 적용될 수 있다. 상기 방법은 또한 미생물, 세포 배양물 및 외식된 조직을 포함하는 생물학적 물질의 생체 밖 배양물에서 적용될 수 있다.
본 발명의 하이드로겔 전구체 용액은 얻어진 하이드로겔에 치료적 또는 다른 특성을 부여하기 위해 다양한 구성성분으로 보충될 수 있다. 예를 들어, 용액은 항생제, 마취약, 성장 인자, 비타민, 세포(예컨대, 치료적 줄기 세포), 펩타이드 및 단백질, 및 작은 약물-유사 분자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 HA 중합체의 반응성 기에 적합하도록, 즉, 반응성 기와 실질적으로 반응하지 않고, 겔화를 방해하지 않도록, 당업자에 의해 선택될 수 있다.
실시예
실시예 1. 다음은 이상적인 동력학을 갖는 생체 적합성 HA 하이드로겔 형성을 가능하게 하고, 얻어진 하이드로겔이 의학적 용도를 위한 바람직한 유동학적 특성을 갖는 것을 가능하게 하는 화학을 입증하는 본 발명의 예시적인 실행이다.
하이드로겔은 신규하고 유용한 하이드로겔을 형성하기 위해 사이아노벤조티아졸(CBT)에 의해 작용화된 HA 중합체와 D-시스테인(D-Cys) 사이의 "클릭" 반응에 의해 형성된다. 상기 반응은 반딧불이에서 일어나며, 빛-생성 효소 루시퍼라제에 대한 기질로서 작용하는 루시페린을 얻는다. 고전적인 아자이드-알킨 클릭 화학과 달리, 이 반응은 임의의 촉매를 필요로 하지 않으며, 생리적 조건 또는 일반적으로는 수성 완충제에서 일어나고, 양호한 동력학(2차 속도 상수 k2 ~ 9M-1s-1) 및 고수율을 특징으로 한다.
이 예에서, CBT-D-Cys "클릭" 반응을 사용하여 약학 동력학에 의한 인시추 가교를 통해 안정한 겔을 얻는 2상 HA계 시스템을 생성한다. 이를 위하여, 두 HA계 접합체를 생성하였는데, 하나는 CBT에 의해 작용화되고, 하나는 D-Cys에 의해 작용화된다. 겔화 동력학, 얻어진 겔의 유동학적 특성뿐만 아니라 충전 또는 상처-봉합 제형으로서 그의 적용 가능성을 평가하였다. 반응 시스템과 완전히 형성된 겔 둘 다에 대해 수행한 유동학적 분석은 졸/겔 전이(대략 30분)의 약한 동력학과 얻어진 3-D 그물망의 기계적 강도를 둘 다 확인하였다. 돼지 피부 샘플에 대한 다수의 시험을 또한 실행하였다. 2상 HA 혼합물의 주사 및 국소 적용을 수행하여 피하 겔 상 또는 다양한 피부층 전체적으로 확산된 가교 상을 형성하는 것에 대한 시스템의 능력을 평가하였다. 추가로, 혼합물을 모델 피부 상처에 적용하고 나서, 얻어진 실란트 필름의 강도를 결정하였다. 최종적으로, 접합체를 둘 다 상피 케라틴세포와 함께 인큐베이션하여 개시된 시스템의 안전성을 분석하였다. 결과는 시스템의 유효성과 안전성을 둘 다 강하게 뒷받침하였고, 다양한 생의학적 적용, 예컨대 피부 장애의 치료, 상처 치유 및 연골 대체를 위한 그의 능력을 나타낸다.
물질 및 방법. 하이알루론산(HA, MW = 250KDa)을 크리에이티브 PEG웍스(Creative PEGworks)(노스캐롤라이나주 윈스턴세일럼에 소재)로부터 획득하였다. D-시스테인, 6-아미노-2-사이아노-벤조티아졸(ACBT), 1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드 염산염(EDC), 1,2-다이아미노에탄 (DAE), 다이메틸설폭사이드(DMSO) 및 에탄올을 시그마 알드리치(미주리주 세인트 루이스에 소재)로부터 얻었다. MES 완충제, pH 4.5 및 덱스트란 탈염 칼럼(MWCO = 10kDa)을 피어스(Pierce)(일리노이주 락포드에 소재)로부터 얻었다. 완전한 두께의 돼지 피부를 램파이어 바이올로지컬 래버러토리즈(Lampire Biological Laboratories)(펜실베니아주 피퍼스빌에 소재)로부터 구입하고 나서, -80℃에서 저장하였다. 인간 성인 상피 케라틴세포(HEKa 세포) 및 세포 배양 물질을 라이프 테크놀로지즈(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재)로부터 획득하였다.
