JP6448755B2 - 植物由来の細胞培養材料 - Google Patents

Description

本発明は、セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を含む、植物由来の細胞培養、及び細胞送達組成物に関する。

発明の背景
ヘルスケアは、依然として科学研究の重要なフロンティアである。費用対効果の高い、より安全な薬剤を発見し、開発する必要性がこれまでに増加し続けている。特定の組織又は器官内の細胞の組織的構成を正確にモデル化できることは極めて重要である。ｉｎ ｖｉｖｏシステムのｉｎ ｖｉｔｒｏへの忠実な模倣は、三次元（３Ｄ）での細胞増殖を必要とするであろう。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３Ｄ細胞培養において細胞間でなされる「クロストーク」は、生理的な条件下での細胞増殖の忠実な模倣である。実際に、３Ｄ細胞培養は、再生医療、慢性疾患のより良い理解、並びに薬剤のスクリーニング及び毒性検定のための優れたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムの提供に向けた取り組みにおける重要な役割を担っていると考えられる。従って、その出現は、適切に「生物学の新次元」として宣伝されている。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３Ｄ細胞増殖を助けるであろう「因子及び足場」を同定し開発することについて、集中した研究の取り組みがなされている。生理的な条件下での細胞は、それら細胞間でのクロストークを行っているばかりでなく、それらが存在する細胞の微小環境（細胞外マトリックス（ＥＣＭ））とも相互作用する。ＥＣＭは、細胞に対し構造的な支持を提供し、また、細胞運命へのシグナリング及び方向づけにも寄与する。主に、ＥＣＭは、グリコサミノグリカン、並びに、例えば、ナノファイバーネットワークに自己集合した、コラーゲン、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチンなどの線維性タンパク質で構成される。３Ｄ細胞増殖のための理想的な足場は、天然のＥＣＭの構造的成分を模倣することができ、細胞増殖及び維持を支持することができ、効率的な細胞遊走及び細胞への栄養分の伝達のための相互に接続する細孔の望ましいサイズのネットワークを有するべきである。本質的には、足場の機械的及び化学的特性は、天然の状態のような細胞機能をもたらすべきである。

ヒドロゲル（合成および天然起源の両方）は、３Ｄ細胞培養に適した足場として現れた。ヒドロゲル中の相互に接続した細孔のネットワークは、大量の生体液の保持を可能にし、酸素、栄養分、及び老廃物の輸送を促進する。さらに、ほとんどのヒドロゲルは、穏やかな細胞適合性の条件下で形成することができ、生物学的特性を界面化学により調節することができる。修飾された機械的、化学的、及び生物学的特性を有する、操作されたヒドロゲルは、ＥＣＭを模倣する可能性を有し、それ故、３Ｄ細胞培養におけるその有用性を確立している。３Ｄ細胞培養のための市販の製品は、例えば、PuraMatrix^TM（3DM Inc.）及びMatrigel（BD Biosciences）である。PuraMatrix^TMは、ファイバーの直径５〜１０ｎｍを有する、ＥＣＭにおける天然の線維状コラーゲンの構造に似た、自己集合したペプチドナノファイバーのヒドロゲルである。それは通常９９．５％の高い水分含量も有する。US 7,449,180及びWO 2004/007683は、ペプチドヒドロゲルを開示している。Matrigelは、マウス腫瘍細胞により分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物である。該混合物は、多くの組織において見出される複雑な細胞外環境と類似し、細胞生物学者により細胞培養のための基質として使用されている。ヒトＥＣＭ成分の混合物を含むMaxGel^TM ECM Matrix
（Sigma-Aldrich）は、環境温度においてゲルを形成する。

細菌性セルロースは、創傷治癒膜、及び細胞培養における足場として使用されている。
細胞培養での細菌性セルロースの使用における制限は、発酵した材料の特有の構造である；培養の際に、発酵槽内で空気と水の界面において非常に堅固な膜として、ＢＣを形成する。形成された膜は、多くの３Ｄ細胞培養の作業には過度に堅固であり、細胞の浸透及び細胞塊の形成に必要とされる多孔度を改善するために、様々な修飾を要する。

ヒドロゲル材料は、親水性の支持材料を必要とする他の種類の培養作業においても広く使用され、例えば、寒天タイプの親水コロイドは、植物細胞、細菌、及び真菌の培養において、様々な微生物学的な目的のために広く使用される。

US 5,254,471は、超微細なファイバーでできた細胞を培養するための担体を開示する。WO 2009/126980は、平均重合度１５０〜６２００を示すセルロースを含む、セルロースベースのヒドロゲルを開示する。

先行技術の溶液は、細胞培養においてはかなり不十分なものであると認められている。全ての現在の２Ｄ及び３Ｄの細胞培養方法及びマトリックスは、細胞を維持し増殖させるために、生体材料培地に動物ベースの化学物質又は化合物を使用することを必要とする。幹細胞の維持は特に要求性が高く、幹細胞を生きたまま維持するであろう、細胞培養培地とともに使用されるマトリックスについての単純な解決策は存在しない。細胞培養環境における動物ベースの化合物の存在は、免疫反応及び最終的に培養細胞を殺すであろう異なる種類の毒性の問題の深刻な危険性を生じる。動物ベースの添加物を含む細胞培養マトリックスは、幹細胞（特に、幹細胞が組織移植や組織技術（工学）に使用される場合）に使用するのに適さない。さらに、細胞培養培地に使用するために提案された多くのポリマーは、生理的温度に耐性がなく、又は細胞に対し毒性を有する。

様々な細胞種について適した３又は２次元の支持物を提供することができる、改善された細胞培養材料の明らかな必要性が存在する。それらの機能的な３Ｄ細胞モデルは、動物実験に取って代わり、現在使用されている２Ｄの細胞モデルよりもより進歩している、創薬におけるツールとして利用し得る。例えば、組織移植又は細胞治療が目的であった場合、培養した細胞の輸送も大いに望まれる。異なるｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞モデルが開発されているときに、３Ｄマトリックス中の培養細胞塊を移動する可能性が望まれる。現存の３Ｄ細胞培養生体材料は、培養した細胞に深刻な損傷を与えることなく、針を用いてヒドロゲルマトリックスを移動することを許容しない。

従って、本発明の目的は、先行技術において生じる前述の問題を、少なくとも部分的には解決する又は緩和する新規のアプローチを提供することである。本発明の目的は、独立請求項において述べられている事項により特徴付けられる、セルロースナノファイバー又はその誘導体を含む、細胞培養又は細胞送達組成物により達成される。好ましい実施形態は従属請求項において開示される。

本発明は、２Ｄ及び３Ｄの細胞培養マトリックスにおけるセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体の使用に基づいている。本発明は、細胞培養マトリックスにおけるセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体の使用を提供する。セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体の２Ｄ及び３Ｄの細胞培養マトリックスとしての使用は、セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を含むマトリックス上での細胞の増殖を高めるため及び達成するための、動物ベースの添加物の使用の必要性を廃止する。

本発明者は、驚いたことに、植物由来のＣＮＦヒドロゲルが、３Ｄ細胞培養のための生体模倣ヒトＥＣＭとして、いかなる修飾もすることなく使用可能であることを見出した。
細胞増殖及び生存率のデータは、ＣＮＦヒドロゲルが、薬剤開発、薬剤毒性試験、及び再生医療、さらにはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞送達における、進化した機能的な細胞ベースのハイスループットスクリーニングアッセイのための３Ｄの細胞の足場のための最適な生体材料であることを示唆する。

本発明者らは、植物由来のＣＮＦヒドロゲルの物理的及び生体適合性の特性を初めて記述する。植物のセルロースは製紙及び繊維産業において広く使用されており、天然に豊富に存在する。天然のセルロースナノファーバーヒドロゲルは不透明である。機械的な崩壊の前のセルロースパルプの化学修飾は、光学的に透明なヒドロゲルを生じる。

本発明は、水性環境において分散したセルロースナノファイバー（ＣＮＦ）からなるヒドロゲルに関する実験研究に基づいている。該ナノファイバーは、セルロースポリマーのヒドロキシル官能性に起因して高度に親水性であり、部分的にヘミセルロース多糖で覆われている。

