JP6684719B2 - ペプチド組成物の滅菌および濾過 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年3月10日に出願された米国仮特許出願第61/950,536号の、合衆国法典第35巻第119条(e)の下での利益を主張し、その出願は、その全体で参照により本明細書に援用される。
本出願は、「2004837−0044_Sequences.txt」というASCII.txtファイルとして電子的形態で提出された配列リストを参照する。txtファイルは、2015年3月9日に作られ、1kbのサイズである。
本明細書において用いられる用語「薬剤」は、例えば、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、小分子、金属、またはそれらの組み合わせを含む、任意の化学クラスの化合物または物質を指し得る。一部の実施態様では、薬剤は、天然に見られ、および/または天然から得られるという点で、天然物であり、または含む。一部の実施態様では、薬剤は、人の手の動作を通して設計され、改変され、および/または生産され、および/または、天然に見られないという点で、人工である1つまたは複数の物質であり、または含む。一部の実施態様では、薬剤は、分離されまたは純粋な形態で使用され得て;一部の実施態様では、薬剤は、粗製形態で使用され得る。一部の実施態様では、潜在的な薬剤は、コレクションまたはライブラリーとして提供され、例えば、スクリーニングしてそれらの中の活性の薬剤が同定または特徴付けられ得る。本発明により使用され得る薬剤の一部の特定の実施態様は、小分子、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、核酸(例えば、siRNA、shRNA、DNA/RNAハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム)、ペプチド、ペプチド模倣物などを含む。一部の実施態様では、薬剤は、ポリマーであり、または含む。一部の実施態様では、薬剤はポリマーではなく、および/または、いかなるポリマーも実質的に存在しない。一部の実施態様では、薬剤は、少なくとも1つのポリマー部分を含む。一部の実施態様では、薬剤は、いかなるポリマー部分もなく、または実質的に存在しない。
本発明は、ペプチド組成物の滅菌のための技術を提供する。一部の実施態様では、開示される方法は、高い粘度および/または剛性を有するペプチド溶液に特に適している。一部の実施態様では、本開示は、オートクレーブ処理により滅菌され得る特定のペプチド溶液を定義する。一部の実施態様では、本開示は、それらのレオロジー特性を変更するように処理されない限り、および処理されるまで、濾過に適し得ない特定のペプチド溶液を定義する。一部の実施態様では、本開示は、ペプチド溶液の粘度および/または剛性を、濾過を可能にするのに十分に一時的に低下させ得る技術を提供する。一部の実施態様では、本開示は、特定のペプチド溶液の操作、処理、および/または濾過を、例えばそのレオロジー特性を改変する高剪断応力を適用することにより、促進する技術を教示する。
1つまたは複数の実施態様によれば、本開示が教示するペプチド組成物は、約6〜約200個のアミノ酸残基を有する両親媒性ペプチドの組成物であり得る。特定の実施態様では、関連のあるペプチドは、少なくとも約7個のアミノ酸の長さを有してよい。特定の実施態様では、ペプチドは、約7〜約17個の間のアミノ酸の長さを有してよい。特定の実施態様では、ペプチドは、少なくとも8個のアミノ酸、少なくとも約12個のアミノ酸、または少なくとも約16個のアミノ酸の長さを有してよい。
本開示は、特定のペプチド組成物(例えば、特に、特定の自己組織化ペプチドおよび/または高ペプチド濃度の、特定の組成物)の調製および/または操作は、例えば高い粘度および/または剛性と関連する困難性により、複雑になっていることを認識する。本開示は、特に、特定のペプチド組成物が、濾過(具体的には滅菌フィルターを介した濾過)に適していないことを示す。
オートクレーブ処理は、物質を121℃の高圧飽和蒸気に供するステップを伴う、従来の滅菌方法である。当分野において、オートクレーブ処理に伴うような高熱の適用は、ペプチドを分解し得ることが一般に理解される。
本開示は、1つまたは複数のレオロジー特性を変更する(例えば、粘度および/または剛性を変更する)処理への曝露を介して、特定のペプチド組成物を濾過に適するようにさせることができることを示す。
一部の非限定的な実施態様では、剪断応力は、1つまたは複数のニードルを通した注入により適用され得る。したがって、一部の実施態様では、1つまたは複数のニードルは、剪断減粘性ユニットとして用いられ得る。