HA-CBT 및 HA-D-Cys 접합체의 합성 및 정제. 하이알루론산을 30분 동안 격렬한 교반 및 가열(60℃)을 통해 10㎎/㎖의 농도로 50:50 DMSO:밀리큐 워터(MilliQ water) 중에 초기에 용해시켰다. 용액을 두 분취액으로 분할하였는데, 이를 각각 CBT 및 D-Cys과 함께 접합을 위해 사용하였다. MES 완충제(pH 4.5) 중에 EDC의 5㎎/㎖ 용액을 첨가함으로써 제1 분취액을 활성화시켜, 6.5% 몰비의 EDC/카복실 기를 얻었다. 짧은 활성화 시간(2분) 후에, 60℃에서 사전가열한 DMSO 중의 CBT의 1㎎/㎖ 용액을 적가하여 CBT/카복실기의 6.5% 몰비를 얻었다. 반응을 60℃에서 격렬한 교반하에 밤새 진행시켰다. 제2 분취액을 EDC를 이용하여 유사하게 활성화시키고, 6.5% 몰비로 다이아미노에탄(DAE)과 밤새 반응시켰다. 얻어진 아미노화된 HA를 에탄올 중에서 침전시키고 나서, 따뜻한 초순수 물(45℃)에서 재용해시키고, 다시 EDC를 이용하여 활성화시키고 나서, 6.5% 몰비로 MES 완충제 중에서 1㎎/㎖의 D-시스테인과 밤새 격렬한 교반 하에 반응시켰다. 반응 후에, HA-CBT 및 HA-D-Cys 접합체를 에탄올 중에서 2회 침전시키고 나서, 따뜻한 표준 식염수 용액(45℃) 중에서 대략 20㎎/㎖로 재용해시키고, 최종적으로 4℃에서 저장하였다. 반응 상청액의 HPLC-RP 분석에 의한 차별적 균형을 통해 HA에 대한 CBT 및 D-Cys 결합의 수율을 결정하였다.
유동학적 특성규명. 유동계 AR-G2를 이용하여 유동학적 실험을 수행하였다. 쿠에트(Couette) 기하학(컵 직경 = 30.42㎜, 갭 = 0.5㎜, 및 봅(bob) 직경 및 길이 각각 27.95㎜ 및 42.15㎜)을 이용하여 유동학적 유동 및 진동 실험을 수행하였다. 용매의 증발을 방지하기 위해, 물질을 열적으로 분리시키고(용매 트랩), 중량을 실험 전 및 후에 확인하였다(중량의 차이는 1% 미만이었다). 일정한 온도(37℃)하에 모든 실험을 수행하였다. 겔화 동력학을 시간 스위핑(sweeping) 시험을 통해 모니터링하고, 저장 G' 및 손실 G" 탄성률을 10rad/s 빈도 및 1% 응력 변형도에서 시간의 함수로서 측정하였다. HA-CBT 및 HA-D-Cys 용액을 잠시 사전혼합하고(대략 5분), 부하한 다음에, 시험 온도에서 측정하였다. 주파수와 유동 스위핑 시험을 둘 다 하이드로겔 형성 후에 수행하였다. 주파수 스위핑 시험을 주파수 범위 0.01 < ω < 100rad/s에서 등온선상으로 수행한 반면, 1%에서 응력 변형을 유지하였다. 정상적인 힘을 마찬가지로 일정한 값으로 유지하였고, 조심해서 부하에 기인하는 잔여 응력이 이완되는 것을 보장하고, 시험 온도에서 평형 상태가 되도록 하이드로겔에 담지 시간을 허용하였다. 전단 속도 범위 0.0005 < γ < 100 s-1에서 등온으로 유동 스위핑 실험을 하여서, 0전단 점성도 및 강력한 전단박화 요법을 결정하였다. 100 s마다 1회 데이터 지점을 수집하였다.
