FI123988B - Soluviljelymateriaali - Google Patents

Soluviljelymateriaali Download PDF

Info

Publication number
FI123988B
FI123988B FI20106121A FI20106121A FI123988B FI 123988 B FI123988 B FI 123988B FI 20106121 A FI20106121 A FI 20106121A FI 20106121 A FI20106121 A FI 20106121A FI 123988 B FI123988 B FI 123988B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
cellulose
cnf
cell
cell culture
Prior art date
Application number
FI20106121A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20106121A0 (fi
FI20106121L (fi
FI20106121A (fi
Inventor
Antti Laukkanen
Marjo Yliperttula
Patrick Lauren
Madhushree Bhattacharya
Yanru Lou
Original Assignee
Upm Kymmene Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upm Kymmene Corp filed Critical Upm Kymmene Corp
Publication of FI20106121A0 publication Critical patent/FI20106121A0/fi
Priority to FI20106121A priority Critical patent/FI123988B/fi
Priority to PL15155375T priority patent/PL2975115T3/pl
Priority to JP2013535475A priority patent/JP2013541956A/ja
Priority to DK11785715.1T priority patent/DK2632493T3/da
Priority to CN2011800627192A priority patent/CN103354834A/zh
Priority to PL11785713T priority patent/PL2633032T3/pl
Priority to SG2013030721A priority patent/SG189966A1/en
Priority to US13/881,973 priority patent/US20140010790A1/en
Priority to AU2011322363A priority patent/AU2011322363B2/en
Priority to EP11785714.4A priority patent/EP2633033B1/en
Priority to ES11785713.6T priority patent/ES2537268T3/es
Priority to DK15155375T priority patent/DK2975115T3/da
Priority to JP2013535476A priority patent/JP6321961B2/ja
Priority to BR112013010377-9A priority patent/BR112013010377B1/pt
Priority to CA2815276A priority patent/CA2815276C/en
Priority to RU2013122757/10A priority patent/RU2597978C2/ru
Priority to DK11785713.6T priority patent/DK2633032T3/en
Priority to CN201710872909.XA priority patent/CN107557330B/zh
Priority to ES15155375T priority patent/ES2759257T3/es
Priority to PCT/FI2011/050939 priority patent/WO2012056109A2/en
Priority to US13/881,982 priority patent/US9631177B2/en
Priority to EP11785715.1A priority patent/EP2632493B1/en
Priority to PCT/FI2011/050940 priority patent/WO2012056110A2/en
Priority to EP15155375.7A priority patent/EP2975115B1/en
Priority to EP11785713.6A priority patent/EP2633032B1/en
Priority to ES11785715.1T priority patent/ES2565958T3/es
Priority to PCT/FI2011/050941 priority patent/WO2012056111A2/en
Priority to US13/881,959 priority patent/US10612003B2/en
Publication of FI20106121L publication Critical patent/FI20106121L/fi
Publication of FI20106121A publication Critical patent/FI20106121A/fi
Priority to IL225923A priority patent/IL225923B/en
Application granted granted Critical
Publication of FI123988B publication Critical patent/FI123988B/fi
Priority to HK14101542.5A priority patent/HK1188466A1/xx
Priority to JP2017241022A priority patent/JP6448755B2/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3637—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the origin of the biological material other than human or animal, e.g. plant extracts, algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L1/00—Compositions of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08L1/02—Cellulose; Modified cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L97/00—Compositions of lignin-containing materials
    • C08L97/02—Lignocellulosic material, e.g. wood, straw or bagasse
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2301/00—Characterised by the use of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08J2301/02—Cellulose; Modified cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/78—Cellulose

