KR20110097728A - 생분해성 합성고분자와 공중합을 통한 세포주사형 하이드로겔 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 체내 전달을 위한 세포 기계적물성이 향상된 세포 주사형 생분해성 합성 고분자 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 온도 감응성 고분자인 플루로닉 (pluronic) F-127과 카프로락톤 (ε-carprolactone) 과의 공중합체 방법으로 합성된 Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 세포 주사형 고분자 하이드로겔(hydrogel) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 합성된 하이드로겔은 고분자물질로써 체내에 세포를 주사하였을때 세포의 in situ localization을 증대시키고, 분해 거동을 늦추어 전달하고자 하는 세포와의 생체적합성을 향상시키는 효과를 나타냄으로써 세포 전달체 및 치료제로서의 장점을 가진 물질이라 할 수 있다.

Description

생분해성 합성고분자와 공중합을 통한 세포주사형 하이드로겔 및 이의 제조방법 {Cell injectable hydrogel copolymerized with biodegradable synthetic polymers and the preparation method thereof}
본 발명은 기계적 물성이 개선된 세포 주사형 고분자 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 주사형으로 광범위하게 쓰이는 하이드로겔인 온도 감응성 고분자인 플루로닉 (pluronic) F-127에 카프로락톤 (ε-carprolactone)을 공중합하여 합성된 Poly(ε-carprolactone:PCL)-Pluornic F-127 하이드로겔 (hydrogel)의 제조방법에 관한 것이다.
알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 등의 천연 하이드로겔 (hydrogel)의 대표적인 특징은 그 구조상 친수성 고분자의 망상구조를 가짐으로써 많은 양의 물을 함유하여 팽윤할 수 있다는 데에 있다. 하이드로겔의 3차원적인 망상구조는 공유결합, 수소결합, 반데르발스 (Van der Waals)결합 또는 물리적 응집 등 여러 요인에 의해 형성된다. 또한, 여러 가지 합성 고분자 하이드로겔은 온도, pH,용매의 조성, 이온의 농도, 전기장, 광도, 화학물질 등과 같은 외부 자극에 대하여 민감하게 반응하여 연속적 또는 불연속적으로 함수율 등의 물성변화를 나타내게 된다.
하이드로겔은 조직공학 및 약물 전달 분야에서 널리 사용되는 물질로서, 하이드로겔에 약물 및 세포를 함께 포함시켜 생물공학 및 의료분야에 널리 사용되고 있다.　종래에는 하이드로겔을 사용하여 세포지지체, 세포캡슐, 약물전달체 등을 제조하여 왔으며, 최근에 이런 하이드로겔의 특성을 활용하여 생체 적용에 용이한 주사형 전달체로의 개발과 응용이 다양하게 시도되고 있다.
임상에 적용 가능한 생체 적합성, 생분해성을 갖는 주사형 하이드로겔은 세포를 함입하였을 경우 외과적인 수술과정 없이 간단하게 세포를 체내로 주입하고 세포가 체내의 한 장소에 머물 수 있도록 도와줌으로써 체내에서 세포가 조직화되는 것에 크게 영향을 준다. 이러한 주사형 하이드로겔의 특성은 체외에서 조작의 편리성을 위한 유동성을 지녀야 하며, 체내에 주입하고 난 뒤 화학적인 가교나 물리적인 가교를 통해 그 형태가 흐트러지지 않고, 한 곳에서 겔화(gelation) 되어야 한다.
세포주사형 하이드로겔은 다양한 물질을 사용하여 제형화되거나 제조되어 왔다.　기본적으로 많이 사용되는 물질은 생체 적합성이 좋은 것으로 알려진 고분자로 PEG, Pluronic F-127 등이 사용되어져 왔다.
현재, 온도 감응성 하이드로겔인 Pluronic F-127은 polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide(PPO)-polyehtylene oxide (PEO)의 삼원블록공중합체로 16% 이상의 수용액 농도일 때 온도 의존적 (Temperature-dependent) 졸-젤 전이 (sol-gel transition) 현상을 나타낸다. Pluronic F-127은 생체적합성이며 경구, 비강, 안구 등의 경로를 통한 다양한 약물전달 및 세포 운반체 (carrier)로 사용되어지고 있으나, 단독으로는 기계적 물성이 약하여 체내에서 쉽게 분해, 방출되어 장기간 세포를 한 곳에서 지탱해야 할 경우 좀 더 기계적인 강도가 좋은 하이드로겔의 개발이 필요하다.