一部の実施態様では、本明細書に記載されるペプチド組成物に対して剪断応力を適用するために使用される剪断減粘性ユニットは、マイクロ−またはナノ−孔により特徴付けられるデバイスまたは物質であり得る。図13は、本発明の1つまたは複数の非限定的な実施態様による滅菌デバイスの1つの非限定的な実施態様を示す。示されるように、ペプチド溶液(例えば、自己組織化ペプチドの粘性溶液)は、分注シリンジ(または圧力容器)へ移され、剪断応力のための孔を有する第一のチャンバーに送達され、それから、第二のチャンバー内で濾過され得る。当業者により理解されるように、膜の直径サイズは、ペプチド溶液の量に応じて変更し得る。
一部の実施態様では、剪断減粘性ユニットは、マイクロ−またはナノ−穴を有し得る。一部の実施態様では、穴は、一部の実施態様では厚さが約10μm〜10mmであり得るプレート上に、パターン形成またはドリル穴あけされてよい。図15は、本開示の1つまたは複数の非限定的な実施態様による滅菌デバイスの1つの非限定的な実施態様を示す。剪断減粘性ユニットは、図13に示される第一の濾過チャンバー内に挿入され得る。
一部の実施態様では、本明細書に記載の技術が適用されるペプチド組成物は、それから、(例えば、滅菌された組成物に、特定の有用性があるように、)生物学的な細胞、組織、または生物に関わる1つまたは複数の適用において使用される。
本実施例は、とりわけ、様々なペプチド組成物の(すなわち、具体的には、自己組織化ペプチドの組成物の)レオロジー特性を説明し、および、異なるペプチドおよび/または異なる濃度の同一ペプチドに関する、粘度、貯蔵弾性率(例えば、剛性)、損失弾性率、および降状応力などのパラメーターの有意な可変性を示す。また、本実施例は、特定のこれらの溶液は、濾過に適しにくいことも示す。具体的には、本実施例は、そのようなペプチドの高粘度溶液は、濾過技術に対するチャレンジを表わすことを示す。レオロジー特性を、様々なペプチド溶液に関して決定した。具体的には、RADA16、IEIK13、およびKLD12の溶液を、以下の表1に示される濃度で調製した。見ることができるように、一般に、より高い濃度の溶液は、より高い最大粘度を示した。さらに、異なる配列のペプチドは、同一濃度の溶液において、異なる最大粘度を示した。例えば、2%のKLD12、2.5%のKLD12、および1.5%のIEIK13溶液は、それぞれ、2.5%のRADA16よりも2倍、3.4倍、および3.2倍高い最大粘度を有する。
本実施例は、一部のペプチド組成物(すなわち、具体的には、本明細書に記載の自己組織化ペプチドの組成物)が、驚くべきことに、熱処理に対して安定であることを示す。具体的には、本実施例は、特定のペプチド組成物が、121℃で25分間のオートクレーブ処理の適用の際でさえ、安定したモル質量を維持することを示す。したがって、本実施例は、そのような組成物が、高熱(例えば、オートクレーブ)技術の適用を通じてうまく滅菌され得ることを確立する。本実施例は同時に、しかしながら特定のペプチド組成物はそのような処理に対して安定でないことを示す。
本実施例は、適用された剪断応力が、特定のペプチド溶液の粘度および/または剛性を低下させ得ることを示し、さらに、粘度および/または剛性のそのような低下は、そのような処理をしないと組成物が適さない様々および/または処理の技術(例えば濾過)に、組成物を適するようにさせることができることを示す。
剪断流動試験を、20mmプレートを備えるレオメータ(DHR−1、TA Instruments)を用いて、ペプチド溶液に対して行なった。結果を図9(2.5%のRADA16溶液)および図10(1.5%のIEIK13溶液)に示す。見ることができるように、2.5%のRADA16およびIEIK13の1.5%溶液の両方とも、典型的な剪断減粘性の特性を示した。すなわち、剪断速度が増加するにつれて、それらの粘度は劇的に低下した。剪断速度が増加するにつれて、剪断応力が直ちに増加し、それから、粘度がプラトーに達したときに、わずかに低下した。降状応力は、2.5%のRADA16溶液について約40Paであり、1.5%のIEIK13溶液について約60Paであった。
