JP2016020323A - 神経再生足場材料用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】より生体安全性が高く、脊髄等の中枢神経をも再生可能な神経再生足場材料を提供すること。【解決手段】本発明の神経再生足場材料は、自己組織化ペプチドを含み、該自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷の総和が０を超えて＋５以下である【選択図】なし

Description

本発明は、神経再生足場材料用組成物に関する。より詳細には、自己組織化ペプチドを含む神経再生足場材料用組成物に関する。

日本では、毎年５０００人以上の患者が脊髄損傷を来たしており、麻痺を抱えたままの生活を余儀なくされている。麻痺による肉体的、精神的、経済的負担による影響は、個人だけではなく、社会に極めて大きいものである。近年、損傷神経を再生する様々な試みが提案されている（特許文献１および特許文献２）。例えば、ＥＳ細胞やＩＰＳ細胞を含む神経幹細胞、骨髄幹細胞、シュワン細胞、歯髄幹細胞治療では、神経栄養因子、および、神経再生抑制因子阻害剤を併用することが神経再生に有効であることが明らかとなっている。そのため、脊髄損傷後の再生医療にこれらを適用することへの期待が高まっている。

しかしながら、中枢神経の再生には様々な阻害要因が存在するため、神経再生の際に効果的に軸索伸長を行うことが困難である。例えば、脊髄の損傷部位周辺では、神経修復の結果としてグリア瘢痕が形成され、これにより物理的に軸索伸長が阻害されると考えられる。さらに、脳や脊髄等の白質にはそもそもミエリン関連糖タンパク（ＭＡＧ）やＮｏｇｏ−Ａ等の軸索伸長を阻害する物質が存在することに加え、損傷部周辺ではＮＧ２等のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンや、テネイシン等の阻害因子が存在することが確認されている。このような、阻害要因を抑制することができ、中枢神経をも効果的に再生可能な神経再生足場材料が求められている。

特表２０１１−５１２３２２号公報 特表２０１３−５３３０９３号公報

本発明は、より生体安全性が高く、脊髄等の中枢神経をも再生可能な神経再生足場材料用組成物および該組成物を用いた神経再生足場材料を提供することを目的とする。

本発明によれば、神経再生足場材料用組成物が提供される。本発明の神経再生足場材料用組成物は、自己組織化ペプチドを含み、該自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷の総和が０を超えて＋５以下である。
１つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドは、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである。
アミノ酸配列：ａ_１ｂ_１ｃ_１ｂ_２ａ_２ｂ_３ｄｂ_４ａ_３ｂ_５ｃ_２ｂ_６ａ_４
（該アミノ酸配列中、ａ_１〜ａ_４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ_１〜ｂ_６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ_１およびｃ_２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
１つの実施形態において、上記神経再生足場材料用組成物は神経栄養因子をさらに含む。
１つの実施形態において、上記神経再生足場材料用組成物は神経再生抑制因子阻害剤をさらに含む。
本発明の別の局面によれば、神経再生足場材料が提供される。本発明の神経再生足場材料は、上記神経再生足場材料用組成物を含む。

本発明によればより生体安全性が高く、脊髄等の中枢神経をも再生可能な神経再生足場材料用組成物が提供される。本発明の神経再生足場材料用組成物は、中性領域、すなわち生体内に近いｐＨ条件（ｐＨ７．０付近）において、神経再生足場材料用組成物に含まれる自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷の総和が０を超えて＋５以下である。これにより、本発明の神経再生足場材料は、生体内環境で十分な強度および細胞接着性を発揮することができる。そのため、高い生体安全性の確保と、効果的な神経再生とを両立することができる。

中枢神経系では様々な軸索伸長の阻害要因が働くため、効果的な神経再生が困難である。しかしながら、本発明の神経再生足場材料によれば、阻害要因を抑制するための添加剤を含まない場合であっても、中枢神経系における軸索伸長の阻害要因の働きを抑制し、効果的な軸索伸長を行うことができる。具体的には、本発明の神経再生足場材料は、グリア瘢痕の形成自体を抑制することができ、神経再生を促進することができる。また、神経成長因子であるＮＧＦは炎症にも関連することが知られている。本発明の神経再生足場材料は、炎症を抑制することも可能であり、脊髄損傷後の複雑な回復過程において、抗炎症作用をも発揮し得る。

