KR101702677B1 - 자기 조직화 펩티드 및 고강도 펩티드 겔 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 실용상 충분한 역학적 강도를 가지는 펩티드 겔 및 그 펩티드 겔을 형성할 수 있는 자기 조직화 펩티드를 제공한다. 본 발명의 자기 조직화 펩티드는 하기 아미노산 서열로 이루어진다.
아미노산 서열: a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(상기 아미노산 서열 중, a1∼a4는 염기성 아미노산 잔기이며; b1∼b6은 비전하 극성 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기이며, 단, 그 중의 적어도 5개는 소수성 아미노산 잔기이며; c1 및 c2는 산성 아미노산 잔기이며; d는 소수성 아미노산 잔기이다)

Description

자기 조직화 펩티드 및 고강도 펩티드 겔{SELF-ASSEMBLING PEPTIDE AND PEPTIDE GEL WITH HIGH STRENGTH}
본 발명은, 고강도의 펩티드 겔을 형성할 수 있는 자기 조직화 펩티드 및 그 펩티드로 형성되는 펩티드 겔에 관한 것이다.
재생 의료 분야에 있어서의 연구 및 실제 치료에 있어서 사용하는 스캐폴드 (세포의 기반)로서, 콜라겐 겔이 일반적으로 이용되고 있다. 그러나, 콜라겐 겔은 동물 유래이기 때문에, 알려지지 않은 감염증의 우려가 있다. 이 알려지지 않은 감염증의 불안을 없애는 수단으로서, 화학적으로 합성되는 재료 유래의 스캐폴드가 존재한다. 이러한 재료로는, 예를 들면, 특허문헌 1 또는 특허문헌 2에 개시되는 것과 같은 자기 조직화 펩티드를 들 수 있다. 그러나, 특허문헌 1 또는 2의 자기 조직화 펩티드로부터 수득되는 스캐폴드 (펩티드 겔)는 역학적 강도가 불충분하므로, 예를 들면, 핀셋으로 집으면 허물어져 버리는 등의 조작성의 문제가 있다. 또한, 특허문헌 1의 자기 조직화 펩티드 겔은, 중성 영역에 있어서, 투명성이 불충분하다는 문제가 있다.
특허문헌 1: US5670483 특허문헌 2: WO2007/000979호 팜플렛
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서 이루어진 것이며, 그 목적은 실용상 충분한 역학적 강도를 가지는 펩티드 겔 및 그 펩티드 겔을 형성할 수 있는 자기 조직화 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 자기 조직화 펩티드가 제공된다. 상기 자기 조직화 펩티드는 하기 아미노산 서열로 이루어진다.
아미노산 서열: a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(상기 아미노산 서열 중, a1∼a4는 염기성 아미노산 잔기이며; b1∼b6은 비전하 극성 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기이며, 단, 그 중의 적어도 5개는 소수성 아미노산 잔기이며; c1 및 c2는 산성 아미노산 잔기이며; d는 소수성 아미노산 잔기이다)
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 아미노산 서열 중, b3 및 b4가 소수성 아미노산 잔기이다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 아미노산 서열 중, b1∼b6이 모두 소수성 아미노산 잔기이다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 아미노산 서열 중, b1∼b6이 각각 독립하여 알라닌 잔기, 발린 잔기, 류신 잔기 또는 이소류신 잔기이다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 아미노산 서열 중, d가 알라닌 잔기, 발린 잔기, 류신 잔기 또는 이소류신 잔기이다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 자기 조직화 펩티드는 RLDLRLALRLDLR (서열 번호 1), RLDLRLLLRLDLR (서열 번호 2), RADLRLALRLDLR (서열 번호 6), RLDLRLALRLDAR (서열 번호 7), RADLRLLLRLDLR (서열 번호 8), RADLRLLLRLDAR (서열 번호 9), RLDLRALLRLDLR (서열 번호 10) 또는 RLDLRLLARLDLR (서열 번호 11)의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 자기 조직화 펩티드는 RLDLRLALRLDLR (서열 번호 1) 또는 RLDLRLLLRLDLR (서열 번호 2)의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다.
본 발명의 다른 국면에 의하면, 변형 펩티드가 제공된다. 그 변형 펩티드는, 상기 자기 조직화 펩티드의 N 말단 아미노기 및/또는 C 말단 카복실기가 변형된 펩티드이며, 자기 조직화능을 가진다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 N 말단 아미노기 및/또는 C 말단 카복실기에, RGD를 포함하는 아미노산 서열이 부가되어 있다.
본 발명의 다른 별도의 국면에 의하면, 펩티드 겔이 제공된다. 그 펩티드 겔은, 상기 자기 조직화 펩티드 및/또는 상기 변형 펩티드를 포함하는 수용액으로 형성된다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 수용액이 첨가물을 더 포함한다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 첨가물이 pH 조정제, 아미노산류, 비타민류, 당류, 다당류, 알코올류, 다가 알코올류, 색소, 생리 활성 물질, 효소, 항체, DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 펩티드 겔을, 22℃의 온도 조건 하에서, 선단이 직경 3.2㎜, 곡률 반경 1.6㎜의 구형상인 지그를 이용하여, 0.05㎜/s의 압축 속도로 행한 압축 시험에 있어서, 압축 개시부터 8∼10초 후까지의 측정치의 근사 직선에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치 L(g/s)이 0.03g/s 이상이다.
본 발명의 다른 별도의 국면에 의하면, 세포 배양용 기재가 제공된다. 그 세포 배양용 기재는, 상기 자기 조직화 펩티드, 상기 변형 펩티드 및 상기 펩티드 겔로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 별도의 국면에 의하면, 무균 펩티드의 제조 방법이 제공된다. 그 무균 펩티드의 제조 방법은, 상기 자기 조직화 펩티드 및/또는 변형 펩티드를, 가압 조건 하, 100℃ 이상에서 멸균하는 공정을 포함한다.
본 발명의 다른 별도의 국면에 의하면, 펩티드 겔로 코팅된 물품의 제조 방법이 제공된다. 그 펩티드 겔로 코팅된 물품의 제조 방법은, 상기 펩티드 겔을 동결하는 공정, 동결물을 융해하여 펩티드 졸을 수득하는 공정, 코팅 대상 물품 표면의 적어도 일부를 상기 펩티드 졸로 코팅하는 공정, 및 상기 펩티드 졸로부터 펩티드 겔을 재형성하는 공정을 포함한다.
본 발명의 특정 아미노산 서열을 가지는 자기 조직화 펩티드에 의하면, 실용적인 역학적 강도를 가지는 펩티드 겔을 수득할 수 있다.
도 1은 n―RADARAAARADAR―c의 서열로 이루어진 펩티드간의 거리를 설명하는 모식도이다. 도면 중의 N 말단과 C 말단을 연결하는 주쇄 중의 굵은 선은 펩티드 결합을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 펩티드 겔의 압축 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 (a) 실시예 1의 펩티드 겔을 핀셋에 끼웠을 때의 사진이며, (b) 실시예 2의 펩티드 겔을 핀셋에 끼웠을 때의 사진이며, (c) 비교예 1의 펩티드 겔을 핀셋에 끼웠을 때의 사진이다.
도 4는 실시예 2의 펩티드 겔의 압축 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 3의 펩티드 겔의 압축 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 비교예 1의 펩티드 겔의 압축 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 비교예 2의 펩티드 겔의 압축 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 4의 펩티드 겔의 압축 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 실시예 7에 있어서의 세포 증식률을 나타내는 그래프이다.
도 10의 (a)는 멸균 처리 전의 펩티드 수용액의 질량 분석 결과이며, (b)는 멸균 처리후의 펩티드 수용액의 질량 분석 결과이다.
도 11의 (a)는 멸균 처리 전의 상품명 「PuraMatrixTM」(쓰리·디·매트릭스사 제)의 질량 분석 결과이며, (b)는 멸균 처리후의 상품명 「PuraMatrixTM」(쓰리·디·매트릭스사 제)의 질량 분석 결과이다.
도 12의 (a), (b), 및 (c)는 각각 겔을 샬레에 옮겼을 때의 사진, 동결한 겔의 사진, 및 펩티드 겔로 표면 전체가 균일하게 코팅된 샬레의 사진이다.
도 13의 (a), (b) 및 (c)는 각각 겔을 슬라이드 글래스에 옮겼을 때의 사진, 동결한 겔의 사진, 및 펩티드 겔로 표면 전체가 균일하게 코팅된 슬라이드 글래스의 사진이다.
