BR112013010377B1

BR112013010377B1 - composição fornecedora de células ou de cultura de células, matriz fornecedora de células ou de cultura de células, métodos para produzir uma composição, para remover nanofibras de celulose e para cultura de células, uso microbiológico de nanofibras, e, uso da composição

Info

Publication number: BR112013010377B1
Application number: BR112013010377-9A
Authority: BR
Inventors: Marjo Yliperttula; Patrick Laurén; Madhushree Bhattacharya; Yanru Lou; Antti Laukkanen
Original assignee: Upm-Kymmene Corporation
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2021-01-19
Also published as: EP2633033B1; PL2975115T3; DK2632493T3; PL2633032T3; IL225923B; FI123988B; HK1188466A1; DK2633032T3; US10612003B2; WO2012056109A2; JP2018102291A; IL225923A0; BR112013010377A2; US20140010790A1; JP2013540804A; ES2759257T3; EP2633033A2; RU2597978C2; FI20106121A; ES2565958T3

Abstract

COMPOSIÇÃO FORNECEDORA DE CÉLULAS OU DE CULTURA DE CÉLULAS, MATRIZ FORNECEDORA DE CÉLULAS OU DE CULTURA DE CÉLULAS, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO, PARA REMOVER NANOFIBRAS DE CELULOSE E PARA CULTURA DE CÉLULAS, USO MICROBIOLÓGICO DE NANOFIBRA, E, USO DA COMPOSIÇÃO A presente invenção refere-se ao material que é útil em cultura e tranferência de células e também como fornecedor de células. O material compreende nanofibras de celulose derivadas de planta ou seus derivados, sendo que as nanofibras de celulose estão em uma forma de um hidrogel ou uma membrana. A invenção também fornece métodos para produzir estes materiais e composições e seus usos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se à cultura de células derivada de planta e às composições fornecedoras de células compreendendo nanofibras de celulose (cellulose nanofibers, CNF) e/ou seus derivados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O cuidado da saúde permanece nas fronteiras mais importantes para a pesquisa científica. A necessidade para descobrir e desenvolver medicações custo-efetivas e mais seguras está sempre crescendo. A capacidade para acuradamente modelar a organização de células dentro de um órgão ou tecido é de grande importância. Uma cópia exata do sistema in vivo para in vitro exigiria crescimento celular em três dimensões (3D). A “conversação-cruzada” alcançada entre as células em uma cultura celular em 3D in vitro é uma imitação exata do crescimento celular sob condições fisiológicas. De fato, a cultura celular em 3D tem assumido significância em esforços direcionados para medicina regenerativa, melhor entendimento de doenças crônicas e fornecimento de sistema de modelo in vitro superior para triagem de medicamentos e ensaios toxicológicos. Seu surgimento está por conseguinte sendo apropriadamente apregoado como a “nova dimensão da biologia”.

[003] Esforços de pesquisa intensos estão aparecendo para identificar e desenvolver “fatores e armações” que favoreceriam o crescimento de células em 3D in vitro. As células sob condições fisiológicas não apenas “conversam-cruzadamente” entre elas mesmas mas também interagem com o microambiente celular, a matriz extracelular (“extra-cellular matrix”, ECM), com a qual elas residem. A ECM proporciona suporte estrutural às células e também contribui para sinalizar e dirigir o destino celular. Predominantemente, a ECM é composta de glicosaminoglicanas e proteínas fibrosas tais como colágeno, elastina, laminina e fibromectina auto- montadas em rede nanofibrilar. Uma armação ideal para crescimento celular em 3D deve ser capaz de imitar o componente estrutural de ECM nativa, favorecer o crescimento celular e a manutenção celular, ter a rede corretamente dimensionada de poros interconectados para eficientes migração celular e transferência de nutrientes para as células. Em essência, as propriedades mecânicas e químicas da armação deve produzir a função celular como no estado nativo.

[004] Hidrogéis, de origens tanto sintética quanto natural têm surgido como armações adequadas para cultura de células em 3D. A rede de poros interconectados em hidrogéis permite a retenção de uma quantidade grande de fluido biológico, facilita o transporte de oxigênio, nutrientes e resíduo. Ademais, os hidrogéis podem ser formados em sua maioria sob condições citocompatíveis brandas e as propriedades biológicas podem ser moduladas por química de superfície. Hidrogéis engenhados com propriedades mecânicas, químicas e físicas modificadas têm o potencial de imitar a ECM e por conseguinte estabelecer a sua utilidade em cultura de células em 3D. Produtos comerciais para a cultura de células em 3D são por exemplo PuraMatrix™ (3DM Inc.) e Matrigel (BD Biosciences). PuraMatrix™ é um hidrogel de nanofibras de peptídeo auto-montadas que se parece com a estrutura de colágeno fibrilar natural em ECM com diâmetro de fibra de 5-10 nm. Também tem teor de água alto, tipicamente de 99,5%. US 7.449.180 e WO 2004/007683 divulgam hidrogéis de peptídeo. Matrigel é uma mistura de proteína gelatinosa secretada por células tumorais de camundongo. A mistura se parece com o ambiente extracelular complexo encontrado em muitos tecidos e é usada por biólogos celulares como um substrato para a cultura de células. MaxGel™ ECM Matrix (Sigma-Aldrich), que inclui uma mistura de componentes de ECM de humano, forma um gel em temperatura ambiente.

[005] Celulose bacteriana (“bacterial cellulose”, BC) tem sido usada em membranas cicatrizadoras de ferimento e como uma armação em cultura de células. A limitação no uso de celulose bacteriana é a estrutura inerente do material fermentado; sob cultivo, a BC é formada em membranas muito estanques em interface de ar-água no fermentador. As membranas formadas são muito estanques para muitas tarefas de cultura de células em 3D e várias modificações são necessárias para aperfeiçoar a porosidade, que é necessária para a penetração de células e a formação de agrupamentos celulares.

[006] Materiais de hidrogel também são amplamente usados em outros tipos de tarefas de cultura nas quais material de suporte hidrofílico é necessário, por exemplo hidrocolóides do tipo ágar são amplamente usados em cultura de células de plantas, de bactérias, e de fungos para vários propósitos microbiológicos.

[007] US 5.254.471 divulga um suporte para a cultura de células feito de fibras ultrafinas. WO 2009/126980 divulga hidrogel com base em celulose, que contém celulose exibindo um grau médio de polimerização de 150-6.200.

[008] Tem sido verificado que as soluções da técnica anterior são bastante insatisfatórias em cultura de células. Todas as matrizes e todos métodos de cultura de células em 2D e 3D exigem o uso de compostos ou agentes químicos com base em animal sobre os meios biomateriais com o propósito de as células serem mantidas e multiplicadas. Manutenção de células-tronco é especialmente exigente e não há soluções simples para a matriz usada com meios de cultura de células que manteriam as células-tronco vivas. A presença de compostos com base em animal em ambiente de cultura de células gera um risco sério de imunorreações, e tipos diferentes de problemas de toxicidade, que irrevogavelmente matarão as células cultivadas. As matrizes de cultura de células contendo aditivos com base em animal não são adequadas para uso com células-tronco, especialmente se as células- tronco forem para serem usadas para transplante de tecido e tecnologia (engenharia) de tecido. Ademais, muitos dos polímeros propostos para uso nos meios de cultura de células não toleram uma temperatura fisiológica ou são tóxicos para as células.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[009] Há uma necessidade evidente por material de cultura de células aperfeiçoado que seja capaz de proporcionar suporte bidimensional ou tridimensional para vários tipos de células. Aqueles modelos de células em 3D funcionais podem ser usados como ferramentas em descoberta de medicamentos substituindo os experimentos em animais e sendo mais avançados do que os modelos de célula em 2D usados hoje em dia. O transporte de células cultivados também é elevadamente desejável, por exemplo quando transferências de tecido ou terapia celular é o objetivo. Possibilidade para transferência de agrupamentos celulares cultivados em matriz 3D é desejável quando diferentes modelos de célula in vitro estão sendo desenvolvidos. Biomateriais para cultura de células em 3D existentes não permitem a transferência da matriz de hidrogel com uma agulha sem danificar seriamente as células cultivadas.

[0010] Um objetivo da presente invenção é por conseguinte proporcionar uma abordagem nova para pelo menos parcialmente solucionar ou minorar os problemas anteriormente citados decorrentes da técnica anterior. Os objetivos da presente invenção são alcançados por uma composição fornecedora de células ou de cultura de células compreendendo nanofibras de celulose ou um seu derivado que é caracterizada pelo que é declarado nas reivindicações independentes. As modalidades preferidas são divulgadas nas reivindicações independentes.

[0011] A presente invenção é com base no uso de nanofibras de celulose e/ou seus derivados em matriz de cultura de células em 2D e 3D. A presente invenção fornece o uso de nanofibras de celulose e/ou seus derivados na matriz de cultura de células. O uso de nanofibras de celulose e/ou seus derivados como matriz de cultura de células em 2D e 3D elimina a necessidade do uso de aditivos com base em animal para multiplicar e realizar proliferação de células sobre uma matriz contendo as nanofibras de celulose e/ou seus derivados.