従って、本発明は最初の態様として、ヒドロゲル又は膜の形態であるセルロースナノファイバー又はその誘導体を含む、細胞培養又は細胞送達組成物を提供する。

本発明の重要な利点は、細胞外で生じる動物又はヒトベースの化学物質の無い、生体材料培地上で又は生体材料培地中で、細胞を維持する（及び増殖させる）ことが可能であるということである。細胞は、セルロースナノファイバー又はその誘導体を含む、培地／マトリックス上又は培地／マトリックス中で、均一に分散する。細胞は培地上又は培地中で分裂し、増殖を開始し、細胞培養プラットフォームの底に細胞を蓄積させることなく、細胞塊が自然発生的に成長を開始する。セルロースナノファイバー又はその誘導体における細胞の均質な分裂は、生体材料が３Ｄ細胞培養培地として機能するための必要条件である。

本発明のさらなる利点として：セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体は不活性であり、蛍光バックグラウンドを付与しない、ということが挙げられる。セルロースナノファイバー又はその誘導体を含む培地は注入可能である。注入性は流動学的特性により説明される。注入は、細胞がマトリックス内部で安定して留まり、それらが注入後にマトリックス中で均一に分散するように行うことができる。

図１は、セルロースナノファイバーヒドロゲルのクライオ透過型電子顕微鏡（cryo-TEM）写真を示す。天然のＣＮＦは左側（Ａ）及び透明なＣＮＦは右側（Ｂ）である。 図２は、市販の細胞培養材料（MaxGel^TM（Sigma-Aldrich）、HydroMatrix^TM（Sigma-Aldrich）及びPuraMatrix^TM（3DM Inc.））、２つの異なるセルロースナノファイバー材料（天然ＣＮＦ及び透明ＣＮＦ）、並びにフィブロネクチン（ＦＮ）を添加したＣＮＦにおける、ＨｅｐＧ２細胞の生存率を示す。増殖ＡＢアッセイにおいて、細胞を４８時間培養し、コントロール細胞は同等の条件でプラスチック表面上で培養した。 図３は、ＡＲＰＥ−１９細胞を様々なサイズの注射針を用いて移動した後の、天然ＣＮＦヒドロゲル中の培養細胞の生存率を示す。生存率は相対蛍光強度として示す。 図４は、１％の天然セルロースナノファイバーヒドロゲルを介した、様々な分子量のデキストラン（２０ｋＤａ、７０ｋＤａ、及び２５０ｋＤａ）の拡散を示す。 図５は、天然ＣＮＦ膜上のＡＲＰＥ−１９細胞の光学顕微鏡写真を示す。写真上部において、該ＣＮＦ膜が該細胞の増殖を支持しており、写真下部では、該細胞が細胞培養プラスチック上で生育している。倍率は２０×。 図６は、細胞培養プラスチック上（Ａ）及び天然セルロースナノファイバーヒドロゲル中（Ｂ）におけるＨｅｐＧ２細胞の共焦点顕微鏡の切片写真を示す。 図７は、動的振動流動学的測定による０．５％ＣＮＦヒドロゲルの粘弾性特性を示す。０．５％の天然ＣＮＦヒドロゲルのＧ’（貯蔵率）及びＧ”（損失率）の振動数依存性を示す。 図８は、水溶性ポリマーであるポリアクリルアミド（５０００ｋＤａ）及びＣＭＣ（２５０ｋＤａ）の０．５％溶液と比較した、適用されたせん断応力の関数としての０．５％ＣＮＦヒドロゲルの粘度を示す。 図９は、０．５％ポリアクリルアミド及びＣＭＣと比較した、測定されたせん断率の関数としての０．５％ＣＮＦヒドロゲルの粘度を示す。様々な物理的過程の典型的なせん断率の領域を、矢印で図中に示している。 図１０は、針の中を流れるＣＮＦヒドロゲルを含む細胞の模式図を示す。高いせん断率の領域（低い粘度）は、ゲル−針の界面に位置し、低いせん断率の領域（非常に高い粘度）は、針の中間に位置する。 図１１は、０．７％の天然ＣＮＦヒドロゲルを４０Ｐａの一定の応力で、レオメーターの同心円筒形状においてせん断した際の、せん断率と粘度の漸進的変化を示す。 図１２は、高いせん断率でせん断した後の０．７％の天然ＣＮＦヒドロゲルの分散の構造回復を、ガラス棒で穏やかに混合した後のものと比較して示す。 図１３は、０．５％の天然ＣＮＦヒドロゲル中（上列）及び０．５％の透明ＣＮＦヒドロゲル中（下列）の、２つの砂利の懸濁液の１７日間に渡る安定性を示す。該砂利は、平均粒子サイズ１〜２ｍｍ及び２〜３ｍｍのCEN Standard sand（EN 196-1）であった。サンプルは室温で保存した。 図１４は、セルロースナノファイバーゲルの懸濁液の性能に対する酵素加水分解の影響を示す。砂利は平均粒子サイズ１〜２ｍｍのCEN Standard sand（EN 196-1）であった。 図１５は、天然ＣＮＦヒドロゲル中に包埋された、ヒトＥＳ細胞由来の肝前駆細胞の共焦点顕微鏡の写真を示す。スケールバー：７０μｍ。

発明の詳細な説明
本発明は、セルロースナノファイバー又はその誘導体がヒドロゲル又は膜の形態である、セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を含む、細胞培養又は送達組成物に関する。セルロースナノファイバー又はその誘導体は、植物材料を含む原料等の、非動物ベースの材料から得ることができる。

特別の定めがない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語は、細胞培養において一般に使用される意味を有する。具体的には、以下の用語は以下に示す意味を有する。

用語「細胞培養又は送達組成物」は、セルロースナノファイバー又はセルロースナノファイバーの誘導体を含み、細胞培養培地として又は細胞送達のために使用される材料のことをいう。前記組成物は、細胞又は細胞塊を移動するのにも使用できる。セルロースナノファイバーは、ヒドロゲル又は膜の形態であり得る。前記組成物は、特別な細胞外マトリックス成分、血清、成長因子、及びタンパク質等の様々な添加物をさらに含み得る。

用語「セルロース原料」は、セルロースパルプ、精製パルプ、又はセルロースナノファイバーの生産に使用できる、いかなるセルロース原料源をもいう。該原料はセルロースを含むいかなる植物材料に基づいたものでもあり得る。植物材料は木であり得る。木は、トウヒ、マツ、モミ、カラマツ、ダグラスモミ若しくはツガ等の軟材の木からのもの、又は
カバノキ、アスペン、ポプラ、ハンノキ、ユーカリ若しくはアカシア等の硬材の木からのもの、又は軟材及び硬材の混合物からのものであり得る。非木材の材料は、農業残渣、草、又は綿、トウモロコシ、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、米、亜麻、麻、マニラ麻、サイザル麻、ジュート、ラミー、ケナフ、バガス、竹、又は葦からの、わら、葉、樹皮、種子、殻、花、野菜若しくは果実等のその他の植物材料からのものであり得る。
用語「セルロースパルプ」は、化学的、機械的、熱機械的、又は化学熱機械的なパルプ化工程を使用して、任意のセルロース原料から分離したセルロースファイバーをいう。通常、ファイバーの直径は１５〜２５μｍの間で変動し、長さは５００μｍを超えるが、本発明はこれらのパラメーターに限定されることを意図しない。

本発明におけるセルロースは構造的にＩ型セルロースである。

用語「セルロースナノファイバー」は、分離したセルロースナノファイバー（ＣＮＦ）の集まり、又はセルロース原料若しくはセルロースパルプ由来のナノファイバーの束をいう。ナノファイバーは通常、高いアスペクト比を有する：数平均直径は通常２００ｎｍ未満であるが、長さは１μｍを超え得る。また、ナノファイバーの束の直径はより大きいものであり得るが、一般的には１μｍ未満である。最も小さいナノファイバーは、通常直径２〜１２ｎｍであるいわゆるエレメンタリーフィブリル（elementary fibril）に類似す
る。フィブリル又はフィブリルの束の大きさは、原料及び崩壊方法に依存する。セルロースナノファイバーは、いくらかのヘミセルロースも含み得る；その量は植物源に依存する。

セルロース原料、セルロースパルプ、又は精製パルプからのセルロースナノファイバーの機械的な崩壊は、精製機、グラインダー、ホモジナイザー、コロイダー（colloider）
、摩擦グラインダー、超音波処理装置、マイクロフリューダイザー（microfluidizer）、マクロフリューダイザー（macrofluidizer）又は流動化型ホモジナイザーなどのフリューダイザー等の適切な機器を用いて実施される。好ましくは、「セルロースナノファイバー」は機械的に崩壊させた材料である。