A. 용어의 정의
(1) 본 명세서에 있어서, 「자기 조직화 펩티드」란, 용매 중에 있어서, 펩티드 분자끼리의 상호 작용을 통하여 자발적으로 집합하는 펩티드를 말한다. 상호 작용으로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 수소 결합, 이온간 상호 작용, 반데르발스힘(Van der Waals force) 등의 정전기적 상호 작용, 소수성 상호 작용을 들 수 있다. 1개의 실시 형태에 있어서, 자기 조직화 펩티드는, 실온의 수용액(예를 들면, 0.4w/v%의 펩티드 수용액) 중에 있어서, 자기 조직화하여 나노 파이버 또는 겔을 형성할 수 있다.
(2) 본 명세서에 있어서, 「겔」이란, 점성적인 성질과 탄성적인 성질을 함께 가지는 점탄성 물질을 말한다.
(3) 본 명세서에 있어서, 「친수성 아미노산」은 아르기닌(Arg/R), 리신(Lys/K), 히스티딘(His/H) 등의 염기성 아미노산, 아스파라긴산(Asp/D), 글루타민산(Glu/E) 등의 산성 아미노산, 티로신(Tyr/Y), 세린(Ser/S), 트레오닌(Thr/T), 아스파라긴(Asn/N), 글루타민(Gln/Q), 시스테인(Cys/C) 등의 비전하 극성 아미노산을 포함한다. 상기 괄호 내의 알파벳은 각각 아미노산의 3문자 표기 및 1문자 표기이다.
(4) 본 명세서에 있어서, 「소수성 아미노산」은 알라닌(Ala/A), 류신(Leu/L), 이소류신(Ile/I), 발린(Val/V), 메티오닌(Met/M), 페닐알라닌(Phe/F), 트립토판(Trp/W), 글리신(Gly/G), 프롤린(Pro/P) 등의 비극성 아미노산을 포함한다. 상기 괄호 내의 알파벳은 각각 아미노산의 3문자 표기 및 1문자 표기이다.
B. 자기 조직화 펩티드
본 발명의 자기 조직화 펩티드는 하기 아미노산 서열로 이루어진다.
아미노산 서열: a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(상기 아미노산 서열 중, a1∼a4는 염기성 아미노산 잔기이며; b1∼b6은 비전하 극성 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기이며, 단, 그 중의 적어도 5개는 소수성 아미노산 잔기이며; c1 및 c2는 산성 아미노산 잔기이며; d는 소수성 아미노산 잔기이다)
일반적으로, 자기 조직화 펩티드는, 수용액 중에서, 친수성의 측쇄가 배치되는 면과 소수성의 측쇄가 배치되는 면으로 이루어진 β시트 구조를 취하고, 친수성면간에 작용하는 수소 결합, 이온간 상호 작용 등 및 소수성면간에 작용하는 소수성 상호 작용 등의 상호 작용에 의해, 복수의 펩티드가 자발적으로 집합한다고 생각된다. 이 때문에, 종래의 자기 조직화 펩티드에 있어서는, 친수성 아미노산과 소수성 아미노산을, 번갈아, 또한, 동일한 비율로 가지는 것이 매우 중요하게 여겨진다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).
이에 대하여, 본 발명의 자기 조직화 펩티드는, 상기와 같이, 7 위치의 소수성 아미노산 잔기를 중심으로 하여, 1 잔기 걸러 염기성 아미노산 잔기 (1, 5, 9, 및 13 위치) 및 산성 아미노산 잔기 (3 및 11 위치)를 N 말단 방향 및 C 말단 방향에 대칭의 위치에 가지는 13 잔기의 아미노산 서열로 이루어진다. 즉, 본 발명의 자기 조직화 펩티드는 친수성 아미노산과 소수성 아미노산을 번갈아 가지지 않는 것을 하나의 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 자기 조직화 펩티드는 친수성 아미노산 잔기와 소수성 아미노산 잔기를 동일한 비율로 가지지 않는 것을 별도의 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 자기 조직화 펩티드는 7 위치의 소수성 아미노산 잔기를 중심으로 하여, 4개의 염기성 아미노산 잔기와 2개의 산성 아미노산 잔기를 소정의 대칭 위치에 가지고, N 말단과 C 말단의 아미노산 잔기가 모두 염기성 아미노산 잔기인 것을 또 다른 특징으로 한다. 일반적으로는, 7 위치를 소수성 아미노산 잔기로 하는 것은, β시트 구조의 형성에 있어서 불리해지고, 또한, 친수성 아미노산과 소수성 아미노산의 비율을 불균등하게 하므로, 펩티드의 자기 조직화능에 악영향을 끼치는 것으로 생각되어 왔다. 그러나, 본 발명의 자기 조직화 펩티드는, 뛰어난 자기 조직화 능을 가지고, 또한, 종래보다도 역학적 강도가 뛰어난 펩티드 겔을 형성할 수 있다. 이러한 효과가 발휘되는 이유는 확실하지는 않지만, 7 위치를 소수성 아미노산으로 하는 것에 추가하여, 염기성 아미노산 잔기를 산성 아미노산 잔기보다도 2개 많이 가지고, 또한, 각각의 아미노산 잔기를 특정 위치에 가짐으로써, β시트 구조를 형성하는 능력을 유지하면서, 펩티드 분자간에 정전기적 인력과 정전기적 척력이 매우 뛰어난 밸런스로 작용함에 의한 것으로 생각된다.
상기 자기 조직화 펩티드를 구성하는 아미노산은, L―아미노산이어도 되고, D―아미노산이어도 된다. 또한, 천연 아미노산이어도 되고, 비천연 아미노산이어도 된다. 저가격으로 입수 가능하고, 펩티드 합성이 용이하므로, 바람직한 것은 천연 아미노산이다.
상기 아미노산 서열 중, a1∼a4는 염기성 아미노산 잔기이다. 염기성 아미노산은 바람직하게는 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이며, 보다 바람직하게는 아르기닌 또는 리신이다. 이들 아미노산은, 염기성이 강하기 때문이다. a1∼a4는 동일한 아미노산 잔기여도 되고, 상이한 아미노산 잔기여도 된다.
상기 아미노산 서열 중, b1∼b6은 비전하 극성 아미노산 잔기 및/또는 소수성 아미노산 잔기이며, 그 중의 적어도 5개는 소수성 아미노산 잔기이다. 소수성 아미노산은 바람직하게는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 글리신 또는 프롤린이다. 비전하 극성 아미노산은 바람직하게는 티로신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 또는 시스테인이다. 이들 아미노산은 입수가 용이하기 때문이다.
바람직하게는, b3 및 b4는 각각 독립하여 임의의 적절한 소수성 아미노산 잔기이며, 더욱 바람직하게는 류신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기 또는 이소류신 잔기이며, 특히 바람직하게는 류신 잔기 또는 알라닌 잔기이다. 상기 아미노산 서열에 있어서, 각각 6 위치와 8 위치에 위치하는 b3과 b4가 소수성 아미노산 잔기인 경우, 6∼8 위치의 3개의 아미노산 잔기가 연속하여 소수성 아미노산 잔기가 된다. 이와 같이 아미노산 서열의 중심에 형성된 소수성 영역은, 그 소수성 상호 작용 등에 의해, 강도가 뛰어난 펩티드 겔의 형성에 기여할 수 있다고 추측된다.
바람직하게는, b1∼b6은 모두 소수성 아미노산 잔기이다. 자기 조직화 펩티드가 적합하게 β시트 구조를 형성하고, 자기 조직화할 수 있기 때문이다. 보다 바람직하게는, b1∼b6은 각각 독립하여 류신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기 또는 이소류신 잔기이며, 더욱 바람직하게는 류신 잔기 또는 알라닌 잔기이다. 바람직한 실시 형태에 있어서는, b1∼b6 중의 4개 이상이 류신 잔기이며, 특히 바람직하게는 그 중의 5개 이상이 류신 잔기이며, 가장 바람직하게는 전체가 류신 잔기이다. 물에 대한 용해성이 뛰어나고, 또한, 고강도의 펩티드 겔을 형성할 수 있는 자기 조직화 펩티드를 수득할 수 있기 때문이다.
상기 아미노산 서열 중, c1 및 c2는 산성 아미노산 잔기이다. 산성 아미노산은 바람직하게는 아스파라긴산 또는 글루타민산이다. 이들 아미노산은 입수가 용이하기 때문이다. c1 및 c2는 동일한 아미노산 잔기여도 되고, 상이한 아미노산 잔기여도 된다.
