WO2009095562A2 - Biomateriau permettant la delivrance controlee d'actifs - Google Patents

Biomateriau permettant la delivrance controlee d'actifs Download PDF

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Véronique LARRETA GARDE
Julien Picard
Marie Cécile KLAK
Sebastien Perrin
Sébastien GIRAUDIER
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Ma.I.A Woundcare
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Definitions

  • the present invention relates to a biomaterial comprising an aqueous phase, a polymer network, a second polymer induced in the network and at least one degradation enzyme of the second polymer.
  • the present invention also relates to a process for preparing said biomaterial.
  • the present invention relates to uses of the biomaterial, in particular for the release of active substances and to a controlled release device for active substances comprising the biomaterial.
  • the biomaterial of the invention finds particular applications in the cosmetic and pharmaceutical fields.
  • Gels are used because of their particular properties in many fields, in particular food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • a gel is composed of at least two components of which one, very strongly, corresponds to a liquid solvent and the other is a component that can be described as solid. Both components are continuous throughout the medium.
  • the so-called solid phase constitutes a network that traps the so-called liquid phase corresponding to the solvent, and prevents it from flowing.
  • the whole medium behaves like a soft and elastic solid easy to deform.
  • Gels are classifiable according to the type of links that form the network. Thus two major gelling mechanisms are distinguished which lead to "physical" gels or "chemical” gels.
  • gel formation is the result of the formation of a continuous solid network. This transformation is called the solution / gel transition.
  • a physical gel is a supramolecular assembly consisting of molecules linked together by low energy bonds (Van der Waals, hydrogen bonds, polar bonds, etc.).
  • the stability of this assembly is associated with a precise range of physico-chemical conditions (pH, concentration in molecules, temperature, quality of the solvent, ionic strength, etc.). Outside this range, the mixture is liquid.
  • the sol / gel transition is therefore reversible for physical gels.
  • a modification of the environmental parameters can lead to the destruction of the building and induce a freeze-soil transition.
  • Biogels are obtained essentially from macromolecules or polymers of natural origin: proteins or polysaccharides.
  • a chemical gel corresponds to a supramolecular assembly whose molecules are associated by high energy (covalent) bonds. The stability of this assembly is very large. These chemical gels have improved stability, the only way to perform a gel / solution transition is to destroy the covalent bonds of the network. This is why the ground / gel transition of chemical gels is called irreversible.
  • a family of chemical gels corresponds to enzymatically catalyzed gels. This mode of gelation is mainly observed in large biological processes. Blood coagulation, scarring, skin formation, extracellular matrix assembly are biological processes where the passage of soluble proteins to the gel state is indispensable. In vivo, a limited number of enzymes, for example lysyloxidases, transglutaminases, catalyze these reactions. In vitro, the most commonly used is transglutaminase which creates covalent bridges between the side chains of lysine and glutamine residues of proteins.
  • Tgases thus catalyze the polymerization of the proteins responsible for the formation of biological gelled networks.
  • This family of proteins is ubiquitous and is found in both prokaryotes and eukaryotes.
  • Tgases make it possible to obtain gels from numerous proteins in the food industry, and in particular for the manufacture of surimi or the hardening of many meat derivatives (ham, reconstituted food, etc.). Mention may be made, as examples of polymerizable proteins, of gelatin, fibrin, gliadin, myosin, globulin (7S and 11S), actin, myoglobin, whey proteins, in particular caseins and lactaglobulin, soy protein, wheat and especially glutenin, yellow and egg white, including ovalbumin.
  • gelatin gel is obtained from collagen which is a structural protein. Collagen is a molecule organized in triple helix. These triple helices can associate in fibrils which can associate in fibers. The collagen triple helix is unstable at body temperature. Gelatin is obtained by denaturation of collagen. Tissues containing collagen thus undergo acid or alkaline treatment, which results in the denaturation of the collagen triple helix. The possibility of making fibers is then totally lost. Acidic treatment results in the formation of type A gelatin and an alkaline treatment with type B gelatin. The gelatin solution is therefore composed of isolated chains of collagen.