細胞培養試験における２日後および７日後のＢＮＤＦ、ＮＧＦ、および、ＴｒｋＡの発現量を示すグラフである。 細胞培養試験における２日後および７日後のＭＭＰ−３、および、ＭＭＰ−９の発現量を示すグラフである。 マウス投与試験における７日後、１４日後、および、２８日後のＮＴ−３、ＧＤＮＦ、ＴｒｋＣ、および、ｐ７５の発現量を示すグラフである。 マウス投与試験における７日後、１４日後、および、２８日後のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９の発現量を示すグラフである。 マウス投与試験における投与１４日後の脊髄組織のＨＥ染色写真である。 マウス投与試験における投与２８日後の脊髄組織のＨＥ染色写真である。 マウス投与試験における投与１４日後および２８日後の脊髄組織のＣｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ４染色写真である。 マウス投与試験における投与１４日後および２８日後の脊髄組織のＩｂａ１染色写真である。 マウス投与試験における投与１４日後および２８日後の脊髄組織のＧＦＡＰ染色写真である。

［Ａ．神経再生足場材料用組成物］
本発明の神経再生足場材料用組成物は、自己組織化ペプチドを含む。本発明の神経再生足場材料用組成物に含まれる自己組織化ペプチドは、該自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷の総和が０を超えて＋５以下であり、好ましくは＋１〜＋３である。自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷が上記の範囲内であることにより、生体内環境で十分な強度および細胞接着性を発揮することができ、より生体安全性が高く、より効率的に神経再生が可能な神経再生足場材料用組成物とすることができる。中性領域において自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の側鎖に由来するプラス電荷とマイナス電荷とが相殺されないことにより、ゲル形成に適した静電的引力及び斥力のバランスが保たれ、その結果として、中性領域で透明かつ安定なゲルを形成し得るからである。上記自己組織化ペプチドの電荷は、例えば、レーニンジャー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９７９〕の方法に従って算出され得る。レーニンジャーの方法は、例えば、ＥＭＢＬ ＷＷＷ Ｇａｔｅｗａｙ ｔｏ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｐｏｉｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ／ｐｉ−ｗｒａｐｐｅｒ．ｐｌ）上で利用可能なプログラムにより行なわれ得る。なお、本明細書において、「中性領域」とは、ｐＨ５．０〜８．０、好ましくはｐＨ５．５〜７．５、より好ましくはｐＨ６．０〜７．０、さらに好ましくはｐＨ７．０の領域をいう。

［Ａ−１．自己組織化ペプチド］
自己組織化ペプチドとしては、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合してゲルを形成し得る任意の適切なペプチドが用いられ得る。より具体的には、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状分子集合体を形成し、当該分子集合体間の相互作用により三次元網目構造を発達させてゲルを形成し得るペプチドが好ましく用いられ得る。ペプチド分子同士の相互作用としては、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用および疎水性相互作用が挙げられる。

自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であってもよく、Ｄ−アミノ酸であってもよい。好ましくはＬ−アミノ酸である。また、天然アミノ酸であってもよく、非天然アミノ酸であってもよい。低価格で入手可能であり、ペプチド合成が容易であることから、好ましくは天然アミノ酸である。

本発明に好ましく使用され得る自己組織化ペプチドの具体例としては、下記の式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
ａ_１ｂ_１ｃ_１ｂ_２ａ_２ｂ_３ｄｂ_４ａ_３ｂ_５ｃ_２ｂ_６ａ_４ （Ｉ）
（上記アミノ酸配列中、ａ_１〜ａ_４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ_１〜ｂ_６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ_１およびｃ_２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）

上記アミノ酸配列中、ａ_１〜ａ_４は、塩基性アミノ酸残基である。塩基性アミノ酸は、好ましくはアルギニン、リシン、またはヒスチジンであり、より好ましくはアルギニンまたはリシンである。これらのアミノ酸は、塩基性が強いからである。ａ_１〜ａ_４は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。

上記アミノ酸配列中、ｂ_１〜ｂ_６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基である。疎水性アミノ酸は、好ましくはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、またはプロリンである。非電荷極性アミノ酸は、好ましくはチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、またはシステインである。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。