RADA16およびIEIK13溶液の粘度復元時間を、高剪断応力の適用後に評価した。DHR−1レオメータ―(rheomether)(TA Instruments)を用いて、2.5%のRADA16および1.5%のIEIK13溶液の粘度変化を、サンプルに対して1000 1/secの剪断速度を1分間適用後に、0.005 1/secの剪断速度での流動試験により測定した。RADA16およびIEIK13溶液は、典型的なチキソトロピック挙動を示した。これは、それらの粘度がゆっくり回復したことを意味する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まずに、我々は、これらの溶液に関するレオロジー特性の復元時間は、溶液中での、ペプチド分子の構造(例えば、ナノ−ファイバー)への再組織化に基づき得ることを提案する。2.5%のRADA16および1.5%のIEIK13溶液の完全な再組織化時間は、約12〜48時間であった。結果を図11(2.5%のRADA16溶液)および図12(1.5%のIEIK13溶液)に示す。
30ゲージニードルを通したペプチド組成物の注入後1分および20分の、元の貯蔵弾性率に戻る復元のパーセンテージを表2に挙げる。IEIK13(具体的には、2.5%のIEIK13溶液)の復元速度は、ペプチド溶液の中で最も速く、元の貯蔵弾性率に100%の復元を20分で示した。KLD12は、復元が試験されたものの中で最も遅く;20分で元の貯蔵弾性率に23%の復元しか示さなかった(2.5%に関して)。一部の非限定的な実施態様では、ニードルを通過(例えば注入)後に、元の弾性率に完全に復元するのに約12〜48時間かかり得る。
本実施例は、剪断減粘性ユニットとしてニードルを用いた、ペプチド組成物(具体的には、本明細書に記載の自己組織化ペプチド)の濾過処理を記載する。具体的には、本実施例は、(例えば剪断減粘性ユニットの通過を介した)適切な剪断応力の適用は、例えば滅菌フィルターなどのフィルターをうまく通過することができるように、組成物のレオロジー特性を変更することができる(例えば、粘度および/または剛性などを低下させることができる)ことを示す)。
本実施例は、特定の剪断減粘性ユニットを記載する。操作原理は、上述の第一のニードルと同様である。具体的には、各剪断減粘性ユニットは、組成物が濾過(具体的には滅菌フィルターを通した濾過)に適するようになるように、適用されるペプチド組成物の1つまたは複数のレオロジー特性を調節するのに適切かつ十分な剪断応力を適用する。一部の実施態様では、複数のニードルまたは当量物を、剪断減粘性ユニットとして使用し得る。
本実施例は、剪断減粘性ユニットとして、膜フィルター(孔サイズ>0.45μm)を備える使用を示す。粘性の2.5%のKLD12または1.5%のIEIK13溶液は、分注シリンジ(または圧力容器)へ移され、剪断減粘性ユニット(例えば、0.45μm〜120μmの範囲の孔サイズ)を備える第一のチャンバーに送達され、それから、第二のチャンバーにおいて濾過膜(例えば、孔サイズ:0.2μm)を通して濾過され得る。
本実施例は、剪断減粘性ユニットとしてのマイクロ−および/またはナノ−穴を備えるスクリーンの、成功使用を示す。粘性の2.5%のKLD12または1.5%のIEIK13溶液は、分注シリンジ(またはチャンバー)に移され、マイクロ−および/またはナノ−穴を有する剪断減粘性ユニットを備える第一のチャンバーに注入され、それから、第二のチャンバー内の膜フィルター(孔サイズ:0.2μm)を通して濾過され得る。注入用シリンジの代わりに、高圧チャンバーを用いてペプチド組成物を送達してよい。膜サイズ(例えば、直径)および/または他の特性(例えば、孔サイズなど)は、それを通過するペプチド組成物の量に適合するように選択してよい。
Claims (9)
- 配列番号6に規定されるIEIKの一連の繰り返し単位を配列に含む液体ペプチド組成物を滅菌する方法であって、
前記組成物をオートクレーブ処理に供するステップを含む、
方法。 - 請求項1の方法であって、
前記方法は、滅菌濾過を伴わない、
方法。 - 配列番号6に規定されるIEIKの一連の繰り返し単位を配列に含む液体ペプチド組成物を滅菌する方法であって、
前記組成物を熱処理に供するステップを含み、
前記熱処理は、約121℃で約25分間実施する、
方法。 - 請求項1の方法であって、
前記液体ペプチド組成物は、約0.01w/v%〜約10w/v%の範囲の濃度を有する、
方法。 - 請求項1の方法であって、
前記液体ペプチド組成物は、配列番号3に規定されるIEIK13を含む、
方法。 - 請求項1の方法であって、
前記方法は、前記液体ペプチド組成物を分解しない、
方法。 - 請求項3の方法であって、
前記液体ペプチド組成物は、約0.01w/v%〜約10w/v%の範囲の濃度を有する、
方法。 - 請求項3の方法であって、
前記液体ペプチド組成物は、配列番号3に規定されるIEIK13を含む、
方法。 - 請求項3の方法であって、
前記方法は、前記液体ペプチド組成物を分解しない、
方法。
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