[0012] O presente inventor surpreendentemente descobriu que hidrogel de CNF derivado de planta pode ser usado sem quaisquer modificações como ECM de humano biomimética para a cultura de células em 3D. Dados de proliferação e viabilidade celulares sugerem que o hidrogel de CNF é um biomaterial ótimo para armações celulares em 3D para progressos de ensaios funcionais de triagem de alta produtividade com base em células em desenvolvimento de medicamentos, em teste de toxicidade de medicamento e em medicina regenerativa e adicionalmente para o fornecimento de células in vivo.

[0013] Os presentes inventores descrevem pela primeira vez as propriedades físicas e de biocompatibilidade de hidrogel de CNF derivado de planta. Celulose de planta é extensivamente usada nas indústrias têxtil e de papel e é naturalmente abundante. O hidrogel de nanofibra de celulose nativa é opaco. Modificação química da polpa de celulose antes da desintegração mecânica produz hidrogéis opticamente transparentes.

[0014] A presente invenção é com base em estudos experimentais sobre hidrogéis compostos de nanofibras de celulose (cellulose nanofibers, CNF), que estão dispersadas em ambiente aquoso. As nanofibras são elevadamente hidrofílicas devido às funcionalidades hidroxila de polímeros de celulose e devido ao fato de estarem parcialmente cobertas com polissacarídeos de hemicelulose.

[0015] Consequentemente a presente invenção fornece como um primeiro aspecto uma composição fornecedora de células ou de cultura de células compreendendo nanofibras de celulose ou um seu derivado, sendo que a nanofibra de celulose está em uma forma de hidrogel ou membrana.

[0016] Uma vantagem significativa da presente invenção é que as células podem ser mantidas (e proliferadas) sobre os meios biomateriais ou dentro dos meios biomateriais sem agentes químicos com base em humano ou animal originários externamente às células. As células são uniformemente dispersadas sobre ou na(o) matriz/meio contendo as nanofibras de celulose ou um seu derivado. As células se dividem sobre os ou nos meios, iniciam a se proliferar e os agrupamentos de células começam a crescer espontaneamente sem o acúmulo de células sobre o fundo da plataforma de cultura de células. A divisão homogênea das células nas nanofibras de celulose ou em um seu derivado é um pré-requisito para o biomaterial funcionar como meios de cultura de células em 3D.

[0017] Outras vantagens da presente invenção incluem: nanofibras de celulose e/ou seus derivados são inertes e não dão fluorescência de fundo. Os meios compreendendo nanofibras de celulose ou um seu derivado podem ser injetados. Injetabilidade é explicada pelas propriedades reológicas. A injeção pode ser realizada de modo que as células permaneçam estáveis dentro da matriz e estejam homogeneamente dispersadas na matriz após a injeção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] A Figura 1 retrata as imagens por cryo-TEM de hidrogéis de nanofibras de celulose. CNF nativo está no lado esquerdo (A) e CNF transparente está no lado direito (B).

[0019] A Figura 2 retrata a viabilidade de células HepG2 em materiais de cultura de células comerciais [MaxGel™ (Sigma-Aldrich), HydroMatrix™ (Sigma-Aldrich) e PuraMatrix™ (3DM Inc.)], em dois materiais de nanofibras de celulose diferentes (CNF nativa e CNF transparente) e em CNF na qual fibronectina (FN) foi adicionada. Em ensaio de proliferação AB, as células foram cultivadas durante 48 h e as células de controle foram cultivadas em condições iguais sobre uma superfície de plástico.

[0020] A Figura 3 retrata a viabilidade de células ARPE-19 cultivadas em hidrogel de CNF nativa após a transferência das células com uma agulha de seringa de tamanhos diferentes. A viabilidade é apresentada como intensidade de fluorescência relativa.

[0021] A Figura 4 retrata a difusão de dextranos de pesos moleculares diferentes (20 kDa, 70 kDa, e 250 kDa) através de hidrogel de nanofibras de celulose nativas 1%.

[0022] A Figura 5 retrata a imagem por microscopia de luz de células ARPE-19 sobre membrana de CNF nativa. A membrana de CNF suporta o crescimento de células sobre a parte superior da imagem, sobre a parte inferior da imagem as células crescem sobre plástico de cultura de células. Magnificação de 20x.

[0023] A Figura 6 retrata as imagens de seção de microscopia confocal de células HepG2 sobre um plástico de cultura de células (A) e no hidrogel de nanofibras de celulose nativas (B).

[0024] A Figura 7 retrata as propriedades viscoelásticas de hidrogel de CNF 0,5% por medições reológicas oscilatórias dinâmicas. São apresentadas as dependências da frequência de G’ (o módulo de armazenagem) e de G” (o módulo de perda) de um hidrogel de CNF nativa 0,5%.

[0025] A Figura 8 retrata a viscosidade de hidrogéis de CNF 0,5% como função de tensão de cisalhamento aplicada em comparação com solução 0,5% de polímeros de poliacrilamida solúveis em água (5.000 kDa) e de CMC (250 kDa).

[0026] A Figura 9 retrata a viscosidade de hidrogéis de CNF 0,5% como função da taxa cisalhante medida em comparação com poliacrilamida 0,5% e CMC 0,5%. Regiões de cisalhamento típicas de diferentes processos físicos estão marcadas na Figura com setas.

[0027] A Figura 10 retrata a representação esquemática de um hidrogel de CNF contendo células fluindo dentro de uma agulha. Região de taxa cisalhante alta (viscosidade baixa) está localizada na interface do gel- agulha e região de cisalhamento baixo (viscosidade muito alta) está localizada no centro da agulha.

[0028] A Figura 11 retrata a evolução da taxa cisalhante e da viscosidade quando hidrogel de CNF nativa 0,7% foi cisalhado em um reômetro em geometria cilíndrica concêntrica em uma tensão constante de 40 Pa.

[0029] A Figura 12 retrata a recuperação de estrutura de uma dispersão de hidrogel de CNF nativa 0,7% após o cisalhamento em taxa cisalhante alta em comparação com misturação branda com um bastão de vidro.

[0030] A Figura 13 retrata a estabilidade de duas suspensões de cascalho em hidrogel de CNF nativa 0,5%, (fileira superior) e em hidrogel de CNF transparente 0,5% (fileira inferior) durante período de 17 dias. O cascalho foi areia CEN Standard (EN 196-1) com tamanho de partícula médio de 1-2 mm e 2-3 mm. As amostras foram armazenadas na temperatura ambiente.

[0031] A Figura 14 retrata a influência da hidrólise enzimática sobre a capacidade de suspensão de geles de nanofibras de celulose. O cascalho foi areia CEN Standard (EN 196-1) com tamanho de partícula médio de 1-2 mm.

[0032] A Figura 15 retrata a imagem por microscopia confocal de células progenitoras hepáticas derivadas de célula ES de humano, que estão imersas em hidrogel de CNF nativa. Barra de escala: 70 μm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0033] A presente invenção refere-se a uma composição fornecedora de células ou de cultura de células compreendendo nanofibras de celulose e/ou seus derivados, na qual as nanofibras de celulose ou seus derivados estão em uma forma de um hidrogel ou uma membrana. Nanofibras de celulose ou seus derivados podem ser obtidas de material não-com base em animal tal como matéria-prima compreendendo material de planta.

[0034] Salvo indicação em contrário, os termos, que são usados no relatório descritivo e nas reivindicações, têm os significados comumente usados na cultura de células. Especificamente, os seguintes termos têm os significados indicados abaixo.

[0035] O termo “composição fornecedora de células ou de cultura de células” refere-se a um material compreendendo nanofibras de celulose ou derivados de nanofibras de celulose e cujo material é usado como um meio de cultura de células ou para fornecimento de células. Dita composição também pode ser usada para a transferência de células ou agrupamentos de células. Nanofibras de celulose pode estar em uma forma de um hidrogel ou uma membrana. Dita composição pode adicionalmente conter vários aditivos tais como componentes de matriz extracelular especiais, soro, fatores de crescimento, e proteínas.

[0036] O termo “matéria-prima de celulose” refere-se a qualquer fonte de matéria-prima de celulose que pode ser usada na produção de polpa de celulose, polpa refinada, ou nanofibras de celulose. A matéria-prima pode ser com base em qualquer material de planta que contém celulose. Material de planta pode ser madeira. Madeira pode ser de árvore de madeira macia tal como abeto, pinho, pinheiro, lariço, pinheiro-douglas ou pinheiro do Canadá, ou de árvore de madeira dura tal como bétula, álamo tremedor, choupo, aimeiro, eucalipto ou acácia, ou de uma mistura de madeiras macias e madeiras duras. Material de não-madeira podem ser de resíduos agrícolas, gramíneas ou outras substâncias de planta tais como palha, folhas, cortiça, sementes, cascas, flores, hortaliças ou frutas de algodoeiro, milho, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, linho, cânhamo, cânhamo-de-manilha, fibra de sisal, juta, rami, kenaf, bagaço, bambu ou junco.

[0037] O termo “polpa de celulose” refere-se às fibras de celulose, que são isoladas de qualquer matéria-prima de celulose usando processos de polpeamento químico, mecânico, termo-mecânico, ou quimio-termo- mecânico. Tipicamente o diâmetro das fibras varia entre 15 e 25 μm e o comprimento ultrapassa 500 μm, mas a presente invenção não é intencionada para ser limitada a estes parâmetros.