이에 본 발명의 발명자들은 겔의 기계적인 물성을 개선하고 체내 안정성을 높이며 분해 거동을 늦추고자 polyester 계열의 생분해성 고분자인 poly (carprolactone ) (PCL)과 Pluronic F-127의 화학적 가교 결합을 통한 공중합 고분자 하이드로겔을 만들어 임상에 적용할 수 있는 주사가능한 고분자 물질을 얻고자 본원 발명을 고안하였다.
본 발명의 목적은 치료를 위한 세포 주사형 고분자 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로, 온도 감응성 고분자인 플루로닉 (Pluronic) F-127과 카프로락톤 (ε-carprolactone) 과의 공중합체 방법으로 합성된 Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 세포 주사형 고분자 하이드로겔(hydrogel) 및 이의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 체내로 세포전달을 위한 세포 주사형 고분자 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
이하에서 자세하게 설명한다.
a) 생분해성을 갖는 소수성 (hydrophobic) 고분자에 중합 촉매를 넣고, 80~90oC 에서 교반 시키는 단계;
b) 상기 교반 후 질소 기류 하에서 온도 감응성을 갖는 친수성 (hydrophilic) 고분자를 더 넣고 80~90oC 에서 교반 시키는 단계;
c) 상기 교반 후 식힌 다음 석유 에테르/ 노말헥산 (petroleum ether / n-hexane)으로 재침전하는 단계; 및
d) 상기 침전물을 거른 후 감압시키는 단계;
를 포함하는 세포 주사형 고분자 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
상기 a) 단계의 생분해성을 갖는 소수성 (hydrophobic) 고분자는 폴리글라이콜라이드 (polyglycolide), 폴리락타이드 (polylactide) 또는 이 고분자들의 공중합체인 poly(lactide-co-glycolide)가 있으나, 카프로락톤 (ε-carprolactone)이 바람직하다. 카프로락톤은 겔의 기계적인 물성과 체내 안정성을 높이고 분해 거동을 늦추기 위한 것으로서, 기계적 안정성과 탄력성을 지닌 고분자이며, 주 쇄에 있는 6개의 알킬기로 인해 탄력성을 지닌 생체적합성 고분자물질이다.
또한, 상기 a) 단계의 촉매는 이에 제한되지 않으나, Sn(Oct)2 가 바람직하며, 전체 반응물에 대해 5 wt% 가 바람직하다.
상기 b) 단계의 온도 감응성을 갖는 친수성 고분자는 플루로닉 (Pluronic) F-127 과 폴리나이팜[P(NiPAM)] 이 있으나, 플루로닉 (Pluronic) F-127가 바람직하다. 플루로닉 (Pluronic) F-127은 저온에서는 액체 상태이고, 체온에 이르러는 고체상태가 되는 온도 민감성 고분자로 주사형 물질로 적절하다.
상기 a) 단계의 생분해성을 갖는 소수성 (hydrophobic) 고분자와 상기 b) 단계의 온도 감응성을 갖는 친수성 (hydrophilic) 고분자는 동량의 몰 (mol)인 것이 바람직하다.
상기 c) 단계의 식히는 과정은 실온에서 서서히 식히는 것을 더 포함할 수 있으며, 상기 석유 에테르/ 노말헥산 (petroleum ether / n-hexane)은 0~4oC 하에서 사용하는 것이 바람직하다.
상기 d) 단계의 침전물은 거름종이로 거르는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 합성된 세포 주사형 고분자 하이드로겔 (hydrogel)을 제공한다. 이는 플루로닉 (Pluronic) F-127과 카프로락톤 (ε-carprolactone)과의 공중합체 방법으로 합성된 Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 블록 공중합체이다.
상기 합성된 Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 블록 공중합체는 하기의 특성을 1이상 가지는 고분자 하이드로겔 (hydrogel)이다.
(a) 온도 변화에 따른 상전이 거동을 나타냄;
(b) 주사된 세포를 2주 이상 같은 위치에 고정화(localize) 시킬 수 있음;
(c) 분해 거동이 2주 이상 지속적; 및
(d) 세포적합성이 뛰어나고 세포의 증식률을 향상시킬 수 있음.