인시추(피부) 내부 및 표피상의 겔화. 돼지 피부 샘플을 사용 30분 전에 실온에서 해동시키고 나서, 가위를 이용하여 털을 깎고, 0.9% 식염수 용액을 이용하여 린스하였다. HA-CBT와 HA-D-Cys 용액의 등몰 혼합물을 주사함으로써 피하 인시추 겔화 시험을 수행하였다. 2% w/w에서 접합체 용액을 합하여서 CBT와 D-Cys 둘 다의 5% ㏖ 농도를 얻었고, 격렬한 교반 하에 실온에서 3분 동안 사전혼합하고 나서, 최종적으로 27 게이지 바늘을 이용하여 주사하였다(50㎕). 피부 샘플을 1시간 동안 페트리 접시에서 실온에 저장하여 완전한 겔화를 보장하였다. 피하 겔에 대응되게 가위를 이용하여 샘플을 절단하여 작은(0.4㎝ x 0.4㎝) 정사각형을 얻고, 이를 아이소펜탄/드라이아이스 욕에 침지시켜 냉동시키고 나서, -80℃에서 저장하였다. 크라이오스탯(cryostat)을 이용하여 얇은(20㎛) 피부 절편을 얻고 나서, 공초점 현미경을 이용하여 영상화하였다. 피부의 ㎠ 당 1㎎의 HA 접합체의 비로 HA-CBT 및 HA-D-Cys 용액(2% w/w)을 순차적으로 적용함으로써 표피 겔화 시험을 또한 수행하였다. 피부 샘플을 절편화하고 나서, 상기 기재한 바와 같이 영상화하였다.
추가로, 기저 진피층에 도달될 때까지 가위를 이용하여 정사각형 돼지 피부 샘플(2㎝ x 2㎝)을 절개하였다. HA-CBT와 HA-D-Cys 접합체 용액의 등몰(5% ㏖)(둘 다 2% w/w) 혼합물로 절개를 채우고, 피부 샘플을 37℃에서 인큐베이션시켰다. 베트본드(VETBOND)(상표명) 조직 접착제(3M) 및 PBS를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 샘플을 시각적으로 분석하고 절개를 다시 개방하는 데 필요한 강도를 측정하기 위해 동력계를 이용하여 분석하였다.
접합체 생체적합성의 시험관내 특성규명. 인간 성인 상피 케라틴세포(HEKa 세포)를 인간 케라틴세포 성장 보충물, 50U/㎖ 페니실린, 50㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100㎍/㎖ 네오마이신으로 보충한 에피라이프(EPILIFE)(상표명)에서 배양시켰다. 배양물을 5% CO2와 함께 37℃에서 성장시켰다. MTT 세포 증식 분석(미국 버지니아주 매너서스에 소재한 ATCC)을 이용하여 HA 및 HA-접합체의 세포독성을 결정하였다. 세포를 96-웰 마이크로플레이트에 파종하고 나서, 밤새 부착시켰다. 대략 80% 합류까지 세포를 인큐베이션시키고, 이때 배지를 제거하고 나서, 새로운 배지 내 250㎍/㎖, 25㎍/㎖ 또는 2.5㎍/㎖ HA 또는 HA-접합체를 웰에 첨가하였다. 세포를 시험 제형과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 배지 단독과 인큐베이션시킨 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 5% SDS를 양성 대조군으로서 사용하였다. 배지 단독(세포 없음)을 갖는 웰을 기준으로서 차감하였다. SAFIRE XFLUOR4(상표명), V4.50 마이크로-플레이트 판독기(뉴욕주 모리스빌에 소재한 테칸 그룹 리미티드(Tecan Group Ltd))를 이용하여 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 생존도%를 결정하였다.