[0038] Celulose na presente invenção é estruturalmente celulose de tipo I.

[0039] O termo “nanofibra de celulose” refere-se a uma coleção de nanofibras de celulose (cellulose nanofibers, CNF) isoladas ou feixe de nanofibras derivados de matéria-prima de celulose ou polpa de celulose. Nanofibras têm razão de aspecto tipicamente alta: o comprimento pode exceder um micrômetro enquanto que o diâmetro numérico médio é tipicamente menor do que 200 nm. O diâmetro dos feixes de nanofibras pode ser maior mas geralmente é menor do que 1 μm. As nanofibras menores são similares às denominadas fibrilas elementares, que são tipicamente de 2-12 nm. As dimensões das fibrilas ou dos feixes de fibrilas são dependentes da matéria-prima e do método de desintegração. As nanofibras de celulose também podem conter algumas hemiceluloses; a quantidade é dependente da fonte de planta.

[0040] Desintegração mecânica de nanofibras de celulose a partir da matéria-prima celulose, polpa de celulose, ou polpa refinada é realizada com equipamento adequado tal como um refinador, um moedor, um homogeneizador, um coagulador de matéria coloidal, moedor por friacção, sonificador por ultra-som, fluidizador tal como microfluidizador, macrofluidizador ou homogeneizador do tipo fluidizador. Preferivelmente as “nanofibras de celulose” são material mecanicamente desintegrado.

[0041] “Nanofibras de celulose” ou “nanofibras de celulose e/ou seus derivados” também podem ser qualquer derivado quimicamente ou fisicamente modificado de nanofibras de celulose ou feixes de nanofibras. A modificação química pode ser com base por exemplo em reação de carbometilação, oxidação, tal como oxidação por TEMPO, esterificação, ou eterificação de moléculas de celulose. Modificação também pode ser realizada por adsorção física de substâncias aniônicas, catiônicas, ou não-iônicas ou qualquer combinação destas sobre a superfície da celulose. A modificação descrita pode ser realizada antes, após, ou durante a produção de nanofibras de celulose. Certas modificações podem produzir materiais de CNF que são degradáveis dentro do corpo humano.

[0042] Adequadamente a matéria-prima de celulose tal como polpa de celulose é pré-tratada com ácido ou base antes da desintegração mecânica. O pré-tratamento é realizado ao se submeter a polpa de celulose ao tratamento ácido, preferivelmente com ácido clorídrico para remover quaisquer íons positivamente carregados tendo uma carga maior do que +1, seguido por tratamento com uma base inorgânica contendo íons positivamente carregados tendo uma carga + 1, preferivelmente NaOH, onde íons Na+ substituem os íons iniciais. Este pré-tratamento concede às “nanofibras de celulose” excelentes propriedades de gelificação e transparência. Este produto pré- tratado é chamado de “nanofibras de celulose” pré-tratadas com ácido-base ou íon-trocadas.

[0043] Pureza microbiana das “nanofibras de celulose” é essencial para o desempenho da cultura de células. Portanto, as “nanofibras de celulose” são esterilizadas antes dos experimentos de cultura de células em uma forma de um hidrogel ou uma membrana. Em adição é importante minimizar a contaminação microbiana do produto antes e durante a fibrilação. Antes da fibrilação, é vantajoso assepticamente coletar a polpa de celulose da fábrica de polpa imediatamente após o estágio de alvejamento quando a polpa ainda está estéril.

[0044] Há vários sinônimos amplamente usados para as nanofibras de celulose. Por exemplo: nanocellulose, celose nanofibrilada (CNF), celulose nanofibrilar, nanofibra de celulose, celulose fibrilada em nanoescala, celulose microfibrilar, celulose microfibrilada (CNF), ou microfibrilas de celulose. Nanofibras de celulose produzidas por certos micróbios têm vários sinônimos, tais como celulose bacteriana, celulose microbiana (microbial cellulose, MC), biocelulose, nata de coco (NDC), ou coco de nata.

[0045] Nanofibras de celulose descritas nesta invenção não são o mesmo material denominado de whiskers de celulose, que também são conhecidos como: nanowhiskers de celulose, nanocristais de celulose, nanobastões de celulose, microcristais de celulose semelhantes a bastão, ou nanofios de celulose. Em alguns casos, terminologia similar é usada para ambos os materiais, por exemplo por Kuthcarlapati et al. (Metals Materials and Processes 20(3):307-314, 2008) onde o material estudado foi chamado de “nanofibra de celulose” embora referissem aos nanowhiskers de celulose. Tipicamente estes materiais não têm segmentos amorfos ao longo da estrutura fibrilar como nanofibras de celulose, que acarreta estrutura mais rígida. Whiskers de celulose também são mais curtos do que as nanofibras de celulose; tipicamente o comprimento é menor do que um micrômetro.

[0046] As dimensões de nanofibras de celulose individuais são bastante próximas das dimensões anteriormente mencionadas de fibras de colágeno em ECM, i.e. 4-10 nm. Portanto, hidrogéis com base em CNF podem ser usados como matriz de cultura de células em 3D.

[0047] Nos experimentos de cultura de células da presente invenção, foram usados dois tipos de nanofibras de celulose: CNF nativa opaca e CNF opticamente transparente, que foi celulose oxidada por TEMPO. Descrição detalhada dos materiais é apresentada na seção de Exemplos, Materiais e Métodos.

[0048] O termo “hidrogel de nanofibras de celulose” refere-se à dispersão aquosa de nanofibras de celulose.

[0049] O termo “membrana de nanofibras de celulose” refere-se a uma formação de fibras de celulose semelhante à folha seca ou úmida. As membranas são tipicamente produzidas por filtração da dispersão de nanofibras de celulose diluída com aparelho de filtração a vácuo com um filtro apropriado. O vazamento de solvente também pode ser usado para obter as estruturas de membrana anteriormente mencionadas. A membrana obtida pode ser usada como tal em estado úmido ou ser seca antes do uso.

[0050] As nanofibras de celulose ou um seu derivado da presente invenção podem compreender derivados quimicamente ou fisicamente modificados das nanofibras de celulose ou feixes de nanofibras.

[0051] A composição fornecedora de medicamento [sic] ou de cultura de células da presente invenção pode adicionalmente compreender aditivos adequados selecionados do grupo consistindo de componentes de matriz extracelular especiais, soro, fatores de crescimento, e proteínas.

[0052] A presente invenção também se refere a uma matriz fornecedora de células ou de cultura de células, na qual a matriz compreende células vivas e a composição fornecedora de células ou de cultura de células forma um hidrogel e na qual as células estão presentes na matriz em uma disposição bidimensional ou tridimensional.

[0053] As células podem ser quaisquer células. Qualquer célula eucariótica, como células de animal, células de planta e células fúngicas estão dentro do escopo da presente invenção e também células procarióticas tais como células bacterianas.

[0054] Dependendo da linhagem celular, os experimentos são realizados em 2D ou 3D, i.e. as células são cultivadas sobre as membranas ou os geles de CNF ou as células são dispersadas homogeneamente nos hidrogéis de CNF ou nas membranas de CNF. Os exemplos específicos da presente invenção divulgam que as células epiteliais pigmentadas da retina espontaneamente aparentes (“spontaneously arising retina pigment epitelial”, ARPE-19) formam monocamada, enquanto que células de carcinoma hepatocelular de humano (HepG2) produzem quer monocamada quer colônias de células.

[0055] As células podem ser detectadas usando qualquer meio de detecção conhecido ou corante conhecido na técnica.

[0056] A presente invenção também se refere a um método para produzir uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo as etapas de obter nanofibras de celulose e/ou seus derivados; opcionalmente misturar juntas ditas nanofibras de celulose e/ou seus derivados com água; e transferir ou posicionar as nanofibras de celulose e/ou seus derivados ou a mistura obtida para o (no) ambiente adequado para o fornecimento ou a cultura de células.

[0057] Membranas ou hidrogéis de nanofibras de celulose ou seus derivados ou a composição da presente invenção podem ser usados como um material fornecedor de células.

[0058] Membranas ou hidrogéis de nanofibras de celulose ou seus derivados ou a composição fornecedora de células ou de cultura de células podem ser usados para fornecer material para uso clínico.

[0059] A presente invenção refere-se ao uso microbiológico de nanofibras de celulose ou um seu derivado ou da composição de acordo com a presente invenção para propósitos laboratoriais e/ou industriais como um meio ou um composto de um meio para manter as células in vitro.

[0060] A composição compreendendo nanofibras de celulose ou seus derivados pode ser usada para imobilizar células ou enzimas.

[0061] A presente invenção também se refere a um método de cultivar células, no qual o método compreende as etapas de obter células; contatar as células com uma composição de cultura de células compreendendo nanofibras de celulose ou um seu derivado para formar uma matriz; e cultivar as células dentro de dita matriz em uma disposição bidimensional ou tridimensional.

[0062] A presente invenção adicionalmente se refere a uma composição, a um método, ou a um uso, na(o) qual as células são células eucarióticas.