好ましくは、ｂ_３およびｂ_４は、それぞれ独立して任意の適切な疎水性アミノ酸残基であり、さらに好ましくはロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、特に好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。

好ましくは、ｂ_１〜ｂ_６はすべて疎水性アミノ酸残基である。自己組織化ペプチドが好適にβシート構造を形成し、自己組織化し得るからである。より好ましくは、ｂ_１〜ｂ_６は、それぞれ独立してロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、さらに好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。好ましい実施形態においては、ｂ_１〜ｂ_６のうちの４個以上がロイシン残基であり、より好ましくはそのうちの５個以上がロイシン残基であり、さらに好ましくは全てがロイシン残基である。

上記アミノ酸配列中、ｃ_１およびｃ_２は、酸性アミノ酸残基である。酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。ｃ_１およびｃ_２は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。

上記アミノ酸配列中、ｄは、疎水性アミノ酸残基である。ｄは、好ましくはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、またはイソロイシン残基である。

１つの好ましい実施形態においては、ｂ_３、ｄ、ｂ_４の連続する３つのアミノ酸残基のうち２つがロイシン残基であり、残りがアラニン残基である。この場合、ｂ_３、ｄ、ｂ_４のいずれがアラニン残基であってもよい。また、別の好ましい実施形態においては、ｂ_３、ｄ、ｂ_４の連続する３つのアミノ酸残基がすべてロイシン残基である。

式（Ｉ）のアミノ酸配列の好ましい具体例を以下に例示する。
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号１）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号２）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号３）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＡＲ−ｃ（配列番号４）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号５）
ｎ−ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＡＲ−ｃ（配列番号６）
ｎ−ＲＬＤＬＲＡＬＬＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号７）
ｎ−ＲＬＤＬＲＬＬＡＲＬＤＬＲ−ｃ（配列番号８）

本発明に好ましく使用され得る別の自己組織化ペプチドとしては、ＷＯ２００７／０００９７９に記載のペプチド、すなわち、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基（疎水性アミノ酸残基）とを有する自己組織化ペプチドであって、該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であり、水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ−シート構造を形成しうる自己組織化ペプチドが挙げられる。

上記自己組織化ペプチドのなかでも、極性アミノ酸として、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基と非電荷極性アミノ酸とを含むペプチドが好ましい。係る自己組織化ペプチドの好ましい具体例を以下に例示する。
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号９）
ｎ−ＲＡＮＡＲＡＤＡＲＡＮＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１０）
ｎ−ＲＡＡＡＲＡＤＡＲＡＡＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１１）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＳＡ−ｃ（配列番号１２）
ｎ−ＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１３）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ−ｃ（配列番号１４）
ｎ−ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡ−ｃ （配列番号１５）
ｎ−ＫＡＳＡＫＡＥＡＫＡＳＡＫＡＥＡ−ｃ（配列番号１６）
ｎ−ＳＡＥＡＫＡＥＡＳＡＥＡＫＡＥＡ−ｃ（配列番号１７）
ｎ−ＫＬＳＬＫＬＤＬＫＬＳＬ−ｃ （配列番号１８）
ｎ−ＫＬＡＬＫＬＤＬＫＬＡＬ−ｃ （配列番号１９）

上記自己組織化ペプチドは、任意の適切な製造方法によって製造され得る。例えば、Ｆｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法が挙げられる。

上記自己組織化ペプチドは、目的等に応じて任意の適切な修飾が施されていてもよい。修飾が行われる部位は、特に限定されず、例えば、自己組織化ペプチドのＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、またはその両方が挙げられる。

上記修飾としては、修飾後のペプチドが自己組織化能を有する範囲において任意の適切な修飾が選択され得る。例えば、Ｎ末端アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化等の保護基の導入；アルキル化、エステル化、またはハロゲン化等の官能基の導入；水素添加；単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖等の糖化合物の導入；脂肪酸、リン脂質、または糖脂質等の脂質化合物の導入；アミノ酸またはタンパク質の導入；ＤＮＡの導入；その他生理活性を有する化合物等の導入が挙げられる。修飾は１種のみ行われてもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。例えば、上記自己組織化ペプチドのＣ末端に所望のアミノ酸を導入した付加ペプチドのＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化してもよい。