  • gelatin gels As the uses of gelatin are multiple, it is sometimes necessary to create gelatin gels under conditions where physical gels do not exist (high temperatures, extreme pH or particular ionic strength). To form the network necessary for freezing, the chains gelatin are then bridged by covalent bonds, and especially by the action of the Tgases. The gels thus obtained are chemical gels.
  • the analysis of living revealed the existence of extremely dynamic systems.
  • the cells interact with a structure called the extracellular matrix (MEC) 1 which is rich in proteins and similar to a gel at the macroscopic level.
  • MEC extracellular matrix
  • This structure is mainly located under the epithelial cells and around the connective tissues.
  • the cells can synthesize different components of the extracellular matrix such as collagen which confers its rigidity to the MEC or fibronectin which is involved in the mechanisms of cell adhesion.
  • the cell also produces proteases that cause degradation of the extracellular matrix.
  • the cell therefore intervenes simultaneously in the construction and degradation of the extracellular matrix.
  • the structure of the extracellular matrix is thus not an irreversible and static structure but corresponds to a dynamic equilibrium resulting from the balance between the construction and degradation activities of the proteins synthesized by the cell.
  • the clots formed according to the blood clotting mechanism also constitute dynamic systems.
  • a clot is formed from soluble proteins organized in an insoluble network. This clot will then be removed during another enzymatic reaction.
  • protein networks combine to become insoluble and form gels, which can be likened to solution / gel transitions.
  • the protein networks are also destroyed by the action of proteases, this type of transition can this time be likened to gel / solution transitions.
  • proteases this type of transition can this time be likened to gel / solution transitions.
  • the solution / gel transition in these biological processes is most often associated with the transglutaminase family mentioned above.
  • the opposite transition, namely gel / solution, is associated with the antagonistic activity of proteolytic-type enzymes.
  • MMP matrix metalloproteinases
  • serine proteases such as trypsin, matriptase, cysteines and aspartate proteases, such as cathepsins B and L and cathepsins D and G, metalloproteases and ADAM family.
  • Gels having the solution / gel and gel / solution transition capacity are described in WO 2006/056700. These gels comprise an aqueous phase, a polymer and enzymes capable of degrading the polymer and of polymerizing monomers to form said polymer. .
  • the "monomers” may be biological or polymeric macromolecules.
  • the term "polymer” applies to a "polymer network”.
  • the gels of the state of the art have programmed gelling and resolubilization kinetics. Furthermore, the gels of the state of the art have controlled physical characteristics, for example their viscoelasticity. In addition, the physical characteristics of the solid network and the aqueous phase forming the gels of the state of the art are modified indissociable and simultaneous. These disadvantages limit the scope of these gels because of their physical characteristics. It is for example impossible, according to the state of the art, to modify the solid network without modifying the aqueous phase or to modify the aqueous phase without modifying the solid gel network.
  • the invention specifically makes it possible to meet these needs of the prior art and to overcome these disadvantages by providing a biomaterial in which the viscoelastic properties of the gel can be modified and in which the modification of these properties is programmed.
  • the subject of the present invention is in particular a biomaterial comprising an aqueous phase and a first polymer network constituted by a first protein or saccharide polymer or a mixture of first protein and / or saccharide polymers, in which the first polymer network and the aqueous phase form a first gel (A), the biomaterial comprising:
  • a second protein or saccharide polymer or a mixture of second protein or saccharide polymers is in solution in the aqueous phase of the gel (A), either in the form of a second polymer network constituting a gel (B),
  • polymer is understood to mean an association of molecules. This association between the molecules can be ensured by strong or weak interactions (covalent bonds, hydrogen bonds, Van der Waals, etc.). In the case of covalent bonds, the association is a crosslinking and the network is said to be "crosslinked".
  • polymer is meant a macromolecule, for example a protein or saccharide polymer.
  • a polymer network is a combination of protein polymers or a combination of saccharide polymers.
  • the polymer network can be a gel.
  • aqueous phase is understood to mean an aqueous solution, for example water, for example still an aqueous buffered solution, for example at a desired pH, for example by means of a phosphate buffer or Tris or any suitable buffer known to those skilled in the art as a buffer. It may be, for example, a medium allowing the activity of the enzyme (s) present in the biomaterial.
  • the first polymer network may consist of a first protein polymer.