[0063] A presente invenção adicionalmente se refere a uma composição, um método ou um uso, na(o) qual as células são células procarióticas. As células procarióticas compreendem microorganismos tais como bactérias aeróbicas ou anaeróbicas, vírus, ou fungos tais como leveduras e bolores.

[0064] A presente invenção adicionalmente fornece uma composição, um método ou um uso, na(o) qual as células são células-tronco.

[0065] A remoção de nanofibras de celulose pode ser realizada por exemplo com enzimas usando degradação enzimática de moléculas de celulose. Enzimas apropriadas são por exemplo celulases comercialmente disponíveis. As linhagens de células cultivadas também podem ser geneticamente engenhadas para produzir a necessária proteína enzima para dentro do sistema de cultura.

[0066] A presente invenção também se refere a um método para remover nanofibras de celulose ou um seu derivado do material de cultura de células ou de crescimento de células, o método compreendendo as etapas de obter material compreendendo meio de crescimento de células e as células e opcionalmente um medicamento; diluir o dito material com líquido aquoso ou não-aquoso; e remover as nanofibras de celulose por decantação. Centrifugação moderada pode ser usada para sedimentar as células e agregados de células antes da decantação.

[0067] Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que o hidrogel de CNF derivado de planta pode ser usado mesmo sem nenhuma modificação como ECM de humano biomimética para a cultura de células em 3D. Os dados de viabilidade e proliferação celulares sugerem que o hidrogel de CNF é um biomaterial ótimo para as armações de células em 3D para ensaios funcionais de triagem de produtividade alta com base em células avançados em desenvolvimento de medicamentos, em teste de toxicidade de medicamentos e em medicina regenerativa e adicionalmente em fornecimento de células in vivo.

[0068] A presente invenção divulga pela primeira vez as propriedades físicas e de biocompatibilidade de hidrogel de CNF derivada de planta. A celulose de planta é extensivamente usada em indústrias têxtil e de papel e é naturalmente abundante. O hidrogel de nanofibras de celulose nativas é opaco. A modificação química de polpa de celulose antes da desintegração mecânica produz hidrogéis opticamente transparentes.

[0069] Nanofibras de celulose da presente invenção podem ser usadas na forma de hidrogel ou de membrana úmida ou seca. A resistência de gel do hidrogel de CNF pode ser facilmente alterada por diluição. As nanofibras de celulose ou um seu derivado tendo propriedades similares são não-tóxicas para as células.

[0070] Se os hidrogéis de nanofibras de celulose são comparados com hidrogéis de cultura de células reticuláveis por UV, como hidrogéis de PEG ou de ácido hialurônico, os materiais de CNF são considerados muito menos tóxicos. Em geles reticuláveis por UV são necessários fotoiniciadores nocivos para iniciar a gelificação enquanto os hidrogéis de CNF são formados espontaneamente. A natureza não-covalente dos hidrogéis de CNF permite também o ajuste da porosidade por diluição.

[0071] As células são uniformemente espalhadas nos hidrogéis de nanofibras de celulose e podem automaticamente iniciar a duplicação e o crescimento em agrupamentos de células em 3D sem sedimentação para o fundo da plataforma de cultura de células. Todos os meios de cultura de células em 3D comerciais atualmente usados exigem a adição de peptídeo de adesão fazendo com que as células formem estrutura em 3D sobre a plataforma de cultura de células.

[0072] Nanofibras de celulose de acordo com a presente invenção ou um seu derivado podem ser usadas sem peptídeo de adesão. As células fixam- se na plataforma e espontaneamente se distribuem homogeneamente para dentro do hidrogel de nanofibras de celulose. As células são suspensas homogeneamente na fase contínua devido ao suporte mecânico proporcionado pelas fibras de nanofibras de celulose. O limite de escoamento extraordinariamente alto estabiliza as células e os agrupamentos celulares crescidos contra a sedimentação.

[0073] Os hidrogéis de nanofibras de celulose originários de planta funcionam sem peptídeo de adesão e/ou porosidade ajustada, enquanto que as nanofibras de celulose bacteriana exigem peptídeo de adesão. A celulose bacteriana tem sido usada diretamente após a fermentação, em cujo caso a estrutura de membrana resultante é consideravelmente mais firme do que a do hidrogel da presente invenção i.e. um hidrogel de nanofibras de celulose. Portanto os métodos da técnica anterior têm exigido processos adicionais para tornar a matriz de hidrogel mais porosa.

[0074] A firmeza dos meios de cultura de células contendo as nanofibras de celulose em forma de gel pode ser ajustada sem influenciar as propriedades da cultura de células. As nanofibras de celulose originárias de bactérias também são mais espessas do que as nanofibras de celulose de outras fontes e portanto não são livremente modificáveis para a cultura de células.

[0075] As células crescem dentro da matriz em 3D ou sobre a matriz. Dito material pode ser injetável ou membrana semelhante à folha com topologia de superfície apropriada.

[0076] As propriedades da CNF estão próximas do ideal para cultura de células em 3D: transparente, não-tóxica, elevadamente viscosa, alto poder de suspensão, alta retenção de água, boa adesão mecânica, não-com base em animal, parece-se com as dimensões de ECM, insensível aos sais, à temperatura ou ao pH, não-degradável, sem auto-fluorescência. CNF tem fluorescência de fundo insignificante devido à estrutura química do material. Ademais, o gel de CNF é não-tóxico para as células.

[0077] As células podem ser cultivadas ou crescidas sobre geles de CNF por tempo longo, por exemplo 2 a 7 dias ou mesmo por tempo mais longo. As células também podem ser cultivadas ou apenas suspensas no hidrogel por um tempo curto, por exemplo minutos a várias horas. As células usam a matriz de nanofibras de celulose como suporte/armação de crescimento utilizado como plataforma. As células formam agrupamentos indicando assim a utilidade das nanofibras de celulose como armação para cultura de células em 3D. As células crescem como camadas ou agregados celulares sobre o ou dentro do gel de CNF, dependendo do método de deposição e do tipo de célula.

[0078] O hidrogel de CNF não-tóxico é da mesma maneira boa ECM para as células estudadas como o MaxGel™ com base em ECM de humano. A viabilidade das células é ainda mais alta do que a viabilidade em PuraMatrix™ ou HydroMatrix™. Não são adicionados componentes de ECM com base em humano e em animal nos hidrogéis de CNF. Contudo, a adição de fibronectina ou de colágeno IV pode ser benéfica em alguns casos. Com base nos estudos de difusão o hidrogel de CNF é elevadamente permeável e livremente facilita a troca de oxigênio, nutrientes e metabólitos solúveis em água das células.

[0079] Crio-microscopia eletrônica de transmissão mostra que o hidrogel de CNF é composto de uma mistura de nanofibrilas de celulose individuais e de feixes de fibras. As dimensões de CNF são similares às do colágeno nativo de humano, que é um componente natural de ECM e comumente usado como um suporte de células. A resistência (elasticidade) de hidrogel de CNF permanece quase constante como função da frequência usada de 0,01 a 1 Hz. Dados de reologia revelam viscosidade por cisalhamento de cerca de várias centenas de quiloPascals em repouso (tensão de cisalhamento baixa) para abaixar para uns poucos Pascals dentro de tensão de cisalhamento de um Pascal. Este comportamento é de certa forma incomum para hidrogéis de biomaterial. Permite o suporte e a capacidade de suspensão extremamente bons de células e pelo comportamento de adelgaçamento por cisalhamento permite as fáceis dispensação e injeção desejadas de células em hidrogel de CNF independentemente do tamanho das agulhas usadas, cujos comportamentos não são obtidos antes para outros hidrogéis de biomaterial para cultura de células. As propriedades mecânicas de elasticidade e firmeza são ótimas para os hidrogéis de CNF para o crescimento em cultura de células em 3D e injeção de células.

[0080] A vantagem da presente invenção é que as dimensões da rede fibrilar de nanofibras de celulose ou um seu derivado estão muito próximas das dimensões da rede de ECM natural de nanofibras de colágeno. Ademais, as nanofibras de celulose ou um seu derivado são de material não-com base em animal, i.e. não há o risco de transferência de doença. Atualmente, os produtos comerciais são em sua maioria isolados de animais. Ademais, a invenção proporciona possibilidades para ajustar a forma física porque podem ser utilizados materiais de CNF desde hidrogéis até membranas.

[0081] Hidrogel injetável forma matriz de suporte ao redor das células devido à tensão de cisalhamento muito alta. As membranas de CNF são transparentes e elevadamente porosas. A produção em massa é fácil em comparação com as alternativas.

[0082] Nanofibras de celulose nativas são não-tóxicas para as células. A proliferação de células é quase o dobro no caso de nanofibras de celulose ou um seu derivado em comparação com o controle (apenas células). Células podem ser controladas sobre hidrogéis de CNF durante tempo longo (por exemplo durante 2-7 dias). As células usam a matriz de nanofibras de celulose como uma plataforma de crescimento. As células formam agrupamentos, o que indica a utilidade das nanofibras de celulose ou um seu derivado como armação para cultura de células em 3D. As células crescem como camadas dentro do gel de CNF. As nanofibras de celulose ou um seu derivado têm fluorescência de fundo insignificante. O hidrogel de nanofibras de celulose tem ótimas elasticidade, firmeza, tensão de cisalhamento, adesão mecânica e porosidade para ser usado como matriz de cultura de células em 2D e 3D.