또한, 본 발명은 상기 따른 하이드로겔에 세포가 함입된 세포치료제를 제공한다. 또한, 본 발명의 세포치료제는 줄기세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 합성된 하이드로겔은 고분자물질로써 체내에 세포를 주사하여 in situ localization을 증대시키고, 체내에서 세포가 겔 밖으로 빠져나가지 않고 머무는 시간을 연장시키며, 전달하고자 하는 세포와의 생체적합성을 향상시키는 효과를 나타냄으로써 세포 전달체로서의 기대되는 장점을 가진 물질이라 할 수 있다.
도 1은 FT-IR 스펙트럼로 관찰된 (a) Pluronic, (b) 합성 하이드로젤 (PCL-Pluronic hydrogel) 것이다.
도 2는 1H NMR 스펙트럼으로 관찰된 합성하이드로젤 (PCL-Pluronic hydrogel) 것이다.
도 3은 Weight loss로 측정된 하이드로젤의 분해 거동(n=3,mean±SD)을 나타낸 그래프이다.
도 4은 합성 하이드로젤의 저임계 용해온도에따른 졸-젤거동 (n=3, mean±SD)을 나타낸 그래프이다.
도 5은 분리 및 배양된 인간양수줄기세포: (A) 광학현미경사진, (B) c-kit 면역염색사진 (×200) 이다.
도 6은 합성 하이드로젤(PCL-Pluronic hydrogel)의 세포증식검사 (n=5, mean±SD); (A) control, (B) 10(w/v) % PCL-Pluronic hydrogel, (C) 20(w/v) % PCL-Pluronic hydrogel을 나타낸 그래프이다.
도 7은 합성 하이드로젤(PCL-Pluronic hydrogel)의 세포독성 검사 (n=5, mean±SD): (A) control, (B) 10(w/v) % PCL-Pluronic hydrogel, (C) 20(w/v) % PCL-Pluronic hydrogel.
도 8은 합성 하이드로젤(PCL-Pluronic hydrogel)의 시간경과 (*500) (a) 1일, (b) 10일, (c)20일, (d) 30일 에 따른 형태학적 특징을 주사전자현미경 (FE-SEM, Scanning Electron Microscope, Hitachi, Japan) 으로 관찰한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1: 하이드로겔의 제조>
1. 시약
플루로닉 (Pluornic F127, Mw 12600)과 카프로락톤 (ε-carprolactone)은 시그마 알드리치사 (Sigma-Aldrich, USA)에서 구입하였다. 촉매로는 Sn(Oct)2 (Sigma-aldrich, USA)를 사용하였고, 사용된 용매로는 노말헥산 (n-Hexane), 메틸렌클로라이드 (Methylene chloride, Junsei, Japan)를 사용하였고, 실험에 사용된 모든 시약들은 시약급 (reagent grade) 이었다.
2. 하이드로겔의 제조 (Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127)
카프로락톤 (ε-carprolactone) 4mmol를 주사기를 이용하여 잘 건조된 목이 1개인 둥근바닥 플라스크 (one-neck round flask)에 넣은 다음 중합 촉매로서 Sn (Oct)2(5 wt% of total reactants)를 넣은 다음 80~90oC에서 1시간 교반 시켰다. 그 후, Pluronic F-127을 4mmol 을 넣고 질소 기류 하에서 80~90oC에서 3일간 교반 시켰다. 반응 후 실온에서 서서히 식힌 다음, 차가운 석유 에테르/ 노말헥산 (petroleum ether / n-hexane)으로 재침전하고, 침전물은 거름종이로 거른 후 감압 하에서 건조 생성물을 얻었다. 합성 고분자 하이드로겔의 화학구조를 분석 및 확인하기 위한 FT-IR, 1H NMR 측정하였다. 각 치환기의 확인을 통해 공중합된 구조임을 확인 할 수 있었다 (도 1, 2)
<실시예 2: Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 합성 고분자 하이드로겔의 시간에 따른 분해 (dissolution)>
1. 시행
37oC에 각각 10mg 하이드로겔을 30ml의 인산완충용액 (PBS, pH 7.4 )에 분산시키고, 중탕 교반기 100rpm 하에서 30일 동안 분해 거동을 수행하였다. 일정 시간 간격으로 완충 용액을 채취하고 최초의 합성 하이드로겔의 무게와 건조시킨 합성 하이드로겔의 무게 차이로 손실된 양을 측정하였다. 각 실험은 3회에 걸쳐 시행되었다.