アミノ酸またはタンパク質が導入される場合、導入されるアミノ酸の数は、好ましくは１〜１８０であり、より好ましくは１〜５０、さらに好ましくは１〜３０、特に好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜５である。導入するアミノ酸残基数が１８０を超えると、自己組織化能が損なわれる場合がある。

本発明の神経再生足場材料用組成物は、１種類のみの自己組織化ペプチドを含んでもよく、２種以上の自己組織化ペプチドを含んでもよい。

本発明の神経再生足場材料用組成物における自己組織化ペプチドの濃度は、組成、用途等に応じて適切に設定され得る。自己組織化ペプチドの濃度は、好ましくは０．１重量％〜５．０重量％、より好ましくは０．１重量％〜１．５重量％、さらに好ましくは０．２重量％〜１．０重量％である。上記範囲の濃度であれば、本発明の効果が好適に得られ得る。

本発明の神経再生足場材料用組成物は、さらに水を含むことが好ましい。本発明の神経再生足場材料用組成物がさらに水を含むことにより、自己組織化ペプチドをゲル化し、所望の強度および硬さを有する神経再生足場材料を提供することができる。水としては、イオン交換水、蒸留水等の精製された水が好ましく用いられ得る。

本発明の神経再生足場材料用組成物の含水率（％）（＝神経再生足場材料用組成物中の水の重量／神経再生足場材料用組成物の総重量×１００）は、例えば、８０％〜９９．９％、好ましくは８５％〜９９.８％であり得る。

［Ａ−２．神経栄養因子］
本発明の神経再生足場材料用組成物は、神経栄養因子をさらに含むことが好ましい。本発明の神経再生足場材料用組成物は、神経栄養因子を含まない場合であっても優れた神経再生効果を発揮し得るが、神経栄養因子を併用することにより、神経再生をさらに促進し得る。本発明の神経再生足場材料用組成物が含み得る神経栄養因子としては、任意の適切な神経栄養因子が挙げられる。具体的には、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ−Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ：ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−４）等が挙げられる。これらの神経栄養因子は１種のみで用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。神経栄養因子は、任意の適切な組織から、分離・精製したものを用いてもよく、市販のものを用いてもよい。また、神経栄養因子自体に代えて、後述する神経栄養因子を産生し得る細胞を用いてもよい。

本発明の神経再生足場材料用組成物における神経栄養因子の濃度は、通常０．００１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ〜５００ｐｐｍである。当該濃度範囲であれば、神経栄養因子の作用が好適に発揮されて、神経再生が促進され得る。

［Ａ−３．神経再生抑制因子阻害剤］
本発明の神経再生足場材料用組成物は、神経再生抑制因子阻害剤をさらに含むことが好ましい。神経再生抑制因子阻害剤をさらに含むことにより、本発明の神経再生足場材料用組成物による神経再生がさらに促進され得る。神経再生抑制因子としては、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるＮＧ２、フォスファカン、ニューロカン、テネイシン、セマフォリン、Ｅｐｈとｅｐｈｒｉｎ等が知られている。これらの神経再生抑制因子、および、その受容体の阻害剤をさらに含むことにより、より効率よく、神経を再生することができる。阻害剤としては、例えば、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ケラタナーゼ等が挙げられる。神経再生因子阻害剤は１種のみで用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明の神経再生足場材料用組成物における神経再生抑制因子阻害剤の濃度は、通常０．００１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ〜５００ｐｐｍである。当該濃度範囲であれば、神経再生抑制因子の作用を適切に阻害することができ、神経再生が促進され得る。

［Ａ−４．細胞］
本発明の神経再生足場材料用組成物は、任意の適切な細胞をさらに含んでいてもよい。具体的には、グレア細胞、シュワン細胞、角化細胞、線維芽細胞等の神経栄養因子を産生し得る細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の万能細胞等が挙げられる。細胞としては、神経栄養因子を産生し得る細胞が好ましい。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、それを継代培養したものでもよく、あるいは、それらを保存（凍結保存、低温保存）したものでもよい。細胞はまた、神経再生足場材料用組成物の中で所定期間培養されていてもよく、培養期間中に他の細胞への分化あるいは脱分化がおこなわれたものでもよい。培養期間は、投与対象、細胞の種類等によって異なるが、例えば、１日〜２０日程度であり得る。