[0083] Em ambiente aquoso, as nanofibras de celulose formam uma rede de hidrogel contínua de nanofibras dispersadas ou feixes de nanofibras dispersados. O gel é formado por fibrilas elevadamente hidratadas que são emaranhadas umas nas outras, mesmo em concentrações muito baixas. As fibrilas também podem interagir via ligações de hidrogênio. A estrutura macroscópica é facilmente destruída com agitação mecânica, i.e. o gel começa a fluir em tensão de cisalhamento elevada. Não têm sido previamente descritos hidrogéis de nanofibras de celulose e/ou seus derivados usados como material para a cultura de células.

[0084] Aplicações da presente invenção incluem obter material para a cultura de células para pesquisa em biotecnologia. Meios de cultura de células ou crescimento de células contendo CNF podem ser usados para a manutenção e o crescimento de células e também para a transferência de células. A presente invenção obtém meios de cultura de células que podem ser utilizados por exemplo em engenharia de tecidos ou em cicatrização de ferimentos. Outras aplicações incluem por exemplo aplicações de dosagem de medicamentos, medicamentos biotecnológicos ou biológicos e sua dosagem e também ensaios de teste de células funcionais de medicamentos em 3D. As propriedades reológicas singulares do hidrogel de CNF permitem várias aplicações que são com base na injetabilidade do hidrogel, como injeção de células ou medicamentos em hidrogel de CNF em tratamentos intraoculares, intramusculares, ou subcutâneos.

[0085] Os seguintes exemplos são fornecidos para adicionalmente ilustrarem a invenção e não são intencionados para limitarem o seu escopo. Com base na descrição, uma pessoa experiente na técnica será capaz de modificar a invenção em muitas maneiras. EXEMPLOS Materiais e métodos Preparação de hidrogéis de CNF

[0086] O hidrogel de CNF nativa opaca (1,7% em peso) foi obtido por homogeneização em alta pressão de fibras de polpa de celulose úmida. Assim, o produto direto do processo é um hidrogel de nanofibras de celulose diluído. O hidrogel de CNF transparente (0,9% em peso) foi obtido por processo de homogeneização similar de uma polpa de celulose quimicamente tratada (polpa de celulose oxidada por TEMPO). As amostras foram esterilizadas em autoclave. Para os estudos com células, o hidrogel de CNF foi diluído para a concentração apropriada e homogeneizado com sonificação ou misturação mecânica. Imagens obtidas por Cryo-TEM de CNF nativa e de CNF transparente são apresentadas em Figura 1. Hidrogel de nanofibras de celulose nativas é composto de uma mistura de nanofibrilas de celulose individuais e feixes de fibras (Figura 1A). O diâmetro de fibras menores é de aproximadamente 7 nm, contudo a maior parte do material de celulose forma estruturas de feixes de 50-100 nm. A escala de comprimento exata não pode ser estimada a partir das imagens devido à natureza emaranhada e de feixes do material, mas parece evidente que as nanofibras individuais são de comprimento de vários micrômetros. A imagem por cryo-TEM do hidrogel de CNF opticamente transparente mostra rede de nanofibras de celulose individuais homogeneamente distribuídas. O diâmetro destas nanofibras é de aproximadamente 7 nm e o comprimento ultrapassa um micrômetro. As nanofibras têm segmentos de comprimento de 100-200 nm seguidos por dobras acentuadas ao longo do eixo da fibra. Os segmentos retos são compostos de domínios de celulose elevadamente cristalinos - os sítios de dobra são formados pelas partes amorfas. Preparação de membranas de CNF

[0087] Membranas de CNF foram preparadas por filtração a vácuo de uma dispersão aquosa de CFN nativa 0,2 % em peso. Após a filtração, as membranas úmidas foram secas sob peso dentro de forno a 55°C durante 48 h. Os filmes secos foram lisos e opacos com uma gramatura de 70-80 g/m2. Hidrólise enzimática

[0088] A degradação enzimática de hidrogéis de CNF foi demonstrada por hidrólise de hidrogéis 0,5% contendo cascalho com Celluclast 1.5 LFG, CCN0367 (Novozymes, pH ótimo de 5), Prot. 90 mg/mL. Degradação de CNF nativa foi conduzida em pH 5 a 50°C durante 4 dias e a degradação de CNF transparente em pH 7 a 21°C durante uma hora. A dosagem de enzima foi de 5 mg de enzima por um grama de CNF. Células HepG2 Origem das células HepG2

[0089] Células de carcinoma hepatocelular de humano (HepG2) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, E.U.A.). Cultura de manutenção das células HepG2

[0090] As células HepG2 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM, Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina / estreptomicina (Gibco), L-glutamina (Gibco) 2mM, Piruvato de sódio 100 mM (Gibco). As células foram mantidas em frascos de cultura de 75 cm2 a 37°C em uma incubadora com umidade relativa de 95% na temperatura ambiente (room temperature, RT) em uma atmosfera contendo 5% de CO2. As células foram passadas para concentração de 1:10 por tripsinização duas vezes por semana com uma taxa de divisão de 1:4. O meio foi trocado a cada 48 h e as células foram subcultivadas para a confluência de 90%. Cultura em 3D de células HepG2 sobre hidrogel de CNF

[0091] Hidrogel de nanofibras de celulose foi posicionado no fundo de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades e a suspensão de células HepG2 em meio de crescimento contendo 25.000-50.000 células por cavidade quer foi semeada sobre o topo do hidrogel de CNF quer foi misturada com ele. A concentração de hidrogel de CNF varia de 0,01% a 1%. Células ARPE-19 Origem das células ARPE-19

[0092] Células epiteliais pigmentadas de retina espontaneamente aparentes (ARPE-19) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, E.U.A.). Cultura de manutenção das células ARPE-19

[0093] Células ARPE-19 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): Mistura de Nutrientes F12, mistura 1:1 suplementada com 10% de soro fetal bovino (fetal bovine serum, FBS), L- glutamina 2mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 U/mL. As células foram cultivadas a 37°C em atmosfera contendo 7% de CO2. O meio de crescimento foi trocado a cada 2-3 dias e as culturas foram usadas em 24-30 passagens. Cultura de células ARPE-19 sobre membrana de CNF

[0094] Hidrogel de nanofibras de celulose foi posicionado no fundo de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades e a suspensão de células ARPE-19 em meio de crescimento contendo 25.000-50.000 células por cavidade quer foi semeada sobre o topo do hidrogel quer foi misturada com ele. A concentração de hidrogel varia de 0,01% , 1%. Células progenitoras hepáticas derivadas de células ES de humano Cultura de manutenção de células-tronco embrionárias de humano

[0095] A linhagem H9 de célula-tronco embrionária de humano (human embryonic stem, hES) (Wisconsin International Stem Cell Bank, o “WISC Bank” c/o WiCell research Institute, Madison, WI, E.U.A.) foi usada para os presentes estudos. Células H9 foram rotineiramente cultivadas sobre placas de cultura de tecido revestidas com meio Matrigel mTeSR1 e passadas pelo uso de Dispase 1 mg/mL (StemCell Technologies). Nesta condição, as células-tronco formaram colônicas de monocamada bidimensionais (2D). Cultura em 3D de células hES em CNF

[0096] Colônias de células H9 foram misturadas quer com CNF nativa 0,3% quer com CNF transparente 0,3% e cultivadas em meio mTeSR1. As células hES em CNF formam agrupamentos celulares em 3D. Em alguns experimentos, CNF 0,3% foi misturada com 58 μg/mL de fibronectina de humano (Sigma-Aldrich). Cultura em 3D de células progenitoras hepáticas derivadas de células H9 em CNF

[0097] Células H9 foram diferenciadas em células progenitoras hepáticas durante 11 dias seguindo o protocolo publicado [Hay DC, Zhao D, Fletcher J, Hewitt ZA, McLean D, Urruticoechea-Uriguen A, Black JR, Elcombe C, Ross JA, Wolf R, Cui W. “Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.” Stem Cells. 2008 Apr;26(4):894-902)]. As células progenitoras hepáticas derivadas foram cultivadas em ambiente 3D usando quer CNF nativa 0,3% quer CNF transparente 0,3% durante 7 duas. Em alguns experimentos, CNF 0,3% foi misturada com 13 μg/mL de colágeno de tipo IV de camundongo (Sigma-Aldrich). Coloração de células vivas / células mortas (‘Live/Dead’)

[0098] Agrupamentos de células H9 e células progenitoras hepáticas em CNF foram co-corados com CellTracker Blue CMAC (20 μM) para células vivas e com iodeto de propídio (25 μg/mL) para células mortas. Imagens das células foram adquiridas por microscopia de varredura de laser confocal (Leica TCS SP5 MP SMD FLIM) em comprimento de onda de excitação de 405 nm para CellTracker Blue CMAC e de 514 nm para iodeto de propídio. Ensaio AlamarBlue para proliferação / viabilidade de células

[0099] A viabilidade de células foi quantificada pelo AlamarBlue™ Cell Viability Assay Kit (Biotium Inc., Hayward, CA, E.U.A). Hidrogel de nanofibras de celulose foi posicionado no fundo de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades e suspensão de células HepG2/ARPE-19 em meio de crescimento contendo 25.000-50.000 células por cavidade quer foi semeada sobre o topo do hidrogel quer foi misturada com ele. A concentração de hidrogel varia de 1 a 0,01%. A viabilidade e a proliferação de células foram medidas como uma função de dias após a cultura das células sobre o hidrogel de nanofibras de celulose em uma incubadora a 37°C em 5% de CO2 e umidade relativa de 95%.