Description

Soluviljelymateriaali
Keksinnön ala 5
Keksinnön kohteena ovat soluviljelyyn tarkoitetut koostumukset, jotka sisältävät selluloosan nanokuituja tai niiden johdannaisia.
Keksinnön taustaa 10
Terveydenhoito sijaitsee tieteellisen tutkimuksen etulinjassa. Tarve löytää ja kehittää kustannustehokkaita ja turvallisempia lääkitsemistapoja kasvaa jatkuvasti. Kyky mallintaa täsmällisesti solujen järjestäytymistä erityisessä kudoksessa tai elimessä on äärimmäisen tärkeätä. In v/Vo-järjestelmän tarkka kopio in v/fro-järjestelmäksi 15 edellyttää solujen kolmiulotteista (3D) kasvatusta. 3D-soluviljelmässä in vitro olevien solujen välillä saavutettu "ristiinpuhelu" jäljittelee läheisesti solujen kasvua fysiologisissa olosuhteissa. 3D-soluviljelmät ovat todellakin saavuttaneet merkitystä pyrkimyksissä, jotka kohdistuvat regeneratiiviseen lääketieteeseen, kroonisten sairauksien parempaan ymmärtämiseen ja paremman, lääkeaineiden seulontaan ja 20 toksikologisiin määrityksiin soveltuvan in v/fro-mallijäijestelmän aikaansaamiseen. Sen ilmaantumiseen viitataan näin ollen sopivasti "biologian uutena ulottuvuutena".
Intensiivistä tutkimustyötä tehdään parhaillaan solujen in vitro 3D-kasvulle suosiollisten "tekijöiden ja tukitelineiden" tunnistamiseksi ja kehittämiseksi. Solut 25 eivät vain "ristiinpuhele" fysiologisissa olosuhteissa keskenään, vaan ne myös vuorovaikuttavat solujen pienympäristön, solujen ulkopuolisen matriisin (ECM), £2 kanssa, jonka seurassa ne ovat. ECM toimii rakenteellisena tukena soluille ja se myös o cm myötävaikuttaa signalointiin ja solujen kohtalon ohjaukseen. Useimmiten ECM koostuu o glykosaminoglykaaneista ja kuitumaisista proteiineista kuten kollageenista, g 30 elastiinista, laminiinista ja fibronektiinistä, jotka itse ovat kokoontuneet x nanosäikeiseksi verkostoksi. 3D-solukasvun ihanteellisen tukitelineen tulisi kyetä
CC
jäljittelemään luonnonmukaisen ECM:n rakennekomponenttia, tukemaan solukasvua £! ja sen ylläpitoa, siinä tulisi olla toisiinsa yhteydessä olevien huokosten oikealla tavalla
CD
o mitoitettu verkosto, joka sallii solujen tehokkaan kulkeutumisen ja ravinteiden S 35 siirtymisen soluihin. Tukitelineen mekaanisten ja kemiallisten ominaisuuksien tulisi johtaa olennaisella tavalla solun toimintaan kuten natiivissa tilassa.
2
Hydrogeelejä, joiden alkuperä voi olla sekä synteettinen että luonnollinen, on ilmaantunut sopiviksi tukitelineiksi 3D-soluviljelmiä varten. Hydrogeeleissä oleva, toisiinsa yhteydessä olevien huokosten verkosto tekee mahdolliseksi biologisen nesteen suuren määrän pidätyksen, helpottaa hapen, ravinteiden ja jätteen kuljetusta. 5 Edelleen useimmat hydrogeelit voidaan muodostaa lievissä, solujen kanssa yhteensopivissa olosuhteissa ja biologisia ominaisuuksia voidaan muokata pintakemian avulla.
Teknisesti muokatuilla hydrogeeleillä, joiden mekaanisia, kemiallisia ja biologisia 10 ominaisuuksia on muokattu, kyetään jäljittelemään ECM-matriisia ja näin ollen vakiinnuttamaan niiden käyttökelpoisuus 3D-solukasvatuksessa. Kaupallisia tuotteita 3D-solukasvatusta varten ovat esimerkiksi PuraMatrix™ (3DM Inc.) ja Matrigel (BD Biosciences). PuraMatrix™ on itsestään kokoontuneiden peptidisten nanokuitujen hydrogeeli, jotka nanokuidut muistuttavat luonnollisen säiemäisen kollageenin 15 rakennetta ECM:ssä ja joiden kuitujen halkaisija on 5-10 nm. Veden pitoisuus siinä on myös suuri, tyypillisesti 99,5 %. Patenttijulkaisuissa US 7,449,180 ja WO 2004/007683 kuvataan peptidiset hydrogeelit. Matrigel on gelatiinimainen proteiiniseos, jota hiiren kasvainsolut erittävät. Seos muistuttaa monissa kudoksissa esiintyvää kompleksista, solun ulkopuolista ympäristöä ja monet solubiologit käyttävät 20 sitä soluviljelmän substraattina. MaxGel™ ECM Matrix (Sigma-AIdrich), joka sisältää ihmisen ECM-komponenttien seoksen, muodostaa geelin ympäristön lämpötilassa.
Bakteeriperäistä selluloosaa on käytetty haavoja parantavissa kalvoissa ja tukitelineena soluviljelmässä. Bakteeriperäisen selluloosan käyttöä soluviljelmässä 25 rajoittaa fermentoidun materiaalin luontainen rakenne; viljelyn aikana bakteeriperäistä selluloosaa muodostuu hyvin tiiviinä kalvoina ilman ja veden rajapinnalle ” fermentorissa. Muodostuneet kalvot ovat liian tiiviitä useille 3D-soluviljelytehtäville ja o cm lukuisia muutoksia tarvitaan huokoisuuden parantamiseksi, jota huokoisuutta i o tarvitaan solujen läpäisemistä ja soluryppäiden muodostumista varten.
§ 30 x Hydrogeelimateriaaleja käytetään myös laajasti muun tyyppisissä viljelytöissä, joissa Q_ tarvitaan hydrofiilista tukimateriaalia, esimerkiksi agar-tyyppisiä hydrokolloideja £! käytetään laajasti kasvi-, bakteeri- ja sienisolujen viljelmissä erilaisia mikrobiologisia co o tarkoituksia varten.
° 35
Patenttijulkaisussa US 5,254,471 kuvataan erittäin hienoista kuiduista tehty kantaja solujen viljelemiseksi, patenttijulkaisussa WO 2009/126980 kuvataan selluloosaan 3 perustuva hydrogeeli, joka sisältää selluloosaa, jonka keskimääräinen polymeroitumisaste on 150-6200.
Tunnetun tekniikan mukaiset ratkaisut on todettu sangen epätyydyttäviksi 5 soluviljelmässä. Kaikki tämänhetkiset 2D- ja 3D-soluviljelymenetelmät ja -matriisit edellyttävät eläinperäisten kemikaalien tai yhdisteiden käyttöä biomateriaalin väliaineessa, jotta soluja kyettäisiin ylläpitämään ja niiden lukumäärää lisäämään. Kantasolujen ylläpito on erityisen vaativaa eikä olemassa ole yksinkertaisia ratkaisuja ajatellen soluviljelyn väliaineessa käytettävää matriisia, joka pitäisi kantasolut elossa. 10 Eläinperäisten yhdisteiden esiintyminen soluviljelyn ympäristössä aiheuttaa immuunireaktioiden vakavan vaaran ja erityyppisiä myrkyllisyysongelmia, jotka lopulta tappavat viljellyt solut. Soluviljelyn matriisit, jotka sisältävät eläinperäisiä lisäaineita, eivät sovellu käytettäviksi yhdessä kantasolujen kanssa, erityisesti mikäli kantasoluja on tarkoitus käyttää kudossiirrossa ja kudosteknologiassa (tekninen 15 muokkaus). Lisäksi monet soluviljelmän väliaineessa käytettäviksi ehdotetuista polymeereistä eivät siedä fysiologista lämpötilaa tai ovat myrkyllisiä soluille.
Keksinnön lyhyt kuvaus 20 On olemassa selvä tarve parannetulle soluviljelymateriaalille, jolla voidaan saada aikaan oikeanlainen kolmi- tai kaksiulotteinen tuki erilaisille solutyypeille. Näitä toiminnallisia 3D-solumalleja voidaan käyttää työkaluina lääkkeiden etsinnässä korvaamaan eläinkokeet, ja ne ovat edistyneempiä kuin tällä hetkellä käytetyt 2D- solumallit. Viljeltyjen solujen kuljetus on myös erittäin toivottavaa, esimerkiksi silloin, 25 kun tavoitteena on kudossiirto tai soluhoito. Mahdollisuus siirtää viljeltyjä soluryppäitä 3D-matriisissa on toivottavaa, kun kehitetään erilaisia in v/fro-solumalleja. Olemassa £2 olevat 3D-soluviljelyn biomateriaalit eivät salli hydrogeelimatriisin siirtoa neulalla o cm viljeltyjä soluja vakavasti vahingoittamatta.
i O) o g 30 Näin ollen esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusi lähestymistapa x edellä mainittujen, tunnetun tekniikan tasolla ilmenevien ongelmien ratkaisemiseksi Q_ tai vähentämiseksi ainakin osittain. Keksinnön tavoitteet saavutetaan soluviljelyyn £! tarkoitetulla koostumuksella, joka käsittää selluloosananokuituja tai niiden johdan to o naista ja jonka tunnuspiirteenä on se, mitä on esitetty itsenäisessä patenttivaatimuk- 1 35 sessa. Edulliset suoritusmuodot on kuvattu epäitsenäisissä patenttivaatimuksissa.
4
Esillä oleva keksintö perustuu selluloosananokuitujen tai niiden johdannaisten käyttöön 2D- ja 3D-soluviljelymatriisissa. Esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan selluloosan nanokuitujen (CNF) tai niiden johdannaisen käyttö soluviljelymatriisissa. Selluloosan nanokuitujen tai niiden johdannaisen käyttö 2D- ja 3D-soluviljely-5 matriisissa tekee tarpeettomaksi eläinperäisten lisäaineiden käytön solujen lisäämiseksi ja lisääntymiseksi matriisissa, joka sisältää selluloosananokuituja tai niiden johdannaisia.
Esillä olevan keksinnön keksijä on yllättäen todennut, että kasvista peräisin olevaa 10 CNF-hydrogeeliä voidaan käyttää tämän enempää muokkaamatta biomimeettisenä ihmisen ECM-matriisina 3D-soluviljelmässä. Solujen lisääntymiseen ja elossapysymiseen liittyvät tiedot viittaavat siihen, että CNF-hydrogeeli on optimaalinen biomateriaali solujen 3D-tukitelineisiin pitkälle kehitetyissä, toiminnallisissa, solupohjaisissa seulontamäärityksissä, jossa läpimenevät määrät ovat 15 suuria, lääkeaineita kehitettäessä, lääkeaineen myrkyllisyyttä testattaessa ja regeneratiivisessa lääketieteessä.
Esillä olevan keksinnön keksijät kuvaavat ensimmäisen kerran kasviperäisen CNF-hydrogeelin fysikaalisia ja biologiseen yhteensopivuuteen liittyviä ominaisuuksia. 20 Kasviperäistä selluloosaa käytetään laajasti paperi- ja tekstiiliteollisuudessa ja sitä esiintyy runsaasti luonnossa. Luonnonmukaisesta (natiivista) selluloosananokuidusta koostuva hydrogeeli on läpikuultamatonta. Selluloosamassan kemiallinen muokkaus ennen mekaanista hajotusta johtaa optisesti läpinäkyvien hydrogeelien muodostumiseen.
25
Esillä oleva keksintö perustuu selluloosananokuiduista (CNF) koostuvien, £2 vesipohjaiseen ympäristöön dispergoitujen hydrogeelien kokeellisiin tutkimuksiin, o cm Nanokuidut ovat erittäin hydrofiilisiä johtuen selluloosapolymeerien funktionaalisista o hydroksyyliryhmistä ja ne ovat peittyneet osittain hemiselluloosan polysakkarideilla.
§ 30 x Näin ollen, esillä olevan keksinnön ensimmäisen piirteen mukaan aikaan saadaan solu- Q_ viljelyyn tarkoitettu koostumus, joka sisältää selluloosan nanokuituja tai niiden £2 johdannaista, joka selluloosananokuitu on hydrogeelinä tai kalvona.
tö o ^ 35 Esillä olevan keksinnön eräs merkittävä etu on se, että soluja voidaan ylläpitää (ja saada lisääntymään) tämän biomateriaalia olevan väliaineen pinnalla tai sen sisällä ilman solujen ulkopuolelta peräisin olevia, eläin- tai ihmispohjaisia kemikaaleja. Solut 5 ovat jakaantuneet tasaisesti selluloosan nanokuituja tai niiden johdannaista sisältävän väliaineen/matriisin pinnalle tai tähän väliaineeseen/matriisiin. Solut jakautuvat väliaineen pinnalla tai väliaineessa, niiden lisääntyminen alkaa ja soluryppäitä alkaa kasvaa spontaanisti niin, ettei soluja keräänny soluviljelyjärjestelmän pohjalle. Solujen 5 homogeeninen jakautuminen selluloosananokuiduissa tai niiden johdannaisessa on edellytys sille, että biomateriaali voi toimia soluviljelmän 3D-väliaineena.
Esillä olevan keksinnön muita etuja ovat: selluloosa nanokuidut tai niiden johdannainen ovat inerttejä eivätkä ne tuota fluoresoivaa taustaa. Selluloosa nanokuituja tai 10 niiden johdannaista sisältävää väliainetta voidaan injektoida. Injektoitavuus selittyy Teologisilla ominaisuuksilla. Injektio voidaan toteuttaa niin, että solut pysyvät vakaasti matriisin sisällä ja ovat jakautuneena homogeenisesti matriisiin injektion jälkeen.
Piirustusten lyhyt kuvaus 15
Kuvio 1 esittää kryo-TEM-kuvia selluloosananokuitu hydrogeeleistä. Luonnonmukainen (natiivi) CNF on vasemmalla puolella (A) ja läpinäkyvä CNF on oikealla puolella (B).
Kuvio 2 esittää HepG2-solujen elinkelpoisuutta kaupallisissa soluviljelymateriaaleissa 20 [MaxGel™ (Sigma-AIdrich), HydroMatrix™ (Sigma-AIdrich) ja PuraMatrix™ (3DM Inc.)], kahdessa erilaisessa selluloosananokuitumateriaaleissa (natiivi CNF ja läpinäkyvä CNF) sekä CNF:ssa, johon on lisätty fibronektiiniä. AB-lisääntymismäärityksessä soluja viljeltiin 48 tuntia ja vertailusoluja viljeltiin samanlaisissa olosuhteissa muovipinnalla.
25 Kuvio 3 esittää natiivissa CNF-hydrogeelissä viljeltyjen ARPE-19-solujen elinkelpoisuutta sen jälkeen, kun solut on siirretty erikokoisilla neularuiskun neuloilla.
£2 Elinkelpoisuus on esitetty fluoresenssin suhteellisena intensiteettinä, o
CvJ
o Kuvio 4 esittää dekstraanien, joilla on erilaiset molekyylipainot (20 kDa, 70 kDa ja 250 g 30 kDa), diffuusiota 1-prosenttisen natiivista selluloosananokuidusta muodostuvan x hydrogeelin läpi.
CL
Kuvio 5 esittää valomikroskooppikuvan natiivin CNF-kalvon päällä olevista ARPE-19-
CD
o soluista. CNF-kalvo tukee solujen kasvua kuvan yläosassa, kuvan alaosassa solut ° 35 kasvavat soluviljelymuovin päällä. Suurennus 20x.
6
Kuvio 6 esittää mikroskoopilla, jolla on sama polttopiste, saatuja lohkokuvia soluviljelymuovin (A) päällä ja natiivista selluloosananokuidusta muodostuvassa hydrogeelissä (B) olevista HepG2-soluista.
5 Kuvio 7 esittää 0,5% CNF-hydrogeelin viskoelastisia ominaisuuksia dynaamisten, värähtelyyn perustuvien Teologisten mittausten perusteella. 0,5% natiivin CNF-hydrogeelin tapauksessa on esitetty suureen G' (varastomoduuli) ja G" (häviömoduuli) riippuvuus taajuudesta.
10 Kuvio 8 esittää 0,5% CNF-hydrogeelien viskositeettia kohdistettujen leikkausvoimien funktiona verrattuna vesiliuokoisten polymeerien polyakryyliamidin (5000 kDa) ja CMC:n (250 kDa) 0,5% liuokseen.
Kuvio 9 esittää 0,5% CNF-hydrogeelien viskositeettia mitatun leikkausnopeuden 15 funktiona verrattuna 0,5% polyakryyliamidiin ja CMC:hen. Erilaisten fysikaalisten prosessien tyypilliset leikkausnopeusalueet on merkitty kuvioon nuolilla.
Kuvio 10 esittää kaavamaisesti neulassa virtaavaa soluja sisältävää CNF-hydrogeeliä. Alue, jossa leikkausnopeus on suuri (pieni viskositeetti) sijaitsee geelin ja neulan raja-20 pinnalla, ja alue, jossa leikkausnopeus on pieni (hyvin suuri viskositeetti), sijaitsee keskellä neulaa.
Kuvio 11 esittää leikkausnopeuden ja viskositeetin kehittymistä, kun 0,7% natiiviin CNF-hydrogeeliin kohdistettiin leikkausvoimia reometrissä, lieriön samankeskisen 25 geometrian tapauksessa, rasituksen ollessa vakio, 40 Pa.
£2 Kuvio 12 esittää 0,7% natiivin CNF-hydrogeelin dispersion rakenteen palautumista sen o c\j jälkeen, kun siihen on kohdistettu leikkausvoimia suurella leikkausnopeudella, i o verrattuna tilanteeseen lasisauvalla toteutetun varovaisen sekoituksen jälkeen.
i § 30 x Kuvio 13 esittää kahden sorasuspension pysyvyyttä 0,5% natiivissa CNF-hydrogeelissä ^ (ylärivi) ja 0,5% läpinäkyvässä CNF-hydrogeelissä (alarivi) 17 vuorokauden pituisen ajanjakson aikana. Sora oli CEN-standardin mukaista hiekkaa (EN 196-1), jonka
CD
o keskimääräinen hiukkaskoko oli 1-2 mm ja 2-3 mm. Näytteitä säilytettiin huoneen 1 35 lämpötilassa.
7
Kuvio 14 esittää entsymaattisen hydrolyysin vaikutusta selluloosan nanokuiduista muodostuvien geelien suspensiokykyyn. Sora oli CEN-standardin mukaista hiekkaa (EN 196-1), jonka keskimääräinen hiukkaskoko oli 1-2 mm 5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Esillä oleva keksintö kohdistuu soluviljelyyn tarkoitettuun koostumukseen, joka sisältää selluloosananokuituja tai niiden johdannaista, jotka selluloosananokuidut tai niiden johdannainen ovat hydrogeelinä tai kalvona. Selluloosananokuituja tai niiden 10 johdannaisia voidaan saada muusta kuin eläinperäisestä materiaalista kuten raaka-aineesta, joka käsittää kasvimateriaalia tai mikrobiperäistä selluloosaa tai joka on peräisin bakteereiden fermentointiprosesseista, ja joka tunnetaan yleisesti käsitteellä bakteeriperäinen selluloosa (BC). Lisäksi selluloosananokuituja tai niiden johdannaisia voidaan saada eläinperäisistä lähteistä kuten tunikaateista.
15
Mikäli toisin ei ole mainittu, käsitteillä, joita käytetään kuvauksessa ja patenttivaatimuksissa, on soluviljelmien yhteydessä yleisesti käytetyt merkitykset. Erityisesti seuraavilla käsitteillä on alla esitetyt merkitykset.
20 Käsitteellä "soluviljelyyn tarkoitettu koostumus" viittaa materiaaliin, joka käsittää selluloosananokuituja tai selluloosananokuitujen johdannaisia ja jota materiaalia käytetään soluviljelmän väliaineena. Mainittua koostumusta voidaan käyttää myös solujen tai soluryppäiden siirtoon. Selluloosan nanokuidut voivat olla hydrogeelinä tai kalvona. Tällainen koostumus voi sisältää lisäksi erilaisia lisäaineita kuten erityisiä 25 solun ulkopuolisen matriisin komponentteja, seerumia, kasvutekijöitä ja proteiineja.
” Käsitteellä "selluloosaraaka-aine" viitataan mihin tahansa selluloosaraaka-aineen o lähteeseen, jota voidaan käyttää selluloosamassan, jauhetun massan tai i o selluloosananokuitujen valmistuksessa. Tämä raaka-aine voi perustua mihin tahansa i g 30 selluloosaa sisältävään kasvimateriaaliin. Raaka-aine voi olla myös peräisin tietyistä x bakteereiden fermentointiprosesseista. Kasvimateriaali voi olla puuta. Puu voi olla
CL
peräisin havupuusta kuten erilaisista kuusista (spruce, fir), männystä, lehtikuusesta, ™ douglas-kuusesta tai hemlokista, tai lehtipuusta kuten koivusta, haavasta, poppelista,
CO
o lepästä, eukalyptuksesta tai akaasiasta, tai havupuiden ja lehtipuiden seoksesta. Muu ° 35 kuin puumateriaali voi olla peräisin maatalouden jätteistä, ruohoista tai muista kasvi- materiaaleista kuten oljista, lehdistä, puunkuoresta, siemenistä, siemenkuorista, kukinnoista, vihanneksista tai hedelmistä, jotka ovat peräisin puuvillasta, maissista, 8 vehnästä, kaurasta, rukiista, ohrasta, riisistä, pellavasta, hampusta, manillahampusta, sisaalihampusta, juutista, ramiesta, kenafista, bagassista, bambusta tai kaisloista. Selluloosaa oleva materiaali on voitu saada myös selluloosaa tuottavasta mikro-organismista. Mikro-organismit voivat kuulua sukuun Acetobacter, Agrobacterium, 5 Rhizobium, Pseudomonas tai Alcaligenes, edullisesti sukuun Acetobacter ja edullisemmin lajiin Acetobacter xylinum tai Acetobacter pasteurianus.