細胞の由来は、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、サル等であり得る。

［Ａ−５．他の添加物］
本発明の神経再生足場材料用組成物は、必要に応じて任意の適切な添加物をさらに含み得る。添加物の具体例としては、ｐＨ調整剤；緩衝剤；等張化剤；塩類；アミノ酸類；ビタミン類；アルコール類；細胞培養用培地成分；蛋白質；薬物等が挙げられる。これらの添加物は、１種のみ用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

ｐＨ調整剤としては、塩酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。

緩衝剤としては、リン酸、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩；ホウ酸、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等のホウ酸塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム等のクエン酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。

等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の塩化物；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖；スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース等の二糖；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；等が挙げられる。

塩類としては、上記で例示した添加物以外の任意の適切な塩が用いられ得る。例えば、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。

細胞培養用培地成分としては、目的等に応じて任意の適切な液体培地成分が選択され得る。液体培地としては、例えば、神経細胞用培養液、神経細胞用分散液（具体的には、住友ベークライト株式会社製、神経細胞用分散液 品番：ＭＢ−Ｘ９９０１等）、イーグル培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭα）等が挙げられる。

上記添加物の添加量は、その目的等に応じて任意の適切な値に設定され得る。

［Ｂ．神経再生足場材料用組成物の調製方法］
本発明の神経再生足場材料用組成物の調製方法は、任意の適切な方法で行われる。例えば、本発明の神経再生足場材料用組成物は、自己組織化ペプチドと水と任意の構成成分とを混合することにより調製され得る。混合順は特に限定されず、目的等に応じて適切に設定される。例えば、自己組織化ペプチドを均一に分散または溶解させる観点から、細胞等の激しい撹拌に不向きな構成成分は、自己組織化ペプチドと水との混合後に添加され得る。

［Ｃ．神経再生足場材料］
本発明の神経再生足場材料は、上記神経再生足場材料用組成物を含む。上記神経再生足場材料用組成物を含むことにより、これまで困難であった中枢神経の再生にも適用可能な神経再生足場材料を得ることができる。

［Ｄ．神経再生足場材料の調製方法］
本発明の神経再生足場材料は任意の適切な方法で行われる。例えば、本発明の神経再生足場材料は、自己組織化ペプチドと水と任意の構成成分とを含む神経再生足場材料用組成物を静置することにより、調製され得る。これにより、神経再生足場材料組成物に含まれる自己組織化ペプチドがペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状の分子集合体を形成し、静置を続けることにより、当該分子集合体間の相互作用によって三次元網目構造が発達してゲルの形態となる。

上記自己組織化ペプチドのゲル化は、中性領域のｐＨで好適に進行し得る。したがって、必要に応じて、ｐＨ調整剤を用いて、神経再生足場材料用組成物のｐＨが中性領域となるよう調整することが好ましい。神経再生足場材料用組成物のｐＨを中性にした後、静置することにより好適にゲル化が進行し、神経再生足場材料が得られる。静置時間および静置温度を調整することにより、所望の硬度を有する神経再生足場材料を得ることができる。投与手段に応じて、神経再生足場材料の硬度は調整され得る。また、静置時間および静置温度は、投与対象、自己組織化ペプチドの濃度および種類等に応じて適切に設定され得る。

本発明の神経再生足場材料の調製方法は、ろ過等の精製；高圧蒸気滅菌、放射線滅菌、乾熱滅菌等の滅菌；包装容器への分注；等の任意の工程をさらに含み得る。

［Ｅ．使用方法］
本発明の神経再生足場材料は、好ましくはゲルの形態である神経再生足場材料を投与対象部位に投与（注入）することにより、使用され得る。１つの実施形態において、本発明の神経再生足場材料の使用方法は、ゲルの形態の神経再生足場材料を投与対象部位に投与（注入または留置）することを含む。

神経再生足場材料の投与対象部位への注入は、シリンジ、チューブ、ピペット等の任意の適切な手段を用いて行われ得る。また、外科的手段により、投与対象部位に直接神経再生足場材料を投与（留置）してもよい。

投与対象部位は通常生理的環境下であることから、投与対象部位における本発明の神経再生足場材料のゲル化は、自発的に進行し得る。そのため、投与する段階で、投与に適した濃度となるよう自己組織化ペプチドの濃度を調整した場合であっても、投与後投与対象部位において神経再生の足場として適した強度へとさらにゲル化が進行し得る。