[00100] Após 48 horas, AlamarBlue foi adicionado diretamente no meio de cultura em placas de 96 cavidades em uma concentração final de 10%. As placas foram incubadas durante 5 h e foram expostas a um comprimento de onda de excitação de 530 nm, e a um comprimento de onda de emissão de 590 nm para medir a fluorescência. A viabilidade percentual foi expressada como contagens de fluorescência na presença de hidrogel de CNF como uma percentagem daquela na ausência de hidrogel de nanofibras de celulose (células crescendo sobre superfície de plástico).

[00101] As medições de fluorescência de fundo (controle negativo) foram determinadas das cavidades contendo hidrogel e reagente corante em meio de cultura mas sem as células. A média e o desvio padrão para todas as medições de fluorescência foram calculadas e subsequentemente corrigidas para a fluorescência de fundo e expressados como fluorescência relativa. Microscopia de laser confocal

[00102] A viabilidade de células HepG2 cultivadas sobre hidrogel e a formação de esferóides de HepG2 em 3D foram avaliadas com o Live/Dead® Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen) consistindo de calceína AM e homodímero de etídio.

[00103] Resumidamente, células HepG2 foram suspensas em hidrogel de CNF nativa e transparente 1% com ou sem fibronecina. A suspensão de células em hidrogel foi transferida para cada cavidade com células. O meio de cultura de células foi adicionado em cada cavidade. As células HepG2 encapsuladas em hidrogel foram cultivadas durante 5 dias e o meio foi renovado a cada 48 h. Após 5 dias, o meio foi removido das cavidades e as células encapsuladas foram lavadas com PBS e incubadas em solução ‘Live/Dead’ contendo calceína AM 0,2 μM e homodímero de etídio 1,0 μM durante cerca de 45 min na temperatura ambiente. Células vivas tiveram a sua imagem obtida usando um microscópio confocal de varredura de laser (confocal laser scanning microscope, CLSM, Leica SP2 inverted microscope, Zurique, Suíça) equipado com laser de argônio (488 nm/35mW), objetivas HC PL APO 10x/ 0,4 CS e HC PL APO 20x/0,7 CS (ar), caixa incubadora com um sistema aquecedor de ar (Life Imaging /Services, Suíça), e misturador de CO2 (Okolab). As imagens foram adquiridas de dois detectores (um para Calceína e o outro para Homodímero de Etídio). As imagens foram criadas e editadas com Imaris 7.0 (Bitplane). Não foi realizada deconvolução. Exemplo 1 Comparação de viabilidade celular de células HepG2 em materiais de cultura de célula diferentes

[00104] Hidrogéis de nanofibras de celulose foram posicionados no fundo de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades e suspensão de células HepG2 em meio de crescimento de manutenção contendo 25.00050.000 células por cavidade foi quer semeada sobre o topo do hidrogel quer misturada com ele. A concentração de hidrogel varia de 1-0,01%. A intensidade de fluorescência que indica as viabilidade e proliferação celulares foi medida como uma função de dias após a cultura das células sobre o hidrogel de nanofibras de celulose em uma incubadora a 37°C em 5% de CO2 e umidade relativa de 95%.

[00105] Foram usados três materiais de cultura de células comercialmente disponíveis como materiais de cultura em 3D de referência: MaxGel™ (Sigma-Aldrich), HydroMatrix™ (Sigma-AIdrich) e PuraMatrix™ (3DM Inc.). A configuração experimental foi idêntica em todos os materiais estudados.

[00106] A viabilidade de células HepG2 foi quantificada por AlamarBlue™ Cell Viability Assay Kit (Biotium Inc., Hayward, CA, USA) conforme apresentado acima em Materiais e métodos, ensaio Alamar Blue para viabilidade / proliferação celular.

[00107] A viabilidade percentual de células HepG2 para os materiais estudados é apresentada em Figura 2.

[00108] Ambos os tipos de hidrogéis de nanofibras de celulose, i.e. CNF nativa e transparente mostram valores de viabilidade mais altos do que os dos materiais de referência comerciais Hydromatrix™ ou PuraMatrix™. Se fibronectina é adicionada nos hidrogéis de CNF, a viabilidade fica próxima da viabilidade em MaxGel ™ comercial. Em adição a proliferação e a viabilidade celulares aumentam linearmente como uma função da concentração de células em ambos os hidrogéis. Esta observação confirma a hipótese de que o hidrogel imita os componentes de ECM de humano. Ele tem toda a composição principal de ECM. Exemplo 2 Transferência de células ARPE-19 com uma agulha de seringa

[00109] Células ARPE-19 (25.000 células por cavidade) foram semeadas e cultivadas em matriz de CNF sobre o fundo de placa de 96 cavidades. A viabilidade de células ARPE-19 após a transferência das células com uma agulha de seringa de tamanhos diferentes é apresentada em Figura 3. O mesmo fenômeno também pode ser obtido com outros tipos de células como células HepG2 e ES.

[00110] Explanação mais detalhada da transferência de células ARPE- 19 com uma agulha de seringa é dada a seguir: Na Transferência 1 em Figura 3 as células foram incubadas durante 48 horas com CNF 1,66%, e após isto as células foram transferidas com uma seringa (20G-27G) cerca de 100 μL para dentro de uma placa de 96 cavidades. Após a transferência com a seringa as células foram incubadas durante 24 horas, e a viabilidade das células em CNF foi medida.

[00111] Na Transferência 2, as células incubadas durante 24 horas em CNF 1,66 % foram transferidas com uma seringa 27G (cerca de 2 mL) para dentro de um meio novo. As células foram incubadas durante 24 horas após a transferência, após a qual as células foram de novo transferidas com uma seringa (20G-27G) cerca de 100 μL para dentro da placa de 96 cavidades, incubadas de novo durante 24 horas e foram medidas as viabilidades das células duplamente transferidas em CNF 1,66%.

[00112] Estes experimentos comprovam que é possível transferir as células em hidrogel de CNF, o processo de transferência foi bem sucedido e as células estavam vivas e permaneceram vivas durante a transferência com uma seringa. Este fenômeno foi obtido mesmo com o menor tamanho de agulha de 27G, e não ocorreu nenhuma interrupção relativa ao tamanho da agulha usada no processo de transferência. As amostras que foram transferidas duas vezes (Transferência 2) mostraram taxas de proliferação menores mais provavelmente devido ao tempo de incubação 24 horas mais curto no início do experimento. A transferência de células em hidrogel de CNF comprova que as células estavam de fato dentro do hidrogel e permaneceram lá porque as células que estavam fixadas na placa não foram transferidas (sem tripsinização). Estes experimentos mostraram que as células permaneceram viáveis durante a transferência. Exemplo 3 Células-Tronco Coloração ‘Live/dead’ de células progenitoras hepáticas derivadas de células hES

[00113] Células progenitoras hepáticas derivadas de células ES de humano foram imersas em hidrogel de CNF (Figura 15) e cultivadas durante 7 dias com e sem colágeno IV. Não foi detectada fluorescência de fundo. As células progenitoras hepáticas derivadas de células ES foram imersas em hidrogel de CNF transparente e cultivadas durante 7 dias com e sem colágeno IV. Não foi detectada fluorescência de fundo, o que torna este material extremamente fácil de usar neste contexto. Habitualmente outros materiais usados e.g. MatriGel e MaxGel têm uma fluorescência de fundo significativa, e portanto são difíceis de funcionar com aquelas matrizes. É possível a manutenção de células ES em hidrogel de CNF, elas sobrevivem e assim este material é capaz de mantê-las vivas. Em adição, as células ES também formam estrutura em 3D, que não tem sido observada antes com nenhum outro material. Exemplo 4 Difusão de dextranos através de hidrogéis de CNF

[00114] É importante o conhecimento detalhado sobre as propriedades de difusão de um material de cultura de células. O material de cultura de células deve ser suficientemente poroso para permitir a difusão de nutrientes e de oxigênio para as células cultivadas e também para permitir a difusão eficiente de metabólitos das células. As propriedades de difusão de hidrogel de CNF foram demonstradas com dextranos de pesos moleculares diferentes na seguinte maneira: 400 μL de CNF transparente ou opaca (1%) foram depositados por filtro sobre o compartimento apical em placas de cavidades de filtro Transwell™ (tamanho de poro de filtro de 0,4 μm). 1 mL de PBS foi adicionado no lado basolateral e 100 μL (25 μg) de dextranos fluorescentemente marcados foram adicionados no topo dos hidrogéis (PM de 20k, 70k e 250k). Placa foi firmemente fixada e deixada imperturbada sobre um agitador de placa de cavidades. Amostras de 100 μL foram retiradas do lado basolateral e quantidade igual de PBS foi reposta. Primeiras amostras foram retiradas em intervalos de 15 minutos, outras amostras foram retiradas em instantes de tempo diferentes variando de 30 minutos a 2 horas e as amostras finais em 24 horas. Total de 168 amostras foi retirado. Placa alvo (OptiPlate™-96 F) foi medida em comprimentos de onda de excitação e de emissão de 490 nm e 520 nm respectivamente.