Käsite "selluloosamassa" viittaa selluloosakuituihin, jotka on eristetty mistä tahansa selluloosaraaka-aineesta käyttäen kemiallisia, mekaanisia, lämpömekaanisia tai 10 kemiallisia lämpömekaanisia kuidutusprosesseja. Tyypillisessä tapauksessa kuitujen halkaisijat vaihtelevat alueella 15-25 pm ja niiden pituus on enemmän kuin 500 pm, mutta näiden parametrien ei ole tarkoitus rajoittaa esillä olevaa keksintöä.
Käsitteellä "selluloosan nanokuitu" viitataan joukkoon eristettyjä selluloosananokuituja 15 (CNF) tai nanokuitujen kimppuihin, jotka on saatu selluloosaraaka-aineesta tai selluloosamassasta. Nanokuiduilla on tyypillisesti suuri muotosuhde (aspektisuhde): pituus voi olla esuurempi kuin yksi mikrometri, kun taas luku keski määräinen halkaisija on tyypillisesti alle 200 nm. Nanokuitukimppujen halkaisija voi myös olla suurempi, mutta se on yleensä alle 1 pm. Pienimmät nanokuidut ovat samankaltaisia kuin 20 niinsanotut alkeisfibrillit, joiden halkaisija on tyypillisesti 2-12 nm. Fibrillien tai fibrillikimppujen dimensiot riippuvat raaka-aineesta ja hajotusmenetelmästä.
Selluloosananokuidut voivat myös sisältää joitakin hemiselluloosia; määrä riippuu kasvi lähteestä. Selluloosaraaka-aineesta, selluloosamassasta tai jauhetusta massasta saatujen, selluloosananokuitujen mekaaninen hajotus toteutetaan sopivilla laitteilla 25 kuten jauhimella, hiertimellä, homogenisaattorilla, kollodisaattorilla, kitkajauhimella, ultraäänilaitteella, fluidisaattorilla kuten mikrofluidisaattorilla, makrafluidisaattorilla tai ” fluidisattorityyppisellä homogenisaattorilla. "Selluloosananokuituja" voidaan myös o cm eristää suoraan tietyistä fermentoi nti prosesseista. Esillä olevan keksinnön mukainen, o selluloosaa tuottava pieneliö voi kuulua sukuun Acetobacter, Agrobacterium, g 30 Rhizobium, Pseudomonas tai Alcaligenes, edullisesti sukuun Acetobacter ja x edullisemmin lajiin Acetobacter xylinum tai Acetobacter pasteurianus.
CL
"Selluloosananokuidut" tai "selluloosananokuidut tai niiden johdannainen" voi myös £! olla mikä tahansa kemiallisesti tai fysikaalisesti muokattu, selluloosananokuitujen tai
CD
o nanokuitukimppujen johdannainen. Kemiallinen muokkaus voi perustua esimerkiksi S 35 selluloosamolekyylien karboksimetylointi-, hapetus-, esteröinti- tai eetteröi nti reaktioon. Muokkaus voitaisiin toteuttaa myös anionisten, kationisten tai ei-ionisten aineiden tai niiden minkä tahansa yhdistelmän fysikaalisella adsorptiolla 9 selluloosan pinnalle. Kuvattu muokkaus voidaan toteuttaa ennen selluloosan nanokuitujen valmistusta, sen aikana tai jälkeen. Tietyt muokkaukset saattavat johtaa CNF-materiaaleihin, jotka voivat hajota ihmisen elimistössä.
5 "Selluloosananokuitujen" mikrobiologinen puhtaus on olennaista soluviljelyn suorituskyvyn kannalta. Tästä syystä "selluloosananokuidut" steriloidaan ennen soluviljelykokeita hydrogeelin tai kalvon muodossa. Tämän lisäksi tärkeätä on minimoida tuotteen kontaminoituminen mikrobeilla ennen fibrillointia ja sen aikana. Ennen fibrillointia on edullista ottaa selluloosamassa talteen aseptisesti massatehtaalta 10 välittömästi valkaisuvaiheen jälkeen, jolloin massa on edelleen steriiliä.
Olemassa on useita laajasti käytettyjä synonyymejä selluloosa nanokuiduille.
Esimerkkejä ovat mm. nanoselluloosa, nanofibrilloitu selluloosa (CNF), nanofibrilliselluloosa, selluloosan nanokuitu, nanomitan fibrilloitu selluloosa, 15 mikrofibrilliselluloosa, mikrofibrilloitu selluloosa (CNF) tai selluloosan mikrofibrillit.
Lisäksi tiettyjen mikrobien tuottamilla selluloosan nanokuiduilla on myös erilaisia synonyymejä. Esimerkkejä ovat bakteeriperäinen selluloosa, mikrobiperäinen selluloosa (MC), bioselluloosa, nata de coco (NDC) tai coco de nata. Tässä keksinnössä kuvatut selluloosan nanokuidut eivät ole samaa materiaalia kuin niinkutsutut 20 selluloosakuitukiteet ("whisker"), jotka tunnetaan myös käsitteillä: selluloosan nanokuitukiteet, selluloosan nanokiteet, selluloosan nanosauvat, sauvamaiset selluloosan mikrokiteet tai selluloosan nanolangat. Eräissä tapauksissa samankaltaista terminologiaa käytetään kummastakin materiaalista, esimerkkinä Kuthcarlapati et ai.
(Metals Materials and Processes 20(3):307-314, 2008), jotka kutsuivat tutkittua 25 materiaalia "selluloosan nanokuiduiksi", vaikka he selvästikin viittasivat selluloosan nanokidekuituihin. Näissä materiaaleissa, toisin kuin selluloosan nanokuiduissa, ei J2 tyypillisesti ole amorfisia lohkoja säierakennetta (fibrillirakennetta) pitkin, mikä johtaa o cm jäykempään rakenteeseen. Selluloosan kidekuidut ovat myös lyhyempiä kuin o selluloosan nanokuidut; pituus on tyypillisesti vähemmän kuin yksi mikrometri.
§ 30 x Yksittäisten selluloosananokuitujen dimensiot ovat sangen lähellä edellä mainittuja, α ECM:ssä olevien kollageenikuitujen mittoja, eli 4-10 nm. Näin ollen CNF-pohjaisia JM hydrogeelejä voidaan käyttää 3D-soluviljelmän matriisina.
tö o ^ 35 Esillä olevan keksinnön mukaisissa soluviljelykokeissa käytettiin kahdentyyppisiä sellu loosan nanokuituja: läpikuultamattomia luonnonmukaisia (natiiveja) CNF-kuituja ja 10 optisesti läpinäkyviä CNF-kuituja. Näiden materiaalien yksityiskohtainen kuvaus on esitetty esimerkeissä, osassa materiaalit ja menetelmät.
Käsitteellä "selluloosananokuitu hydrogeeli" viitataan selluloosananokuitujen 5 vesidispersioon.
Käsitteellä "selluloosan nanokuitujen kalvo (membraani)" viitataan selluloosakuitujen märkään tai kuivaan levymäiseen muodosteeseen. Kalvot valmistetaan tyypillisesti suodattamalla selluloosan nanokuitujen laimeata dispersiota alipainesuodatukseen 10 sopivalla laitteella, sopivan suodattimen avulla. Liuotinvalua voidaan myös käyttää edellämainittujen kaivorakenteiden saamiseen. Saatua kalvoa voidaan käyttää sellaisenaan märkänä tai kuivattuna ennen käyttöä.
Esillä olevan keksinnön mukaiset selluloosananokuidut tai niiden johdannainen voivat 15 käsittää selluloosananokuitujen tai nanokuitukimppujen kemiallisesti tai fysikaalisesti muokattuja johdannaisia.
Esillä olevan keksinnön mukainen, soluviljelyyn tarkoitettu koostumus voi sisältää lisäksi sopivia lisäaineita, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu erityisistä solun 20 ulkopuolisen matriisin komponenteista, seerumista, kasvutekijöistä ja proteiineista.
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös soluviljelyyn tarkoitettu matriisi, joka matriisi sisältää eläviä soluja, soluviljelyyn tai lääkeaineiden kuljetukseen tarkoitetun koostumuksen muodostaessa hydrogeelin, jolloin soluja on läsnä matriisissa 25 kolmiulotteisena tai kaksiulotteisena järjestelynä.
” Solut voivat olla mitä tahansa soluja. Mikä tahansa eukarioottinen solu kuten o ^ eläinsolut, kasvisolut ja sienisolut kuuluvat esillä olevan keksinnön suojapiiriin, samoin i o kuin pro kanootti set solut kuten bakteerisolut.
§ 30 g Solulinjasta riippuen kokeet toteutetaan 2D tai 3D, eli soluja viljellään CNF-kalvoilla tai G_ -geeleillä tai solut on dispergoitu homogeenisesti CNF-hydrogeeleihin tai CNF- £! kalvoihin. Esillä olevan keksinnön erityisissä esimerkeissä kuvataan, että spontaanisti co o ilmestyvät verkkokalvon pigmentin epiteelisolut (ARPE-19) muodostavat ° 35 yksikerroksen, kun taas ihmisen hepatosolukarsinooman (HepG2) solut tuottavat joko yksikerroksen tai solupesäkkeitä.
11
Solut voidaan detektoida käyttäen mitä tahansa alalla tunnettua ilmaisukeinoa tai väriainetta.
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös menetelmä minkä tahansa edellä olevan 5 patenttivaatimuksen mukaisen koostumuksen tuottamiseksi, johon menetelmään kuuluvissa vaiheissa saadaan aikaan selluloosan nanokuituja tai niiden johdannaista, valinnaisesti mainittuja selluloosan nanokuituja tai niiden johdannaista ja vettä sekoitetaan yhteen; ja selluloosan nanokuidut tai niiden johdannainen tai saatu seos siirretään tai laitetaan sopivaan ympäristöön soluviljelyä varten.
10
Keksinnön eräässä suoritusmuodossa menetelmään kuuluu lisäksi vaihe, jossa saatu seos yhdistetään sopivaan lääkkeeseen.
Selluloosananokuitujen hydrogeelejä tai kalvoja tai johdannaisia tai esillä olevan 15 keksinnön mukaista koostumusta voidaan käyttää materiaalina solujen kuljettamiseksi.
Selluloosananokuitujen hydrogeelejä tai näiden kuitujen kalvoja tai johdannaisia tai soluviljelyyn tarkoitettua koostumusta voidaan käyttää kuljettavana materiaalina 20 kliinisessä käytössä.
Esillä oleva keksintö kohdistuu selluloosan nanokuitujen tai niiden johdannaisen tai esillä olevan keksinnön mukaisen koostumuksen mikrobiologiseen käyttöön laboratorioiden ja/tai teollisuuden tarkoituksiin väliaineena tai väliaineiden yhdisteenä 25 solujen ylläpitämiseksi in vitro.
£2 Selluloosan nanokuituja tai niiden johdannaisia sisältävää koostumusta voidaan o cm käyttää solujen tai entsyymien immobilisointiin.
i O) o g 30 Esillä oleva keksintö kohdistuu myös menetelmään solujen viljelemiseksi, johon x menetelmään kuuluvissa vaiheissa saadaan aikaan soluja; solut saatetaan
CL
kosketukseen minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen, soluviljelyyn ™ tarkoitetun, selluloosan nanokuituja tai niiden johdannaista sisältävän koostumuksen co o kanssa matriisin muodostamiseksi; ja soluja viljellään mainitussa matriisissa ° 35 kolmiulotteisena tai kaksiulotteisena järjestelynä.
12
Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen yhden tai useamman edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen koostumus, menetelmä tai käyttö, jossa solut ovat eukarioottisia soluja.
5 Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen yhden tai useamman edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen koostumus, menetelmä tai käyttö, jossa solut ovat prokarioottisia soluja. Prokarioottisia soluja ovat mm. sellaiset pieneliöt kuten aerobiset tai anaerobiset bakteerit, virukset tai fungit kuten hiiva ja homeet.
10 Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen yhden tai useamman edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen koostumus, menetelmä tai käyttö, jossa solut ovat kantasoluja.
Selluloosananokuitujen poisto voi tapahtua esimerkiksi entsyymien avulla käyttäen 15 selluloosamolekyylin entsymaattista hajotusta. Sopivia entsyymejä ovat esimerkiksi kaupallisesti saatavat sellulaasit. Viljeltyjä solulinjoja on myös voitu muokata geneettisesti tarvittavan entsyymiproteiinin tuottamiseksi viljelyjärjestelmään.
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös menetelmä selluloosan nanokuitujen tai 20 niiden johdannaisen poistamiseksi solujen kasvumateriaalista, johon menetelmään kuuluvissa vaiheissa saadaan aikaan materiaalia, joka sisältää solujen kasvatuksen väliainetta ja soluja; mainittu materiaali laimennetaan vesipohjaisella tai muunlaisella kuin vesipohjaisella nesteellä; ja selluloosan nanokuidut poistetaan dekantoimalla. Maltillista sentrifugointia voidaan käyttää solujen ja soluaggregaattien sedimentointiin 25 ennen dekantointia.
” Esillä olevat keksijät ovat yllättäen todenneet, että kasviperäistä CNF-hydrogeeliä o ^ voidaan käyttää sitä millään tavalla muokkaamatta biomimeettisenä ihmisen ECM- i o materiaalina 3D-soluviljelyssä. Solujen lisääntymiseen ja elinvoimaisuuteen liittyvät g 30 tiedot viittaavat siihen, että CNF-hydrogeeli on optimaalista biomateriaalia solujen 3D- x tukitelineeksi kehittyneitä toiminnallisia solupohjaisia seulontamäärityksiä varten,
CL
missä läpimenevät määrät ovat suuria, lääkeaineiden kehityksessä, lääkeaineen ^ myrkyllisyyden testauksessa ja regeneroivassa lääketieteessä.
co o ° 35 Esillä olevassa keksinnössä kuvataan ensimmäisen kerran kasviperäisen CNF- hydrogeelin fysikaaliset ja biologiseen yhteensopivuuteen liittyvät ominaisuudet. Kasviselluloosaa käytetään laajasti paperi- ja tekstiiliteollisuudessa ja sitä esiintyy 13 runsaasti luonnossa. Natiivi selluloosananokuiduista koostuva hydrogeeli on läpikuultarmatonta. Selluloosamassan kemiallinen muokkaus ennen mekaanista hajotusta johtaa optisesti läpinäkyvien hydrogeelien muodostumiseen.
5 Esillä olevan keksinnön mukaisia selluloosananokuituja voidaan käyttää hydrogeelinä tai kuivaan tai märkänä kalvona. CNF-hydrogeelin geelilujuutta voidaan muuttaa helposti laimentamalla. Selluloosananokuidut tai niiden johdannaiset, jolla on samankaltaisia ominaisuuksia, eivät ole myrkyllisiä soluille.
10 Mikäli selluloosan nanokuiduista saatuja hydrogeelejä verrataan UV-silloittuviin, solu-viljelyyn sopiviin hydrogeeleihin kuten hyaluronihappoon tai PEG-hydrogeeleihin, CNF-materiaaleja pidetään paljon vähemmän myrkyllisinä. UV-silloittuvissa geeleissä tarvitaan haitallisia fotoinitiaattoreita geeliytymisen käynnistämiseksi, kun taas CNF-hydrogeelit muodostuvat itsestään. CNF-hydrogeelien ei-kovalenttinen luonne sallii 15 myös huokoisuuden säätelyn laimentamalla.
Solut ovat jakaantuneet tasaisesti selluloosan nanokuiduista saatuihin hydrogeeleihin ja ne voivat automaattisesti monistua ja kasvaa 3D-soluryppäiksi laskeutumatta solu-viljelyn tukirakenteen pohjalle. Kaikki tällä hetkellä käytetyt, kaupalliset soluviljelyyn 20 tarkoitetut 3D-väliaineet vaativat tarttumispolymeerin lisäystä, jotta solut muodostaisivat 3D-rakenteen soluviljelyn tukirakenteessa.
Esillä olevan keksinnön mukaisia selluloosan nanokuituja tai niiden johdannaista voidaan käyttää ilman tarttumispeptidiä. Solut tarttuvat tukirakenteeseen ja ne 25 hajaantuvat itsestään homogeenisesti selluloosan nanokuiduista saatuun hydrogeeliin.
Solut suspendoituvat homogeenisesti jatkuvaan faasiin selluloosan nanokuitujen ” muodostaman mekaanisen tuen johdosta. Fluomattavan suuri myötörasitus (yield o stress) stabiloi solut ja kasvaneet soluryppäät laskeutumista vastaan.
i O) cp g 30 Kasviperäisen selluloosan nanokuiduista saadut hydrogeelit toimivat ilman tarttumis- x peptidiä ja/tai räätälöityä huokoisuutta, kun taas bakteeriperäisen selluloosananokuidut vaativat tarttumispeptidin. Bakteeriperäistä selluloosaa on £! käytetty suoraan fermentoinnin jälkeen, missä tapauksessa tuloksena oleva co o kaivorakenne on huomattavasti kiinteämpää kuin esillä olevan keksinnön mukainen ° 35 hydrogeeli, eli selluloosananokuiduista saatu hydrogeeli. Tästä syystä tunnetun tekniikan mukaisissa menetelmissä on tarvittu lisäprosesseja hydrogeelimatriisin tekemiseksi huokoisemmaksi.
14
Solut kasvavat 3D-matriisin sisällä tai sen päällä. Materiaali voi olla injektoitava tai levymäinen kalvo, jonka pinnan topologia on asianmukainen.
5 CNF:n ominaisuudet ovat lähes optimaaliset solujen 3D-viljelyyn: läpinäkyvä, ei-myr-kyllinen, erittäin viskoosi, suuri suspendoiva kyky, suuri vedenpidätyskyky, hyvä mekaaninen tarttuvuus, muunlainen kuin eläinperäinen, muistuttaa ECM:n mittoja, epäherkkä suoloille, lämpötilalle tai pH:Ile, hajoamaton, autofluoresoimaton. CNF:Mä on mitätön fluoresenssitausta materiaalin kemiallisesta rakenteesta johtuen. Lisäksi 10 CNF ei ole myrkyllistä soluille.
Soluja voidaan viljellä CNF-geeleillä pitkiä aikoja, esimerkiksi 2-7 vuorokautta tai jopa kauemmin. Soluja voidaan myös viljellä tai vain suspendoida hydrogeeliin lyhyeksi ajaksi, esimerkiksi minuuteista useisiin tunteihin. Solut käyttävät tätä selluloosan 15 nanokuiduista saatua matriisia tukialustana toimivana kasvun tukitelineenä / tukena. Solut muodostavat ryppäitä, mikä osoittaa selluloosan nanokuitujen käyttökelpoisuuden 3D-soluviljelyn tukitelinenä. Solut kasvavat kerroksina tai soluaggregaatteina CNF-geelin päällä tai sen sisällä, riippuen kerrostusmenetelmästä ja solutyypistä.
20 CNF-hydrogeeli, joka ei ole myrkyllistä, on yhtä hyvä ECM tutkituille soluille kuin ihmisen ECM:iin perustuva MaxGel™. Solujen elossa pysyvyys on jopa suurempaa kuin tuotteissa PuraMatrix™ tai HydroMatrix™. CNF-hydrogeeleihin ei lisätä ihmis- eikä eläinperäisiä ECM-komponentteja. Fibronektiinin tai IV-kollageenin lisäys CNF-25 pohjaisiin järjestelmiin voi kuitenkin olla edullista eräissä tapauksissa. Diffuusiotutkimusten perusteella CNF-hydrogeeli on erittäin läpäisevää ja helpottaa ” vapaasti hapen, ravinteiden ja solujen vesiliukoisten metaboliittien vaihtoa.
o c\j i o Kryotransmissioon perustuva elektronimikroskopia osoittaa, että CNF-hydrogeeli g 30 koostuu yksittäisten selluloosananokuitujen ja kuitukimppujen seoksesta. CNF:n x diensiot ovat samankaltaiset kuin luonnonmukaisella ihmiskollageenilla, joka on ECM:n
CL
luonnollinen komponentti ja jota käytetään yleisesti solun tukena. CNF-hydrogeelin ™ lujuus (kimmoisuus) pysyy lähes vakiona alueella 0,01-1 Hz olevan käytetyn co o taajuuden funktiona. Reologiset tiedot paljastavat, että leikkausviskositeetti on noin ° 35 useita satoja kiloPascalia levossa (alhainen leikkausrasitus), ja se putoaa muutamaan
Pascaliin, kun leikkausrasitus on yksi Pascal. Tämä käyttäytyminen on sangen ainutlaatuista biomateriaalina toimiville hydrogeeleille. Se tekee mahdolliseksi 15 äärimmäisen hyvän suspendointikyvyn ja solujen kannatuksen ja oheneminen leikkausrasituksen seurauksena tekee mahdolliseksi toivotun helpon annostelun ja solujen injektoinnin CNF-hydrogeeliin, käytettyjen neulojen koosta riippumatta, jollaista käyttäytymistä ei ole saavutettu aikaisemmin muilla soluviljelyssä 5 biomateriaaleina käytetyillä hydrogeeleillä. Kimmoisuuteen ja jäykkyyteen liittyvät mekaaniset ominaisuudet ovat optimaaliset CNF-hydrogeelien tapauksessa 3D-soluvil-jelmän kasvua ja solujen injektointia ajatellen.