「セルロースナノファイバー」又は「セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体」は、セルロースナノファイバー又はナノファイバーの束の、いかなる化学的又は物理的に修飾された誘導体でもあり得る。化学的修飾は、例えば、セルロース分子のTEMPO-酸化、エステル化、又はエーテル化反応等のカルボキシメチル化、酸化に基づいたものであり得る。修飾は、セルロース表面上の、アニオン性、カチオン性、若しくは非イオン性物質、又はこれらの任意の組み合わせの物理的吸着によっても実現することができる。前記修飾は、セルロースナノファイバーの製造前、製造後、又は製造中に実施することができる。特定の修飾は、ヒトの体内で分解可能なＣＮＦ材料をもたらし得る。

適切に、セルロースパルプ等のセルロース原料を、機械的な崩壊の前に酸及び塩基で前処理する。該前処理は、セルロースパルプを、酸で処理し（＋１より多い電荷を有するいかなる正電荷イオンをも除くために、好ましくは塩酸を用いる）、次いで、＋１の電荷を有する正電荷イオンを含む無機塩基（好ましくはＮａＯＨ、Ｎａ^＋イオンがそれ以前のイオンを置換する）で処理することで効果を生じる。この前処理は、「セルロースナノファイバー」に優れたゲル化特性及び透明性を提供する。この前処理された産物は、酸−塩基で前処理された、又はイオン交換された、「セルロースナノファイバー」と称される。

「セルロースナノファイバー」の微生物純度は細胞培養を行う上で必須である。従って、「セルロースナノファイバー」を、ヒドロゲル又は膜の形態で細胞培養実験の前に滅菌する。それに加え、細線維化の前及び細線維化中に該産物の微生物混入を最小化することが重要である。細線維化に先立って、パルプがまだ無菌である漂白工程の後すぐに、パル
プ製造機からセルロースパルプを無菌的に収集することは有利である。

いくつかの広く使用されているセルロースナノファイバーの同義語が存在する。例えば：ナノセルロース、ナノフィブリル化セルロース（nanofibrillated cellulose）（CNF）、ナノフィブリルセルロース（nanofibrillar cellulose）、セルロースナノファイバー
、ナノスケールフィブリル化セルロース、ミクロフィブリルセルロース（microfibrillar
cellulose）、ミクロフィブリル化セルロース（microfibrillated cellulose）（CNF）
、又はセルロースミクロフィブリル（cellulose microfibril）。特定の微生物により生
産されたセルロースナノファイバーは、細菌性セルロース、微生物性セルロース（ＭＣ）、バイオセルロース、ナタデココ（ＮＤＣ）、又はココデナタ（coco de nata）等の様々な同義語を有する。

本発明に記載のセルロースナノファイバーは、いわゆるセルロースウィスカー（セルロースナノウィスカー、セルロースナノ結晶、セルロースナノロッド、棒状セルロース微結晶、又はセルロースナノワイヤーとしても知られる）と同じ材料ではない。いくつかの場合において、両材料について類似した用語が使用される。例えば、Kuthcarlapatiら（Metals Materials and Processes 20(3):307-314, 2008）により、彼らは明らかにセルロー
スナノウィスカーについて言及していたが、研究された材料は「セルロースナノファイバー」と呼ばれた。通常、これらの材料は、セルロースナノファイバーのようにフィブリル構造に沿った非結晶部分を有さず、このことがより堅固な構造をもたらす。セルロースウィスカーもセルロースナノファイバーよりも短い；通常、長さは１μｍ未満である。

個々のセルロースナノファイバーの大きさは、上記のＥＣＭにおけるコラーゲンファイバーの大きさ（即ち４〜１０ｎｍ）に非常に近い。従って、ＣＮＦベースのヒドロゲルは３Ｄ細胞培養マトリックスとして使用することができる。

本発明の細胞培養実験において、２種類のセルロースナノファイバーが使用された：不透明な天然のＣＮＦ、及びＴＥＭＰＯ−酸化されたセルロースである光学的に透明なＣＮＦ。該材料の詳細な説明は、本願実施例の材料及び方法のセクションに示す。

用語「セルロースナノファイバーヒドロゲル」は、セルロースナノファイバーの水性分散物をいう。

用語「セルロースナノファイバー膜」は、セルロースファイバーの湿った又は乾燥したシート状形成物をいう。該膜は、通常、適切なフィルターを用いた真空濾過装置による低濃度のセルロースナノファイバー分散液の濾過により製造される。溶媒キャスティング（Solvent casting）も、上記膜構造を得るのに使用し得る。得られた膜は、使用前に湿っ
た状態又は乾燥状態として使用することができる。

本発明のセルロースナノファイバー又はその誘導体は、セルロースナノファイバー又はナノファイバーの束の、化学的又は物理的に修飾した誘導体を含み得る。

本発明の細胞培養又は薬剤送達組成物は、特別な細胞外マトリックス成分、血清、成長因子、及びタンパク質からなる群より選択される適切な添加物をさらに含み得る。

本発明は、細胞培養又は細胞送達マトリックスであって、該マトリックスが生細胞及びヒドロゲルを形成する細胞培養又は細胞送達組成物を含み、該細胞がマトリックス中で３次元又は２次元の配置で存在する、細胞培養又は細胞送達マトリックスにも関連する。

細胞はいかなる細胞でもあり得る。細菌細胞等の原核細胞に加えて、動物細胞、植物細
胞、及び真菌細胞等のいかなる真核細胞も、本発明の範囲にある。

細胞株に依存して、実験は２Ｄ又は３Ｄで行われる（即ち、細胞はＣＮＦ膜若しくはゲル上で培養される、又は細胞はＣＮＦヒドロゲル若しくはＣＮＦ膜において均一に分散される）。本発明の特定の実施例は、自発的に生じた網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞は単層を形成し、一方で、ヒト肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）細胞は、単層又は細胞コロニーのいずれかを生じることを開示する。

細胞は、当該技術分野で公知の任意の検出方法又は色素を使用して検出し得る。

本発明は、セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を提供する工程；任意で前記セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を水と混合する工程；並びに、該セルロースナノファイバー及び／若しくはその誘導体、又は得られた該混合物を、細胞培養又は送達のための適切な環境へ移動又は配置する工程、を含む前述の特許請求の範囲のいずれかの組成物を製造する方法にも関連する。

セルロースナノファイバーヒドロゲル若しくは膜、又はそれらの誘導体、又は本発明の組成物は、細胞送達材料として使用することができる。

セルロースナノファイバーヒドロゲル若しくは膜、又はそれらの誘導体、又は細胞培養若しくは細胞送達組成物は、臨床での使用のための送達材料のために使用することができる。

本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するための培地若しくは培地の化合物としての研究及び／又は産業目的のための、セルロースナノファイバー若しくはその誘導体、又は本発明の組成物の微生物学的使用に関連する。

セルロースナノファイバー又はその誘導体を含む組成物は、細胞又は酵素を固定化するために使用することができる。

本発明は、細胞を培養する方法であって、該方法が、細胞を提供する工程；セルロースナノファイバー又はその誘導体を含む細胞培養組成物と、細胞を接触させ、マトリックスを形成する工程；及び、３次元又は２次元の配置で前記マトリックス内で細胞を培養する工程、を含む方法にも関連する。

本発明は、該細胞が真核細胞である、組成物、方法又は使用にさらに関連する。

本発明は、該細胞が原核細胞である、組成物、方法又は使用にさらに関連する。原核細胞は、好気性若しくは嫌気性細菌、ウイルス、又は真菌（酵母やカビ等）などの微生物を含む。

本発明は、該細胞が幹細胞である、組成物、方法又は使用をさらに提供する。
セルロースナノファイバーの除去は、例えば、セルロース分子の酵素分解を利用して酵素を用いて行うことができる。適切な酵素としては、例えば、市販のセルラーゼがある。培養した細胞株は、培養システムへ必要とされる酵素タンパク質を産生するように遺伝子操作することもできる。

本発明は、細胞増殖又は細胞培養材料からセルロースナノファイバー又はその誘導体を除く方法であって、該方法が、細胞増殖培地及び細胞、並びに任意で薬物を含む材料を提供する工程；前記材料を水性又は非水性の液体で希釈する工程；並びに、デカンテーショ
ンによりセルロースナノファイバーを除く工程、を含む方法にも関連する。デカンテーションの前に細胞及び細胞凝集物を沈降させるために、適度な遠心を利用することができる。

本発明者らは、驚いたことに、植物由来のＣＮＦヒドロゲルが、３Ｄ細胞培養のための生体模倣ヒトＥＣＭとして、いかなる修飾も無く使用することができることを見出した。細胞増殖及び生存率のデータは、ＣＮＦヒドロゲルが、薬剤開発、薬剤毒性試験、及び再生医療、さらにはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞送達における、進化した機能的な細胞ベースのハイスループットスクリーニングアッセイのための３Ｄの細胞の足場のための最適な生体材料であることを示唆する。