상기 아미노산 서열 중, d는 소수성 아미노산 잔기이다. 상기와 같이, d가 소수성 아미노산 잔기이며, 또한, 소정의 대칭 구조를 가짐으로써, 상기 자기 조직화 펩티드는 종래의 펩티드 겔보다도 역학적 강도가 뛰어난 겔을 형성할 수 있다고 생각된다. 이러한 효과가 발휘되는 이유는 확실하지는 않지만, 본 발명의 자기 조직화 펩티드는, 7 위치의 아미노산 잔기(d)가 소수성 아미노산 잔기이므로, 자기 조직화할 때의 펩티드끼리의 겹침이 일정하게 되어, 균일성이 높은 집합 상태를 형성할 수 있기 때문으로 추측된다.
d는 바람직하게는 알라닌 잔기, 발린 잔기, 류신 잔기 또는 이소류신 잔기이다. 이 경우, 자기 조직화 펩티드가 형성하는 β시트 구조의 친수성면측의 아미노산의 측쇄 길이는 비상보적으로 될 수 있는데, 그 자기 조직화 펩티드는 뛰어난 자기 조직화 능력을 발휘할 수 있고, 나아가, 종래보다도 역학적 강도가 뛰어난 펩티드 겔을 형성할 수 있다. 이는, 자기 조직화에 있어서 적합한 정전기적 인력을 수득하기 위해서는, β시트 구조의 친수성면측의 아미노산의 측쇄 길이가 상보적인 것이 바람직하다는 종래의 지견과는 크게 다른 효과이다. 여기에서, 「측쇄 길이가 상보적」이란, 상호 작용을 발휘하는 한쌍의 아미노산 잔기 (예를 들면, 염기성 아미노산 잔기와 산성 아미노산 잔기)의 측쇄 길이에 주로 관여하는 원자의 수의 합이 일정한 것을 말한다. 예를 들면, 도 1은 측쇄 길이가 비상보적인 경우의 펩티드간의 거리를 설명하는 모식도이다. 도 1에 도시되는 바와 같이, 점선으로 둘러싸이는 알라닌 잔기―아르기닌 잔기쌍의 측쇄 길이에 주로 관여하는 원자의 수의 합(7)은, 실선으로 둘러싸이는 아스파라긴산 잔기―아르기닌 잔기쌍의 측쇠 길이에 주로 관여하는 원자의 수의 합(9)보다도 작다.
상기 자기 조직화 펩티드에 포함되는 아미노산 잔기의 중성 영역에 있어서의 전하의 총 합은, 실질적으로 ＋2이다. 즉, 상기 자기 조직화 펩티드는, 중성 영역에 있어서 그 펩티드에 포함되는 아미노산 잔기의 측쇄에 유래하는 플러스 전하와 마이너스 전하가 상쇄되지 않는다. 추가하여, N 말단과 C 말단의 아미노산 잔기가 모두 염기성 아미노산 잔기이므로, 본 발명의 자기 조직화 펩티드는, 예를 들면, 펩티드간에 정전기적 인력에 추가하여 정전기적 척력이 작용하고, 이들의 미묘한 밸런스가 유지됨으로써 과도한 회합이 실질적으로 발생하지 않으므로, 중성 영역에서 침전하지 않고 안정적인 겔을 형성할 수 있다고 추측된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「중성 영역」이란, pH6∼8, 바람직하게는 pH6.5∼7.5의 영역을 말한다.
각 pH에 있어서의 상기 자기 조직화 펩티드의 전하는, 예를 들면, 레닌저(Lehninger)〔Biochimie, 1979〕의 방법에 따라서 산출될 수 있다. 레닌저의 방법은, 예를 들면, EMBL WWW Gateway to Isoelectric Point Service의 웹사이트 (http://www. embl-heidelberg. de/cgi/pi-wrapper. pl) 상에서 이용가능한 프로그램에 의해 행해질 수 있다.
상기 자기 조직화 펩티드를 포함하는 수용액은, 역학적 강도가 뛰어난 펩티드 겔을 형성할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서는, 자기 조직화 펩티드 수용액 (바람직하게는 0.2∼5w/v%, 더욱 바람직하게는 0.2∼2w/v%, 특히 바람직하게는 0.2∼1w/v%, 가장 바람직하게는 0.3∼0.8w/v%)은, 22℃의 온도 조건 하에서, 선단이 직경 3.2㎜, 곡률반경 1.6㎜의 구형상인 지그를 이용하여, 0.05㎜/s의 압축 속도로 행한 압축 시험에 있어서, 압축 개시부터 초기 (8∼10초후까지)의 측정치의 근사 직선에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치 L(g/s)이, 바람직하게는 0.03g/s 이상, 더욱 바람직하게는 0.035g/s 이상, 특히 바람직하게는 0.04g/s 이상의 겔을 형성할 수 있다. 상기 압축 시험은, 후술의 실시예에 기재와 같이, 예를 들면, 스테인리스 스틸 제 지그(티·에이·인스트루먼트사 제)를 부착한 점탄성 측정 장치(티·에이·인스트루먼트사 제, 제품번호 「RSA III」)를 이용하여 행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태의 자기 조직화 펩티드를 이하에 예시한다.
n―RLDLRLALRLDLR―c (서열 번호 1)
n―RLDLRLLLRLDLR―c (서열 번호 2)
n―RADLRLALRLDLR―c (서열 번호 6)
n―RLDLRLALRLDAR―c (서열 번호 7)
n―RADLRLLLRLDLR―c (서열 번호 8)
n―RADLRLLLRLDAR―c (서열 번호 9)
n―RLDLRALLRLDLR―c (서열 번호 10)
n―RLDLRLLARLDLR―c (서열 번호 11)
상기 자기 조직화 펩티드는 임의의 적절한 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, Fmoc법 등의 고상법 또는 액상법 등의 화학 합성 방법, 유전자 재조합 발현 등의 분자 생물학적 방법을 들 수 있다.
C. 변형 펩티드
본 발명의 변형 펩티드는, 자기 조직화능을 가지는 한에 있어서, 상기 자기 조직화 펩티드에 임의의 변형을 실시한 펩티드이다. 변형이 행해지는 부위는, 상기 자기 조직화 펩티드의 N 말단 아미노기여도 되고, C 말단 카복실기여도 되고, 그 양쪽이어도 된다.
상기 변형으로는, 수득되는 변형 펩티드가 자기 조직화능을 가지는 범위에 있어서 임의의 적절한 변형이 선택될 수 있다. 예를 들면, N 말단 아미노기의 아세틸화, C 말단 카복실기의 아미드화 등의 보호기의 도입; 알킬화, 에스테르화, 또는 할로겐화 등의 관능기의 도입; 수소 첨가; 단당, 이당, 올리고당, 또는 다당 등의 당 화합물의 도입; 지방산, 인지질, 또는 당지질 등의 지질 화합물의 도입; 아미노산 또는 단백질의 도입; DNA의 도입; 그 외 생리 활성을 가지는 화합물 등의 도입을 들 수 있다. 아미노산 또는 단백질이 도입되는 경우, 도입후의 펩티드는 상기 자기 조직화 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 임의의 아미노산이 부가된 펩티드인데, 본 명세서에 있어서는, 그 부가 펩티드도 변형 펩티드에 포함한다. 변형은 1종만 행해져도 되고, 2종 이상을 조합하여 행해도 된다. 예를 들면, 상기 자기 조직화 펩티드의 C 말단에 원하는 아미노산을 도입한 부가 펩티드의 N 말단을 아세틸화하고, C 말단을 아미드화해도 된다.
상기 부가 펩티드(변형 펩티드)는, 전체로서, 상기 자기 조직화 펩티드의 특징을 가지지 않는 경우가 있다. 구체적으로는, 임의의 아미노산의 부가에 의해, 7 위치의 소수성 아미노산 서열을 중심으로 하여 N 말단 방향의 서열과 C 말단 방향의 서열이 비대칭이 될 경우, 소수성 아미노산과 친수성 아미노산을 동일한 비율로 가지는 경우 등이 있다. 이러한 경우라도, 상기 자기 조직화 펩티드가 매우 뛰어난 자기 조직화 능력을 가지므로, 임의의 아미노산이 부가된 부가 펩티드도 또한 역학적 강도가 뛰어난 펩티드 겔을 형성할 수 있다.