本発明の神経再生足場材料は生体分解性に優れることから、投与対象部位における神経再生に伴って経時的に分解または吸収され得る。

本発明の神経再生足場材料は、例えば、末梢神経、脊髄、脳等の中枢神経等における神経再生等に用いられ得る。本発明の神経再生足場材料は、神経成長因子（ＮＧＦ）が関連し得る炎症を抑制し得るため、神経再生の足場材料として好適に用いることができる。さらに、中枢神経系における再生阻害因子として知られている、グリア瘢痕の形成をも抑制し得る。そのため、従来は再生が特に困難であった中枢神経についても、神経再生を促進することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。

［試験例１：脊髄前角細胞および神経再生足場材料培養試験］
マウス脊髄前角細胞から採取した細胞を用いて初代神経細胞培養試験を行った。自己組織化ペプチドゲル（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ Ｇｅｌ ＳＰＧ−１７８−２０８（Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化された配列番号１のペプチド（自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷の総和：＋２）を含むペプチドゲル、ペプチド濃度：０．８ｗ／ｗ％）を、神経再生足場材料１として用いた。９６ウェルプレートに、神経再生足場材料１を３０μｌ／ｗｅｌｌ、神経細胞用培養液（住友ベークライト株式会社製、商品名：ＳＵＭＩＴＯＭＯ Ｎｅｒｖｅ−Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ、品番：ＭＢ−Ｘ９９０１）を１００μｌ／ｗｅｌｌを加え、採取した細胞を細胞数が６００，０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるよう播種した。同様に、８ウェルチャンバーに神経再生足場材料１を９０μｌ／ｗｅｌｌ、神経細胞用培養液を３００μｌ／ｗｅｌｌ加え、採取した細胞を細胞数が１５０，０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるよう播種した。次いで、９６ウェルプレートおよび８ウェルチャンバーを３７℃で培養した。培養から２日後、および、７日後にサンプルを採取した。採取した各サンプルにおける、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびこれらの受容体であるＴｒｋＡ、脊髄損傷後の細胞外基質の再構築に関与するＭＭＰ−９、およびその活性化因子であるＭＭＰ−３の発現量をＰＣＲにて測定した。

また、自己組織化ペプチドゲル（３Ｄマトリックス社製、製品名「Ｐｕｒａｍａｔｒｉｘ^ＴＭ」、Ａｃ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＯＮＨ_２、自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷の総和：０、ペプチド濃度：１ｗ／ｖ％）を、神経再生足場材料Ｃ１として用いた。神経再生足場材料１に代えて、神経再生足場材料Ｃ１を用いた以外は同様にして、細胞培養を行い、培養から２日後、および、７日後にサンプルを採取した。採取した各サンプルにおける、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびこれらの受容体であるＴｒｋＡ、脊髄損傷後の細胞外基質の再構築に関与するＭＭＰ−９、およびその活性化因子であるＭＭＰ−３の発現量をＰＣＲにて測定した。

さらに、神経再生足場材料１に代えて、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）（１０μｇ／ｍｌ）５００μｌを用いた以外は同様にして細胞培養し、培養から２日後、および、７日後にサンプルを採取した（参考例１）。また、神経再生足場材料１に代えて、ラミニン（２０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを用いた以外は同様にして細胞培養し、培養から２日後、および、７日後にサンプルを採取した（参考例２）。採取した各サンプルにおける、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびこれらの受容体であるＴｒｋＡ、脊髄損傷後の細胞外基質の再構築に関与するＭＭＰ−９、およびその活性化因子であるＭＭＰ−３の発現量をＰＣＲにて測定した。

（結果）
神経再生足場材料１、神経再生足場材料Ｃ１、ＰＬＬおよびラミニンのＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＴｒｋＡの発現量を示すグラフを図１に、ＭＭＰ−３および、ＭＭＰ−９の発現量を示すグラフを図２にそれぞれ示す。培養２日後および７日後のいずれのサンプルにおいても、全ての因子の発現量が神経再生足場材料１を用いた場合に最も高かった。培養２日後においては、神経再生足場材料１でのＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＴｒｋＡの発現量は、神経再生足場材料Ｃ１よりも有意に高い値であった（ＢＤＮＦ、ＮＧＦ：ｐ＜０．０１、ＴｒｋＡ：ｐ＜０．０５）。また、培養７日後においては、ＮＧＦおよびＴｒｋＡの発現量は、神経再生足場材料Ｃ１よりも有意に高い値であった（ＢＤＮＦ：ｐ＜０．０１、ＴｒｋＡ：ｐ＜０．０５）。この結果から、本発明の神経再生足場材料を用いることにより、細胞での神経栄養因子の産生が促進され、結果として神経再生が促進されると考えられた。