本発明は、植物由来のＣＮＦヒドロゲルの物理的及び生体適合性の特性を初めて開示する。植物のセルロースは製紙及び繊維産業において広く使用されており、天然に豊富に存在する。天然のセルロースナノファーバーヒドロゲルは不透明である。機械的な崩壊の前のセルロースパルプの化学修飾は、光学的に透明なヒドロゲルを生じる。

本発明のセルロースナノファイバーは、ヒドロゲル、又は乾燥した若しくは湿った膜の形態で使用することができる。ＣＮＦヒドロゲルのゲル強度は、希釈により容易に変更できる。セルロースナノファイバー又は類似の特性を有するその誘導体は、細胞に対し有毒ではない。

セルロースナノファイバーヒドロゲルを、ヒアルロン酸又はＰＥＧヒドロゲルの様なＵＶ架橋可能な細胞培養ヒドロゲルと比較した場合、ＣＮＦ材料ははるかに毒性が低いと考えられる。ＵＶ架橋可能なゲルにおいては、ゲル化を開始するのに、有害な光開始剤を要するが、一方で、ＣＮＦヒドロゲルは自発的に形成される。ＣＮＦヒドロゲルの非共有結合性の性質が、希釈による多孔度の調節も可能にする。

細胞は、セルロースナノファイバーヒドロゲル中に均等に拡散し、細胞培養プラットフォームの底への沈降なく、自然と複製を開始し、３Ｄの細胞塊へと成長し得る。全ての現在使用されている市販の３Ｄ細胞培養培地は、細胞が細胞培養プラットフォーム上に３Ｄ構造を形成するように、接着ペプチドの添加を必要とする。

本発明のセルロースナノファイバー又はその誘導体は、接着ペプチドを用いずに使用することができる。細胞はプラットフォームに付着し、セルロースナノファイバーヒドロゲル中へ自発的に均一に分布する。細胞は、セルロースナノファイバーのファイバーにより提供される機械的な支持に起因して連続相へ均一に懸濁される。著しく高い降伏応力は、沈降に対して細胞及び成長した細胞塊を安定化する。

植物起源のセルロースナノファイバーヒドロゲルは、接着ぺプチド及び／又は個々に適した多孔性なしで機能するが、一方で、細菌性セルロースナノファイバーは接着ペプチドを必要とする。細菌性セルロースは発酵後、直接使用されてきたが、その場合、もたらされる膜構造は本発明のヒドロゲル（即ち、セルロースナノファイバーからのヒドロゲル）よりもかなり堅固である。従って、先行技術の方法は、ヒドロゲルマトリックスをより多孔性にするためにさらなる過程を必要とする。

ゲル形態においてセルロースナノファイバーを含む細胞培養培地の堅固さは、細胞培養の特性に影響することなく調節することができる。また、細菌から派生するセルロースナノファイバーは、その他の起源からのセルロースナノファイバーよりも厚く、それ故、細胞培養のために自由に修飾することができない。

細胞は３Ｄマトリックス中で又はマトリックス上で成長する。前記材料は、注入可能であり得、又は適切な表面トポロジーを有するシート状の膜であり得る。

ＣＮＦの特性は、３Ｄ細胞培養について最適に近い：透明、毒性がない、高度に粘性、高い懸濁力、高い水分保持、良好な機械的接着、非動物ベース、ＥＣＭの大きさと類似する、塩、温度又はｐＨに非感受性、分解可能でない、自家蛍光がない。ＣＮＦは、材料の化学構造に起因して、無視できる程度の蛍光バックグラウンドを有する。さらに、ＣＮＦゲルは細胞に対し有毒ではない。

細胞はＣＮＦゲル上で、長時間（例えば、２〜７日間又はより長く）培養又は成長させることができる。また、細胞はヒドロゲル中で短時間（例えば、数分〜数時間）培養又は懸濁のみを行うことができる。細胞は、ナノセルロースファイバーマトリックスを、プラットフォームとして使用される成長の足場／支持として使用する。細胞は塊を形成し、従って、セルロースナノファイバーの３Ｄ細胞培養の足場としての有用性を示している。細胞は、沈着の方法及び細胞種に依存して、ＣＮＦゲル上又はＣＮＦゲル中で、層又は細胞凝集物として成長する。

非毒性のＣＮＦヒドロゲルは、ヒトＥＣＭベースのMaxGel^TM同様、調査した細胞については等しく良好なＥＣＭである。細胞の生存率は、PuraMatrix^TM又はHydroMatrix^TM中よ
りもさらに高い。ヒト又は動物ベースのＥＣＭ成分のいずれも、ＣＮＦヒドロゲルへ添加していない。しかしながら、フィブロネクチン又はコラーゲンＩＶのＣＮＦベースシステムへの添加は、いくつかの場合において有益であり得る。拡散研究に基づいて、ＣＮＦヒドロゲルは高度に浸透性であり、酸素、栄養分、及び細胞の水溶性代謝物の自由な交換を促進する。

クライオ透過型電子顕微鏡は、ＣＮＦヒドロゲルが個々のセルロースナノフィブリル及びファイバーの束の混合物から構成されることを示している。ＣＮＦの大きさは、天然のＥＣＭ成分であり、細胞の支持として一般に使用される、天然のヒトコラーゲンに類似する。ＣＮＦヒドロゲルの強度（弾性）は、使用した振動数０．０１〜１Ｈｚに応じてほぼ一定である。流動学的データは、停止中（低せん断応力）ではおよそ数百キロパスカルのせん断粘度であり、１パスカル以内のせん断応力で数パスカルまで落ちることを明らかにしている。そのような挙動は生体材料ヒドロゲルについてはかなり特有のものである。それは極めて良好な懸濁能力及び細胞の支持を可能にし、せん断で希薄になる挙動により、望みの容易な分散を可能にし、使用した針のサイズに関わらずＣＮＦヒドロゲル中の細胞の注入を可能にする（これら挙動は、他の細胞培養生体材料ヒドロゲルについて、以前には得られていない）。弾性及び剛性の機械的特性は、３Ｄ細胞培養増殖及び細胞の注入に関して、ＣＮＦヒドロゲルは最適である。

本発明の利点は、セルロースナノファイバー又はその誘導体のフィブリルネットワークの大きさが、コラーゲンナノファイバーの天然ＥＣＭネットワークに非常に近似していることである。さらに、セルロースナノファイバー又はその誘導体は、非動物ベースの材料であり、即ち、疾患の伝達のリスクがない。現在、市販製品のほとんどは動物から単離される。さらに、ヒドロゲルから膜までのＣＮＦ材料を利用できるので、本発明は、物理的形態を調節する可能性を提供する。

注入可能なヒドロゲルは、非常に高い降伏応力に起因して、細胞の周囲に支持マトリックスを形成する。ＣＮＦ膜は透明で高度に多孔性である。大量生産は代替物と比べ容易である。

天然のセルロースナノファイバーは細胞に対し毒性がない。細胞の増殖は、セルロース
ナノファイバー又はその誘導体の場合は、コントロール（細胞のみ）と比較して、ほぼ倍増する。細胞はＣＮＦヒドロゲル上で長時間（例えば、２〜７日間）制御可能である。細胞はセルロースナノファイバーマトリックスを成長プラットフォームとして使用する。細胞は塊を形成し、これはセルロースナノファイバー又はその誘導体の３Ｄ細胞培養の足場としての有用性を示している。細胞はＣＮＦゲル中で層として成長する。セルロースナノファイバー又はその誘導体はわずかな蛍光バックグラウンドを有する。セルロースナノファイバーヒドロゲルは、３Ｄ及び２Ｄ細胞培養マトリックスとして使用される、最適な弾性、剛性、せん断応力、機械的接着、及び多孔性を有する。

水性の環境において、セルロースナノファイバーは、分散したナノファイバー又はナノファイバーの束の連続的なヒドロゲルネットワークを形成する。該ゲルは、非常に低濃度においてでさえ互いに絡み合う、高度に水和したフィブリルにより形成される。該フィブリルは水素結合を介しても相互作用し得る。巨視的構造は、機械的な攪拌で容易に破壊される（即ち、高いせん断応力でゲルが流動を開始する）。セルロースナノファイバーヒドロゲル及び／又はその誘導体は、細胞培養材料として使用されることが以前には述べられていない。