아미노산 또는 단백질이 도입될 경우, 도입 후의 변형 펩티드를 구성하는 아미노산 잔기수는, 바람직하게는 14∼200이며, 보다 바람직하게는 14∼100이며, 더욱 바람직하게는 14∼50이며, 특히 바람직하게는 14∼30, 가장 바람직하게는 14∼20이다. 아미노산 잔기수가 200을 초과하면, 상기 자기 조직화 펩티드의 자기 조직화능이 손상될 경우가 있기 때문이다.
도입되는 아미노산의 종류 및 위치는, 변형 펩티드의 용도 등에 따라서 적절하게 설정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 자기 조직화 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단의 아르기닌 잔기(친수성 아미노산)로부터 소수성 아미노산과 친수성 아미노산이 번갈아 되도록 도입된다.
도입되는 아미노산의 구체예로는, 예를 들면, 세포 접착 인자로서, REDV, EILDV, YEKPGSPPREVVPRPRPGV, KNNOKSEPLIGRK, YIGSR, RNIAELLKDI, RYVVLPRPVCFEKGMNYTVR, IKVAV, PDSGR, 및 RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열 (예를 들면, GRGDSPASS, RGDN, RGDF, RGDT, RGDA, RGD 및 RGDS) 등; 핵 이행 시그널로서, PPKKKRKV, PAAKRVKLD, PQPKKKP 및 QRKRQK 등; 소포체 이행 시그널로서, MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLTLCEVFQ 등; 미토콘드리아 이행 시그널로서, MLSLRQSIRFFLPATRTLCSSRYLL 등을 들 수 있다. 이들 서열은 단독으로 도입되어도 되고, 복수 서열의 조합으로서 도입되어도 된다. 또한, 도입되는 아미노산 서열과 상기 자기 조직화 펩티드는, 그 사이에 1개 이상의 임의의 아미노산을 통하여 연결되어도 된다.
상기 변형은 그 종류 등에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 행해질 수 있다.
상기 변형 펩티드를 포함하는 수용액은, 역학적 강도가 뛰어난 펩티드 겔을 형성할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서는, 변형 펩티드 수용액 (바람직하게는 0.2∼5w/v%, 더욱 바람직하게는 0.2∼2w/v%, 특히 바람직하게는 0.2∼1w/v%, 가장 바람직하게는 0.3∼0.8w/v%)은, 22℃의 온도 조건 하에서, 선단이 직경 3.2㎜, 곡률 반경 1.6㎜의 구형상인 지그를 이용하여, 0.05㎜/s의 압축 속도로 행한 압축 시험에 있어서, 압축 개시부터 초기 (8∼10초후까지)의 측정치의 근사 직선에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치 L(g/s)이, 바람직하게는 0.03g/s 이상, 더욱 바람직하게는 0.035g/s 이상, 특히 바람직하게는 0.04g/s 이상의 겔을 형성할 수 있다.
D. 펩티드 겔
본 발명의 펩티드 겔은 상기 자기 조직화 펩티드 및/또는 상기 변형 펩티드 (이하, 「상기 자기 조직화 펩티드 및/또는 상기 변형 펩티드」를 「본 발명의 펩티드」로 부르는 경우가 있다)를 포함하는 수용액으로 형성된다. 본 발명의 펩티드가 수용액 중에서 자발적으로 집합하여, 나노미터 스케일의 폭을 가지는 섬유상의 분자 집합체, 소위 나노 파이버를 형성하고, 그 나노 파이버간에 작용하는 정전기적 상호 작용을 주요인으로 하여 3차원 망형상 구조를 형성함으로써, 겔이 형성된다고 추측된다. 그 수용액 중에 포함되는 본 발명의 펩티드는, 1종류만이어도 되고, 2종류 이상이어도 된다. 그 수용액은, 본 발명의 펩티드 및 물에 첨가하여, 임의의 적절한 첨가물을 더 포함할 수 있다. 또한, 그 수용액은 세포 등의 불용물을 포함하고 있어도 된다.
상기 수용액 중에 있어서의 본 발명의 펩티드 농도는, 바람직하게는 0.2∼5w/v%, 더욱 바람직하게는 0.2∼2w/v%, 특히 바람직하게는 0.2∼1w/v%, 가장 바람직하게는 0.3∼0.8w/v%이다. 농도가 이 범위인 경우, 역학적 강도가 뛰어난 펩티드 겔을 수득할 수 있다. 또한, 세포 배양 기재로서 이용한 경우에, 양호한 세포 생존율을 수득할 수 있다.
상기 첨가물은 펩티드 겔의 용도, 포함되는 펩티드의 종류 등에 따라서 적절하게 선택될 수 있다. 첨가물의 구체예로는, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 염산, 인산, 염화수소나트륨, 탄산나트륨 등의 pH조정제; 아미노산류; 비타민 A, 비타민 B군, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 그 유도체 등의 비타민류; 단당, 이당, 올리고당 등의 당류; 히알론산, 키토산, 친수화 셀룰로오스 등의 다당류; 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 등의 알코올류; 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올류; 페놀레드 등의 색소; 호르몬, 사이토카인(조혈 인자, 증식 인자 등), 펩티드 등의 생리 활성 물질; 효소; 항체; DNA; RNA; 그 외 일반적인 저분자 화합물을 들 수 있다. 첨가물은 1종류만 첨가되어도 되고, 2종류 이상 조합하여 첨가되어도 된다. 수용액 중에 있어서의 첨가물의 농도는 목적, 펩티드 겔의 용도 등에 따라서 적절하게 설정될 수 있다.
첨가물을 포함하는 수용액의 구체예로는, 인산 완충화 생리 식염수(PBS), Tris―HCl 등의 각종 완충액, 둘베코(Dulbecco's) 변법 이글(Eagle's) 배지(DMEM) 등의 세포 배양용 배지, 수산화나트륨, 염산, 탄산수소나트륨 등으로 pH를 조정한 수용액을 들 수 있다.
상기 수용액은 목적에 따라 임의의 적절한 pH일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 용해하는 전후에 있어서의 수용액의 pH는, 각각 바람직하게는 5∼9이며, 더욱 바람직하게는 5.5∼8이며, 특히 바람직하게는 6.0∼7.5이다. 이 범위이면, 역학적 강도가 뛰어난 펩티드 겔을 수득할 수 있다. 또한, 상기 수용액이 세포를 포함하는 경우에, 양호한 세포 생존율을 수득할 수 있다. 또한, pH가 이 범위이면, 고온 가압 조건 하에서 펩티드의 분해가 생기기 어려우므로, 오토클레이브 등의 고압 증기 멸균 처리를 실시할 수 있다. 그 결과, 무균 상태의 펩티드 겔을 간편하게 수득할 수 있다.
상기 세포로는, 목적 등에 따라, 임의의 적절한 세포가 선택될 수 있다. 세포는 동물 세포거나, 식물 세포여도 된다. 세포의 구체예로는, 연골 세포, 근아 세포, 골수 세포, 선유아 세포, 간 세포, 심근 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드 겔은 22℃의 온도 조건 하에서, 선단이 직경 3.2㎜, 곡률 반경 1.6㎜의 구형상인 지그를 이용하여, 0.05㎜/s의 압축 속도로 행한 압축 시험에 있어서의, 압축 개시부터 초기 (8∼10초후까지)의 측정치의 근사 직선에 있어서, 바람직하게는 0.03g/s 이상, 더욱 바람직하게는 0.035g/s 이상, 특히 바람직하게는 0.04g/s 이상의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치 L(g/s)을 나타낸다. 상기의 역학적 강도를 가지는 펩티드 겔은, 예를 들면, 본 발명의 펩티드를, 바람직하게는 0.2∼5w/v%, 더욱 바람직하게는 0.2∼2w/v%, 특히 바람직하게는 0.2∼1w/v%, 가장 바람직하게는 0.3∼0.8w/v%의 농도로 포함하는 수용액으로 형성될 수 있다.