결과 및 논의. HA-CABT 및 HA-D-Cys 접합체 및 겔화 화학의 제조. 5%의 작용기(CBT 및 D-Cys)의 농도를 얻기 위한 목적으로 중합체 접합체를 제조하였다. 5%보다 높은 CBT 밀도는 수 중에서 덜 가용성이거나 불용성인 중합체 접합체를 제공한다. 반응 1:1 화학량론에 따르면, 마찬가지로 5% ㏖의 HA에 대한 D-Cys의 접합을 얻기 위한 시도를 하였다. 수 용해도에 적합한 기능성 밀도의 가장 높은 값은 양호한 겔화 수율을 보장하는 것을 추구하였다. 반응 혼합물 및 상청액의 C18 RP-HPLC 분석을 수행하여 작용화 수율을 추정하고, 4.7% 및 5.3% ㏖의 값을 회복시켰다. 정량화 분석을 초기에 수행하여 두 중합체 접합체 사이의 겔화 속도 및 수율을 특성 규명하였다. CBT와 D-Cys 사이의 액상 "클릭" 반응은 고 수율을 얻는 것으로 보고되었다. HA-CBT와 HA-D-Cys 접합체의 2% w/w 수용액(5% ㏖)이 혼합됨에 따라, 혼탁함의 형성이 관찰되었다. 이는 가교 중합체를 포함하는 두 순수한 HA-CBT와 HA-D-Cys 액상 사이의 얇은 계면의 형성에 기인할 가능성이 있다. 슬러리가 격렬하게 교반된다면, 혼탁함은 용해되고, 밝은 황색 겔의 형성까지 가교 반응이 진행된다. 반대로, 혼탁함이 기계적으로 소멸되지 않는다면, 중합체 용액 중의 우유색 현탁액으로서 지속될 수 있으며, 겔은 형성되지 않는다. 이는 혼탁함이 국소로 침전된 가교 중합체로 이루어져서, HA-CBT와 HA-D-Cys 액상 사이의 추가적인 접촉의 방지하고, 따라서 겔화 과정을 방해한다는 가설을 뒷받침한다.
유동학적 특성규명. 진동 시간 스위프, 겔화 지점: 개시된 시스템의 겔화 동력학을 연구하기 위해, 표준 식염수 중의 HA-CBT와 HA-D-Cys 접합체의 2% w/w 용액의 등몰량을(5% ㏖, HA 쇄에 대한 CBT 및 D-Cys 치환에 관해) 조합함으로써 혼합물을 제조하였다. 격렬한 교반 하에서 혼합물을 빠르게(대략 3분) 균질화시키고, 실린더 외부의 쿠에트 내로 부었다. 중합체 용액이 그것을 완전히 뒤덮을 때까지 내부 실린더(bob)를 외부 챔버 내로 낮추었다. 이어서, 진동 시간 스위프 실험을 수행하여 동력학적 저장 탄성률 G' 및 손실 탄성률 G"을 시간의 함수로서 모니터링하였다. 얻어진 데이터는 대략 2,000s에서 겔 형성을 나타내는 크로스-오버(cross-over) 지점(G' = G")을 나타낸다. 측정 전체적으로, 저장 탄성률은 γ를 10,000 s까지 증가시켜, 대략 100 Pa에서 최종적으로 평형 상태가 되었다.
목적으로 하는 피부 적용을 위해 보통의 겔화 동력학이 바람직하다. 혼합 시 너무 빠른 겔화는 겔을 주사기 어렵게 만들며, 균일한 그물망의 피하 형성을 방지한다. 다른 한편으로, 너무 느린 겔화 및 겔 약화(작은 G')는 피부층 전체적으로 확산, 불충분한 가교에 기인하여 중합체의 분산을 야기하고, 궁극적으로 양호한 조직 접착 및 점조도를 야기한다. 시스템을 최적화하여 정확한 겔화 시간 및 충분한 G' 값을 얻었다. 하이드로겔은 3시간 미만에 잘 진행된 그물망에 도달되었고, 37℃에서 시간에 따라(1주) 안정하게 되었다. G'에 대한 G"의 초기 우세함은 졸 상태, 즉, 액체-유사 거동을 특징으로 하는 시스템을 나타낸다. 시스템이 겔화 지점(G' = G")에 접근함에 따라, 저장 탄성률의 증가는 손실 탄성률의 증가보다 상당히 더 빠르다. 탄성률의 동시 성장은 HA-CBT와 HA-D-Cys 접합체 사이의 가교에 기인하며, G'은 특히 하이드로겔의 기계 강도 증가를 나타낸다. 교차점(대략 2000s)은 액체로부터 고체상까지의 전이, 지배적인 점탄성 거동을 나타내고, 화학적 가교를 통해 얻어진 하이드로겔의 전형적인 3-D 그물망의 형성을 나타낸다. 그물망 발생은 시스템에 점탄성 특성을 부여하는 고체-유사 시스템을 제공한다. 가교가 최종 단계로 접근함에 따라(대략 8,000s), G'과 G"는 둘 다 평형상태가 되며, 그물망의 형성은 잘 진행된다. 특히, 겔화 지점 후에 G'가 G"를 초과하자마자, 위상각 δ는 빠르게 감소된다. 하이드로겔은 위상각 대략 1°의 작은 위상각으로 3시간 미만에 탄성률의 안정기의 개시에 도달되는데, 이는 고체-유사 상태에 의해 제어된 잘-구조화된 그물망을 나타낸다. 이는 또한 거의 102만큼 다른 탄성률 강도에 의해 확인되었다.