[00115] Difusão de dextranos de pesos moleculares diferentes através de gel de nanofibras de celulose nativa 1% é apresentada em Figura 4. A difusão dos compostos modelo ocorre em velocidade constante e é elevadamente dependente do peso molecular (tamanho) do composto. É evidente que nos hidrogéis de CNF as moléculas são capazes de difundir eficientemente embora a estrutura do gel seja suficientemente firme para estabilizar a suspensão de células.

[00116] O perfil de difusão observado também pode ser utilizado em várias aplicações e formulações de liberação de medicamentos. A difusão de medicamentos pode ser controlada como uma função do tamanho da molécula de medicamento ou proteína (usada como medicamento) ou como uma concentração do hidrogel de CNF. O perfil de liberação prolongado evidente é especialmente benéfico para certos tratamentos onde liberação mais longa é preferida. Exemplo 5 Proliferação de células ARPE19 sobre membrana de CNF

[00117] Membrana de CNF nativa foi posicionada sobre o fundo de uma placa de cultura de células de 96 cavidades e a suspensão de células no meio de crescimento de manutenção contendo 25.000-50.000 células por cavidade foi semeada sobre o topo da membrana. A concentração da membrana varia de 1,6 a 0,01%. As viabilidade e proliferação celulares foram medidas como uma função de dias após a cultura de células sobre a membrana de CNF nativa em uma incubadora a 37°C em 5% de CO2 e umidade relativa de 95%.

[00118] Células ARPE-19 sobre membrana de CNF nativa tiveram sua imagem adquirida por microscopia de luz. A membrana de CNF suporta o crescimento das células como apresentado na parte superior da imagem (Figura 5) mostrando que as células ARPE-19 podem ser crescidas em 2D sobre a membrana de CNF e que a membrana de CNF é útil como matriz de crescimento de células em 2D.

[00119] Células ARPE-19 proliferaram bem em hidrogéis independentemente da concentração de células usada. Não há diferença significativa entre os hidrogéis. A proliferação de células aumentou ~2 vezes quando cultivadas sobre hidrogel em comparação com as células cultivadas na ausência de hidrogel. Exemplo 6 Morfologia de agrupamentos de células HepG2 cultivadas em 3D Microscopia de laser confocal

[00120] Microscopia de laser confocal foi usada para adquirir a imagem de células vivas. A forma esferoidal das células HepG2 encapsuladas no hidrogel de CNF sugere claramente que as células estão aprisionadas dentro do hidrogel e estão crescendo em três dimensões (Figura 6). Imagens obtidas das células após 5 dias de cultura são apresentadas em Figura 6 mostrando que as células são viáveis dentro de esferóides 3D em ambos os hidrogéis. A viabilidade das células foi independente da concentração das células em hidrogéis e o tamanho dos esferóides aumentou como uma função do tempo em todas as culturas (Figura 6).

[00121] O meio foi renovado depois a cada 48 h e o tamanho de esferóide aumenta como uma função do tempo na cultura. Quando fibronectina foi adicionada no hidrogel de CNF, a viabilidade das células dentro do esferóide 3D foi aumentada. Imagens por microscopia confocal de coloração ‘live/dead’ revelaram que as células permaneceram viáveis durante o período de cultura de 5 dias. Estas descobertas estão relacionadas com os resultados do ensaio Alamar Blue de proliferação de células (Figura 2). Esta observação confirma nossa hipótese de que o hidrogel de CNF imita os componentes da ECM de humano. Ele tem todas as composições principais da ECM exceto fibronectina. Portanto a adição de fibronectina melhora a viabilidade das células em agrupamentos 3D. Fibronectina facilitou a fixação e a viabilidade de células HepG2. Tem sido mostrado anteriormente que fibronectina aumenta a sobrevivência de hepatócito e decresce a apoptose via ligação em integrina β1.

[00122] Por este meio é possível mostrar a estrutura 3D das células HepG2 obtidas sem nenhum outro material de suporte ou outros componentes de ECM do que apenas o hidrogel de CNF. Isto comprova a utilidade e a facilidade de uso do hidrogel de CNF como matriz de cultura de células em 3D. Exemplo 7 Resistência do gel

[00123] Uma função importante de um meio de cultura de células em 3D é manter as células homogeneamente suspensas na matriz e evitar a sedimentação. CNF atende a esta exigência por causa de sua capacidade de formar uma rede de gel em concentração muito baixa (0,5%). Foi mostrada a estrutura semelhante a gel de CNF pela determinação de suas propriedades viscoelásticas por medições reológicas oscilatórias dinâmicas. Os resultados das varreduras de frequência mostram comportamento típico semelhante a gel. O módulo de armazenagem (G’) é várias ordens de magnitude mais alto do que o módulo de perda (G’) e quase independente da frequência, o que significa que as propriedades elásticas (semelhantes à de sólido) são mais pronunciadas do que as características viscosas (semelhantes às de líquido) (Figura 7). Típico para os geles também é que ambos G’ e G” são relativamente independentes da frequência. As propriedades viscoelásticas dos geles de CNF foram determinadas com uma medição de varredura de frequência oscilatória em um reômetro (AR-G2, TA Instruments) em uma deformação de 0,1%. Exemplo 8 Propriedades de fluxo do hidrogel de CNF

[00124] As propriedades de fluxo reológico de hidrogéis de CNF mostram várias características que são benéficas no uso em cultura de células. Os hidrogéis têm uma viscosidade alta em cisalhamento baixo (ou repouso) para capacidade de suspensão ótima das células mas também mostram comportamento de adelgaçamento por cisalhamento em taxas cisalhantes mais altas para permitir a dispensação e a injeção. A capacidade de CNF em proporcionar estes tipos de propriedades reológicas foi demonstrada em uma série de testes na qual a viscosidade de dispersões de CNF foi medida sobre uma ampla faixa de tensão de cisalhamento (taxa cisalhante) em um reômetro rotativo (AR-G2, TA Instruments, UK).

[00125] Dispersões de CNF mostram viscosidades em cisalhamento zero muito altas (a região de viscosidade constante em tensões cisalhantes pequenas) diferentes de polímeros solúveis em água, como mostrado em Figura 8. A viscosidade em cisalhamento zero de CNF é sobremaneira aumentada pelo diâmetro de nanofibrila menor induzido pelo pré-tratamento químico precedente do material inicial. A tensão na qual o comportamento de adelgaçamento por cisalhamento inicia (“limite de escoamento”) também é consideravelmente alta para as dispersões de CNF. A capacidade de suspensão de um material é melhor quanto mais alto for o limite de escoamento. As células são efetivamente estabilizadas contra sedimentação pelos efeitos combinados de viscosidade alta em cisalhamento zero e limite de escoamento alto e módulo de armazenagem alto. A força gravitacional aplicada pelas células é muito mais fraca do que o limite de escoamento. Assim, as células suspensas estão “congeladas” dentro da matriz de gel se misturadas com CNF ou “congeladas” sobre o gel se depositadas sobre o topo do gel.

[00126] Em Figura 9 a viscosidade é apresentada como uma função da taxa cisalhante medida. Desta Figura 9 é óbvio que a viscosidade das dispersões de CNF cai em taxas cisalhantes relativamente pequenas e alcança um nível similar como aquele medido para os materiais de referência em taxas cisalhantes de cerca de 200 s-1.

[00127] A estrutura de rede de CNF se rompe sob cisalhamento (Figura 7). Sob a aplicação de uma certa tensão, a viscosidade do sistema cai dramaticamente e ocorre uma transição do comportamento semelhante a sólido para semelhante a líquido. Este tipo de comportamento é benéfico porque permite a misturação das células homogeneamente dentro da suspensão de CNF por cisalhamento mecânico moderado. Quando líquidos de duas fases, tais como dispersões de CNF floculadas, são cisalhados (e.g., em um reômetro ou em um tubo), a fase dispersada tende a se mover para longe dos limites sólidos, o que leva à criação de uma camada de viscosidade mais baixa de líquido nas paredes do recipiente (Figura 10). Este fenômeno significa que a resistência ao fluxo, i.e. a viscosidade é menor nos limites sólidos do que na região da dispersão afastada dos limites sólidos (Barnes, 1995). Respectivamente, a injeção do hidrogel de CNF com uma seringa e uma agulha ou com uma pipeta é fácil mesmo em concentrações altas (1-4%). O fenômeno também permite a fácil dispensação de suspensões de células com um distúrbio mínimo das células, i.e. a maior parte das células está localizada no centro da agulha e está praticamente em repouso (Figura 10).