また、神経再生足場材料１では培養２日後にＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９の発現量が他の足場材料を用いたものよりも高くなっていた。神経再生足場材料１でのＭＭＰ−３の発現量は、神経再生足場材料Ｃ１よりも有意に高い値であった（ｐ＜０．０５）。本発明の神経再生足場材料１を用いた場合、速やかにＭＭＰ−９の活性因子であるＭＭＰ−３の発現量が増加し、神経再生足場材料の適用後速やかに神経再生が開始されると考えられる。また、これらの因子は炎症性サイトカインでもある。神経再生足場材料１では、培養７日後にはこれらの発現量が減少していた。そのため、神経再生開始後は、これらの因子による炎症が抑制されると考えられた。

［試験例２：マウス脊髄投与試験］
Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウスのｄｏｒｓａｌ−ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌを用いて、脊髄投与試験を行った。Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウス（８週齢、ｎ＝５４）を尖刃を用いて脊髄の背側を切離して、ｄｏｒｓａｌ−ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌマウスを作製した。作製したマウスの脊髄損傷部位に神経再生足場材料２（自己組織化ペプチドゲル（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ Ｇｅｌ ＳＰＧ−１７８−２０８、ペプチド濃度：０．８ｗ／ｗ％））１μｌ〜２μｌをシリンジで注入した。各マウスの脊髄から、７日後、１４日後、２８日後にサンプルを採取した。各サンプルにおける神経栄養因子であるＮＴ−３、ＧＤＮＦ、およびこれらの受容体であるＴｒｋ−Ｃ、ｐ７５、脊髄損傷後の細胞外基質の再構築に関与するＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびその活性化因子であるＭＭＰ−３の発現量をＰＣＲにて測定した。また、神経再生足場材料投与後１４日後、および、２８日後のマウスから、脊髄を採取して、ＨＥ染色、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ４染色、Ｉｂａ１染色、および、ＧＦＡＰ染色をそれぞれ行い、損傷部位を観察した。各染色に用いたキットは以下の通りである。
（ＨＥ染色）
ヘマトキシリン：マイヤーヘマトキシリン溶液（×２）（Ｍａｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （×２））（和光純薬工業株式会社製、コードＮｏ．１３４−１３０６５）
エオシン：エオシン溶液（武藤化学株式会社製、商品名：エオシンＹ １％液）１ｍｌに酢酸１μｌを添加した溶液
（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ４染色）
Ａｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ 抗体（ａｂ６５８６）（ａｂｃａｍ株式会社製、Ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｔｏ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ １／２００）
（Ｉｂａ１染色）
Ａｎｔｉ Ｉｂａ１, Ｒａｂｂｉｔ （ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 抗Ｉｂａ１， ウサギ（免疫細胞化学用）（和光純薬工業株式会社製）
（ＧＦＡＰ染色）
ＧＦＡＰ （Ｄ１Ｆ４Ｑ） ＸＰ（登録商標） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ ＃１２３８９ （Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, Ｉｎｃ.製）

比較として、未投与のｄｏｒｓａｌ−ｈｅｍｉｓｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌマウス、および、神経再生足場材料２に代えて神経再生足場材料Ｃ２（自己組織化ペプチドゲル（３Ｄマトリックス社製、製品名「Ｐｕｒａｍａｔｒｉｘ^ＴＭ」ペプチド濃度：１ｗ／ｖ％））１μｌ〜２μｌを注入したマウスの脊髄からも、７日後、１４日後、２８日後にサンプルを採取した。各サンプルにおける神経栄養因子であるＮＴ−３、ＧＤＮＦ、および、これらの受容体であるＴｒｋ−Ｃ、ｐ７５、脊髄損傷後の細胞外基質の再構築に関与するＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびその活性化因子であるＭＭＰ−３の発現量をＰＣＲにて測定した。また、神経再生足場材料Ｃ２を投与後１４日後、および、２８日後のマウスから、脊髄を採取して、ＨＥ染色、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ４染色、Ｉｂａ１染色、および、ＧＦＡＰ染色を行い、損傷部位を観察した。