本発明の応用として、バイオテクノロジー研究のために細胞培養材料を提供することが挙げられる。ＣＮＦを含む細胞増殖又は細胞培養培地は、細胞を維持する及び育てるため、並びに細胞を移動するために使用し得る。本発明は、例えば、組織工学及び創傷治癒において利用可能な、細胞培養培地を提供する。その他の応用として、例えば、薬剤用量適用、バイオテクノロジー的又は生物学的医薬、及びそれらの用量、並びに３Ｄ薬剤の機能的細胞試験アッセイが挙げられる。ＣＮＦヒドロゲルの特有の流動学的特性は、眼内、筋肉内、又は皮下治療におけるＣＮＦヒドロゲル中の細胞又は薬剤の注入のような、ヒドロゲルの注入性に基づいた、いくつかの応用を可能にする。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するために記載されており、本発明の範囲を限定することを意図しない。本明細書に基づいて、当業者は多くの方法で本発明を修飾することができるであろう。

材料及び方法
ＣＮＦヒドロゲルの調製
不透明な天然ＣＮＦヒドロゲル（１．７重量％）を、湿セルロースパルプファイバーの高圧ホモジナイゼーションにより得た。従って、該過程の直接の産物は希釈セルロースナノファイバーヒドロゲルである。透明なＣＮＦヒドロゲル（０．９重量％）は、化学的に修飾されたセルロースパルプ（ＴＥＭＰＯ−酸化したセルロースパルプ）の同様のホモジナイゼーション過程により得た。該サンプルはオートクレーブで滅菌した。細胞の研究については、該ＣＮＦヒドロゲルを適切な濃度に希釈し、機械的な混合又はソニケーションでホモジナイズした。天然ＣＮＦ及び透明ＣＮＦのクライオ−ＴＥＭの写真を図１に示す。天然のセルロースナノファイバーヒドロゲルは、個々のセルロースナノフィブリル及びファイバーの束の混合物で構成される（図１Ａ）。最も小さいファイバーの直径はおよそ７ｎｍであるが、セルロース材料の大部分は束の構造内で５０〜１００ｎｍを形成している。正確な長さのスケールは、材料の絡み合い束ねられている性質に起因して、写真から推定することはできないが、個々のナノファイバーが数マイクロメーター長であることは明白であると思われる。光学的に透明なＣＮＦヒドロゲルのクライオＴＥＭの写真は、均一に分布した個々のセルロースナノファイバーのネットワークを示す。これらのナノファイバーの直径はおよそ７ｎｍであり、長さは１マイクロメーターを超える。該ナノファイバーは、１００〜２００ｎｍ長の直線部分を有し、ファイバーのアクセル（axel）に沿って急なねじれが続く。これらの直線部分は高結晶質のセルロース領域からなり、曲がって
いる部分は非結晶部により形成される。

ＣＮＦ膜の調製
ＣＮＦ膜は、水性０．２重量％の天然ＣＮＦの分散液の真空濾過により調製した。濾過後、湿った膜を５５℃のオーブンで４８時間、重りの下で乾燥させた。乾燥した薄い膜は、坪量７０〜８０ｇ／ｍ^２で、滑らかで不透明であった。

酵素的加水分解
ＣＮＦヒドロゲルの酵素分解を、Celluclast 1.5 LFG, CCN0367（Novozymes, pHopt 5
）、タンパク質９０ｍｇ／ｍｌを用いて０．５％ヒドロゲルを含む砂利を加水分解することにより示した。天然ＣＮＦの分解をｐＨ５、５０℃で４日間、及び透明ＣＮＦの分解をｐＨ７、２１℃で１時間行った。酵素量は１グラムのＣＮＦに対し５ｍｇの酵素であった。

ＨｅｐＧ２細胞
ＨｅｐＧ２細胞の起源
ヒト肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得た。

ＨｅｐＧ２細胞の維持培養
ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。該細胞は、７５ｃｍ^２培養フラスコ中で、９５％ＲＴ湿度、５％ＣＯ_２雰囲気中のインキュベーター内で、３７℃で維持した。細胞は、トリプシン処理により１：１０で、週２回、１：４の分割比で継代した。培地は４８時間おきに交換し、細胞は９０％コンフルエンシーで継代培養した。

ＨｅｐＧ２細胞のＣＮＦヒドロゲルにおける３Ｄ培養
セルロースナノファイバーヒドロゲルを９６ウェル組織培養プレートの底に配置し、ウェル当り25,000〜50,000細胞を含む増殖培地中のＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を、ＣＮＦヒドロゲルの上に播種したか、又はＣＮＦヒドロゲルと混合した。ＣＮＦヒドロゲルの濃度は０．０１％〜１％に及ぶ。

ＡＲＰＥ−１９細胞
ＡＲＰＥ−１９細胞の起源
自発的に生じた網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得た。

ＡＲＰＥ−１９細胞の維持培養
ＡＲＰＥ−１９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを補充した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）：栄養混合物Ｆ１２，１：１混合物で培養した。該細胞は３７℃、７％ＣＯ_２雰囲気中において培養した。増殖培地は２〜３日ごとに交換し、培養は２４〜３０継代で使用した。

ＣＮＦ膜上でのＡＲＰＥ−１９細胞の培養
セルロースナノファイバーヒドロゲルを、９６ウェル組織培養プレートの底に配置し、ウェル当り25,000〜50,000細胞を含む増殖培地中のＡＲＰＥ−１９細胞の懸濁液を、該ヒドロゲル上に播種したか、又は該ヒドロゲルと混合した。ヒドロゲルの濃度は０．０１％
〜１％に及ぶ。

ヒトＥＳ細胞由来肝前駆細胞
ヒト胚性幹細胞の維持培養
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株Ｈ９（Wisconsin International Stem Cell Bank, WiCell
research Institute内「WISC Bank」，Madison，WI，USA）を本研究に使用した。Ｈ９細胞は、mTeSR1培地中においてMatrigelでコートした組織培養プレート上で定期的に培養し、１ｍｇ／ｍｌディスパーゼ（StemCell Technologies）を使用して継代した。本条件に
おいて、幹細胞は２次元（２Ｄ）の単層コロニーを形成する。

ＣＮＦにおけるｈＥＳ細胞の３Ｄ培養
Ｈ９細胞のコロニーを０．３％の天然ＣＮＦ又は０．３％の透明ＣＮＦのいずれかと混合し、mTeSR1培地中で培養した。ＣＮＦにおけるｈＥＳ細胞は３Ｄの細胞塊を形成する。いくつかの実験において、０．３％ＣＮＦを５８μｇ／ｍｌ ヒトフィブロネクチン（Sigma-Aldrich）と混合した。

ＣＮＦにおけるＨ９細胞に由来する肝前駆細胞の３Ｄ培養
公表されたプロトコール［Hay DC, Zhao D, Fletcher J, Hewitt ZA, McLean D, Urruticoechea-Uriguen A, Black JR, Elcombe C, Ross JA, Wolf R, Cui W. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 2008 Apr;26(4):894-902)］に従って、Ｈ９細胞を１１日間肝前駆細胞へ分化させた。誘導された肝前駆細胞は、０．３％天然ＣＮＦ又は０．３％透明ＣＮＦのいずれかを使用して、７日間、３Ｄの環境で培養した。いくつかの実験において、０．３％ＣＮＦを１３μｇ／ｍｌマウスＩＶ型コラーゲン（Sigma-Aldrich）と混合した。

生／死染色
ＣＮＦにおけるＨ９細胞塊及び肝前駆細胞を、生細胞についてはCellTracker Blue CMAC（２０μＭ）で、死細胞についてはヨウ化プロピジウム（２５μｇ／ｍｌ）で共染色し
た。細胞の写真は、共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica TCS SP5 MP SMD FLIM）により、CellTracker Blue CMACについては４０５ｎｍの励起波長で、ヨウ化プロピジウムについては５１４ｎｍで取得した。

細胞生存率／増殖についてのAlamarBlueアッセイ
細胞生存率は、AlamarBlue^TM Cell Viability Assay Kit（Biotium Inc., Hayward, CA, USA）により定量化した。セルロースナノファイバーヒドロゲルを、９６ウェル組織培
養プレートの底に配置し、ウェル当り25,000〜50,000細胞を含む増殖培地中のＨｅｐＧ２／ＡＲＰＥ−１９細胞の懸濁液を、該ヒドロゲル上に播種したか、又は該ヒドロゲルと混合した。ヒドロゲルの濃度は１〜０．０１％に及ぶ。細胞生存率及び増殖は、３７℃、５％ＣＯ_２、及び９５％相対湿度のインキュベーターで、セルロースナノファイバーヒドロゲルにおいて細胞を培養した後の日の関数として測定した。