Esillä olevan keksinnön etu on se, että selluloosananokuiduista tai niiden 10 johdannaisesta saadun säikeisen verkon dimensiot ovat hyvin lähellä luonnollisen, kollageenin nanokuiduista muodostuvan ECM-verkon dimensioita. Lisäksi selluloosan nanokuidut tai niiden johdannainen ovat muunlaista kuin eläinperäistä materiaalia, eli vaarana ei ole sairauden siirtymistä. Tällä hetkellä useimmat kaupalliset tuotteet on eristetty eläimistä. Mahdollisuuksia säätää CNF-materiaalien fysikaalista muotoa 15 hydrogeeleistä kalvoiksi voidaan käyttää hyväksi.
Injektoitava hydrogeeli muodostaa tukevan matriisin solujen ympärille erittäin suuresta myötörasituksesta johtuen. CNF-kalvot ovat läpinäkyviä ja erittäin huokoisia. Massatuotanto on helppoa vaihtoehtoihin verrattuna.
20
Natiivit selluloosananokuidut eivät ole myrkyllisiä soluille. Solujen lisääntyminen on lähes kaksinkertainen selluloosananokuitujen tai sen johdannaisen tapauksessa, vertailuun nähden (pelkät solut). Soluja voidaan säädellä CNF-hydrogeeleillä pitkän aikaa (esimerkiksi 2-7 vuorokautta). Solut käyttävät selluloosananokuiduista saatua 25 matriisia kasvunsa tukialustana. Solut muodostavat ryppäitä, mikä osoittaa selluloosan nanokuitujen tai niiden johdannaisen käyttökelpoisuuden 3D-soluviljelmän tuki- ” telineenä. Solut kasvavat kerroksina CNF-geelin sisällä. Selluloosan nanokuiduilla tai o cm niiden johdannaisilla on mitätön fluoresenssitausta. Selluloosan nanokuiduista saadulla i 0 hydrogeelillä on optimaalinen kimmoisuus, jäykkyys, leikkausrasitus, mekaaninen i g 30 tarttuvuus ja huokoisuus ajatellen käyttöä 3D-ja 2D-soluviljelyn matriisina.
CC
CL
Vesipohjaisessa ympäristössä selluloosan nanokuidut muodostavat dispergoitujen nanokuitujen tai nanokuitujen kimppujen jatkuvan hydrogeeliverkon. Geeli muodostuu
CO
o erittäin hydratoituneista toisiinsa kietoutuneista fibrilleist, jopa hyvin alhaisina pitoi- ° 35 suuksina. Fibrillit voivat vuorovaikuttaa toisiinsa myös vetysidosten välityksellä.
Makroskooppinen rakenne tuhoutuu helposti mekaanisen sekoituksen seurauksena, eli geeli muuttuu juoksevaksi, kun siihen kohdistuu suuri leikkausrasitus. Selluloosanano- 16 kuiduista saatujen hydrogeelien ja/tai niiden johdannaisten käyttöä soluviljelymateriaalina ei ole kuvattu aikaisemmin.
Esillä olevan keksinnön sovelluksia ovat mm. soluviljelymateriaalin aikaansaaminen 5 bioteknologista tutkimusta varten. CNF:ää sisältävää solujen kasvatusalustaa voidaan käyttää solujen ylläpitoon ja kasvatukseen sekä solujen siirtoon. Esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan soluviljelyalusta, jota voidaan käyttää esimerkiksi kudosten teknisessä valmistuksessa ja haavan parannuksessa. Muita käyttösovelluksia ovat esimerkiksi 3D-lääkeaineiden toiminnalliset solutestausmääritykset. CNF-hydro-10 geelin ainutlaatuiset Teologiset ominaisuudet tekevät mahdolliseksi useita käyttösovelluksia, jotka perustuvat hydrogeelin injektoitavuuteen, kuten solujen injektointi CNF-hydrogeeliin silmän sisäisessä, lihaksen sisäisessä tai ihon alaisissa hoidoissa.
Seuraavat esimerkit on esitetty keksinnön havainnollistamiseksi edelleen, eikä niiden 15 ole tarkoitus rajoittaa keksinnön suojapiiriä. Tämän kuvauksen perusteella ajan asiantuntija kykenee muokkaamaan keksintöä monin tavoin.
Esimerkit 20 Materiaalit ja menetelmät CNF-hydrogeelien valmistus Läpikuultamaton natiivi CNF-hydrogeeli (1,7 p-%) saatiin suuripaineisella homogenoimalla märän selluloosamassan kuituja. Näin ollen prosessista saatu suora 25 tuote on laimea selluloosananokuitu hydrogeeli. Läpinäkyvä CNF-hydrogeeli (0,9 paino-%) saatiin samankaltaisella homogenointiprosessilla kemiallisesti muokatusta £2 selluloosamassasta. Näytteet steriloitiin autoklaavissa. Solututkimuksia varten CNF- o c\j hydrogeeli laimennettiin sopivaan pitoisuuteen ja homogenoitiin mekaanisella o sekoituksella tai sonikoimalla. Kuviossa 1 on esitetty kryo-TEM-kuvia natiivista g 30 CNF:stä ja läpinäkyvästä CNF:stä. Natiivi selluloosananokuiduista saatu hydrogeeli x koostuu yksittäisten selluloosan nanokuitujen ja kuitukimppujen seoksesta (kuvio IA).
Q_
Pienimpien kuitujen halkaisija on noin 7 nm, suurin osa selluloosamateriaalista ™ muodostaa kuitenkin 50-100 nm kimppurakenteissa. Tarkkaa pituusasteikkoa ei kyetä co o arvioimaan kuvioista materiaalin kietoutunesta ja kimppumaisesta luonteesta johtuen, ° 35 mutta vaikuttaa selvältä, että yksittäiset nanokuidut ovat useiden mikrometrien pituisia. Optisesti läpinäkyvän CNF: n kryo-TEM-kuva esittää homogeenisesti jakautuneiden yksittäisten selluloosan nanokuitujen verkostoa. Näiden nanokuitujen 17 halkaisija on arviolta 7 nm ja pituus ylittää mikrometrin. Nanokuiduissa on 100-200 nm:n pituisia suoria lohkoja, joita seuraa teräviä taitteita kuidun akselia pitkin. Suorat lohkot koostuvat erittäin kiteisistä selluloosadomeeneista - taittuvat osat muodostuvat amorfisista osista.
5 CNF-kalvojen valmistus CNF-kalvot valmistettiin natiivin CNF: n 0,2 p-% vesipohjaisen dispersion alipainesuodatuksella. Suodatuksen jälkeen märkiä kalvoja kuivattiin painon alla uunissa 55 °C:ssa 48 tuntia. Kuivat kalvot olivat sileitä ja läpikuultamattomia, pinta-10 alapainon ollessa 70-80 g/m2.
Entsymaattinen hydrolyysi CNF-hydrogeelien entsymaattinen hajoaminen osoitettiin hydrolysoimalla soraa sisältävät 0,5 % hydrogeelit käyttäen tuotetta Celluclast 1.5 LFG, CCN0367 15 (Novozymes, pH-optimi 5), Prot. 90 mg/ml. Natiivin CNF:n hajotus tapahtui pH:ssa 5, 50°C:ssa 4 vuorokauden ajan ja läpinäkyvän CNF:n hajotus toteutettiin pH:ssa 7, 21°C:ssa yhden tunnin ajan. Entsyymin annostus oli 5 mg entsyymiä yhteen grammaan CNF-kuituja.
20 HepG2-solut
HepG2-soluien alkuperä
Ihmisen hepatosolukarsinooman (HepG2) soluja saatiin kokoelmasta American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA).
25 HepG2-soluien vlläpitovilielmä
HepG2-soluja ylläpidettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen alustassa (DMEM, Gibco), $2 jota oli täydennetty 10 % sikiövasikan seerumia, penisilliinillä /streptomysiinillä o ^ (Gibco), 2 mM L-glutamiinilla (Gibco), 100 mM natriumpyruvaatilla (Gibco). Soluja o ylläpidettiin 75 cm2:n viljelypulloissa 37°C:ssa inkubaattorissa, jossa suhteellinen g 30 kosteus oli 95 % ja jonka ilmakehässä oli 5 % C02:ta. Solut siirrettiin viljelmästä g toiseen suhteessa 1:10 trypsinoimalla kahdesti viikossa, jakosuhteen ollessa 1:4.
Q_
Alusta vaihdettiin kerran 48 tunnissa ja soluja aliviljeltiin niin, että ne olivat kasvaneet yhteen 90-prosenttisesti.
CO
o ° 35 HepG2-soluien 3D-vilielmä CNF-hvdroaeelin päällä
Selluloosananokuiduista saatu hydrogeeli laitettiin 96-kuoppaisen kudosviljelymaljan pohjalle ja HepG2-solujen suspensiota kasvatusalustassa, joka sisälsi 25000-50000 18 solua/kuoppa, siirrostettiin joko CNF-hydrogeelin päälle tai sekoitettiin siihen. CNF-hydrogeelin pitoisuus vaihtelee alueella 0,01-1 %.
ARPE-19-solut 5 ARPE-19-soluien alkuperä
Spontaanisti ilmaantuvat verkkokalvon pigmentin epiteeli- (spontaneously arising retina pigment epithelial; ARPE-19) soluja saatiin kokoelmasta American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA).
10 ARPE-19-soluien vlläpitovilielmä ARPE-19-soluja viljeltiin Dulbeccon muokatussa Eaglen alustassa (DMEM): Ravinneseos F12, l:l-seos, jota oli täydennetty 10 % sikiövasikan seerumilla (FBS), 2 mM L-glutamiinilla, 100 U/ml penisilliinillä ja 100 U/ml streptomysiinillä. Soluja viljeltiin 37°C:ssa, ilmakehässä, joka sisälsi 7 % C02:ta. Kasvatusalusta vaihdettiin 15 kerran 2-3 vuorokaudessa ja viljelmiä käytettiin siirroissa 24-30.
ARPE-19-soluien viljely CNF-kalvon Päällä
Selluloosananokuiduista saatu hydrogeeli laitettiin 96-kuoppaisen kudosviljelymaljan pohjalle ja ARPE-19-solujen suspensiota kasvatusalustassa, joka sisälsi 25000-50000 20 solua/kuoppa, siirrostettiin joko hydrogeelin päälle tai sekoitettiin siihen. Hydrogeelin pitoisuus vaihtelee alueella 0,01-1 %.
Ihmisen ES-soluista peräisin olevat maksan kantaisäsolut
Ihmisalkion kantasoluien vlläpitovilielmä 25 Ihmisalkion kanta- (hES) solulinjaa H9 (Wisconsin International Stem Cell Bank, the "WISC Bank" c/o WiCell research Institute, Madison, WI, USA) käytettiin esillä olevissa £2 tutkimuksissa. H9-soluja viljeltiin tavanomaiseen tapaan Matrigel-pinnoitetuilla kudos- o cm viljelymaljoilla mTeSRl-alustassa, ja ne siirrettiin viljelmästä toiseen käyttäen 1 i o mg/ml tuotetta Dispase (StemCell Technologies). Näissä olosuhteissa kantasolut g 30 muodostavat 2-ulotteisia (2D) yksikerroksisia pesäkkeitä.
X
DC
CL
hES-soluien 3D-vilielmä CNF-kuiduissa H9-solujen pesäkkeitä sekoitettiin joko 0,3 % luonnonmukaiseen CNF:iin tai 0,3 % co o läpinäkyvään CNF:iin ja viljeltiin mTeSRl-alustassa. CNF:ssä olevat hES-solut muo- ^ 35 dostavat 3D-solumöykkyjä. Eräissä kokeissa 0,3 % CN:iin sekoitettiin 58 pg/ml ihmisen fibronektiiniä (Sigma-AIdrich).
19 H9 soluista peräisin olevien maksan kantaisäsoluien 3D-vilielmä CNF:ssä H9-solut saatettiin erilaistumaan maksan kantaisäsoluiksi 11 vuorokauden ajan noudattaen julkaistua menettelyä [Hay DC, Zhao D, Fletcher J, Hewitt ZA, McLean D, Urruticoechea-Uriguen A, Black JR, Elcombe C, Ross JA, Wolf R, Cui W. Efficient 5 differentiation of hepatocytes from human embryonic stem solut exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 2008 Apr; 26(4):894-902)]. Saatuja maksan kantaisäsoluja viljeltiin 3D-ympäristössä käyttäen joko 0,3 % luonnonmukaista CNF:ää ja 0,3 % läpinäkyvää CNF:ää 7 vuorokautta. Eräissä kokeissa 0,3 % CNF:ään sekoitettiin 13 pg/ml hiiren IV-tyyppistä kollageenia (Sigma-10 Aldrich).
Elävä/kuollut-väriävs CNF:ssä olevat H9-solujen möykyt ja maksan kantaisäsolut värjättiin yhdessä tuotteella CellTracker Blue CMAC (20 μΜ) elävien solujen toteamiseksi ja 15 propidiumjodidilla (25 pg/ml) kuolleiden solujen toteamiseksi. Solujen kuvat saatiin konfokaalisella, laseria käyttävällä skannaavalla mikroskoopilla (Leica TCS SP5 MP SMD FLIM) 405 nm olevalla virittävällä aallonpituudella tuotteen CellTracker Blue CMAC tapauksessa ja aallonpituudella 514 nm propidiumjodidin tapauksessa.
20 AlamarBlue-määritys solujen elinkelpoisuuden / lisääntymisen määrittämiseksi
Solujen elinkelpoisuus kvantitoitiin käyttäen yhdistelmäpakkausta AlamarBlue™ Cell
Viability Assay Kit (Biotium Inc., Hayward, CA, USA). Selluloosananokuiduista saatu hydrogeeli laitettiin 96-kuoppaisen kudosviljelymaljan pohjalle ja HepG2/ARPE-19- 25 solujen suspensiota kasvatusalustassa, joka sisälsi 25000-50000 solua kuoppaa kohden, siirrostettiin joko hydrogeelin päälle tai sekoitettiin siihen. Hydrogeelin $2 pitoisuus vaihteli alueella 0,01-1 %. Solujen elinkelpoisuus ja lisääntyminen mitattiin o cvJ vuorokausien funktiona sen jälkeen, kun soluja oli viljelty selluloosan nanokuiduista 0 saadun hydrogeelin päällä inkubaattorissa 37 °C:ssa, ilmakehässä, jossa on 5 % g 30 C02:ta ja jonka suhteellinen kosteus on 95 %.
CC
CL
48 tunnin kuluttua tuotetta AlamarBlue lisättiin suoraan 96-kuoppaisilla levyillä olevaan viljelyalustaan 10 % olevaksi lopulliseksi pitoisuudeksi. Maljoja inkuboitiin 5
CO
o tuntia ja ne altistettiin 530 nm olevalle virittävälle aallonpituudelle, ja saatu säteily oj 35 mitattiin aallonpituudella 590 nm fluoresenssin määrittämiseksi. Prosentuaalinen elossa pysyvyys ilmoitettiin laskettuina fluoresenssiyksikköinä CNF-hydrogeelin läsnä 20 ollessa prosentuaalisena osuutena arvosta, joka saatiin ilman selluloosananokuiduista saatua hydrogeeliä (solut kasvoivat muovin pinnalla).
Taustafluoresenssin mittaukset (negatiivinen vertailu) määritettiin kuopista, jotka 5 sisälsivät hydrogeeliä ja väriainereagenssia viljelyalustassa, jossa ei ollut soluja. Kaikkien fluoresenssimittausten keskipoikkeama ja standardi poikkea ma laskettiin ja korjattiin myöhemmin taustan suhteen ja ilmoitettiin suhteellisena fluoresenssina.
Konfokaalinen lasermikroskopia 10 Hydrogeelin päällä viljeltyjen HepG2-solujen elinkelpoisuus ja 3D HepG2-pallosten muodostuminen määritettiin käyttäen yhdistelmäpakkausta Live/Dead® Viability/ Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen), joka koostui kalseiinista AM ja etidiuminhomo-dimeeristä.
15 Lyhyesti esittäen, HepG2-solut suspendoitiin 1 % natiiviin ja läpinäkyvään CNF- hydrogeeliin, jossa joko oli tai ei ollut fibronektiinia. Hydrogeelissä oleva solususpensio siirrettiin jokaiseen kuoppaan soluineen. Jokaiseen kuoppaan lisättiin soluviljely- alustaa. Hydrogeelin sisään kapseloituja HepG2-soluja viljeltiin 5 vuorokautta ja alusta vaihdettiin uuteen kerran 48 tunnissa. 5 vuorokauden kuluttua alusta poistettiin 20 kuopista ja kapseloidut solut pestiin PBS-liuoksella ja inkuboitiin 'elävä/kuollut'- liuoksessa, joka sisälsi 0,2 μΜ AM-kalseiinia ja 1,0 μΜ etidiumhomodimeeriä, noin 45 minuuttia huoneen lämpötilassa. Elävät solut kuvattiin käyttäen laseria käyttävää konfokaalista skannaavaa mikroskooppia (CLSM, Leica SP2 käänteinen mikroskooppi,
Zurich, Sveitsi), joka oli varustettu argonlaserilla (488 nm/35mW), HC PL APO 10x/ 25 0,4 CS- ja HC PL APO 20x/0,7 CS- (ilma)-objektiiveilla, inkubaattorilaatikolla, jossa oli ilman lämmitysjärjestelmä (Life Imaging /Services, Sveitsi), ja CO2 -sekoitin (Okolab).
” Kuvat saatiin kahdesta ilmaisimesta (yksi kalseiinille ja toinen etidiumhomodimeerille).
o cm Kuvat luotiin ja niitä käsiteltiin ohjelmalla Imaris 7.0 (Bitplane). Dekonvoluutiota ei o tehty.
§ 30 x Esimerkki 1
CC
Q_
Erilaisissa soluviljelymateriaaleissa olevien HepG2-solujen elinkelpoisuuden £! vertailu
CD
o Selluloosananokuiduista saadut hydrogeelit laitettiin 96-kuoppaisen kudosviljelylevyn ° 35 pohjalle ja HepG2-solujen suspensio ylläpitävässä kasvatusalustassa, joka sisälsi 25000-50000 solua kuoppaa kohden, siirrostettiin joko hydrogeelin päälle tai sekoitettiin siihen. Hydrogeelin pitoisuudet vaihtelivat alueella 1-0,01 %. Fluoresenssin 21 intensiteetti, joka osoittaa solujen elinkelpoisuutta ja lisääntymistä, mitattiin vuorokausien funktiona sen jälkeen, kun soluja on viljelty selluloosan nanokuiduista saadun hydrogeelin päällä inkubaattorissa 37°C:ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % C02:ta ja jonka suhteellinen kosteus oli 95 %.
5
Kolmea kaupallisesti saatavaa soluviljelymateriaalia käytettiin 3D-viljelyn vertailumateriaaleina: MaxGel™ (Sigma-AIdrich), HydroMatrix™ (Sigma-AIdrich) ja PuraMatrix™ (3DM Inc.)· Koejärjestely oli samanlainen kaikkien tutkittujen materiaalien tapauksessa.
10
HepG2-solujen elinkelpoisuus kvantitoitiin käyttäen yhdistelmäpakkausta AlamarBlue™ Cell Viability Assay Kit (Biotium Inc., Hayward, CA, USA), kuten edellä on esitetty kappaleessa materiaalit ja menetelmät, Alamar Blue-määritys solujen elinkelpoisuuden / lisääntymisen määrittämiseksi.
15
HepG2-solujen prosentuaalinen elinkelpoisuus tutkittujen materiaalien tapauksessa on esitetty kuviossa 2. Kumpaakin tyyppiä olevien selluloosananokuiduista saatujen hydrogeelien eli natiivin ja läpinäkyvän CNF:n tapauksessa todetaan suurempia elinkelpoisuuden arvoja kuin kaupallisten vertailumateriaalien Hydromatrix™ tai Pura-20 Matrix™ tapauksessa. Mikäli fibronektiiniä lisätään CNF-hydrogeeleihin, elinkelpoisuus on lähellä elinkelpoisuutta kaupallisen MaxGel™-tuotteen tapauksessa. Tämän lisäksi lisääntyminen ja solujen elinkelpoisuus kasvavat lineaarisesti kummassakin hydrogeelissa olevan solupitoisuuden funktiona. Tämä havainto tukee sitä hypoteesia, että hydrogeeli jäljittelee ihmisen ECM:n komponentteja. Sillä on koko ECM:n 25 avain koostumus.
£2 Esimerkki 2 o cm ARPE-19-solujen siirto neularuiskun neulalla 0 ARPE-19-soluja (25 000 solua kuoppaa kohden) siirrostettiin 96-kuoppaisen levyn g 30 pohjalla olevaan CNF-matriisiin ja viljeltiin siinä. Kuviossa 3 on esitetty ARPE-19- 1 solujen elinkelpoisuus sen jälkeen, kun soluja on siirrettu eri kokoisilla neularuiskun
CL
neuloilla. Tämä sama ilmiö voidaan todeta myös muilla solutyypeillä kuten HepG2- ja £! ES-soluilla.
co o w 35 Yksitysikohtaisempi selitys ARPE-19-solujen siirrosta neularuiskun neulalla on seuraava: Kuvion 3 mukaisessa siirrossa 1 soluja inkuboitiin 48 tuntia yhdessä 1,66 % CNF:n kanssa, ja sen jälkeen solut siirrettiin neularuiskulla (20G-27G) noin 100 pl:ssa 22 96-kuoppaiselle levylle. Neularuiskulla tapahtuneen siirron jälkeen soluja inkuboitiin 24 tuntia ja solujen elinkelpoisuus CNF:ssä mitattiin.
Siirrossa 2 soluja, joita oli inkuboitu 24 tuntia 1,66 % CNFissä, siirrettiin 27G-neula-5 ruiskulla (noin 2 ml) tuoreeseen alustaan. Soluja inkuboitiin 24 tuntia siirron jälkeen, minkä jälkeen solut siirrettiin uudestaan neularuiskulla (20G-27G) noin 100 piissä 96-kuoppaiselle levylle, niitä inkuboitiin jälleen 24 tuntia ja kahteen kertaan siirrettyjen solujen elinkelpoisuus 1,66 % CNFissä mitattiin.