진동 주파수 스위프, 점탄성 특성: 쿠에트 유동계에서 형성된 겔을 진동 주파수 스위프 분석을 통해 후속적으로 특성 규명하였다. 결과는 연구한 전체 주파수 범위(0.01 < ω < 100rad/s) 이상으로 G"보다 더 큰 G', 약 102의 평균 G'/G" 비, "강한 겔"의 거동 특징을 나타낸다. 다른 한편으로, "연질 겔", 예컨대 연조직 및 생물학적 겔에서, 탄성률은 주파수 의존을 나타내는 경향이 있으며, G'/G"비는 전형적으로 10보다 더 낮다. 손실 탄성률의 가변성에 기인하여 연구 시스템은 혼성 특징, 즉, 조합된 연질 및 강한 겔 특성을 나타내었다.
유동 스위프, 전단박화 거동: 상이한 속도에서 수행된 겔의 반응을 연구하기 위해, 유동 스위프 분석을 수행하여 전단 속도 γ의 함수로서 정전 상태 전단 점성도(η)를 측정하였다. 결과는 뉴턴 안정기(Newtonian plateau) 다음에 η의 104 이상의 현저한 전단 박화 효과를 특징으로 하는 복잡한 프로파일을 나타내었다. 전단 박화 상황하에서, 점성도 프로파일은 밀집하게 조직화된 구조가 특징적이다. 중간 및 고전단 속도에서 낮은 전단 속도와 전단박화 효과의 조합은 생물학적 겔, 예컨대 단백질 또는 다당류 기반 그물망에 대해 통상적이다. η의 프로파일은 전단박화 생물학적 겔에 대해 통상적으로 사용된 카로-야수다(Carreau-Yasuda) 식을 이용하여 모델링하였다. 상기 모델은 하기 식으로서 점성도를 설명한다
여기서 a, n 및 λ는 일정한, 경험적으로 결정된 매개변수이다. 매개변수, a는 전이 영역에서 프로파일을 조절하는 한편, n은 멱법칙(power law)의 기울기이고, 각각 전단박화에 대해 n < 1이며, 전단농화에 대해 n > 1이다. 시간 상수 λ는 멱법칙 프로파일로부터의 변화를 정한다. η0 및 η∞의 값은 각각 낮은 그리고 높은 전단 속도에서 안정기를 설명한다. 이들 점성도는 모델의 점근적 제한이 생기게 한다. 따라서, a, n 및 λ는 두 제한 사이의 비-뉴턴 상황에서의 거동을 제어한다. 고전단 속도에서 안정기가 상실된 경우에, 모델은 실험 데이터의 양호한 적합화를 제공한다. 수집한 데이터의 선형 회귀는 η0 = 34686 Pa·s, η0 = 0.16 Pa·s, λ = 652 s, n = 0.12 및 a = 64의 값을 회복시킨다.