2. 결과
초기 1일 까지는 무게 변화량이 증가 하였지만 10일 이후부터는 서서히 물질의 무게가 감소되었고 30일 동안 그 양상은 변함이 없음을 확인 할 수 있었다.(도 3). 새롭게 합성된 하이드로젤 고분자는 분해 거동이 안정적으로 나타남을 확인 할 수 있었다.
<실시예 3: 저임계 용해온도 (LCST : low critical solution temperature) 측정>
1. 수행
In situ 젤 형성을 알아보기 위하여 상온에서 Pluronic F127/PCL 블록 공중합체를 수용액 (10 wt %: 0.5ml)으로 만들어 37oC 증류수가 담긴 유리병 (vial)에 5초 동안 주사하였다. 용액을 주사하는 동안 젤이 형성되는 모습을 관찰하기 위하여, 시험관을 뒤집는 방법으로 측정하였다. PF127/PCL 블록 공중합체를 수용액 1.0ml을 담은 vial을 10oC에서 30분 동안 중탕냄비에 담군 뒤 전이 온도는 온도를 1oC씩 올리면서 vial을 뒤집었을 때, 흐름(졸)-안 흐름(젤) 척도에 의하여 결정하였다. 각 실험은 3회에 걸쳐 시행되었다.
2. 결과
합성 하이드로겔의 양이 늘어날수록 높은 점성도를 나타내며 겔화(gelation)되었다 (도 4). 합성 하이드로겔의 함량이 10(w/v)%, 24oC에서는 졸(sol)상태를 보였고, 37oC에서는 30초가 지나면서 점성이 낮은 겔(soft gel)상태가 일어남을 확인할 수 있었다. 함량이 25(w/v) %이상 시에는 임계온도가 낮아 졸(sol)상태가 나타남을 관찰 할 수 있었다. 주사 가능한 하이드로겔에 적합한 합성 하이드로겔의 농도는 10 (w/v) %에서 이상적인 졸-겔 거동을 보였다. 따라서 이 농도를 갖는 물질을 갖고 주사 가능한 하이드로젤 지지체로 이용 가능할 것으로 보인다.
<실시예 5: 세포의 분리 및 배양>
1. 관찰
산모로부터 채취한 양수 2ml에 10ml의 인산완충액를 첨가 하고 이를 40㎛ 메쉬 (Falcon,USA)를 이용하여 거른 후, 세포 수를 측정하고 직경 6cm 의 세포배양접시에 분주 하여 37℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 성장배지로는 α-modified eagle medium (αMEDM, Hyclon, USA)에 15%의 우태아혈청 (FBS, Hyclon, USA), 1%의 chang B and C (Isvile Science,United Kingdom), 1%의 항생제(100U/ml 페니실린과 100㎍/ml의 스트렙토마이신, Hyclon, USA), 1%의 L-glutamin (Hyclon, USA)를 혼합하여 사용하였다. 5 ×106 의 세포가 되었을 때, 형광활성화 세포 분류기(FACS)를 이용하여 c-kit (Santacruze, USA)에 양성을 나타내는 세포만 분리하여 사용하였다. 배양액은 일주일에 세 번 교체해 주었으며, 계대 배양 3회 후 면역염색을 이용하여 c-kit에 양성을 나타내는지 재확인 하였다.
2. 결과
초기 c-kit에 양성을 나타내는 세포를 분리 하였을 때는 15%를 나타내었으며, 계대 배양 3회 후 다시 FACS를 이용하여 확인 시에는 98%의 양성을 나타냄을 확인하였다. 사용한 양수줄기세포를 면역염색을 이용하여 c-kit에 양성을 도 5에 나타내었다 (도 5).
<실시예 5: Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 합성 고분자 하이드로겔의 세포증식 검사>
1. 관찰
합성 하이드로겔의 세포증식을 검사하고자 Cell Counting Kit-8 (CCK-8 assay, Dojindo, Japan) 방법을 이용하여 분석하였다. 이를 이용한 세포 증식 검사 방법으로 양수줄기 세포 (Amniotic Fluid Stem Cells, AFSCs)를 24 well plate에 well 당 1×105 개씩 넣어 세포증식을 3일 수에 측정 하였다. Well 당 25㎕ 의 CCK-8 solution을 첨가 하여 37℃, 5% CO2배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader의 450 nm파장에서 흡광도의 변화를 측정하여 합성 하이드로겔의 세포증식을 확인 하였다. 실험은 5회에 걸쳐 시행되었다.