  • This first protein polymer may be chosen for example from the group comprising fibrin, gliadin, myosin, globulin (7S and 11S), actin, myoglobin, collagen and its derivatives, milk proteins, soy protein, wheat protein, and egg yolk and egg white protein, pea protein, faba bean protein, flax protein, silk protein, fibronectin, laminin, elastin , vitronectin, or a mixture of these polymers.
  • This first polymer network may therefore consist of a single first protein polymer or a mixture of first protein polymers.
  • the first polymer network may consist of a first saccharide polymer.
  • This first saccharide polymer may be chosen, for example, from the group comprising carrageenans, alginates, xanthan, chitosan, chitin, hyaluronic acid, sulphated glycosaminoglycans, glycogen and cellulose. and its derivatives, pectins, starch and derivatives thereof, dextrans and xylans, or a mixture thereof.
  • This first polymer network can therefore consist of a single first saccharide polymer or a mixture of first saccharide polymers.
  • the first polymer network may also consist of a mixture of first protein and saccharide polymers, chosen for example from the abovementioned groups of protein and saccharide polymers.
  • the first polymer network may be chosen for example from the group comprising gelatin, fibrin and alginate gels, it being understood that this first polymer network consists of polymers that are different from the second polymers.
  • the quantity of the first polymer network or mixture of first polymers may for example be between 0.1 and 20% by weight relative to the total weight of the biomaterial, preferably from 0.5 to 10% by weight. weight.
  • the second polymer is different from the polymer constituting the first polymer network.
  • This second polymer may be chosen for example from the group comprising fibrin, gliadin, myosin, globulin (7S and 11S), actin, myoglobin, collagen and its derivatives, milk proteins, proteins soybeans, wheat proteins, and yolk and egg white proteins, pea proteins, faba bean proteins, Nn proteins, silk proteins, fibronectin, laminin, elastin, vitronectin, or a mixture of these polymers.
  • This second polymer may therefore consist of a single protein polymer or a mixture of protein polymers.
  • the second polymer may be chosen for example from the group comprising, for example, carrageenans, alginates, xanthan, chitosan, chitin, hyaluronic acid, sulphated glycosaminoglycans, glycogen, cellulose and its derivatives, pectins, starch and its derivatives, dextrans and xylans, or mixture of these.
  • This second polymer may therefore consist of a single saccharide polymer or a mixture of saccharide polymers.
  • the second polymer may also consist of a mixture of second protein polymers and second saccharide polymers, for example chosen from the abovementioned groups of protein and saccharide polymers.
  • the second polymer may be chosen for example from the group comprising gelatin, fibrin, hyaluronic acid and alginate, it being understood that this second polymer is different from the first.
  • the amount of the second polymer or mixture of second polymers may be between 0.01 and 20% by weight relative to the total weight of the biomaterial, preferably from 0.1 to 10% by weight.
  • the first enzyme may be chosen for example from the group comprising the enzymes of the metalloproteinase family, the family of serine proteases, the family of cysteines and aspartate proteases, the ADAM family, glycosidases including amylase. cellulase, dextranase, pullulanase, pectinase, chitinase, xanthanase, chitosanase, hyaluronidase, and lyases including hydroxyacetyl lyase, chondroitinase, heparinase, alginate lyase.
  • the concentration in the biomaterial of the first enzyme may be between 2 ⁇ 10 7 and 50 U / ml, preferably from 2 ⁇ 10 -6 to 20 U / ml.
  • the biomaterial may further comprise a second enzyme different from the first enzyme and capable of degrading the first polymer network, said first polymer network being capable of performing, under the action of said second enzyme, a gel transition (A) / solution.
  • the second enzyme can be chosen for example from the group comprising the enzymes of the metalloproteinase family, the family of serine proteases, the family of cysteines and aspartate proteases, the ADAM family. , glycosidases including amylase, cellulase, dextranase, pullulanase, pectinase, chitinase, xanthanase, chitosanase, hyaluronidase, and lyases including hydroxyacetyl lyase, chondroitinase, heparinase, and alginate lyase.
  • glycosidases including amylase, cellulase, dextranase, pullulanase, pectinase, chitinase, xanthanase, chitosanase, hyaluronidase, and lyases
  • the concentration in the biomaterial of the second enzyme can be between 2 ⁇ 10 7 and 50 U / ml, preferably from 2 ⁇ 10 7 to 20 U / ml.