10 Nämä kokeet osoittavat, että on mahdollista siirtää soluja CNF-hydrogeelissä, siirto-tapahtuma oli onnistunut ja solut olivat eläviä ja pysyivät elävinä sinä aikana, kun niitä siirrettiin neularuiskulla. Tämä ilmiö todettiin myös kaikkien pienimmällä neulakoolla, 27G, eikä minkäänlaista siirtoprosessissa käytetyn neulan kokoon liittyvää raja-arvoa havaittu. Näytteiden, jotka siirrettiin kahdesti (siirto 2), 15 tapauksessa todettiin pienempiä lisääntymisnopeuksia, mikä johtui mitä todennäköisimmin 24 tuntia lyhyemmästä inkubointiajasta kokeen alussa. Solujen siirto CNF-hydrogeelissä osoittaa, että solut olivat todellakin hydrogeelin sisällä ja pysyivät siellä, koska levyyn kiinnittyneet solut eivät siirry (ei trypsinoitumista). Nämä kokeet osoittavat, että solut säilyivät elinkelpoisina siirron aikana.
20
Esimerkki 3 Kantasolut hES-soluista peräisin olevien maksan kantaisäsoluien elävä / kuollut -väriävs
Ihmisen ES-soluista peräisin olevat maksan kantaisäsolut upotettiin 25 luonnonmukaiseen CNF-hydrogeeliin ja niitä viljeltiin 7 vuorokautta IV-kollageenin läsnä ollessa ja ilman sitä. Taustaa ei havaittu. Ihmisen ES-soluista peräisin olevat ” maksan kantaisäsolut upotettiin läpinäkyvään CNF-hydrogeeliin ja niitä viljeltiin 7 o c\J vuorokautta IV-kollageenin läsnä ollessa ja ilman sitä. Taustaa ei havaittu, minkä i o ansiosta tämän materiaalin käyttö tässä yhteydessä on erittäin helppoa. Tavallisesti g 30 muilla käytetyillä materiaaleilla, esim. MatriGel and MaxGel on merkittävä x fluoresenssitausta ja näin ollen työskentely näillä matriiseilla on vaikeata. ES-soluja
CL
voidaan pitää CNF-hydrogeelissa, ne pysyvät elossa ja näin ollen tämä materiaali ™ kykenee pitämään ne hengissä. Lisäksi ES-solut muodostavat myös 3D-rakenteen,
CO
o jota ei ole havaittu aikaisemmin minkään muun materiaalin yhteydessä.
° 35
Esimerkki 4
Dekstraanien diffuusio CNF-hydrogeelien läpi 23
Yksityiskohtainen tietämys soluviljelymateriaalin diffuusio-ominaisuksista on tärkeätä. Soluviljelymateriaalin tulisi olla riittävän huokoista niin, että se sallii ravinteiden ja hapen diffuusion lävitseen viljeltyihin soluihin, sekä niin, että se tekee mahdolliseksi soluista peräisin olevien metaboliittien tehokkaan diffuusion. CNF-hydrogeelin 5 diffuusio-ominaisuudet osoitettiin seuraavalla tavalla käyttäen dekstraaneja, joiden molekyylipainot vaihtelivat: 400 pl läpinäkyvää tai läpikuultamatonta CNF:ia (1 %) laitettiin suodatinta kohden Transwell™ -suodatinkuoppalevyjen apikaaliosastoon (suodattimen huokoskoko 0,4 10 pm). 1 ml PBS-liuosta lisättiin basolateraaliselle puolelle ja 100 pl (25 pg) fluoresenssi merkittyjä dekstraaneja (molekyylipainot 20k, 70k ja 250k) lisättiin hydrogeelien päälle. Levy kiinnitettiin lujasti ja jätettiin rauhaan kuoppalevyjen keinuttajaan. 100 μΙ:n näytteitä otettiin basolateraalipuolelta ja samansuuruinen määrä korvattiin PBS-liuoksella. Ensimmäiset näytteet otettiin 15 minuutin välein, 15 muut näytteet otettiin eri ajanhetkillä, jotka vaihtelivat 30 minuutista 2 tuntiin, ja viimeiset näytteet 24 tunnin kuluttua. Näytteitä otettiin yhteensä 168. Kohdelevy (OptiPlate™-96 F) mitattiin virittävällä aallonpituudella ja säteilyn aallonpituudella, jotka olivat vastaavasti 490 nm and 520 nm.
20 Kuviossa 4 on esitetty dekstraanien, joilla on erilainen molekyylipaino 1-prosenttisen luonnonmukaisen selluloosan nanokuitugeelin läpi. Malliyhdisteiden diffuusio tapahtuu vakionopeudella ja se riippuu voimakkaasti yhdisteen molekyyli painosta (koosta). Selvää on se, että CNF-hydrogeeleissä molekyylit kykenevät diffundoitumaan tehokkaasti, vaikka geelirakenne on riittävän lujaa solususpension stabiloimiseksi.
25 ” Esimerkki 5 o cvj ARPE19-solujen lisääntyminen CNF-kalvon päällä i o Natiivi CNF-kalvo laitettiin 96-kuoppaisen kudosviljelylevyn pohjalle ja kalvon päälle g 30 siirrostettiin solususpensiota ylläpitävässä väliaineessa, joka sisälsi 25000-50000 x solua/kuoppa. Kalvon pitoisuudet vaihtelevat alueella 1,6-0,01 %. Solujen elin- kelpoisuus ja lisääntyminen mitattiin vuorokausien funktiona sen jälkeen, kun soluja £! oli viljelty natiivin CNF-kalvon päällä inkubaattorissa, 37°C:ssa ilmakehässä, joka
CO
o sisälsi 5 % C02:ta ja jonka suhteellinen kosteus oli 95 %.
S 35
Natiivin CNF-kalvon päällä olevat ARPE-19-solut kuvattiin valomikroskoopilla. CNF-kalvo tukee solujen kasvua kuvan yläosassa (kuvio 5), ja nähdään, että ARPE-19-solut 24 voivat kasvaa 2D CNF-kalvolla ja että CNF-kalvo on käyttökelpoinen 2D-solu-kasvatuksen alustana.
ARPE-19-solut lisääntyivät hyvin hydrogeelien sisällä käytetystä solupitoisuudesta 5 riippumatta. Minkäänlaista merkittävää eroa ei todettu hydrogeelien välillä. Solujen lisääntyminen kasvoi noin kaksinkertaiseksi hydrogeelin päällä viheltäessä, verrattuna ilman hydrogeeliä viljeltyihin soluihin.
Esimerkki 6 10 3D-viljeltyjen HepG2-soluryppäiden morfologia Konfokaalinen lasermikroskopia
Konfokaalista lasermikroskopiaa käytettiin elävien solujen kuvantamiseen. CNF-hydro-geelin sisällä olevien kapseloituneiden HepG2-solujen pallomainen muoto viittaa 15 selvästi siihen, että solut ovat jääneet hydrogeelin sisään ja ne kasvavat kolmiulotteisesti (kuvio 6). Kuvioissa 6 on esitetty kuvat, jotka on otettu soluista 5 vuorokautta kestäneen viljelyn jälkeen, ja ne osoittavat, että solut ovat elinkelpoisia 3D-pallosten sisällä kummassakin hydrogeelissä. Solujen elinkelpoisuus ei riippunut solujen pitoisuudesta hydrogeeleissa, ja pallosten koko kasvoi ajan funktiona kaikissa 20 viljelmissä (kuvio 6).
Alusta vaihdettiin tuoreeseen kerran 48 tunnissa ja pallosten koko kasvaa viljelmässä ajan funktiona. Kun fibronektiiniä lisättiin CNF-hydrogeeliin, solujen elinkelpoisuus 3D- pallosen sisällä kasvoi. Elävä/kuollut-värjäyksestä otetut konfokaaliset mikro- 25 skooppiset kuvat paljastivat, että solut pysyivät elinkelpoisina 5 vuorokauden pituisen viljelyajanjakson ajan. Nämä havainnot ovat solujen Alamar Blue-lisääntymismäärityk- ” sestä saatujen tulosten mukaisia (kuvio 2). Tämä havainto tukee hypoteesiämme siitä, o cm että CNF-hydrogeeli jäljittelee ihmisen ECM-komponentteja. Sillä on kaikki ECM:n o avainkomponentit fibronektiiniä lukuunottamatta. Tästä syystä fibronektiinin lisäys g 30 parantaa solujen elinkelpoisuutta 3D-ryppäissä. Fibronektiini helpotti HepG2-solujen x kiinnittymistä ja elinkelpoisuutta. Aikaisemmin on osoitettu, että fibronektiini
CL
suurentaa hepatosyyttien eloonjämistä ja vähentää apoptoosia sitoutumalla βΐ-™ integriiniin.
S
o ^ 35 Tällä tavalla on mahdollista osoittaa HepG2-solujen 3D-rakenne, joka saatiin ilman muuta tukimateriaalia tai ECM-komponentteja pelkän CNF-hydrogeelin ohella. Tämä 25 osoittaa CNF-hydrogeelin käyttökelpoisuuden ja helppokäyttöisyyden 3D-soluviljelyn matriisina.
Esimerkki 7 5 Geelin lujuus 3D-soluviljelyn väliaineen eräs tärkeä tehtävä on pitää solut suspendoituneina homogeenisesti matriisiin ja estää laskeutuminen. CNF täyttää tämän vaatimuksen kyvyllään muodostaa geeliverkko hyvin pienenä pitoisuutena (0,5 %). CNF:n geelimäinen rakenne osoitettiin määrittämällä viskoelastiset ominaisuudet 10 dynaamisilla värähtelevillä Teologisilla mittauksilla. Taajuuspyyhkäisyjen tulokset osoittavat tyypillistä geelin kaltaista käyttäytymistä. Varastomoduuli (G') on useita kertaluokkia suurempi kuin häviömoduuli (G") ja lähes riippumaton taajuudesta, mikä tarkoittaa että kimmoisat (kiinteän aineen kaltaiset) ominaisuudet ovat selvempiä kuin viskoosit (nesteen kaltaiset) tunnuspiirteet (kuvio 7). Geeleille tyypillistä on myös se, 15 että sekä G' että G" ovat suhteellisen riippumattomia taajuudesta. CNF-geelien viskoelastiset ominaisuudet määritettiin värähtelevällä taajuuspyyhkäisymittauksella käyttäen reometriä (AR-G2, TA Instruments) jännityksen ollessa 0,1 %.
20 Esimerkki 8 CNF-hydrogeelin juoksevuusominaisuudet CNF-hydrogeelien Teologiset juoksevuusominaisuudet osoittavat useita piirteitä, jotka ovat edullisia soluviljelykäytössä. Hydrogeeleillä on suuri viskositeetti, kun leikkaus- voimat ovat vähäisiä (tai levossa), mikä on optimaalista ajatellen kykyä suspendoida 25 soluja, mutta niillä todetaan myös leikkausvoimien vaikutuksesta ohenevaa käyttäytymistä suurten leikkausnopeuksien tapauksessa, mikä tekee mahdolliseksi ” helpon annostelun ja injektoinnin. CNF:n kyky tuottaa tämänkaltaisia Teologisia o c\J ominaisuuksia osoitettiin joukossa kokeita, joissa CNF-dispersioiden viskositeetti i o mitattiin leikkausrasituksen (-nopeuden) laajalla alueella pyörivässä reometrissä (AR- g 30 G2, TA Instruments, UK).
X
CC
CL
CNF-dispersioilla todetaan paljon suurempia viskositeetteja ilman leikkausrasitusta £! (vakioviskositeetin alue, kun leikkausrasitus on pieni) kuin muilla vesiliukoisilla poly- co o meereilla, kuten kuviossa 8 on esitetty. Nanofibrillien pienempi halkaisija, joka on S 35 saatu aikaan lähtömateriaalin edeltävällä kemiallisella esikäsittelyllä, suurentaa huomattavasti CNF: n viskositeettia ilman leikkausrasitusta. Rasitus, jolla leikkausvoimien vaikutuksesta ohentuva käyttäytyminen alkaa ("myötörasitus"), on 26 myös huomattavan suuri CNF-dispersioiden tapauksessa. Materiaalin suspendoiva kyky on sitä parempi, mitä suurempi on myötörasitus. Ilman leikkausrasitusta suurella viskositeetilla ja suurella myötörasituksella ja suurella varastomoduulilla saavutettujen vaikutusten yhdistelmä stabiloi solut tehokkaasti laskeutumista vastaan. Soluihin 5 kohdistuva painovoima on paljon heikompi kuin myötörasitus. Näin ollen suspendoituneet solut "jähmettyvät" geelimatriisin sisään, mikäli ne sekoitetaan CNF-matriisiin, tai ne "jähmettyvät" geelin pinnalle, mikäli ne laitetaan geelin päälle.
Kuviossa 9 viskositeetti on esitetty mitatun leikkausnopeuden funktiona. Kuvion 9 10 perusteella ilmeistä on se, että CNF-dispersioiden viskositeetti putoaa suhteellisen pienten leikkausnopeuksien tapauksessa ja saavuttaa samankaltaisen tason, joka mitataan viitemateriaaleille silloin, kun leikkausnopeudet ovat noin 200 s'1.
CNF:n verkkorakenne hajoaa leikkausvoimien vaikutuksesta (kuvio 7). Tietynlaisen 15 kohdistetun rasituksen seurauksena systeemin viskositeetti pienenee dramaattisesti ja tapahtuu siirtymistä kiinteänkaltaisesta nesteenkaltaiseen käyttäytymiseen. Tämän kaltainen käyttäytyminen on edullista, koska se tekee mahdolliseksi solujen sekoituksen homogeenisesti CNF-suspensioon maltillisia mekaanisia leikkausvoimia käyttäen. Kun leikkausvoimia kohdistetaan kaksifaasisiin nesteisiin kuten 20 flokkuloituihin CNF-dispersioihin (esim. reometrissä tai putkessa), niin dispergoitu faasi pyrkii siirtymään pois kiinteiltä rajapinnoilta, mikä johtaa siihen, että säiliön seinille syntyy nestekerros, jonka viskositeetti on pienempi (kuvio 10). Tämä ilmiö tarkoittaa sitä, että virtausvastus eli viskositeetti on pienempi rajapinnoilla kuin dispersion muussa osassa (Barnes, 1995). Vastaavalla tavalla CNF-hydrogeelin 25 injektointi neularuiskun neulalla tai pipetillä on helppoa suurtenkin pitoisuuksien tapauksessa (1-4 %). Tämä ilmiö tekee myös mahdolliseksi solususpensioiden helpon £2 annostelun niin, että soluja häiritään mahdollisimman vähän, eli suurin osa soluista o cvJ sijaitsee neulan keskellä ja ovat käytännöllisesti katsoen levossa (kuvio 10).
σ> cp g 30 CNF-hydrogeelien helppo injektoitavuus on myös tärkeä piirre injektoitavia lääkeaine- x valmisteita tarkasteltaessa. Kuten esimerkissä 6 on esitetty, CNF-hydrogeelien vapauttamisprofiilit ovat sellaisia, että niitä voitaisiin hyödyntää sovelluksissa, joissa tarvitaan lääkeaineen pitkitettyä ja hallittua vapautumista. Nämä kaksi CNF-hydro-co o geeleihin liittyvää havaintoa tekevät mahdollisiksi erilaiset mahdolliset lääkehoidon ° 35 sovellukset kuten silmänsisäiset, lihakseen, ihon alle toteutetut hoidot tai esimerkiksi viskoelastiset silmätippavalmisteet.
27
Esimerkki 9
Rakenteen palautuminen leikkausvoimien loputtua
Eräs toinen tärkeä CNF-hydrogeelien Teologinen ominaisuus on se, että viskositeetti säilyy suurena kohdistettujen leikkausvoimien (esim. injektoinnin tai sekoituksen) 5 päättymisen jälkeen. CNF-dispersion rakenteen palautuminen osoitettiin koesarjalla, jossa materiaaliin kohdistettiin ensin leikkausvoimia reometrissä (StressTech,
Reologica Instruments Ab) suurta leikkausnopeutta käyttäen, ja leikkausvoimien loputtua geelin lujuuden (G') palautumista seurattiin oskilloivalla aikapyyhkäisymittauksella. Leikkaussykli toteutettiin käyttäen samankeskisen lieriön 10 geometriaa 40 Pa olevalla vakiorasituksella 61 s. Leikkausnopeuden ja viskositeetin kehittyminen tämän kokeen aikana on esitetty kuviossa 10. Materiaaliin kohdistettiin leikkausvoimia suhteellisen suurella leikkausnopeudella (1000 s'1) vähintään 40 sekunnin pituisen ajanjakson ajan, minä aikana materiaalin viskositeetti putosi pienemmäksi kuin 40 mPa.s.
15
Leikkausvoimien kohdistamisen jälkeen arvon G' (geelin lujuuden mitta) kehittymistä seurattiin oskilloivalla mittauksella käyttäen vakiotaajuutta (1 Hz) ja pientä rasitusta (0,5 Pa). Mittaus aloitettiin täsmälleen 10 s sen jälkeen, kun leikkaus oli päättynyt. Kuviosta 11 on ilmeistä se, että geeliverkko muodostuu hyvin nopeasti, kun CNF-20 dispersion annetaan levätä sen jälkeen, kun siihen on kohdistettu leikkausvoimia suurilla leikkausnopeuksilla. Rakenteen olennainen palautuminen todettiin jo 10 sekunnin kuluttua leikkauksen päättymisen jälkeen (yhtäsuuri kuin ajanhetki nolla kuviossa 11). Varastomoduulin (G') vakiotaso saavutetaan sen jälkeen, kun CNF-dispersiota on pidetty levossa alle 10 min. G'-taso, jonka perinpohjaisesti leikattu 25 CNF-dispersio kehitti, oli verrannollinen G'-tasoon CNF-dispersiolla, jota oli vain sekoitettu kevyesti lasisauvalla ennen rakenteen palautumista selvittävää koetta, co δ cvj Kuviossa 11 on esitetty leikkausnopeuden ja viskositeetin kehittyminen, kun 0,7 % i o natiiviin CNF-dispersioon kohdistettiin leikkausvoimia reometrissä käyttäen g 30 samankeskisen lieriön geometriaa ja 40 Pa olevaa vakiorasitusta.
X
CC
Kuviossa 12 on esitetty 0,7 % natiivin CNF-dispersion rakenteen palautuminen ™ suurella leikkausnopeudella tapahtuneen leikkauksen jälkeen verrattuna tilanteeseen
CD
o lasisauvalla toteutetun varovaisen sekoituksen jälkeen, o C\1 35
Rakenteen nopea palautuminen on tärkeätä hydrogeelin tyyppisille soluviljely-materiaaleille kahdesta syystä. Ensinnäkin se mahdollistaa solujen homogeenisen 28 jakautumisen CNF-hydrogeeleihin sen jälkeen, kun ne on sekoitettu hydrogeeliin. Toiseksi, mikäli CNF-hydrogeelejä käytetään viljeltyjen solujen kuljetukseen, niin geelirakenteen nopea palautuminen pidättää nopeasti solut toivottuun paikkaan ja siirtyminen on hyvin vähäistä, esimerkiksi silloin, kun tarkoituksena on toteuttaa 5 solujen siirto.
Esimerkki 10 Stabiilisuus
Kuten esimerkissä 1 on osoitettu, hyvinkin laimeilla CNF-dispersioilla on erittäin suuri 10 viskositeetti pienillä leikkausnopeuksilla. Samoin hydrogeelin rakenne palautuu, kun leikkausvoimien kohdistaminen, esimerkiksi injektointi, päättyy. Staattisissa olosuhteissa CNF muodostaa hydrogeeliverkon, jolla on suuri kimmokerroin ja poikkeuksellisen suuri myötörasitus. Näiden ominaisuuksien johdosta CNF:Mä on erittäin hyvä kyky suspendoida kiinteitä hiukkasia silloinkin, kun pitoisuus on pieni.
15
Suspendoiva kyky staattisissa olosuhteissa osoitetaan soran suspensioilla. Natiivin CNF:n ja läpinäkyvän CNF:n 0,5 % dispersiot kykenevät stabiloimaan jopa 2-3 mm:n kokoisia sorarakeita hyvin pitkien ajanjaksojen ajaksi, katso kuvio 13. Huomattakoon, että läpinäkyvä CNF kykene stabiloimaan hiukkasten suspensiot pienempänä 20 pitoisuutena kuin natiivi CNF.
Esimerkki 11
Entsymaattinen hydrolyysi
Yleisesti tunnettua on se, että tietyt entsyymit, sellulaasit, kykenevät hydrolysoimaan 25 selluloosan 3-(l-4)-sidoksia. Esimerkkejä ovat endo-l,4-3-glukanaasit (EGt), joiden kohteina ovat satunnaisissa sijaintipaikoissa, muualla kuin ketjujen päissä olevat £2 selluloosa ketjut; eksoglukanaasit tai eksosellobiohydrolaasit (CBHt), jotka hajottavat o cm selluloosaa pilkkomalla irti molekyylejä ketjun kummastakin päästä, sellobioosin i o dimeereja tuottaen; ja β-glukosidaasit (BGLt), jotka hydrolysoivat sellobioosiyksiköitä i g 30 (joita on syntynyt EG- ja CBH-hyökkäyksen aikana) glukoosiksi. Vastaavalla tavalla x selluloosan nanokuidut voidaan hydrolysoida entsymaattisesti glukoosiksi sellulaasien avulla (Ahola, S., Turon, X., Österberg, M., Laine, J., Rojas, O.J., Langmuir, 2008, 24, 5 11592-11599).
S
o ° 35 Selluloosan entsymaattista hydrolyysiä voidaan käyttää hyväksi selluloosan nanokuitua sisältävissä soluviljelyjärjestelmissä eri syistä. CNF-hydrogeelin hydrolyysin seurauksena alustan viskositeetti pienenee voimakkaasti ja viljeltyihin 29 solurakenteisiin päästään helposti käsiksi esim. värjäystä varten. Samoin hydrolyysin jälkeen solurakenteet voidaan siirtää tai istuttaa ilman selluloosaa sisältävää materiaalia. Hajoamistuote, glukoosi, ei yleensä ole myrkyllistä soluille ja sitä voidaan käyttää ravinteena solujen viljelyssä.
5
Selluloosan nanokuitujen entsymaattinen hydrolyysi voidaan toteuttaa erilaisten sellulaasien avulla erilaisessa ympäristössä. Kuviossa 14 kaupallisten Celludast-entsyymien vaikutus geelien suspendoivaan kykyyn on osoitettu. Sekä natiivit että läpinäkyvät CNF-hydrogeelit menettävät suspendoivan kykynsä geeli rakenteen 10 entsymaattisen hajotuksen seurauksena. Viljeltyjä solulinjoja on myös voitu muokata geneettisesti tarvittavan entsyymiproteiinin tuottamiseksi viljelyjärjestelmään.
co δ
CvJ
σ> cp n o
X
X
Q.
δ δ o δ
CvJ