인시추(피부) 내부 및 표피상의 겔화. 돼지 피부에서 HA-CBT와 HA-D-Cys 접합체의 등몰(5% ㏖) 조합물을 주사함으로써 피하 인시추 겔화 실험을 수행하였다. 겔화 메커니즘의 정량적 및 유동학적 분석 결과 후에, 돼지 피부 내 주사 전 접합체 용액(2% w/w)을 빠르게 사전혼합하도록 결정하였다. 피부 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 가교 반응이 완료되도록 진행시켰다. 이어서 겔화 면적에 대응하는 피부 절편을 절단하였다. 피부 샘플의 깨끗한 단면을 얻고 중합체를 선명하게 시각화하기 위해, 겔 샘플을 수집하여 상이한 겔 충전의 단면을 얻었다. 몇몇 20㎛ 슬라이스를 영상화하였다. 405㎚ 여기 파장 및 50㎚ 밴드폭으로 560㎚에 집중된 방출 필터를 이용하여 영상을 촬영하였다. 더 높은 형광을 갖는 면적은 시각적으로 겔 충전된 면적과 중복되고, 따라서 피하 겔 형성의 충분한 증거를 제공한다.
피부 샘플 상에 표면적으로 접합체 용액을 적용함으로써 표피 겔화 실험을 또한 수행하였다. 2% w/w HA-CBT 용액을 적용하고 나서, 37℃에서 15분 동안 피부층에 침투시켰다. 후속적으로, 2% w/w HA-D-Cys 용액을 유사하게 적용하였다. 피부 샘플을 절편화하고 나서, 상기 기재한 바와 같이 영상화하였다. HA 접합체의 대규모 전달을 관찰하였다. 이는 HA 중합체의 크기(250kDa)를 고려할 때 놀라운 결과였다. 본 명세서에서 관찰된 수송이 합성 과정의 인공물이 아니라는 것을 입증하기 위해, HA를 유사한 방식으로 FITC에 접합시켰다. 그러나 HA-FITC 중합체 접합체는 피부 내로 침투하지 않았다. 이는 CBT 또는 D-Cys 중 하나가 피부 내로 HA의 수송체로서 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. HA에 결합된 CBT는 전반적인 중합체 소수성을 증가시키고, 따라서 각질층에 걸친 침투를 유리하게 할 수 있다. 하이알루론산에 대한 그의 상대적으로 높은(5% ㏖) 결합을 고려하면, 이들 현수기는 각질층에 걸친 그리고 표피 내로의 중합체 이동을 유리하게 할 수 있었다.
상처-수선 아교로서 겔화 시스템의 용도. 가교된 상처 수선 필름을 형성하는 두 HA 접합체의 능력을 모델 피부 절개 상에서 추정하였다. 돼지 피부 샘플(2㎝ x 2㎝)을 얻었고, 기저 진피층에 도달될 때까지 가위를 이용하여 절개하였다. HA-CBT와 HA-D-Cys 접합체 용액(둘 다 2% w/w)의 등몰(5% ㏖) 혼합물을 상기 기재한 바와 같이 제조하고, 절개가 완전히 충전될 때까지 첨가하였다(대략 0.25㎖). 이어서, 피부 샘플을 37℃에서 인큐베이션시켜 분석하기 전에 가교반응이 완료에 도달되게 하였다. 베트본드(VETBOND)(상표명) 조직 접착제(양성 대조군) 및 PBS(음성 대조군)을 이용하여 동일한 절차를 수행하였다. 시각적 조사 시, 중합체 접합체 사이의 반응은 상처 끝을 단단히 연결하는 강하고 균일한 가교 필름을 형성하는 것으로 나타났다. 베트본드(상표명) 아교를 이용하여 유사한 결과를 얻은 반면, 예상한 바와 같이 PBS를 이용할 때 연결은 얻어지지 않았다. 동력계를 이용하여, 무손상 피부의 그리고 중합체 접합체 또는 베트본드(상표명) 아교 중 하나로 수선한 피부의 궁극적인 인장 응력을 측정하여, 절개를 재개방하는데 필요한 장력을 결정하였다. 무손상 피부를 파열시키기 위해 약 25㎫의 강도(0.5㎠의 피부 횡단면에 대해 대략 127㎏의 중량)가 필요하였고, 이를 문헌에 보고된 궁극의 인장 응력 값과 잘 비교한다. 베트본드(상표명) 아교 및 본 발명자들의 중합체 접합체를 이용하여 수선한 절개를 재개방하기 위해 약 6.4 및 4.3㎫의 강도(32㎏ 및 22㎏)가 필요하였다.