（結果）
神経再生足場材料２または神経再生足場材料Ｃ２を投与されたマウス、および、未投与のマウスの脊髄におけるＮＴ−３、ＧＤＮＦ、およびこれらの受容体であるＴｒｋ−Ｃ、ｐ７５の発現量を示すグラフを図３に、脊髄損傷後の細胞外基質の再構築に関与するＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびその活性化因子であるＭＭＰ−３の発現量を示すグラフを図４にそれぞれ示す。神経再生足場材料２または神経再生足場材料Ｃ２を投与されたマウスの脊髄の投与１４日後の組織をＨＥ染色した写真を図５に、投与２８日後の組織をＨＥ染色した写真を図６にそれぞれ示す。また、神経再生足場材料２または神経再生足場材料Ｃ２を投与されたマウスの脊髄の投与１４日後および２８日後の組織をＣｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ４染色した写真を図７に示す。神経再生足場材料２または神経再生足場材料Ｃ２を投与されたマウスの脊髄の投与１４日後および２８日後の組織をＩｂａ１染色した写真を図８に、ＧＦＡＰ染色した写真を図９にそれぞれ示す。

神経再生足場材料２を投与したマウスでは、投与後７日後から神経成長因子およびその受容体の発現量が増加し、神経再生の促進が投与後速やかに開始されたと考えられた。また、神経再生足場材料２を投与したマウスでは、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−３の発現量が投与７日後に最も高い値を示し、経時的に低い値となった。そのため、神経再生開始後は、これらの因子による炎症が抑制されると考えられた。

投与１４日後においては、神経再生足場材料２または神経再生足場材料Ｃ２の投与群の間で組織の再生に明確な差異は見られなかった（図６）。しかしながら、投与２８日後においては、神経再生足場材料２を投与したマウスでは、神経組織が再構築されていることが確認された。一方、神経再生足場材料Ｃ２を投与したマウスでは、神経組織が破綻していることが認められた。

Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ４染色では、繊維性瘢痕が染色される。繊維性瘢痕は物理的バリアーとなり軸索伸長を阻害し得る。Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ４染色では、神経再生足場材料２を投与したマウスにおいて、染色範囲が減少していることが確認された。このことから、神経再生足場材料２を用いた場合には、軸索伸長を阻害する瘢痕の形成が抑制されたと考えられた（図７）。また、炎症系細胞であるミクログリアを染色するＩｂａ１染色では、神経再生足場材料２を投与されたマウスにおいて、染色範囲が狭く、抗炎症作用が発揮されたと考えられた。さらに、瘢痕形成減少に関与するグリア細胞を染色するＧＦＡＰ染色した組織では、損傷部位周辺において染色される範囲が大きく、損傷部位周辺において瘢痕形成が抑制されていた。

上記試験例１および試験例２の結果からも明らかな通り、本発明の神経再生足場材料を用いることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても神経栄養因子の発現増加、および、組織損傷後の再構築が確認された。これらの結果から、本発明の神経再生足場材料は、脊髄等の中枢神経系の神経再生足場材料としても有用であることが確認された。

本発明の神経再生足場材料は、研究開発や医療の分野において好適に利用され得る。

Claims (5)

1. 自己組織化ペプチドを含む神経再生足場材料用組成物であって、
   該自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域における電荷の総和が０を超えて＋５以下である、神経再生足場材料用組成物。
2. 前記自己組織化ペプチドが、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである、請求項１に記載の神経再生足場材料用組成物。
   アミノ酸配列：ａ_１ｂ_１ｃ_１ｂ_２ａ_２ｂ_３ｄｂ_４ａ_３ｂ_５ｃ_２ｂ_６ａ_４
   （該アミノ酸配列中、ａ_１〜ａ_４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ_１〜ｂ_６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ_１およびｃ_２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
3. 神経栄養因子をさらに含む、請求項１または２に記載の神経再生足場材料用組成物。
4. 神経再生抑制因子阻害剤をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の神経再生足場材料用組成物。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の神経再生足場材料用組成物を含む、神経再生足場材料。