４８時間後、AlamarBlueを９６ウェルプレート中の培養培地へ、最終濃度１０％で直接添加した。プレートを５時間インキュベートし、５３０ｎｍの励起波長、及び蛍光測定のための５９０ｎｍでの発光へ曝露した。生存率パーセントは、セルロースナノファイバーヒドロゲルの非存在下（プラスチック表面上で細胞を育てる）での生存率のパーセンテージとしての、ＣＮＦヒドロゲル存在下での蛍光数値として表した。

バックグラウンドの蛍光測定値（ネガティブコントロール）は、ヒドロゲル及び色素試薬を培養培地中に含むが、細胞を含まないウェルから決定した。全ての蛍光測定値につい
ての平均値及び標準偏差を計算した後、バックグラウンドに対して補正し、相対蛍光として表した。

共焦点レーザー顕微鏡
ヒドロゲルで培養したＨｅｐＧ２細胞の生存率及び３ＤのＨｅｐＧ２球状体の形成を、カルセインＡＭ及びエチジウムホモダイマーからなる、Live/Dead（登録商標）Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen)で評価した。

簡潔に述べれば、ＨｅｐＧ２細胞を、フィブロネクチンとともに又はフィブロネクチン無しで、１％の天然及び透明ＣＮＦヒドロゲル中で懸濁した。ヒドロゲル中の該細胞懸濁液を細胞とともに各ウェルへ移した。細胞培養培地を各ウェルに添加した。ヒドロゲルに封入したＨｅｐＧ２細胞を５日間培養し、培地は４８時間ごとに新しくした。５日後、培地をウェルから除き、封入した細胞をＰＢＳで洗い、０．２μＭカルセインＡＭ及び１．０μＭエチジウムホモダイマーを含む「生／死」溶液中で、約４５分間、室温でインキュベートした。アルゴンレーザー（488 nm/35mW）、HC PL APO 10x/ 0.4 CS及びHC PL APO 20x/0.7 CS（air）対物レンズ、空気加温システムを有するインキュベーターボックス（Life Imaging /Services, Switzerland）、並びにＣＯ_２攪拌機（Okolab）を備えた、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM, Leica SP2 inverted microscope, Zurich, Switzerland）を使用して、生細胞を撮像した。写真は２つの検出器から取得した（１つはカルセインについて、他の１つはエチジウムホモダイマーについて）。写真はImaris 7.0（Bitplane）を用いて作成し、編集した。デコンボリューションは行わなかった。

実施例１
様々な細胞培養材料におけるＨｅｐＧ２細胞の細胞生存率の比較
セルロースナノファイバーヒドロゲルを、９６ウェル組織培養プレートの底に配置し、ウェル当り25,000〜50,000細胞を含む維持増殖培地中のＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を、該ヒドロゲル上に播種したか、又は該ヒドロゲルと混合した。ヒドロゲル濃度は１〜０．０１％に及ぶ。細胞生存率及び増殖を示す蛍光強度は、３７℃、５％ＣＯ_２、及び９５％相対湿度のインキュベーターで、セルロースナノファイバーヒドロゲルで細胞を培養した後の日の関数として測定した。
３つの市販の細胞培養材料を参照の３Ｄ培養材料として使用した：MaxGel^TM（Sigma-Aldrich）、HydroMatrix^TM（Sigma-Aldrich）及びPuraMatrix^TM（3DM Inc.）。実験設定は
全ての調査材料について同一であった。

ＨｅｐＧ２細胞の生存率は、上記の材料及び方法、細胞生存率／増殖についてのAlamarBlueアッセイ、において示されているように、AlamarBlue^TM Cell Viability Assay Kit
（Biotium Inc., Hayward, CA, USA）により定量した。

調査した材料についてのＨｅｐＧ２細胞の生存率パーセントを図２に示す。両種のセルロースナノファイバーヒドロゲル（即ち、天然及び透明ＣＮＦ）は、市販のHydromatrix^TM又はPuraMatrix^TM参照材料よりも高い生存率の値を示す。ＣＮＦヒドロゲルにフィブロ
ネクチンを添加する場合、生存率は市販のMaxGel^TMに近似する。さらに、増殖及び細胞生存率は、両ヒドロゲルにおける細胞濃度の関数として直線的に増加する。本観測は、ヒドロゲルがヒトＥＣＭ成分を模倣するという仮説を支持する。それはＥＣＭの全ての重要な組成を有する。

実施例２
注射針を用いたＡＲＰＥ−１９細胞の移動
ＡＲＰＥ−１９細胞（ウェル当り２５０００細胞）を、９６ウェルプレートの底面上のＣＮＦマトリックスに播種し、培養した。様々なサイズの注射針を用いて細胞を移動した
後のＡＲＰＥ−１９細胞の生存率を、図３に示す。同様の現象が、ＨｅｐＧ２及びＥＳ細胞のような他の細胞種でも得ることができる。

注射針を用いたＡＲＰＥ−１９細胞の移動のより詳細な説明は以下である：図３の移動１において、該細胞を、１．６６％ＣＮＦを用いて４８時間インキュベートし、その後、該細胞を注射器（２０Ｇ〜２７Ｇ）で約１００μｌを９６ウェルプレートへ移動した。注射器を用いた移動の後、該細胞を２４時間インキュベートし、ＣＮＦにおける該細胞の生存率を測定した。

移動２では、１．６６％ＣＮＦにおいて２４時間インキュベートした該細胞を２７Ｇの注射器（約２ｍｌ）を用いて新たな培地へ移動した。移動の後、該細胞を２４時間インキュベートし、その後、該細胞を再び注射器（２０Ｇ〜２７Ｇ）を用いて約１００μｌを９６ウェルプレートへ移動し、再び２４時間インキュベートし、１．６６％ＣＮＦにおいて二重に移動した細胞の生存率を測定した。

これらの実験は、ＣＮＦヒドロゲル中の細胞を移動することが可能であり、移動の過程に成功し、該細胞は生存していて、注射器を用いた移動の間生存し続けたことを証明する。その現象は、最小の針のサイズ２７Ｇでさえ得られ、移動の過程に使用された針のサイズに関してカットオフは得られなかった。２回移動したサンプル（移動２）は、おそらく実験開始の際の２４時間短いインキュベーションの時間に起因して、より低い増殖率を示した。プレートに接着した細胞は移動しない（トリプシン処理無し）ので、ＣＮＦヒドロゲル中の細胞の移動は、該細胞が実際にヒドロゲル内にあり、そこに留まっていたことを証明する。これらの実験は、該細胞が移動の間生存したままであったことを示した。

実施例３
幹細胞
ｈＥＳ細胞由来の肝前駆細胞の生／死染色
ヒトＥＳ細胞由来の肝前駆細胞を天然ＣＮＦヒドロゲル中に包埋し（図１５）、ＩＶ型コラーゲン有り及び無しで７日間培養した。バックグラウンドは検出されなかった。ヒトＥＳ細胞由来肝前駆細胞を透明ＣＮＦヒドロゲル中に包埋し、ＩＶ型コラーゲン有り及び無しで７日間培養した。バックグラウンドは検出されず、このことは本材料を本背景において極めて容易に使用可能にする。例えば、MatriGel及びMaxGelなどの通常使用される他の材料は顕著な蛍光バックグラウンドを有し、従って、それらのマトリックスとともに作業するのは困難である。ＥＳ細胞をＣＮＦヒドロゲルにおいて維持することは可能であり、それらは生存し、それ故、この材料でそれらを生存したまま維持することができる。さらに、ＥＳ細胞は３Ｄ構造も形成し、これは、いかなる他の材料を用いても以前には観察されていない。

実施例４
ＣＮＦヒドロゲルを介したデキストランの拡散
細胞培養材料の拡散特性についての詳細な知見は重要である。細胞培養材料は、栄養分及び酸素を培養細胞へ拡散させるのを可能にするため、及び細胞からの代謝物の効率的な拡散を可能にするために十分に多孔性であるべきである。ＣＮＦヒドロゲルの拡散特性は、以下の方法で様々な分子量のデキストランを用いて示した：

４００μｌの透明又は不透明ＣＮＦ（１％）を、Transwell^TMフィルターウェルプレー
ト（フィルター孔サイズ０．４μｍ）の頂端側区画上へフィルター当りに植えた。１ｍｌのＰＢＳを基底外側へ添加し、１００μｌ（２５μｇ）の蛍光標識したデキストランを、ヒドロゲル上へ添加した（ＭＷ２０ｋ、７０ｋ、及び２５０ｋ）。プレートをしっかりと固定し、ウェルプレートロッカー上に静置した。１００μｌのサンプルを基底外側から採
取し、等量をＰＢＳで置き換えた。最初のサンプルは１５分間隔で採取し、その他のサンプルは３０分〜２時間におよぶ様々な時点で採取し、最後のサンプルは２４時間で採取した。全１６８サンプルを採取した。励起波長及び発光波長をそれぞれ４９０ｎｍ及び５２０ｎｍで、標的プレート（OptiPlate^TM-96 F）を測定した。