본 발명의 펩티드 겔은, 광로 길이 10㎜의 셀 중, 380㎚∼780㎚의 흡광도로 측정한 가시광 투과율이, 바람직하게는 50% 이상이고, 더욱 바람직하게는 70% 이상이며, 특히 바람직하게는 90% 이상이다. 상기의 가시광 투과율을 가지는 펩티드 겔은, 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 0.2∼2w/v%의 농도로 포함하는 수용액으로부터 형성될 수 있다. 또한, 상기 펩티드 겔을, 실온에서 장기간 (예를 들면, 2개월간), 밀봉 상태로 방치한 후의 가시광 투과율의 저하율 (%) (100―(보존 후의 가시광 투과율/보존 전의 가시광 투과율×100))은, 바람직하게는 30% 이하, 더욱 바람직하게는 20% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하이다. 이와 같이 높은 가시광 투과율을 가지는 펩티드 겔은, 세포 배양용 기재로서 이용된 경우에, 형광 현미경 등에 의한 세포 관찰이 용이한 등의 이점을 가진다. 가시광 투과율은, 예를 들면, UV/VIS 측정 장치를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 펩티드 겔은 임의의 적절한 방법에 의해 형성될 수 있다. 대표적으로는, 상기 펩티드 겔은 적어도 1종의 본 발명의 펩티드를 포함하는 수용액을 정치함으로써 형성될 수 있다. 정치할 때의 온도 또는 시간은, 본 발명의 펩티드가 자기 조직화하여 겔을 형성하는 한 특별히 제한은 없고, 겔의 사용 목적, 그 펩티드의 종류, 농도 등에 따라서 적절하게 설정될 수 있다. 정치하는 시간은 통상 1분 이상, 바람직하게는 3분 이상, 보다 바람직하게는 5분 이상이다. 온도는 통상 4∼50℃, 바람직하게는 15∼45℃이다.
E. 자기 조직화 펩티드, 변형 펩티드 및 펩티드 겔의 용도
본 발명의 자기 조직화 펩티드, 변형 펩티드 및 펩티드 겔의 바람직한 용도로는, 예를 들면, 세포 배양용 기재; 스킨케어 용품, 헤어케어 용품 등의 화장품; 욕창 제제, 뼈 충전제, 미용 형성용 주입제, 안과용 수술 보조제, 인공 유리체, 인공 수정체, 관절 윤활제, 점안제, DDS 기재, 지혈제 등의 의약품; 습윤용 보수제(保水劑); 건조제; 콘텍트렌즈 등의 의료기기에 대한 코팅제를 들 수 있다.
F. 세포 배양용 기재
본 발명의 세포 배양 기재는, 상기 자기 조직화 펩티드, 변형 펩티드 및 펩티드 겔의 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 세포 배양 기재는, 화학 합성에 의해 수득되는 자기 조직화 펩티드 및/또는 변형 펩티드로부터 형성되므로, 병원체 등이 혼입하지 않고, 안전한 세포 배양이 가능하다. 또한, 상기 본 발명의 펩티드로부터 형성된 겔은, 중성 영역에서 투명하고, 또한, 역학적 강도가 뛰어나므로, 본 발명의 세포 배양 기재는 세포 배양시의 시인성 및 조작성이 뛰어나다.
상기 세포 배양 기재는, 그 내부에 있어서 본 발명의 펩티드가 자기 조직화하고, 섬유상으로 되어 3차원 그물코 구조를 형성하고 있다. 따라서, 세포 배양 기재 상에서의 배양뿐만 아니라, 세포 배양 기재 중에서의 배양도 가능하다.
세포 배양 기재 상에서 배양하는 경우는, 이미 형성된 본 발명의 펩티드를 포함하는 펩티드 겔 상에 배양 대상의 세포를 올려 배양할 수 있다. 세포 배양 기재 중에서 배양하는 경우는, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 수용액과 세포 또는 세포 현탁액을 혼합하여, 그 혼합물로부터 펩티드 겔을 형성하여 배양할 수 있다.
펩티드 겔의 액상은 용매 치환에 의해 원하는 배양액으로 치환할 수 있다. 용매 치환은, 예를 들면, 상품명 「셀 컬쳐 인서트」등을 이용하여 행해질 수 있다. 펩티드 겔의 상세(펩티드 농도, 수용액(혼합물)이 포함할 수 있는 첨가물의 종류, pH 등) 및 형성 방법은, 상기 D항에서 기재한 대로이다.
배양 대상의 세포는 목적 등에 따라서 임의의 적절한 세포가 선택될 수 있다. 세포는 동물 세포거나, 식물 세포여도 된다. 세포의 구체예로는, 연골 세포, 근아 세포, 골수 세포, 선유아 세포, 간 세포, 심근 세포 등을 들 수 있다. 배양액 및 배양 조건은 배양하는 세포의 종류, 목적 등에 따라서 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 세포 배양용 기재는 생체 적합성 및 안전성이 뛰어나므로, 예를 들면, 재생 의료 분야 등에서의 3차원 세포 배양에 있어서 적합하게 이용될 수 있다.
G. 무균 펩티드의 제조 방법
본 발명의 무균 펩티드의 제조 방법은, 상기 자기 조직화 펩티드 및/또는 변형 펩티드를, 가압 조건 하에서, 100℃ 이상에서 멸균하는 공정을 포함한다. 이들 펩티드는 대표적으로는 펩티드 수용액 또는 그 펩티드 수용액으로부터 형성된 펩티드 겔의 형태로 멸균 처리에 제공된다. 그 펩티드 수용액의 pH는 바람직하게는 5∼9, 더욱 바람직하게는 5.5∼8, 특히 바람직하게는 6.0∼7.5이다. 이러한 pH이면, 100℃ 이상의 온도 조건으로 멸균해도 펩티드 분해가 실질적으로 생기지 않으므로, 무균 상태의 본 발명의 펩티드를 수득할 수 있다. 펩티드 수용액 및 펩티드 겔에 대해서는, 상기 D항의 기재대로이다.
멸균 방법으로는, 임의의 적절한 멸균 방법이 채용될 수 있다. 예를 들면, 고온 고압의 포화 수증기에 의한 멸균 (소위, 오토클레이브 멸균) 방법이 바람직하게 이용될 수 있다. 오토클레이브 멸균 시의 압력은 바람직하게는 0.122∼0.255MPa, 더욱 바람직하게는 0.152∼0.233Mpa이다. 또한, 멸균 온도는 바람직하게는 105∼135℃, 더욱 바람직하게는 110∼125℃이다. 또한, 멸균 시간은 바람직하게는 1∼60분, 더욱 바람직하게는 3∼40분, 특히 바람직하게는 5∼30분이다.
오토클레이브 멸균은 시판의 오토클레이브 장치를 이용하여 행할 수 있다.
H. 펩티드 겔로 코팅된 물품의 제조 방법
본 발명의 펩티드 겔로 코팅된 물품의 제조 방법은, 상기 펩티드 겔을 동결하는 공정(동결 공정), 동결물을 융해하여 펩티드 졸을 수득하는 공정(융해 공정), 코팅 대상 물품 표면의 적어도 일부를 상기 펩티드 졸로 코팅하는 공정(코팅 공정), 및 상기 펩티드 졸로부터 펩티드 겔을 재형성하는 공정(겔화 공정)을 포함한다. 그 방법은, 필요에 따라, 임의의 공정을 더 포함해도 된다. 본 발명의 펩티드 겔을 동결 융해함으로써, 펩티드 분자간의 결합이 절단되어 겔을 구성하는 3차원 그물코 구조가 붕괴되므로, 펩티드 분자가 수용액 중에 균일하게 분산된 졸을 수득할 수 있다. 이 균일성이 높은 졸로 코팅 대상 물품 표면의 적어도 일부를 코팅하고나서 그 졸을 겔화함으로써, 그 물품의 표면을 펩티드 겔로 균일하게 코팅할 수 있다.
H―1. 동결 공정
동결 조건은, 펩티드 겔이 동결하는 한에 있어서, 임의의 적절한 조건이 채용될 수 있다. 동결 온도는, 펩티드 겔이 동결하는 온도 이하이면 된다. 동결 속도에도 제한은 없고, 서서히 냉동해도 되고, 급속 냉동해도 된다. 예를 들면, 펩티드 겔을 －10℃ 이하의 온도 조건 하에 둠으로써 적합하게 동결시킬 수 있다.
동결 수단으로는, 가정용 또는 업무용 냉동고, 액체 질소 등의 임의의 적절한 동결 수단이 선택될 수 있다. 또한, 동결한 펩티드 겔은, 융해 공정에 제공할때까지의 임의의 기간, 동결한 채로 보존하는 것이 가능하다.