Claims (16)

1. Soluviljely- tai solukuljetuskoostumus, joka käsittää selluloosaa sisältävää 5 kasvimateriaalia mekaanisesti hajottamalla saatuja selluloosananokuituja tai niiden johdannaista, jotka selluloosan nanokuidut tai niiden johdannainen ovat/on hydrogeelin muodossa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, jossa selluloosananokuitujen tai 10 selluloosananokuiduissa tai niiden johdannaisessa olevien nanokuitujen kimppujen halkaisija on alle 1 pm, edullisesti alle 200 nm, edullisemmin alle 100 nm.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, jossa selluloosananokuidut tai niiden johdannainen käsittää kemiallisesti tai fysikaalisesti muokattuja 15 selluloosananokuitujen tai nanokuitukimppujen johdannaisia.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen koostumus, missä koostumus käsittää lisäksi sopivia lisäaineita, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu solun ulkopuolisen matriisin komponenteista, seerumista, kasvutekijöistä ja proteiineista. 20
5. Soluviljely- tai solukuljetusmatriisi, missä matriisi käsittää eläviä soluja ja jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaista hydrogeelin muodostavaa soluviljely- tai solukuljetuskoostumusta ja missä soluja on läsnä mainitussa matriisissa kolmiulotteisena tai kaksiulotteisena järjestelynä. 25
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen soluviljely- tai solukuljetusmatriisi, missä solut ovat eukarioottisia tai prokarioottisia soluja, co δ C\J
, 7. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen koostumuksen co 9 30 valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet: c\j - saadaan aikaan kasviperäisiä selluloosananokuituja tai niiden johdannaista, ir - mainitut selluloosananokuidut tai niiden johdannainen sekoitetaan veteen; ja CL - selluloosananokuidut tai niiden johdannainen tai saatu seos siirretään tai laitetaan ^ sopivaan ympäristöön soluviljelyä tai solukuljetusta varten, co o 35 o CVJ
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jossa menetelmä lisäksi käsittää seoksen yhdistämisen sopivaan lääkkeeseen.
9. Menetelmä kasviperäisten selluloosananokuitujen tai niiden johdannaisten 5 poistamiseksi solukasvatusmateriaalista, joka menetelmä käsittää vaiheet: - saadaan aikaan materiaalia, joka käsittää solukasvatuksen väliainetta ja soluja; mainittu materiaali laimennetaan vesipohjaisella tai muunlaisella kuin vesipohjaisella nesteellä; valinnaisesti materiaali sentrifugoidaan solujen ja soluaggregaattien 10 laskeuttamiseksi; - selluloosan nanokuidut poistetaan dekantoimalla.
10. Menetelmä kasviperäisten selluloosananokuitujen tai niiden johdannaisten poistamiseksi minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisesta 15 solukasvatusmateriaalista, joka menetelmä käsittää vaiheet: - saadaan aikaan materiaalia, joka käsittää solukasvatuksen väliainetta ja soluja; -, solukasvatusmateriaali saatetaan kosketukseen hajottavan entsyymin kanssa; valinnaisesti materiaali sentrifugoidaan solujen ja soluaggregaattien laskeuttamiseksi; 20. selluloosan nanokuidut poistetaan dekantoimalla.
11. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen koostumuksen mikrobiologinen käyttö laboratorioiden ja/tai teollisuuden tarkoituksiin solujen in vitro-ylläpitoon tarkoitettuna väliaineena tai yhdisteenä väliaineessa. 25
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen mikrobiologinen käyttö, missä solut ovat m eukarioottisia tai prokarioottisia soluja. δ CVJ co
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen koostumuksen käyttö solujen tai o ^ 30 entsyymien immobilisoimiseksi. CVJ X
£ 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, missä solut ovat eukarioottisia tai ^ prokarioottisia soluja. δ o ^ 35
15. Menetelmä solujen viljelemiseksi, missä menetelmä käsittää vaiheet: CvJ - saadaan aikaan soluja; - solut saatetaan kosketukseen jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen selluloosananokuituja tai niiden johdannaista käsittävän soluviljelykoostumuksen kanssa matriisin muodostamiseksi; 5. soluja viljellään mainitussa matriisissa kolmiulotteisena tai kaksiulotteisena järjestelynä.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, jossa solut ovat eukarioottisia soluja tai prokarioottisia soluja. co δ c\j i CD O 1^ C\l X cc CL CM δ o δ CM Cellodlingsmaterial 5
FI20106121A 2010-10-27 2010-10-27 Soluviljelymateriaali FI123988B (fi)