１％の天然セルロースナノファイバーゲルを介した、様々な分子量のデキストランの拡散を図４に示す。モデル化合物の拡散は一定の割合で起き、それは化合物の分子量（サイズ）にかなり依存する。ＣＮＦヒドロゲルの構造は細胞懸濁液を安定化するのに十分堅固であるが、該ゲル中で分子は効率的に拡散することができることが明白である。

観察された拡散特性は、様々な薬剤送達の製剤及び適用においても利用することができる。薬剤の拡散は、薬剤分子若しくはタンパク質（薬剤として使用される）のサイズの関数として、又はＣＮＦヒドロゲル濃度として、制御することができる。明らかな持続した放出特性は、特にペプチド又はタンパク質薬剤の場合のような、より長い放出が好ましい特定の治療に対し特に有益である。

実施例５
ＣＮＦ膜上でのＡＲＰＥ１９細胞の増殖
天然ＣＮＦ膜を９６ウェル組織培養プレートの底に配置し、ウェル当り25,000〜50,000細胞を含む維持増殖培地中の細胞懸濁液を、該膜上に播種した。膜濃度は１．６〜０．０１％に及ぶ。細胞の生存率及び増殖は、３７℃、５％ＣＯ_２、及び９５％相対湿度のインキュベーター内で、天然ＣＮＦ膜上で細胞を培養した後の日の関数として測定した。
天然ＣＮＦ膜上のＡＲＰＥ−１９細胞を光学顕微鏡で撮像した。該ＣＮＦ膜は、写真の上部において細胞の増殖を支持し（図５）、ＡＲＰＥ−１９細胞はＣＮＦ膜上で２Ｄで成長することができ、ＣＮＦ膜は２Ｄ細胞増殖マトリックスとして有用であることを示している。

ＡＲＰＥ−１９細胞は、使用した細胞濃度とは無関係にヒドロゲル中でよく増殖した。ヒドロゲル間では顕著な違いは見られない。ヒドロゲル上で培養した場合、ヒドロゲル非存在下で培養した細胞と比べ、細胞増殖は〜２倍増加した。

実施例６
３Ｄ培養したＨｅｐＧ２細胞塊の形態
共焦点レーザー顕微鏡
生細胞イメージングのために、レーザー共焦点顕微鏡を使用した。ＣＮＦヒドロゲルに封入されたＨｅｐＧ２細胞の球形状は、該細胞がヒドロゲル内に捕捉され、三次元に成長していることを明白に示唆している（図６）。５日間の培養後の細胞が両ヒドロゲルにおける３Ｄの球状体内で生存可能であることを示す、該細胞から取得した写真を図６で示す。細胞の生存率は、全ての培養における時間の関数として増加した、ヒドロゲル中の細胞濃度、及び球状体のサイズとは関係していなかった（図６）。

培地は４８時間ごとに新たにし、球状体のサイズは培養時間の関数として増加する。ＣＮＦヒドロゲルにフィブロネクチンを添加した場合、３Ｄの球状体内の細胞の生存率は増加した。生／死染色の共焦点顕微鏡写真は、細胞が５日間の培養の間生存したままであったことを明らかにした。これらの知見はAlamar blueの細胞増殖アッセイの結果に関連す
る（図２）。この観測は、ＣＮＦヒドロゲルがヒトＥＣＭ成分を模倣するという我々の仮説を支持する。それは、フィブロネクチンを除くＥＣＭの全ての重要な成分を有している。従って、フィブロネクチンの添加は３Ｄの集団における細胞の生存率を改善する。フィブロネクチンはＨｅｐＧ２細胞の接着及び生存率を促進した。フィブロネクチンは、以前に、肝細胞の生存を増加し、インテグリンβ１への結合を介したアポトーシスを減ずるこ
とが示されている。

このように、ＣＮＦヒドロゲル以外の、任意の他の支持材料又はＥＣＭ成分なしで得られたＨｅｐＧ２細胞の３Ｄ構造を示すことが可能である。これは、ＣＮＦヒドロゲルを３Ｄ細胞培養マトリックスとして使用することの有用性及び容易性を証明する。

実施例７
ゲル強度
３Ｄ細胞培養培地の重要な機能は、細胞をマトリックス中で均一に懸濁された状態に保ち、沈降を防ぐことである。ＣＮＦは、非常に低い濃度（０．５％）でゲルネットワークを形成するその性能により、この要求を満たす。ＣＮＦのゲル様構造は、動的振動流動学的測定によりその粘弾性特性を決定することで示された。振動数掃引の結果は、典型的なゲル様の挙動を示す。貯蔵率（Ｇ’）は、損失率（Ｇ’）よりも桁違いに高く、振動数にはほぼ無関係であり、これは弾性（固体様）特性が、粘性（液体様）の特徴よりも、より明白であることを意味する（図７）。また、ゲルは通常、Ｇ’及びＧ’’が両方とも振動数とは相対的に独立している。ＣＮＦゲルの粘弾性特性は、０．１％のストレイン（strain）でのレオメーター（AR-G2, TA Instruments）による発振振動数掃引測定で決定した
。

実施例８
ＣＮＦヒドロゲルの流動特性
ＣＮＦヒドロゲルの流動学的な流動特性は、細胞培養での使用において有益ないくつかの特徴を示す。該ヒドロゲルは、低せん断（又は休止）では、細胞の最適な懸濁能力のための、高い粘性を有するが、より高いせん断率ではせん断で希薄になる挙動も示し、容易な調剤及び注入を可能にする。これらの種の流動学的特性を提供するＣＮＦの性能は、ＣＮＦ分散液の粘性を回転式レオメーター（AR-G2, TA Instruments, UK）で広範なせん断
応力（率）に渡って測定した試験シリーズにおいて示された。

図８に示されているように、ＣＮＦ分散液は、その他の水溶性ポリマーよりもかなり高いゼロせん断粘性（小さなせん断応力での定常粘性の領域）を示す。ＣＮＦのゼロせん断粘性は、開始材料の先行する化学的前処理により誘導されるより小さいナノフィブリルの直径により顕著に増加する。せん断で希薄になる挙動が開始する応力（降伏応力）も、ＣＮＦの分散ではかなり高い。降伏応力が高くなるほど、材料の懸濁性能はより良くなる。細胞は、高いゼロせん断粘性、及び高い降伏応力、及び高い貯蔵率の組み合わされた効果により、沈降に対して効果的に安定化される。細胞により適用される重力は降伏応力よりもはるかに弱い。従って、懸濁された細胞は、ＣＮＦと混合した場合にはゲルマトリックス内部で「凍結」され、又はゲル上に沈着させた場合にはゲル上で「凍結」される。

図９において、粘性は測定したせん断率の関数として示している。この図９から、ＣＮＦ分散液の粘性は相対的に小さいせん断率で下降し、せん断率約２００ｓ−１で、参照材料について測定したのと同様なレベルに達することは明白である。

ＣＮＦのネットワーク構造はせん断後崩壊する（図７）。特定の応力の適用後、該システムの粘性は劇的に落ち、固体様挙動から液体様挙動への移行が起きる。適度な機械的せん断により細胞のＣＮＦ懸濁液中での均一な混合を可能にするため、この種の挙動は有益である。凝集ＣＮＦ分散液等の二相の液体をせん断した場合（例えば、レオメーター内で又はチューブ内で）、分散した相は固体界面から遠ざかるように動く傾向があり、これは容器の壁において、液体のより低い粘性の層を生じさせる（図１０）。この現象は、流れに対する抵抗性（即ち、粘性）は、分散液の大部分よりも界面においてより低いことを意味する（Barnes, 1995）。注射器及び針を用いた、又はピペットを用いたＣＮＦヒドロゲ
ルの注入は、それぞれ、高濃度（１〜４％）においてさえ容易である。当該現象は、最少の細胞の障害での細胞懸濁液の容易な分配も可能にする（即ち、大部分の細胞は針の中央部に位置し実質的に静止状態にある）（図１０）。

注入可能な製剤を考慮する場合、ＣＮＦヒドロゲルの容易な注入性も重要な特徴である。実施例６に記載されたように、ＣＮＦヒドロゲルは持続した及び制御された薬剤放出の適用において利用し得る放出特性を有する。ＣＮＦヒドロゲルについてのこれら２つの知見は、眼内、筋肉内、皮下治療、又は例えば、粘弾性の点眼製剤のような、様々な潜在的な薬剤治療の応用を可能にする。