동결되는 펩티드 겔이 첨가물을 포함하는 펩티드 수용액으로부터 형성된 겔인 경우, 그 첨가물의 농도는 겔화 공정에 있어서의 겔의 재형성에 악영향을 끼치지 않는 농도인 것이 바람직하다. 그 농도는 펩티드의 종류, 농도 등에 따라, 적절하게 설정될 수 있는데, 통상 낮은 농도인 것이 바람직하다. 예를 들면, HEPES 및 Tris―HCl용액의 경우, 그 최종 농도는 바람직하게는 50mM 이하, 더욱 바람직하게는 40mM 이하이다. 탄산수소나트륨 용액 및 탄산나트륨 용액의 경우, 그 최종 농도는 바람직하게는 5mM 이하, 더욱 바람직하게는 4mM 이하이다. PBS 용액의 경우, 그 최종 농도는 바람직하게는 0.5×PBS 이하, 더욱 바람직하게는 0.3×PBS 이하이다. 또한, 약전 생리 식염수의 경우, 최종 농도는 바람직하게는 0.5중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.4중량% 이하이다.
H―2. 융해 공정
융해 온도는, 상기 동결 공정에서 수득된 동결물이 융해하여 졸을 형성하는 온도이면, 임의의 적절한 온도로 설정될 수 있다. 일정한 온도로 융해해도 되고, 다른 온도로 단계적으로 융해해도 된다. 융해 속도 및 시간에 제한은 없고, 서서히 융해해도 되고, 급속히 융해해도 된다. 예를 들면, 5∼70℃, 바람직하게는 15∼45℃의 온도 조건 하에 동결한 펩티드 겔을 둠으로써 적합하게 융해를 행할 수 있다.
융해 수단으로는, 임의의 적절한 수단이 선택될 수 있다. 융해 수단의 구체 예로서는, 수욕(水浴), 유욕(油浴), 항온조 등을 들 수 있다.
상기와 같이 펩티드 겔을 동결 융해함으로써, 겔을 형성하는 펩티드 분자간의 다양한 결합이 절단되어, 졸이 수득된다. 동결 융해에 의해 수득된 졸에 있어서는, 펩티드 분자간의 다양한 결합이 충분히 절단되어 점도가 현저하게 저하하고 있으므로, 용이하게 코팅 대상 물품의 표면을 균일하게 코팅할 수 있다. 또한, 졸의 균일성을 보다 높게 하는 관점에서, 졸 내에 기포가 발생하지 않는 정도로 진동을 주면서 동결한 펩티드 겔을 융해해도 되고, 또한, 수득된 졸에 진동을 주고나서 코팅 공정에 제공해도 된다. 진동을 주는 방법으로는, 동결한 펩티드 겔 또는 졸을 흔드는 것, 이들에 초음파를 조사하는 것 등을 들 수 있다.
H―3. 코팅 공정
코팅하는 방법으로는, 임의의 적절한 방법이 채용될 수 있다. 구체예로는, 디스펜서 도포 방식, 침지 방식, 바 코터 방식, 원심력에 의해 졸을 코팅 대상 물품의 표면에 전개하는 방식, 코팅 대상 물품을 기울임으로써 졸을 유동시켜 코팅 대상 물품의 표면에 전개하는 방식을 들 수 있다. 상기 졸에 있어서는, 펩티드 분자간의 다양한 결합이 충분히 절단되어 점도가 현저하게 저하하고 있고, 또한, 펩티드 분자가 충분히 분산되어 있으므로, 코팅 대상 물품의 표면에 균일한 층을 형성할 수 있다.
코팅 대상 물품으로는, 임의의 적절한 물품이 채용될 수 있다. 예를 들면, 튜브, 보틀 등의 용기, 멀티 웰 디쉬(multi-well dish), 샬레 등의 세포 배양 기구, 슬라이드 글래스 등의 플레이트를 들 수 있다. 코팅 대상 물품은, 유리, 플라스틱, 금속 등의 임의의 재료로 형성되어 있다.
H―4. 겔화 공정
겔의 재형성 조건(온도, 시간 등)은, 펩티드 겔이 재형성되는 한 제한은 없고, 펩티드의 종류 및 농도 등에 따라서 적절하게 설정될 수 있다. 본 발명의 펩티드는, 자기 조직화능을 가지므로, 적절한 조건으로 설정함으로써, 자기 집합하여 겔을 자발적으로 재형성할 수 있다.
겔의 재형성 조건으로는, 예를 들면, 상기 펩티드 졸로 표면이 코팅된 물품을 정치하면 된다. 정치 온도는 바람직하게는 15℃ 이상, 더욱 바람직하게는 25∼45℃이다. 정치 시간은 바람직하게는 1분 이상, 더욱 바람직하게는 5분 이상이다.
그 겔화 공정에 있어서 재형성된 펩티드 겔의 두께, 즉, 물품 표면의 코팅막 두께는, 예를 들면, 1㎛ 이상일 수 있고, 바람직하게는 1㎛∼1㎝일 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
Fmoc 고상 합성법에 의해, 표 1에 기재된 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 자기 조직화 펩티드를 합성했다. 이어서, 상법에 의해, N 말단을 아세틸화하고, C 말단을 아미드화하여, 변형 펩티드 1 ([CH3CO]－RLDLRLALRLDLR－[NH2])을 수득하였다.
수득된 변형 펩티드(1)를 0.2, 0.4 및 0.6w/v%가 되도록, 각각 0.1중량% 탄산수소나트륨 용액에 용해하여 펩티드 용액을 수득하였다. 수득된 펩티드 용액을, pH시험지 (상품명: pH Indicator Papers, Whatman International Ltd. 제, 측정 범위 pH＝6.0∼8.1, Cat. No. 2629990)를 이용하여 pH값을 측정한 바, pH는 6.9∼7.8의 범위 내였다. 그 펩티드 용액을 상품명 「Nunc Tissue Culture Inserts」(멤브레인 직경: 10㎜, 포어 사이즈: 8.0㎛, 멤브레인 소재: 폴리카보네이트) (Nalge Nunc International사 제, 제품번호 「Cat. No: 136862」)에 300μl 넣고, 22℃에서 2시간 정치함으로써, 겔을 형성했다. 겔의 두께는 약 2㎜였다. 수득된 겔을 DMEM에서 12시간 용매 치환을 행함으로써, 0.2, 0.4 및 0.6w/v%의 펩티드 겔(1) (액상: DMEM)을 수득하였다. 수득된 각 농도의 펩티드 겔(1)을 이하의 압축 시험에 제공하여, 역학적 강도를 측정했다.
[압축 시험]
22℃의 조건 하, 선단이 구형상 (직경: 3.2㎜, 곡률 반경: 1.6㎜)인 스테인리스 스틸 제 지그 (티·에이·인스트루먼트사 제)를 부착한 점탄성 측정 장치 (티·에이·인스트루먼트사 제, 제품번호 「RSA III」)을 이용하여, 0.05㎜/s(s＝초)의 속도로 겔을 압축함으로써, 역학적 강도를 측정했다.
압축 시험의 결과를 도 2에 도시한다. 도 2는 지그를 샘플에 가압했을 시에 장치에 걸리는 하중과 시간의 관계를 나타내고, 근사 직선의 경사가 클수록 역학적 강도가 높아진다. 따라서, 압축 개시부터 초기 (8∼10초후까지) 측정치의 근사 직선의 경사(단위 시간당 하중의 변화량)의 절대치를 L로 한 경우, L의 값이 클수록 역학적 강도가 높아진다. 도 2에 도시되는 바와 같이, 0.4w/v%의 펩티드 겔(1)의 상기 압축 시험에서의 압축 개시부터 약 10초후까지의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치(L)는 0.0476g/s였다.
0.4w/v%의 펩티드 겔(1)을 핀셋에 끼워 운반한 바, 도 3(a)에 도시하는 바와 같이, 그 펩티드 겔(1)은 끼워 지지하기 위한 충분한 강도를 가지고 있고, 조작성이 뛰어났다.
[실시예 2]
서열 번호 1의 아미노산 서열 대신에 서열 번호 2의 아미노산 서열을 채용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여, 변형 펩티드(2) ([CH3CO]―RLDLRLLLRLDLR― [NH2])를 수득하였다. 변형 펩티드(1) 대신에 변형 펩티드(2)를 이용한 것 이외는 실시 예 1과 동일하게 하여 0.2, 0.4 및 0.6w/v%의 펩티드 겔(2) (액상: DMEM)을 형성했다.
수득된 펩티드 겔에 대해서, 실시예 1과 동일하게 하여 역학적 강도를 측정했다. 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 0.4w/v%의 펩티드 겔(2)의 상기 압축 시험에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치(L)는 0.0423g/s였다.
0.4w/v%의 펩티드 겔(2)을 핀셋에 끼워 운반한 바, 도 3(b)에 도시하는 바와 같이, 그 펩티드 겔(2)은 끼워 지지하기 위한 충분한 강도를 가지고 있고, 조작성이 뛰어났다.