Priority Applications (31)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20106121A FI123988B (fi) 2010-10-27 2010-10-27 Soluviljelymateriaali
DK11785713.6T DK2633032T3 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant-derived cell culture material
ES15155375T ES2759257T3 (es) 2010-10-27 2011-10-26 Material de cultivo celular derivado de plantas
DK11785715.1T DK2632493T3 (da) 2010-10-27 2011-10-26 Lægemiddelindgivelsessammensætninger
CN2011800627192A CN103354834A (zh) 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料
CN201710872909.XA CN107557330B (zh) 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料
SG2013030721A SG189966A1 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
US13/881,973 US20140010790A1 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Cell culture material based on microbial cellulose
JP2013535475A JP2013541956A (ja) 2010-10-27 2011-10-26 植物由来の細胞培養材料
EP11785714.4A EP2633033B1 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Cell culture material based on microbial cellulose
PCT/FI2011/050939 WO2012056109A2 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
DK15155375T DK2975115T3 (da) 2010-10-27 2011-10-26 Planteafledt cellekulturmateriale
JP2013535476A JP6321961B2 (ja) 2010-10-27 2011-10-26 薬剤送達組成物
BR112013010377-9A BR112013010377B1 (pt) 2010-10-27 2011-10-26 composição fornecedora de células ou de cultura de células, matriz fornecedora de células ou de cultura de células, métodos para produzir uma composição, para remover nanofibras de celulose e para cultura de células, uso microbiológico de nanofibras, e, uso da composição
CA2815276A CA2815276C (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
RU2013122757/10A RU2597978C2 (ru) 2010-10-27 2011-10-26 Материал для культур клеток, полученный из растений
PL15155375T PL2975115T3 (pl) 2010-10-27 2011-10-26 Materiał pochodzenia roślinnego do hodowli komórek
PL11785713T PL2633032T3 (pl) 2010-10-27 2011-10-26 Materiał pochodzenia roślinnego do hodowli komórek
AU2011322363A AU2011322363B2 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
ES11785713.6T ES2537268T3 (es) 2010-10-27 2011-10-26 Material de cultivo celular derivado de plantas
US13/881,982 US9631177B2 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Drug delivery compositions
EP11785715.1A EP2632493B1 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Drug delivery compositions
PCT/FI2011/050940 WO2012056110A2 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Cell culture material based on microbial cellulose
EP15155375.7A EP2975115B1 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
EP11785713.6A EP2633032B1 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
ES11785715.1T ES2565958T3 (es) 2010-10-27 2011-10-26 Composiciones de suministro de fármaco
PCT/FI2011/050941 WO2012056111A2 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Drug delivery compositions
US13/881,959 US10612003B2 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
IL225923A IL225923B (en) 2010-10-27 2013-04-24 Cell culture material derived from a plant, methods for its preparation and uses thereof
HK14101542.5A HK1188466A1 (en) 2010-10-27 2014-02-19 Plant derived cell culture material
JP2017241022A JP6448755B2 (ja) 2010-10-27 2017-12-15 植物由来の細胞培養材料

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20106121A FI123988B (fi) 2010-10-27 2010-10-27 Soluviljelymateriaali
FI20106121 2010-10-27

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI20106121A0 FI20106121A0 (fi) 2010-10-27
FI20106121L FI20106121L (fi) 2012-04-28
FI20106121A FI20106121A (fi) 2012-04-28
FI123988B true FI123988B (fi) 2014-01-31

Family

ID=43064279

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20106121A FI123988B (fi) 2010-10-27 2010-10-27 Soluviljelymateriaali

Country Status (16)

Country Link
US (3) US10612003B2 (fi)
EP (4) EP2633032B1 (fi)
JP (3) JP6321961B2 (fi)
CN (2) CN107557330B (fi)
AU (1) AU2011322363B2 (fi)
BR (1) BR112013010377B1 (fi)
CA (1) CA2815276C (fi)
DK (3) DK2632493T3 (fi)
ES (3) ES2537268T3 (fi)
FI (1) FI123988B (fi)
HK (1) HK1188466A1 (fi)
IL (1) IL225923B (fi)
PL (2) PL2975115T3 (fi)
RU (1) RU2597978C2 (fi)
SG (1) SG189966A1 (fi)
WO (3) WO2012056109A2 (fi)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10675379B2 (en) 2014-12-18 2020-06-09 Cellink Ab Cellulose nanofibrillar bioink for 3D bioprinting for cell culturing, tissue engineering and regenerative medicine applications
US11186736B2 (en) 2018-10-10 2021-11-30 Cellink Ab Double network bioinks
US11826951B2 (en) 2019-09-06 2023-11-28 Cellink Ab Temperature-controlled multi-material overprinting
US11931966B2 (en) 2018-01-26 2024-03-19 Cellink Bioprinting Ab Systems and methods for optical assessments of bioink printability