実施例９
せん断停止後の構造回復
ＣＮＦヒドロゲルのさらなる重要な流動学的特性は、せん断（例えば、注入又は混合）が停止した後に、高レベルの粘性が保持されることである。ＣＮＦ分散液の構造回復は、初めに材料をレオメーター（StressTech, Reologica Instruments Ab）内で高せん断率でせん断し、せん断を停止した後、ゲル強度（Ｇ’）の回復を振動時間掃引測定で観測する試験シリーズにより示された。せん断サイクルは、同心円筒形状内で６１秒間４０Ｐａの一定応力で行った。この試験の間のせん断率及び粘性の漸進的変化を図１０に示す。当該材料を、相対的に高いせん断率（１０００ｓ−１）で、少なくとも４０秒間せん断し、その間に、該材料の粘性は４０ｍＰａ ｓを下回るまで下降した。

せん断を停止した後、Ｇ’（ゲル強度の指標値）の漸進的変化を、一定振動数（１Ｈｚ）及び小さい応力（０．５Ｐａ）での振動測定により調査した。該測定は、せん断を停止した後、正確に１０ｓで開始した。図１１から、ＣＮＦ分散液を高せん断率でせん断した後に該ＣＮＦ分散液を静止させる場合、ゲルネットワークが非常に迅速に形成されることが明白である。実質的な構造回復は、せん断停止後１０ｓですでに観測される（図１１の時間０と同等）。ＣＮＦ分散液を静止状態に１０分未満の間維持した後、一定の貯蔵率（Ｇ’）レベルに達する。広範にせん断したＣＮＦ分散液が生じたＧ’レベルは、構造回復試験前にガラス棒で穏やかに混合しただけのＣＮＦ分散液のものと同程度であった。

０．７％の天然ＣＮＦ分散液を、レオメーターの同心円筒形状内で、４０Ｐａの一定応力でせん断した際の、せん断率及び粘性の漸進的変化を図１１に示す。

高せん断率でのせん断後と、ガラス棒を用いて穏やかに混合した後とを比較した、０．７％の天然ＣＮＦ分散液の構造回復を図１２に示す。

速い構造回復は、２つの理由でヒドロゲル型の細胞培養材料では重要である。第１に、それは、細胞をヒドロゲルと混合した後のＣＮＦヒドロゲル中で、細胞が均一に分配されることを可能にする。第２に、例えば細胞移植を考慮した際に、ＣＮＦヒドロゲルが培養した細胞を運搬するのに使用される場合、ゲル構造の速い回復は細胞を望ましい場所へ効率的に捕捉し、移動が最小となる。速い回復は、注入可能な薬剤放出製剤においても必須である。

実施例１０
安定性
実施例１に示されたように、ＣＮＦの非常に希薄な分散液でさえ、低せん断率で非常に高い粘性を有する。注入等のせん断を停止すると、ヒドロゲル構造も回復する。静止状態において、ＣＮＦは高い弾性率及び非常に高い降伏応力を有するヒドロゲルネットワークを形成する。これらの特性に起因して、ＣＮＦは、非常に低濃度においてでさえ、固体粒子の非常に高い懸濁力を有する。

静止状態での懸濁性能は砂利の懸濁液を用いて示される。天然ＣＮＦ及び透明ＣＮＦの０．５％分散液は、２〜３ｍｍサイズの砂利の粒子でさえ、非常に長期間安定化することができる（図１３を参照）。透明ＣＮＦは天然ＣＮＦよりも低い濃度で粒子懸濁液を安定化することができるということは注目すべきである。

実施例１１
酵素加水分解
特定の酵素（セルラーゼ）はセルロース中のβ−（１−４）−結合を加水分解することができることが一般に知られている。例えば、鎖の末端から離れたランダムな位置においてセルロース鎖を標的とするエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＧ）；セロビオースダイマーを産生しながら鎖の両端から分子を切り離すことによりセルロースを分解するエキソグルカナーゼ又はエキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）；及びセロビオース単位（ＥＧ及びＣＢＨの攻撃間に産生される）をグルコースへ加水分解するβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）。それぞれ、セルロースナノファイバーは、セルラーゼを活用して酵素的にグルコースへ加水分解され得る（Ahola, S., Turon, X., Osterberg, M., Laine, J., Rojas, O.J., Langmuir, 2008, 24, 11592-11599）。

セルロースの酵素加水分解は、様々な理由で、細胞培養システムを含むセルロースナノファイバーに利用することができる。ＣＮＦヒドロゲルの加水分解後、培地の粘性は劇的に低くなり、培養した細胞構造へ容易にアクセス可能である（例えば、染色のために）。また、加水分解後、細胞構造は、セルロース含有材料なしで移動又は移植することができる。分解産物であるグルコースは、通常、細胞に対し非毒性であり、細胞培養において栄養分として使用できる。

セルロースナノファイバーの酵素加水分解は、様々なセルラーゼを活用して、様々な環境で行うことができる。図１４において、ゲルの懸濁力に対する市販のCelluclast酵素の効果が示されている。天然及び透明ＣＮＦヒドロゲルは両方とも、ゲル構造の酵素分解に起因して懸濁力を緩める。また、培養細胞株は、培養システムへ必要な酵素タンパク質を産生するように遺伝的に操作し得る。

Claims (20)

1. ヒドロゲル又は湿った状態の膜（但し、乾燥状態を経た膜を除く）の形態の植物由来の機械的に崩壊させたセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を含むことを特徴とする、細胞培養又は細胞送達組成物。
2. セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体におけるセルロースナノファイバー又はナノファイバーの束の直径が、１μｍ未満であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体が、セルロースナノファイバー又はナノファイバーの束の化学的に又は物理的に修飾された誘導体を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 機械的に崩壊させたセルロースナノファイバーが、酸−塩基で前処理されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 組成物が、細胞外マトリックス成分、血清、成長因子、及びタンパク質からなる群より選択される添加物をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 細胞が真核細胞、原核細胞又は幹細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. マトリックスが、生細胞及びヒドロゲルを形成している請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含み、且つ該細胞が前記マトリックスにおいて三次元又は二次元の配置で存在することを特徴とする、細胞培養又は細胞送達マトリックス。
8. 細胞が真核細胞若しくは原核細胞、又は幹細胞であることを特徴とする、請求項７に記載のマトリックス。
9. −植物由来の、機械的に崩壊させたセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を提供する工程、
   −前記セルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を水と混合する工程、
   を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を製造する方法。
10. 該方法が、混合物を適切な薬物と組み合わせることをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 機械的に崩壊させたセルロースナノファイバーが酸−塩基で前処理されることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 細胞が真核細胞、原核細胞又は幹細胞であることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. −請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物、細胞培養培地及び細胞を含む細胞培養材料を提供する工程；
    −前記細胞培養材料を水性又は非水性液体で希釈する工程；
    −任意で、細胞及び細胞凝集体を沈降させるために該細胞培養材料を遠心する工程；
    −デカンテーションによりセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を除去する工程、
    を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物、細胞培養培地及び細胞を含む細胞培養材料から植物ベースのセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を除去する方法。
14. −請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物、細胞培養培地及び細胞を含む細胞培養材料を提供する工程；
    −該細胞培養材料を分解酵素と接触させる工程；
    −任意で、細胞及び細胞凝集体を沈降させるために該細胞培養材料を遠心する工程；
    −デカンテーションによりセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を除去する工程、
    を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物、細胞培養培地及び細胞を含む細胞培養材料から植物ベースのセルロースナノファイバー及び／又はその誘導体を除去する方法。
15. 細胞が真核細胞、原核細胞又は幹細胞であることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するための培地又は培地の化合物として、研究及び／又は産業目的のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の、植物由来の、機械的に崩壊させたセルロースナノファイバー及び／若しくはその誘導体、又は請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の微生物学的使用。
17. 細胞が真核細胞、原核細胞又は幹細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
18. −細胞を提供する工程；
    −該細胞を請求項１〜６のいずれかに記載の組成物と接触させ、マトリックスを形成する工程；
    −前記マトリックス内で三次元又は二次元の配置で該細胞を培養する工程、
    を含むことを特徴とする、細胞を培養する方法。
19. 培養の前に、マトリックスを細胞培養又は細胞送達のための環境へ移動させる又は配置させることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
20. 細胞が真核細胞、原核細胞又は幹細胞であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の方法。

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