HA-CBT 및 HA-D-Cys 접합체의 생체적합성. HA-접합체의 독성을 평가하기 위해, HA, HA-CBT 및 HA-D-Cys을 밤새 HEKa 세포와 함께 인큐베이션시키고, 생존도%를 결정하였다. 케라틴세포는 피부에서 주된 세포 유형이기 때문에 HEKa 세포를 사용하였고, 따라서, 피부 자극에 대한 가능성의 양호한 추정을 나타낸다. 중요하게는, 시험한 임의의 조건에 대해 세포독성은 관찰되지 않은 반면, 5% SDS는 완전한 세포사를 초래하였는데, 이는 본 발명의 HA 접합체가 피부에 대해 비독성이라는 것을 시사한다.
실시예 2. 약물 방출을 위한 HA 하이드로겔의 용도
2% w/w에서 접합체 용액을 합하여 CBT와 D-Cys 둘 다의 5% ㏖ 농도를 얻었고, 모델 단백질과 사전 혼합(실온에서 3분)하여 최종 단백질 농도 2㎎/㎖를 얻었다. 두 모델 단백질, 즉, BSA 및 인간 IgG를 이 연구에서 이용하였다. 원통형 바이알(din = 1.27㎝)에서 밤새 2㎖ 용적의 혼합물을 겔화시켰다. 5㎖ 용적의 PBS, pH 7.4를 바이알에 첨가하고 나서, 겔/PBS 간기를 방해하는 일 없이 48시간에 걸쳐 교반기를 이용하여 부드럽게 혼합하였다. 처음 6시간 동안 매시간마다 그리고 후속적으로 6시간마다 0.3㎖의 용액을 회수하였고, 원심분리 필터(MWCO = 30kDa)를 이용하여 여과시켜 비단백질 종을 제거하고, 최종적으로 BCA 분석을 통해 분석하여 단백질 농도를 결정하였다. 예상한 바와 같이, BSA의 방출은 각각 분자량 66.5kDa 대 150kDa의 현저한 차이에 기인하여 IgG보다 더 빨랐다.
겔화 시스템의 유동학적 분석은 피부 샘플에 대한 피하 및 표피상의 중합체 적용을 가장 잘 수행하는 방법, 특히 첫 번째 경우에 사전혼합의 필요 및 두 번째 경우에서 중간 시간 공백에 의한 후속적 적용을 나타내었다. 유동학적 연구는 CBT-D-Cys "클릭" 화학에 의해 형성된 겔은 피하 압력을 견뎌 내기 위한 충분한 기계적 강도로 지속 가능하고 잘 개발된 겔을 얻는다는 것을 나타내었다. G'/G" 비 및 점성도(η) 값을 알데하이드-아민과 같은 고전적 반응에 기반하여 다른 공지된 인시추 겔화 시스템과 유사한 본 발명의 시스템에 넣었다. 그러나 이들 시스템과 달리, 본 발명의 제형은 HEKa 세포에 의한 분석에 의해 입증한 바와 같이 높은 생체적합성을 나타내었고, 주사/확산된 중합체를 둘러싸는 조직과의 비특이적 반응의 위험을 제공하지 않는다. 얻어진 겔의 온화한 반응 동력학 및 양호한 기계적 특성은 본 발명의 시스템이 관절염의 치료 및 조직 재구성과 같은 적용을 잘 받아들인다는 것을 입증하며, 여기서 중합체 충전은 겔화 전의 공동 내에서 완전히 조절하는 것이 요구되며, 높은 겔 점성도 및 지속능력이 필요하다. 시험관내 특성규명과 조합한 유동학적 데이터는 중간의 점성도 특성이 잘 허용되는 구역, 즉, 신장, 췌장 등에서 물질이 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 각각의 독립적 특허, 특허 출원 또는 간행물이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 개시된 실시형태는 예시의 목적을 위해 제시하며, 제한하지 않는다. 본 발명을 이의 기재된 실시형태를 참고로 하여 기재하였지만, 변형이 전체로서 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 본 발명의 구조 및 구성요소로 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.