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI123988B (fi) 2010-10-27 2014-01-31 Upm Kymmene Corp Soluviljelymateriaali
FI130619B (fi) 2011-11-15 2023-12-15 Upm Kymmene Corp Matriisi bioaktiivisten aineiden hallittuun vapauttamiseen
FI123694B (fi) * 2011-12-22 2013-09-30 Upm Kymmene Corp Matriisi ja koostumus grampositiivisten bakteerien mikrobiviljelyyn
FI123715B (fi) * 2011-12-22 2013-09-30 Upm Kymmene Corp Koostumus sulautettuun mikrobiviljelyyn
FI126055B (fi) 2012-05-14 2016-06-15 Upm Kymmene Corp Menetelmä kalvon valmistamiseksi fibrillisellusta ja fibrillisellukalvo
FI125965B (fi) * 2012-09-25 2016-04-29 Upm Kymmene Corp Kolmiulotteinen soluviljely
JP5846449B2 (ja) * 2012-11-12 2016-01-20 北越紀州製紙株式会社 電池用セパレータの製造方法及び電池用セパレータ
CN102978256B (zh) * 2012-12-26 2013-11-20 东华大学 一种连续生产细菌纤维素的方法
FI126109B (fi) 2013-02-22 2016-06-30 Upm Kymmene Corp Nanofibrillipolysakkaridi käytettäväksi kuroutumisen ja arpeutumisen hallitsemiseen ja estoon
WO2015006874A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 The Governors Of The University Of Alberta Parallel organic synthesis on patterned paper using a solvent-repelling material
CN103422379B (zh) * 2013-08-19 2016-03-30 南京林业大学 一种甘蔗渣纤维素纳米纤维膜的制备方法
FI126854B (fi) * 2013-12-30 2017-06-30 Upm Kymmene Corp Membraani, sen käyttö ja menetelmä membraanin valmistusta varten
KR102368213B1 (ko) * 2014-01-23 2022-02-28 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 미분화성 유지 배양재료
KR102411750B1 (ko) * 2014-01-23 2022-06-22 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 배양 배지 조성물
JP6369044B2 (ja) * 2014-02-19 2018-08-08 凸版印刷株式会社 培養装置およびその製造方法
JP2015159778A (ja) * 2014-02-28 2015-09-07 日本バイリーン株式会社 光学的測定用細胞培養担体、光学的測定用ウェルプレート、及び細胞の光学的測定方法
EP3628337A1 (en) * 2014-03-10 2020-04-01 3-D Matrix, Ltd. Sterilization and filtration of peptide compositions
CA2943182A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods for preparation of a terminally sterilized hydrogel derived from extracellular matrix
JP5727657B1 (ja) * 2014-09-22 2015-06-03 第一工業製薬株式会社 セルロースナノファイバー分散体の製造方法。
EP3011952A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-27 Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs- Time-controlled glucose releasing hydrogels and applications thereof
FI126398B (fi) 2014-12-18 2016-11-15 Upm Kymmene Corp Menetelmä kemikaalitestausta varten
FI125883B (fi) 2014-12-22 2016-03-31 Upm Kymmene Corp Katalyyttisesti hapetetun nanofibrilliselluloosan hydrogeelin käsittely
FI125884B2 (fi) 2014-12-22 2019-03-29 Upm Kymmene Corp Nanofibrilliselluloosan hydrogeelin käsittely korkeassa lämpötilassa
FI126120B (fi) * 2014-12-22 2016-06-30 Upm Kymmene Corp Prosessi hapetetun nanofibrilliselluloosan hydrogeelin tuottamiseksi
FI125758B (fi) 2014-12-22 2016-02-15 Upm Kymmene Corp Menetelmä nanofibrilliselluloosan hydrogeelin viskositeetin vähentämiseksi
WO2016146616A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Ventana Medical Systems, Inc. Control slides for immunohistochemistry generated from three-dimensional cell line cultures
WO2016182969A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. Growth media for three-dimensional cell culture
FI127834B (fi) 2015-06-04 2019-03-29 Upm Kymmene Corp Prosessi nanofibrilliselluloosan hydrogeelin tuottamiseksi
US20170056333A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-02 Cormedix Inc. Delivery of active agents using nanofiber webs
EP3232432A1 (de) * 2016-04-11 2017-10-18 EMPA Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt Verfahren zur verbesserung der akustischen eigenschaften von fichten-klangholz
EP3398189B1 (de) * 2015-12-30 2019-10-30 EMPA Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt Verfahren zur verbesserung der akustischen eigenschaften von fichten-klangholz
JP2017127264A (ja) * 2016-01-21 2017-07-27 株式会社スギノマシン アスペルギルス・オリゼ由来のホルムアルデヒド分解酵素およびホルムアルデヒド分解酵素を用いたホルムアルデヒドの分解方法
JP2017189164A (ja) * 2016-04-08 2017-10-19 三菱ケミカル株式会社 細胞及び／又は細胞外マトリックス成分を含む組成物
JPWO2017199737A1 (ja) * 2016-05-16 2019-03-07 富士フイルム株式会社 培養細胞の回収方法および培養細胞分散液
JP7053503B2 (ja) * 2016-06-09 2022-04-12 セリンク エービー ３ｄバイオプリンティングバイオインクとしての細胞外マトリックス成分で修飾されたセルロースナノ原繊維の調製
JP6758621B2 (ja) * 2016-10-17 2020-09-23 株式会社日本触媒 細胞培養用基材およびその製造方法、ならびにこれを利用した細胞培養容器および細胞培養方法
JP6874329B2 (ja) * 2016-11-01 2021-05-19 凸版印刷株式会社 ホルムアルデヒド除去組成物およびその製造方法、ホルムアルデヒド除去シート
CN106544281B (zh) * 2016-12-07 2019-07-02 哈尔滨工业大学 一种基于蛋白质和多糖构筑生物体保护层的制备方法
EP3335740A1 (en) * 2016-12-15 2018-06-20 UPM-Kymmene Corporation Medical hydrogel
DE102017000368A1 (de) 2017-01-16 2018-07-19 Gabriele Blume Einbringen von schwer und/oder nicht wasserlöslichen Wirkstoffen mittels auf Lipiden basierenden Nanopartikeln/Vesikeln in ein hydrophiles aus Cellulose bestehendes dreidimensionales Netzwerk.
KR20190137119A (ko) * 2017-03-30 2019-12-10 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 나노섬유를 이용한 세포 배양
SG11201909419XA (en) 2017-04-10 2019-11-28 TheWell Bioscience Hydrogel for cell culture and biomedical applications
EP3418377B1 (en) 2017-06-22 2024-04-17 UPM-Kymmene Corporation Supportive nanofibrillar cellulose scaffold for expanding cells
JP7132566B2 (ja) * 2017-09-04 2022-09-07 学校法人早稲田大学 チキソトロピー性を有するゲルを用いる多層３次元細胞培養足場システム
EP3730122A4 (en) * 2017-12-21 2021-09-22 H&A Pharmachem Co., Ltd TRANSDERMALER DELIVERY COMPLEX USING AN ORGANIC METAL SCAFFOLD AND NANOCELLULOSE
CN108300713A (zh) * 2017-12-31 2018-07-20 宁波大学 固定细胞的方法及装置
EP3533458B1 (en) * 2018-03-02 2023-05-03 UPM-Kymmene Corporation A medical product comprising a bioactive molecule immobilized to nanofibrillar cellulose, and a method for preparing thereof
WO2019181294A1 (ja) * 2018-03-23 2019-09-26 国立研究開発法人物質・材料研究機構 スルホン化セルロースナノファイバーを含むハイドロゲル
EP3581591A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-18 UPM-Kymmene Corporation A nanofibrillar cellulose product and a method for manufacturing thereof
EP3616730A1 (en) 2018-08-28 2020-03-04 UPM-Kymmene Corporation Composition or matrix for storage of bacteriophages comprising nanofibrillar cellulose
CA3136957A1 (en) * 2019-04-22 2020-10-29 Elc Management Llc Topical delivery system containing cellulose nanofibers
EP3750982A1 (en) * 2019-06-10 2020-12-16 UPM-Kymmene Corporation Cell culture plate, method for preparing thereof and method for detecting a substance
HUP1900226A1 (hu) * 2019-06-21 2020-12-28 Hummel Zoltan Dr Hidrofil mikrobiális cellulóz nanorostokat tartalmazó hordozóanyag (gél) a bélnyálkahártya állapotának javítására
CN114026223A (zh) * 2019-06-24 2022-02-08 芬欧汇川集团 包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞的可移植细胞组合物、其制备方法和纳米原纤纤维素的用途
CN110387060B (zh) * 2019-07-15 2021-10-29 陕西科技大学 一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用
EP3771470A1 (en) * 2019-07-29 2021-02-03 UPM-Kymmene Corporation Medical hydrogel comprising nanofibrillar cellulose, tailored wound dressing, and methods for preparing thereof
EP3791858A1 (en) 2019-09-13 2021-03-17 UPM-Kymmene Corporation Injectable pharmaceutical formulation
EP3791864A1 (en) 2019-09-13 2021-03-17 UPM-Kymmene Corporation Method for preparing pharmaceutical composition and pharmaceutical composition
US11131059B2 (en) * 2019-11-15 2021-09-28 Innovatech Engineering Llc Nanocellulose composite sheet for use as dermatological treatment or medical device
US20210170031A1 (en) * 2019-12-09 2021-06-10 Nicoventures Trading Limited Oral composition with nanocrystalline cellulose
US11826462B2 (en) 2019-12-09 2023-11-28 Nicoventures Trading Limited Oral product with sustained flavor release
US11793230B2 (en) 2019-12-09 2023-10-24 Nicoventures Trading Limited Oral products with improved binding of active ingredients
US11872231B2 (en) 2019-12-09 2024-01-16 Nicoventures Trading Limited Moist oral product comprising an active ingredient
US20220295861A1 (en) * 2019-12-09 2022-09-22 Nicoventures Trading Limited Oral composition with nanocrystalline cellulose
GB2592240B (en) 2020-02-21 2022-03-23 Advanced Biofuel Solutions Ltd Waste processing system
JP2021136912A (ja) * 2020-03-04 2021-09-16 国立大学法人東海国立大学機構 細胞の機能を変化させる方法
WO2022023815A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Ocean Tunicell As Biocompatible, injectable and in situ gelling hydrogels and preparation and applications of biocompatible, injectable and in situ gelling hydrogels based on cellulose nanofibrils for tissue and organ repair
CN112138215B (zh) * 2020-09-26 2021-11-05 江苏大学 基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用
AU2022335918A1 (en) * 2021-09-02 2024-03-14 Bulugudu Limited Injectable composition

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3783073T2 (de) 1986-04-22 1993-04-29 Ajinomoto Kk Modifiziertes, durch mikroorganismen hergestelltes zellulose-gel und sein komplex mit tierischen zellen.
US5254471A (en) 1986-10-06 1993-10-19 Toray Industries, Inc. Carrier for cell culture
US5405953A (en) 1993-08-03 1995-04-11 Biocontrol Incorporated Microfibrillated oxycellulose
US6602994B1 (en) 1999-02-10 2003-08-05 Hercules Incorporated Derivatized microfibrillar polysaccharide
US7449180B2 (en) 2001-02-06 2008-11-11 John Kisiday Macroscopic scaffold containing amphiphilic peptides encapsulating cells
WO2004007683A2 (en) 2002-07-15 2004-01-22 Massachusetts Institute Of Technology Cellular reprogramming in peptide hydrogel and uses thereof
US20050037082A1 (en) 2003-08-13 2005-02-17 Wan-Kei Wan Poly(vinyl alcohol)-bacterial cellulose nanocomposite
US20080146701A1 (en) 2003-10-22 2008-06-19 Sain Mohini M Manufacturing process of cellulose nanofibers from renewable feed stocks
US7704740B2 (en) 2003-11-05 2010-04-27 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
CN100531685C (zh) 2005-07-20 2009-08-26 同济大学 一种组织工程血管及其体外构建方法
EP1937796A2 (en) 2005-07-20 2008-07-02 SurModics, Inc. Polymer coated nanofibrillar structures and methods for cell maintenance and differentiation
CN100355975C (zh) 2005-08-19 2007-12-19 清华大学 一种天然纳米纤维的制备方法
WO2007027849A2 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiribbon nanocellulose as a matrix for wound healing
US20090317437A1 (en) 2005-12-06 2009-12-24 Albert Mihranyan Cellulose gel formulations
US20070275458A1 (en) 2005-12-09 2007-11-29 The Research Foundation Of State University Of New York Three dimensional-BIO-mimicking active scaffolds
WO2007129991A1 (en) 2006-05-04 2007-11-15 Agency For Science Technology And Research Mechanically reversible gel
JP4998981B2 (ja) 2006-06-20 2012-08-15 国立大学法人 東京大学 微細セルロース繊維
US20080193536A1 (en) * 2006-08-14 2008-08-14 Alireza Khademhosseini Cell-Laden Hydrogels
JP5030667B2 (ja) 2007-05-29 2012-09-19 国立大学法人京都大学 ミクロフィブリル化セルロース複合樹脂及びその製造方法
JP2008308802A (ja) 2007-06-18 2008-12-25 Univ Of Tokyo セルロースナノファイバーの製造方法
US8834917B2 (en) * 2007-11-13 2014-09-16 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research Nanoparticle composition and process thereof
JP5497653B2 (ja) 2007-11-14 2014-05-21 エムアー．イ．アー ワウンドケアー 成分の制御送達のための生体材料
JP5260033B2 (ja) 2007-11-27 2013-08-14 花王株式会社 食後ｇｉｐ及び／又は食後インスリン分泌抑制剤
DE102008014735A1 (de) 2008-03-18 2009-09-24 Studiengesellschaft Kohle Mbh Verfahren zur Depolymerisation von Zellulose
SE0800807L (sv) 2008-04-10 2009-10-11 Stfi Packforsk Ab Nytt förfarande
AT506657A1 (de) 2008-04-14 2009-10-15 Chemiefaser Lenzing Ag Cellulosebasiertes hydrogel und verfahren zu seiner herstellung
JP5386866B2 (ja) 2008-06-30 2014-01-15 国立大学法人京都大学 ナノファイバーシート
JP2010013604A (ja) 2008-07-07 2010-01-21 Toray Ind Inc セルロース分散体
US20100065236A1 (en) * 2008-09-17 2010-03-18 Marielle Henriksson Method of producing and the use of microfibrillated paper
WO2010039865A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Cornell University Biodegradable chemical delivery system
WO2010042647A2 (en) 2008-10-07 2010-04-15 The Research Foundation Of State University Of New York High flux high efficiency nanofiber membranes and methods of production thereof
CN101392246A (zh) * 2008-10-29 2009-03-25 东北电力大学 一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法
WO2010065908A2 (en) 2008-12-05 2010-06-10 Catchmark Jeffrey M Degradable biomolecule compositions
FI124724B (fi) 2009-02-13 2014-12-31 Upm Kymmene Oyj Menetelmä muokatun selluloosan valmistamiseksi
US9192655B2 (en) 2009-03-12 2015-11-24 New Jersey Institute Of Technology System and method for a hydrogel and hydrogel composite for cartilage repair applications
HUE035151T2 (en) * 2009-03-30 2018-05-02 Fiberlean Tech Ltd Process for the preparation of nano-fiber cellulose gels
JP5243371B2 (ja) 2009-09-07 2013-07-24 第一工業製薬株式会社 ゲル状組成物
WO2011079380A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Axcelon Biopolymers Corporation Transparent bacterial cellulose nanocomposite hydrogels
FI123988B (fi) 2010-10-27 2014-01-31 Upm Kymmene Corp Soluviljelymateriaali

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10675379B2 (en) 2014-12-18 2020-06-09 Cellink Ab Cellulose nanofibrillar bioink for 3D bioprinting for cell culturing, tissue engineering and regenerative medicine applications
US11931966B2 (en) 2018-01-26 2024-03-19 Cellink Bioprinting Ab Systems and methods for optical assessments of bioink printability
US11186736B2 (en) 2018-10-10 2021-11-30 Cellink Ab Double network bioinks
US11826951B2 (en) 2019-09-06 2023-11-28 Cellink Ab Temperature-controlled multi-material overprinting

Also Published As

Publication number Publication date
EP2975115A1 (en) 2016-01-20
AU2011322363B2 (en) 2015-07-09
SG189966A1 (en) 2013-06-28
US20140010790A1 (en) 2014-01-09
WO2012056110A2 (en) 2012-05-03
HK1188466A1 (en) 2014-05-02
US20130344036A1 (en) 2013-12-26
IL225923B (en) 2018-01-31
WO2012056109A2 (en) 2012-05-03
ES2759257T3 (es) 2020-05-08
ES2537268T3 (es) 2015-06-05
CN103354834A (zh) 2013-10-16
PL2975115T3 (pl) 2020-05-18
ES2565958T3 (es) 2016-04-07
EP2632493B1 (en) 2015-12-30
FI20106121A0 (fi) 2010-10-27
CA2815276C (en) 2019-09-10
IL225923A0 (en) 2013-06-27
WO2012056109A3 (en) 2012-06-28
EP2633033B1 (en) 2016-04-06
EP2633033A2 (en) 2013-09-04
JP2018102291A (ja) 2018-07-05
WO2012056110A3 (en) 2012-06-14
JP2013541956A (ja) 2013-11-21
EP2633032B1 (en) 2015-02-25
RU2013122757A (ru) 2014-12-10
CN107557330B (zh) 2022-09-13
AU2011322363A1 (en) 2013-06-13
RU2597978C2 (ru) 2016-09-20
DK2633032T3 (en) 2015-05-04
PL2633032T3 (pl) 2015-08-31
DK2632493T3 (da) 2016-03-14
BR112013010377B1 (pt) 2021-01-19
CN107557330A (zh) 2018-01-09
FI20106121L (fi) 2012-04-28
DK2975115T3 (da) 2019-11-04
WO2012056111A2 (en) 2012-05-03
CA2815276A1 (en) 2012-05-03
WO2012056111A3 (en) 2012-06-14
US9631177B2 (en) 2017-04-25
EP2632493A2 (en) 2013-09-04
EP2975115B1 (en) 2019-09-11
JP2013540804A (ja) 2013-11-07
BR112013010377A2 (pt) 2016-07-05
JP6448755B2 (ja) 2019-01-09
EP2633032A2 (en) 2013-09-04
FI20106121A (fi) 2012-04-28
US10612003B2 (en) 2020-04-07
US20130330379A1 (en) 2013-12-12
JP6321961B2 (ja) 2018-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI123988B (fi) Soluviljelymateriaali
FI125965B (fi) Kolmiulotteinen soluviljely
CA2859880C (en) Matrix and composition for microbial culture of gram-positive bacteria
EP3418377B1 (en) Supportive nanofibrillar cellulose scaffold for expanding cells
RU2772470C2 (ru) Поддерживающий каркас на основе нанофибриллярной целлюлозы для растущих клеток

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: UPM-KYMMENE CORPORATION

Free format text: UPM-KYMMENE CORPORATION

FG Patent granted

Ref document number: 123988

Country of ref document: FI

Kind code of ref document: B