[실시예 3]
서열 번호 1의 아미노산 서열 대신 서열 번호 3의 아미노산 서열을 채용한 것이외는 실시예 1과 동일하게 하여, 변형 펩티드 3 ([CH3CO]―RLDLRLALRLDLRL―[NH2])을 수득하였다. 변형 펩티드(1) 대신에 변형 펩티드(3)를 이용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 0.2 및 0.4w/v%의 펩티드 겔(3) (액상: DMEM)을 형성했다.
수득된 펩티드 겔에 대해서, 실시예 1과 동일하게 하여 역학적 강도를 측정했다. 결과를 도 5에 도시한다. 도 5에 나타나는 바와 같이, 0.4w/v%의 펩티드 겔(3)의 상기 압축 시험에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치(L)는 0.0336g/s였다.
[비교예 1]
서열 번호 1의 아미노산 서열 대신에 서열 번호 4의 아미노산 서열을 채용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여, 변형 펩티드(c1) ([CH3CO]―RASARADARADARASA―[NH2])을 수득하였다. 변형 펩티드(1) 대신에 변형 펩티드(c1)를 이용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 0.2, 0.4 및 0.6w/v%의 펩티드 겔(c1) (액상: DMEM)을 형성했다.
수득된 펩티드 겔에 대해서, 실시예 1과 동일하게 하여 역학적 강도를 측정했다. 결과를 도 6에 도시한다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 0.4w/v%의 펩티드 겔(c1)의 상기 압축 시험에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치(L)는 0.0143g/s였다.
0.4w/v%의 펩티드 겔(c1)을 핀셋에 끼워 운반한 바, 도 3(c)에 도시하는 바와 같이, 그 펩티드 겔(c1)은 역학적 강도가 불충분하고, 조작성의 점에서 문제가 있었다.
[비교예 2]
서열 번호 1의 아미노산 서열 대신에 서열 번호 5의 아미노산 서열을 채용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여, 변형 펩티드(c2) ([CH3CO]―RASARADARASARADA―[NH2])을 수득하였다. 변형 펩티드(1) 대신에 변형 펩티드(c2)를 이용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 0.2 및 0.4w/v%의 펩티드 겔(c2) (액상: DMEM)을 형성했다.
수득된 펩티드 겔에 대해서, 실시예 1과 동일하게 하여 역학적 강도를 측정했다. 결과를 도 7에 도시한다. 도 7에 나타내는 바와 같이, 0.4w/v%의 펩티드 겔(c2)의 상기 압축 시험에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치(L)는 0.0167g/s였다.
[실시예 4]
서열 번호 1의 아미노산 서열 대신에 서열 번호 12의 아미노산 서열을 채용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여, 변형 펩티드(4) ([CH3CO]―RGDNRLDLRLALRLDLR―[NH2])를 수득하였다. 변형 펩티드(1) 대신에 변형 펩티드(4)를 이용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 0.2, 0.4 및 0.6w/v%의 펩티드 겔(4) (액상: DMEM)을 형성했다.
수득된 펩티드 겔에 대해서, 실시예 1과 동일하게 하여 역학적 강도를 측정했다. 결과를 도 8에 도시한다. 도 8에 나타내는 바와 같이, 0.4w/v%의 펩티드 겔(4)의 상기 압축 시험에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치(L)는 0.0618g/s였다.
Figure 112011076765434-pct00001
도 2 및 4∼8에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 비교예의 자기 조직화 펩티드에 비해 높은 역학적 강도를 가지는 펩티드 겔을 형성할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, 도 3에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 펩티드 겔은 높은 역학적 강도를 가지므로, 조작성이 매우 뛰어난 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 낮은 펩티드 농도로 충분한 역학적 강도의 펩티드 겔을 형성할 수 있으므로, 비용적으로도 유리하다.
[실시예 5]
마우스 근아 세포(L6)를 2.0×106cells/ml의 세포 농도로 포함하는 세포 현탁액과, 상기 변형 펩티드(1)를 1.0w/v%로 포함하는 펩티드 수용액을, 용적비 3:2 (세포 현탁액:펩티드 수용액)로 혼합했다. 수득된 혼합물 (세포 농도: 1.2×106cells/ml, 펩티드 농도: 0.4w/v%)을 셀 컬쳐 인서트 (BD Falcon사 제, 제품번호 「353096」)에 넣어서 실온에서 약 1분간 정치함으로써, 펩티드 겔을 형성시켰다. 그 겔을 셀 컬쳐 인서트마다 1mL의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배지가 들어간 조직 배양용 24웰 플레이트 (AGC 테크노 글래스사 제, 제품 번호 「3820-024」)의 웰에 셋팅했다. 이어서, 5% CO2 존재 하에서 37℃ 인큐베이터로 세포 배양을 행했다. 배지 교환은 배양 개시부터 2일 후에 한 번만 행했다. 배양 개시부터, 1, 2 및 4일 후에 겔을 꺼내고, 상품명 「CyQUANT(등록상표) Cell Proliferation Assay Kit *for cells in culture* *1000 assays*」(인비트로젠사 제, 제품번호 「C7026」)을 이용하여 DNA 정량을 행하여, 세포 증식률을 산출했다. 세포 증식률은, 배양 개시 직후를 100%로 한 경우에, 1일 후에는 150%, 2일 후에는 180%, 4일 후에는 310%이며, 일수의 경과에 따라 세포수가 증가했다 (산출 결과는 n＝3의 평균).
[실시예 6]
변형 펩티드(1) 대신에 변형 펩티드(2)를 이용한 것 이외는 실시예 5와 동일하게 하여, 세포 배양 및 DNA 정량을 행했다. 세포 증식률을 산출한 바, 세포 증식률은, 배양 개시 직후를 100%로 한 경우에, 1일 후에는 140%, 2일 후에는 160%, 4일 후에는 250%이며, 일수의 경과에 따라 세포수가 증가했다 (산출 결과는 n＝3의 평균).
[실시예 7]
상기 변형 펩티드(1)를 탄산나트륨 용액에 용해하여, 0.5w/v%의 펩티드 수용액 (탄산나트륨의 최종 농도: 2.75mM)을 조제했다. 그 펩티드 수용액에 오토클레이브 장치 (산요덴키사 제, 제품번호 「MLS3020」)를 이용하여, 121℃, 20분의 멸균 처리를 행하여, 펩티드 겔을 수득하였다. 그 겔과 마우스 NIH3T3 세포를 DMEM 배지에 현탁한 세포 현탁액을, 용적비 2:1 (겔:세포 현탁액)로 피페팅에 의해 균일하게 되도록 혼합했다. 수득된 세포―겔 혼합물을 셀 컬쳐 인서트 (BD Falcon사 제, 제품번호 「353096」) 5개에 100μL씩 첨가하고, 그 셀 컬쳐 인서트를 1mL의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배지가 들어간 조직 배양용 24웰 플레이트 (AGC 테크노 글래스사 제, 제품번호 「3820―024」)의 웰에 셋팅했다. 이때, 세포―겔 혼합물 중의 세포 농도는 1.45×105cell/100μL였다. 이어서, 5% CO2 존재 하에서 37℃ 인큐베이터로 세포 배양을 행했다. 배양 개시부터 0일 후 (2시간 후), 1일 후, 3일 후, 및 5일 후에 상품명 「Cell Counting Kit 8」(도진도카가쿠사 제)을 사용하여 세포 증식률을 측정했다. 그 결과, 도 9에 도시하는 바와 같이, 배양 일수의 경과에 따라 세포 증식률이 증가했다.
상기 세포 증식률 측정의 구체적인 순서는 다음과 같다. 즉, 웰 내의 배지 1mL을 새로운 배지 1mL로 교환하여, Cell Counting Kit 8 용액 100μL을 첨가하고, 그 웰 내에 셀 컬쳐 인서트를 넣어 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 인큐베이트 후, 셀 컬쳐 인서트 내의 겔 상에 침투한 배지 100μL을 96웰 플레이트에 옮기고, 플레이트 리더를 이용하여 450㎚에 있어서의 그 배지의 흡광도를 측정했다. 배양 개시부터 0일 후의 샘플의 흡광도를 100으로 하여 각 배양 일수에 있어서의 세포 증식률을 구했다.
실시예 5∼7의 결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 펩티드 겔은 생체 적합성을 가지고 있어, 세포 배양용 기재로서 적합하게 사용될 수 있다.