2. 결과
세포 증식 검사 결과 같은 수의 세포만 심은 대조군(control group)에 비해 세포증식도가 향상됨을 확인 하였다 (도 6). 특히, 10(w/v) %의 합성 하이드로겔의 세포증식이 향상되었다.
<실시예 6: Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 합성 고분자 하이드로겔의 세포독성 검사>
1. 관찰
합성 하이드로겔의 초기세포독성을 검사하고자 Cyto Tox 96R Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (LDH assay, Promega, USA)방법을 이용하여 분석하였다. 세포 독성 검사 방법으로 양수줄기 세포 (Amniotic Fluid Stem Cells, AFSCs)를 24 well plate에 well 당 1×105 개씩 넣어 2, 4, 6, 24 시간 초기독성검사를 실시하였다. 96-well plate 에 well 당 50㎕의 배양액을 넣고 50㎕ substrate mixture solution을 첨가하여 암실에서 30분간 반응 시킨다. 이후 stop solution을 well 당 50㎕ 넣고, microplate reader의 490nm파장에서 흡광도의 변화를 측정하여 합성 하이드로겔의 세포독성을 확인하였다. 실험은 5회에 걸쳐 시행되었다.
2. 결과
세포 독성을 실험한 결과 assay kit를 넣은 직후 같은 수의 세포만 심은 대조군(control group)과 비교할 시 초기 독성은 증가 되었지만, 1일이 지난 후에는 대조군(control group)에 비해 독성이 감소됨을 확인 하였다(도 7).
<실시예 7: Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 합성 고분자 하이드로겔의 형태학적 분석>
1. 관찰
합성된 하이드로겔의 시간에 따른 형태 안정성을 관찰하기 위해 하이드로겔을 10(w/v)% 수용액상에 용해시킨 후 급속 냉동 (-74℃)하여 동결건조기를 통해 건조한 다음 주사전자현미경 (FE-SEM: Scanning Electron Microscope, Hitachi, Japan)으로 형태학적 특징을 관찰하였다.
2. 결과
1일 경과 후 관찰된 합성고분자 하이드로겔은 다공성 (porous)형태를 갖고 있었으며, 시간이 경과함에 따라 그 다공성 구조가 변화됨을 확인 할 수 있었다(도 8). 다공성 구조를 갖고 있는 합성고분자는 세포가 접착할 수 있는 공간을 제공하여 세포와의 복합화에 좋은 환경으로 제공될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. a) 생분해성을 갖는 소수성(hydrophobic) 고분자에 중합촉매를 넣고, 교반시키는 단계;
    b) 상기 교반 후 질소 기류 하에서 온도 감응성을 갖는 친수성(hydrophilic) 고분자를 더 넣고 교반 시키는 단계;
    c) 상기 교반 후 식힌 다음 석유 에테르/ 노말헥산 (petroleum ether / n-hexane)으로 재침전하는 단계; 및
    d) 상기 침전물을 거른 후 감압시키는 단계;
    를 포함하는 세포 주사형 고분자 하이드로겔의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 a)단계 및 b)단계의 교반은 80~90oC에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 생분해성을 갖는 소수성 (hydrophobic) 고분자는카프로락톤 (ε-carprolactone)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 촉매는 Sn(Oct)２인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 온도 감응성을 갖는 친수성 (hydrophilic) 고분자는 플루로닉 (Pluronic) F-127인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 생분해성을 갖는 소수성 (hydrophobic) 고분자와 상기 b) 단계의 온도 감응성을 갖는 친수성 고분자는 동량의 몰 (mol)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항의 제조방법으로 제조된 플루로닉 (Pluronic) F-127과 카프로락톤 (ε-carprolactone)이 공중합 방법으로 합성된 Poly(ε-carprolactone :PCL)-Pluornic F-127 블록 공중합체 세포 주사형 고분자 하이드로겔.
  8. 제 7항에 있어서, 하기의 특성을 하나 이상 가지는 것을 특징으로 하는 세포 주사형 고분자 하이드로겔 (hydrogel):
    (a) 온도 변화에 따른 상전이 거동을 나타냄;
    (b) 주사된 세포를 2주 이상 같은 위치에 고정화(localize) 시킬 수 있음;
    (c) 분해 거동이 2주 이상 지속적;
    (d) 세포적합성이 뛰어나고 세포의 증식률을 향상시킬 수 있음.
  9. 제7항에 따른 하이드로겔에 세포가 함입된 세포치료제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포치료제.
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