Claims (7)

  1. 인시추(in situ) 상처-봉합 아교의 제조 방법으로서,
    제1 용액을 제2 용액과 혼합하는 단계로서, 상기 제1 용액은 D-Cys(D-시스테인) 또는 D-Cys 모방체를 포함하는 제1 반응성 기로 작용화된 제1 중합체 종을 포함하고, 상기 제2 용액은 상기 제1 반응성 기와 반응하여 디하이드로티아졸 모이어티를 형성할 수 있는 나이트릴기를 포함하는 제2 반응성 기로 작용화된 제2 중합체 종을 포함하는 것인, 상기 혼합하는 단계; 및
    상기 제1 반응성 기와 상기 제2 반응성 기를 반응시킴으로써 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액 내의 상기 제1 중합체 종과 상기 제2 중합체 종을 가교시켜, 상기 상처-봉합 아교를 형성하는 단계를 포함하고;
    1종 이상의 치료적 활성제가 상기 제1 용액 또는 상기 제2 용액 중 하나 또는 둘 다에 존재하는 것인, 인시추 상처-봉합 아교의 제조 방법.
  2. 제1 하이알루론산(HA) 중합체 및 제2 하이알루론산 중합체를 포함하는, 상처-봉합 아교를 형성하는 조합물로서,
    상기 제1 HA 중합체는 제2 반응성 기와 반응하는 제1 반응성 기로 작용화된 제1 HA 중합체 모이어티를 포함하고, 상기 제1 반응성 기는 작용화되지 않은 HA 중합체 모이어티에 비하여 상기 제1 HA 중합체의 수송을 증가시키고;
    상기 제2 HA 중합체는 상기 제2 반응성 기로 작용화된 제2 HA 중합체 모이어티를 포함하고, 상기 제2 반응성 기는 D-Cys(D-시스테인) 또는 D-Cys 모방체를 포함하고;
    상기 제1 반응성 기는 사이아노벤조티아졸, 사이아노벤조티아졸 모방체, 또는 상기 제2 반응성 기의 D-Cys 또는 D-Cys 모방체의 -SH 또는 -NH2 기 중 어느 하나와 반응하는 다른 분자를 포함하고; 및
    상기 제1 HA 중합체와 상기 제2 HA 중합체의 용액이 합해질 때, 상기 제1 반응성 기와 상기 제2 반응성 기는 반응하여 상기 제1 HA 중합체 및 상기 제2 HA 중합체를 가교시키고 상기 상처-봉합 아교를 형성하는 것인, 상처-봉합 아교를 형성하는 조합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 중합체 종 및 상기 제2 중합체 종은 하이알루론산인 것인, 인시추 상처-봉합 아교의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 반응성 기는 작용화되지 않은 제1 중합체 종에 비하여 상기 제1 중합체 종의 소수성을 증가시키는 것인, 인시추 상처-봉합 아교의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 반응성 기는 D-Cys이거나 또는 D-Cys를 포함하는 것인, 인시추 상처-봉합 아교의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제2 반응성 기는 사이아노벤조티아졸이거나 또는 사이아노벤조티아졸을 포함하는 것인, 인시추 상처-봉합 아교의 제조 방법.
  7. 제1 하이알루론산(HA) 중합체 및 제2 하이알루론산 중합체를 포함하는, 겔을 형성하는 조합물로서,
    상기 제1 HA 중합체는 제2 반응성 기와 반응하는 제1 반응성 기로 작용화된 제1 HA 중합체 모이어티를 포함하고, 상기 제1 반응성 기는 작용화되지 않은 HA 중합체 모이어티에 비하여 상기 제1 HA 중합체의 수송을 증가시키고;
    상기 제2 HA 중합체는 상기 제2 반응성 기로 작용화된 제2 HA 중합체 모이어티를 포함하고, 상기 제2 반응성 기는 D-Cys(D-시스테인) 또는 D-Cys 모방체를 포함하고;
    상기 제1 반응성 기는 사이아노벤조티아졸, 사이아노벤조티아졸 모방체, 또는 상기 제2 반응성 기의 D-Cys 또는 D-Cys의 모방체의 -SH 또는 -NH2 기 중 어느 하나와 반응하는 다른 분자를 포함하고; 및
    상기 제1 HA 중합체와 상기 제2 HA 중합체의 용액이 합해질 때, 상기 제1 반응성 기와 상기 제2 반응성 기는 반응하여 상기 제1 HA 중합체와 상기 제2 HA 중합체를 가교시키고 상기 겔을 형성하는 것인, 겔을 형성하는 조합물.
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