[실시예 8]
상기 변형 펩티드(1)를 탄산나트륨 용액에 용해하여, 0.5w/v%의 펩티드 수용액 (탄산나트륨의 최종 농도: 4.5mM)을 조제했다. 그 펩티드 수용액의 pH는, 중성 영역이었다. 그 펩티드 수용액에 오토클레이브 장치 (산요덴키사 제, 제품번호 「MLS3020」)를 이용하여 121℃, 20분의 멸균 처리를 행했다. 멸균 처리 전후의 펩티드 수용액에 포함되는 펩티드 분자의 질량을 비행 시간형 질량 분석 장치 (Bruker사 제, 제품번호 「autoflexIII」)를 이용하여, 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행 시간형 질량 분석법 (MALDI―TOF―MS)에 의해 조사했다. 결과를 도 10에 나타낸다.
[비교예 3]
변형 펩티드(1)의 펩티드 수용액 대신에 상품명 「PuraMatrixTM」(쓰리·디·매트릭스사 제)을 이용한 것 이외는 실시예 8과 동일하게 하여 멸균 처리 및 질량 분석 (MALDI―TOF―MS)을 행했다. 결과를 도 11에 도시한다.
도 10에 도시하는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 멸균 처리에 의해 실질적으로 분해되지 않는다. 따라서, 본 발명의 펩티드에 멸균 처리를 행함으로써, 무균 상태로 할 수 있다. 한편, 도 11에 도시하는 바와 같이, 상품명 「PuraMatrixTM」 (쓰리·디·매트릭스사 제)은, 멸균 처리에 의해 펩티드의 분해가 발생하는 것을 알 수 있다. 이는, 상품명 「PuraMatrixTM」(쓰리·디·매트릭스사 제)가 산성의 펩티드 수용액이기 때문으로 추측된다.
[실시예 9]
상기 변형 펩티드(1)를 탄산나트륨 용액에 용해하여, 0.8w/v%의 펩티드 수용액 (탄산나트륨의 최종 농도: 4.5mM)을 조제했다. 수득된 펩티드 수용액을 22℃에서 2시간 정치하여 펩티드 겔을 형성했다. 그 겔을 무조작으로 유리제 샬레(φ6cm)에 옮겼다. 이 때의 사진을 도 12(a)에 도시한다. 도 12(a)에 나타내는 바와 같이, 겔에는 기포가 들어가 있고, 단단하기 때문에 샬레를 균일하게 코팅할 수 없었다.
상기 샬레를 겔마다 －20℃의 냉동고에 넣어서 겔을 동결시켰다. 동결한 겔의 사진을 도 12(b)에 도시한다. 그 후, 샬레를 냉동고로부터 꺼내, 실온 조건 하에서 샬레를 흔들면서 겔을 융해하고, 수득된 졸을 샬레의 저면 전체적으로 전개했다. 이 상태에서 샬레를 정치함으로써, 겔을 재형성시켰다. 이에 따라, 펩티드 겔로 저면 전체가 균일하게 코팅된 샬레를 수득하였다. 그 샬레의 사진을 도 12(c)에 도시한다.
[실시예 10]
유리제 샬레 대신에 슬라이드 글래스를 이용한 것 이외는 실시예 9와 동일하게 하여, 펩티드 겔이 표면 전체적으로 균일하게 코팅된 슬라이드 글래스를 수득하였다. 겔을 슬라이드 글래스에 옮겼을 때의 사진, 동결한 겔의 사진, 및 펩티드 겔로 표면 전체가 균일하게 코팅된 슬라이드 글래스의 사진을 각각, 도 13의 (a), (b) 및 (c)에 도시한다.
본 발명의 자기 조직화 펩티드 등은 재생 의료, 약물 전달 시스템, 화장품, 인공 유리체, 지혈제, 미용 정형용 주사제, 뼈 충전, 관절 윤활제, 습윤용 보수재 등에 적용될 수 있다.
<서열표 프리텍스트>
서열번호 1은 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 2는 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 3은 본 발명의 변형 펩티드이다.
서열번호 4는 본 발명의 자기 조직화 펩티드가 아닌 펩티드이다.
서열번호 5는 본 발명의 자기 조직화 펩티드가 아닌 펩티드이다.
서열번호 6은 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 7은 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 8은 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 9는 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 10은 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 11은 본 발명의 자기 조직화 펩티드이다.
서열번호 12는 본 발명의 변형 펩티드이다.
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Claims (16)

  1. RLDLRLALRLDLR (서열 번호 1), RLDLRLLLRLDLR (서열 번호 2), RADLRLALRLDLR (서열 번호 6), RLDLRLALRLDAR (서열 번호 7), RADLRLLLRLDLR (서열 번호 8), RADLRLLLRLDAR (서열 번호 9), RLDLRALLRLDLR (서열 번호 10) 또는 RLDLRLLARLDLR (서열 번호 11)의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인, 자기 조직화 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, RLDLRLALRLDLR (서열 번호 1) 또는 RLDLRLLLRLDLR (서열 번호 2)의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인, 자기 조직화 펩티드.
  3. 청구항 1에 기재된 자기 조직화 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에, 임의의 소수성 아미노산 잔기가 한 개 부가되어 있고, 자기 조직화능을 가지는, 변형 펩티드.
  4. 청구항 1에 기재된 자기조직화 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에, GRGDSPASS, RGDN, RGDF, RGDT, RGDA, RGD 또는 RGDS가 부가되어 있고, 자기 조직화능을 가지는, 변형 펩티드.
  5. 청구항 1에 기재된 자기 조직화 펩티드;
    청구항 1에 기재된 자기 조직화 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에, 임의의 소수성 아미노산 잔기가 한 개 부가되어 있고, 자기 조직화능을 가지는, 변형 펩티드; 또는
    청구항 1에 기재된 자기조직화 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에, GRGDSPASS, RGDN, RGDF, RGDT, RGDA, RGD 또는 RGDS가 부가되어 있고, 자기 조직화능을 가지는, 변형 펩티드
    의 N 말단 아미노기 및 C 말단 카르복실기 중 어느 하나 이상이 보호된 펩티드이며, 자기 조직화능을 가지는, 변형 펩티드.
  6. 청구항 1에 기재된 자기 조직화 펩티드;
    청구항 1에 기재된 자기 조직화 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에, 임의의 소수성 아미노산 잔기가 한 개 부가되어 있고, 자기 조직화능을 가지는, 변형 펩티드;
    청구항 1에 기재된 자기 조직화 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에, GRGDSPASS, RGDN, RGDF, RGDT, RGDA, RGD 또는 RGDS가 부가되어 있고, 자기 조직화능을 가지는, 변형 펩티드; 및
    청구항 5에 기재된 변형 펩티드
    중 어느 하나 이상을 포함하는 수용액으로 형성되는, 펩티드 겔.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 수용액이 첨가물을 더 포함하는, 펩티드 겔.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 첨가물이 pH 조정제, 아미노산류, 비타민류, 당류, 다당류, 알코올류, 다가 알코올류, 색소, 생리 활성 물질, 효소, 항체, DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인, 펩티드 겔.
  9. 청구항 6에 있어서, 22℃의 온도 조건 하에서, 선단이 직경 3.2㎜, 곡률 반경 1.6㎜의 구형상인 지그를 이용하여, 0.05㎜/s의 압축 속도로 행한 압축 시험에 있어서, 압축 개시부터 8∼10초 후까지의 측정치의 근사 직선에 있어서의 단위 시간당 하중의 변화량의 절대치 L(g/s)이 0.03g/s 이상인, 펩티드 겔.
  10. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 자기 조직화 펩티드, 및 청구항 3 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 변형 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 세포 배양용 기재.
  11. 청구항 6 에 기재된 펩티드 겔을 포함하는, 세포 배양용 기재.
  12. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 자기 조직화 펩티드; 및
    청구항 3 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 변형 펩티드
    중 어느 하나 이상을, 가압 조건 하에서, 100℃℃ 이상에서 멸균하는 공정을 포함하는, 무균 펩티드의 제조 방법.
  13. 청구항 6에 기재된 펩티드 겔을 동결하는 공정,
    동결물을 융해하여 펩티드 졸을 수득하는 공정,
    코팅 대상 물품 표면의 적어도 일부를 상기 펩티드 졸로 코팅하는 공정, 및
    상기 펩티드 졸로부터 펩티드 겔을 재형성하는 공정
    을 포함하는, 펩티드 겔로 코팅된 물품의 제조 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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