[00128] Uma injetabilidade fácil dos hidrogéis de CNF é uma característica importante quando formulações injetáveis são consideradas. Como foi descrito em Exemplo 6, os hidrogéis de CNF têm perfis de liberação que poderiam ser utilizados em aplicações de liberação de medicamento controlada e prolongada. Estas duas descobertas para hidrogéis de CNF permitem várias aplicações de tratamento potencial com medicamentos, como tratamentos intraocular, intramuscular, subcutâneo ou por exemplo formulações oftálmicas viscoelásticas. Exemplo 9 Recuperação de estrutura após o cisalhamento ter cessado

[00129] Uma propriedade reológica importante adicional de hidrogéis de CNF é que o nível alto de viscosidade é mantido após o cisalhamento (e.g. injeção ou misturação) ter cessado. A recuperação de estrutura de uma dispersão de CNF foi demonstrada por uma série de testes na qual o material foi primeiro cisalhado em um reômetro (StressTech, Reologica Instruments Ab) em uma taxa cisalhante alta e após a interrupção do cisalhamento a recuperação da resistência do gel (G’) foi monitorada com uma medição de varredura de tempo oscilatória. O ciclo de cisalhamento foi realizado em uma geometria cilíndrica concêntrica em uma tensão constante de 40 Pa durante 61 s. A evolução da taxa cisalhante e da viscosidade durante este teste é mostrada em Figura 10. O material foi cisalhado em uma taxa cisalhante relativamente alta (1000 s-1) durante um período de tempo de pelo menos 40 s, durante o qual a viscosidade do material caiu para abaixo de 40 mPa s.

[00130] Após o término do cisalhamento, a evolução de G’ (uma medição da resistência do gel) foi permitida por uma medição oscilatória em frequência constante (1 Hz) e tensão pequena (0,5 Pa). A medição foi iniciada exatamente 10 s após o término do cisalhamento. A partir da Figura 11 é óbvio que uma rede de gel é muito rapidamente formada quando a dispersão de CNF é permitida repousar após ela ter sido cisalhada em taxas cisalhantes altas. Recuperação de estrutura substancial é observada já 10 s após a cessação de cisalhamento (igual ao tempo zero em Figura 11). Um nível de módulo de armazenagem constante (G’) é alcançado após manter a dispersão de CNF em repouso por menos do que 10 min. O nível de G’ que a dispersão de CNF extensivamente cisalhada desenvolveu foi comparável com aquele de uma dispersão de CNF que foi apenas brandamente misturada com um bastão de vidro antes do teste da recuperação de estrutura.

[00131] Evolução da taxa cisalhante e da viscosidade quando uma dispersão de CNF nativa 0,7% foi cisalhada em um reômetro em geometria cilíndrica concêntrica em uma tensão constante de 40 Pa é apresentada em Figura 11.

[00132] A recuperação de estrutura de uma dispersão de CNF nativa 0,7% após cisalhamento em tensão de cisalhamento alta em comparação com após misturação branda com um bastão de vidro é apresentada em Figura 12.

[00133] A recuperação de estrutura rápida é importante para os materiais de cultura de células do tipo hidrogel por duas razões. Primeira, ela permite que as células sejam homogeneamente distribuídas nos hidrogéis de CNF após a misturação delas com o hidrogel. Segunda, se os hidrogéis de CNF são usados para transportar células cultivadas, a recuperação rápida da estrutura do gel efetivamente aprisiona as células no lugar desejado e a migração é mínima, por exemplo quando é considerado transplante de células. A recuperação rápida é essencial também nas formulações de liberação de medicamento injetáveis. Exemplo 10 Estabilidade

[00134] Como mostrado em Exemplo 1, mesmo dispersões muito diluídas de CNF têm uma viscosidade muito alta em taxas cisalhantes baixas. A estrutura do hidrogel também é recuperada quando o cisalhamento, tal como injeção, cessa. Em condições estáticas, CNF forma uma rede de hidrogel com módulo elástico alto e limite de escoamento excepcionalmente alto. Devido a estas propriedades, CNF tem um poder de suspensão muito alto de partículas sólidas mesmo em concentração muito baixa.

[00135] A capacidade de suspensão em condições estáticas é demonstrada com suspensões de cascalho. Dispersões 0,5% de CNF nativa e CNF transparente são capazes de estabilizar mesmo partículas de cascalho de tamanho de 2-3 mm por períodos de tempo muito longos, veja Figura 13. Deve ser observado que a CNF transparente é capaz de estabilizar as suspensões de partículas em concentração mais baixa do que a CNF nativa. Exemplo 11 Hidrólise enzimática

[00136] É comumente sabido que certas enzimas, celulases, são capazes de hidrolisar ligações β-(1 ^4) em celulose. Por exemplo endo-1,4-p- glicanases (EGs) que selecionam cadeias de celulose em localizações aleatórias longe das extremidades de cadeia; exoglicanases ou exocelobiohidrolases (CBHs) que degradam celulose por quebra das moléculas a partir de ambas as extremidades da cadeia produzindo dímeros de celobiose; e β-glicosidases (BGLs) que hidrolisam as unidades de celobiose (produzidas usando ataque por EG e CBH ) para glicose. Respectivamente, nanofibras de celulose podem ser enzimaticamente hidrolisadas para glicose com o auxílio de celulases (Ahola, S., Turon, X., Osterberg, M., Laine, J., Rojas, O.J., Langmuir, 2008, 24, 11592-11599).

[00137] Hidrólise enzimática de celulose pode ser utilizada em sistemas de cultura de células contendo nanofibras de celulose devido a várias razões. Sob hidrólise do hidrogel de CNF, a viscosidade do meio é drasticamente abaixada e as estruturas de células cultivadas são facilmente acessíveis e.g. para coloração. Também, após a hidrólise, as estruturas das células podem ser transferidas ou transplantadas sem o material contendo celulose. O produto de degradação, glicose, é geralmente não-tóxico para as células e pode ser utilizado como um nutriente em cultura de células.

[00138] A hidrólise enzimática de nanofibras de celulose pode ser conduzida com um auxílio de celulases diferentes em ambiente diferente. Em Figura 14, é demonstrado o efeito de enzimas comerciais Celluclast sobre o poder de suspensão dos geles. Ambos os hidrogéis de CNF nativa e de CNF transparente perdem o poder de suspensão devido à degradação enzimática da estrutura do gel. As linhagens celulares cultivadas também podem ser geneticamente engenhadas para produzir a proteína enzima necessária para dentro do sistema de cultura.

Claims

1. Composição fornecedora de células ou de cultura de células, caracterizada pelo fato de que a composição compreende nanofibras de celulose derivadas de planta, mecanicamente desintegradas e/ou seus derivados, em uma forma de um hidrogel ou uma membrana em estado úmido.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o diâmetro das nanofibras de celulose ou dos feixes de nanofibras nas nanofibras de celulose e/ou seus derivados é menor do que 1 μm, preferivelmente menor do que 200 nm, mais preferivelmente menor do que 100 nm.

3. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as nanofibras de celulose e/ou seus derivados compreendem derivados quimicamente ou fisicamente modificados de uma nanofibra de celulose ou feixes de nanofibras.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as nanofibras de celulose mecanicamente desintegradas são pré-tratadas com ácido-base.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição adicionalmente compreende aditivos selecionados do grupo consistindo de componentes de matriz extracelular, soro, fatores de crescimento e proteínas.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada(o) pelo fato de que as células são pelo menos uma dentre células eucarióticas, células procarióticas e células-tronco.

7. Matriz fornecedora de células ou de cultura de células, caracterizada pelo fato de que a matriz compreende células vivas e a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, formando um hidrogel e as células estão presentes na matriz em uma disposição bidimensional ou tridimensional.

8. Matriz de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que as células são células eucarióticas ou células procarióticas ou células-tronco.

9. Método para produzir uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - obter nanofibras de celulose derivadas de planta, mecanicamente desintegradas e/ou seus derivados; e, - misturar juntas as nanofibras de celulose e/ou seus derivados com água.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda combinar a mistura com um medicamento adequado.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que as nanofibras de celulose mecanicamente desintegradas são pré-tratadas com ácido-base.

12. Método para remover nanofibras de celulose com base em planta e/ou seus derivados de um material de cultura de células, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - obter um material compreendendo meio de cultura de células e células; - diluir o material com líquido aquoso ou não-aquoso; - opcionalmente centrifugar o material para sedimentar as células e os agregados de células; e, - remover as nanofibras de celulose por decantação.

13. Método para remover nanofibras de celulose com base em planta e/ou seus derivados de um material de cultura de células, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - obter um material compreendendo meio de cultura de células e células; - contatar o material de cultura de células com uma enzima degradadora; - opcionalmente centrifugar o material para sedimentar as células e os agregados de células; e, - remover as nanofibras de celulose por decantação.

14. Método para cultura de células, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - obter células; - contatar as células com a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para formar uma matriz; e, - cultivar as células dentro da matriz em uma disposição bidimensional ou tridimensional.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que antes da cultura a matriz é transferida para ou posicionada em um ambiente para a cultura de células ou para o fornecimento de células.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizada(o) pelo fato de que as células são pelo menos uma dentre células eucarióticas, células procarióticas e células-tronco.

17. Uso microbiológico de nanofibras de celulose derivadas de planta, mecanicamente desintegradas e/ou seus derivados ou da composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para propósitos laboratoriais ou industriais como um meio ou um composto de um meio para manter células IN VITRO.

18. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para imobilizar células ou enzimas.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizada(o) pelo fato de que as células são pelo menos uma dentre células eucarióticas, células procarióticas e células-tronco.