  • the biomaterial may furthermore comprise a third enzyme different from the first and second enzymes and capable of inducing bonds between said first polymers or a mixture of first polymers, said third enzyme being capable of catalyzing a solution / gel transition ( AT).
  • a third enzyme different from the first and second enzymes and capable of inducing bonds between said first polymers or a mixture of first polymers, said third enzyme being capable of catalyzing a solution / gel transition ( AT).
  • the third enzyme may be chosen for example from the group comprising lysyl oxidase, transglutaminases, disulfide isomerase proteins, sulfhydrile thiol oxidases, peroxidases, lipoxygenases, epimerases including alginates epimerases, glucuronate isomerases, cellobiose epimerase and galactose-6-sulfurylases.
  • the concentration in the biomaterial of the third enzyme may be between 0.01 and 50 U / ml, preferably from 0.1 to 5 U / ml.
  • the biomaterial may further comprise a fourth enzyme different from the first, second and third enzymes and capable of inducing bonds between said second polymers or mixture of second polymers, said fourth enzyme being capable of catalyzing a solution / gel transition (B).
  • a fourth enzyme different from the first, second and third enzymes and capable of inducing bonds between said second polymers or mixture of second polymers, said fourth enzyme being capable of catalyzing a solution / gel transition (B).
  • the fourth enzyme may be chosen for example from the group comprising lysyl oxidase, transglutaminases, disulfide isomerase proteins, sulfhydrile thiol oxidases, peroxidases, lipoxygenases, epimerases including alginates epimerases, glucuronate isomerases cellobiose epimerase and galactose-6-sulfurylases.
  • the concentration in the biomaterial of the fourth enzyme can be between 0.01 and 50 U / ml, preferably from 0.1 to 5 U / ml.
  • the first, second, third and fourth enzymes are enzymes that can be independently active or activatable
  • the aqueous phase of the biomaterial may further comprise an active substance.
  • This active substance may for example be in solution in the aqueous phase of the gel (A) and / or in the gel (B).
  • the term "active substance” is intended to mean any substance or composition having a biological or biochemical activity on the surface of an organism (microorganism or multicellular organism, for example skin, bone, organ, etc.) or in an organism .
  • This active substance may have, for example, curative or preventive properties with regard to human or animal diseases. It can be any product that can be administered to humans or animals in order to establish a medical diagnosis or to restore, correct or modify their organic functions. It may be bacteriostatic and / or bactericidal substances, antibiotics, sanitizers, dyes, etc.
  • the active substance may be chosen for example from the group comprising, bacteriostats, bactericides, vasodilators, dyes including eosin, blue dextran, methylene blue, azur, proteins, saccharides including hyaluronic acid and alginates, a liposome, a nanoparticle, a micelle, anti-acne, antiallergics, anxiolytics, antiasthmatics, anticancer drugs, lipid-lowering drugs, hormonal contraceptives, anti-depressants, antidiabetics, analgesics, anti-asthenics, antihypertensives, antifungals, antibiotics, sleeping pills, hormonal treatments, anti-migraine medicines, overweight drugs, anti-Parkinson's, neuroleptics, anti-inflammatory drugs non-steroidal inflammatory drugs, ovulation inducers, bronchial fluidifiers, antitussives, estrient inducers and antiulcer agents.
  • it may be an active substance alone or a mixture of active substances.
  • the amount of active substance may depend, for example, on factors such as its activity and the dose desired by the user.
  • the desired dose can be easily determined by those skilled in the art since they may be for example known doses for known products.
  • the biomaterial of the present invention can therefore be used for the controlled release of at least one active substance.
  • the invention also relates to a method for preparing a biomaterial as described above comprising the following steps: a) forming in aqueous phase a first polymer network consisting of a first protein or saccharide polymer or a mixture of first protein or saccharide polymers, the first protein or saccharide polymer or mixture of first protein or saccharide polymers forming said first polymer network, b) adding a second protein or saccharide polymer or a mixture of second protein or saccharide polymers, different from the first polymer or mixture of first polymers, the addition step being carried out before the formation of the first polymer network.
  • the process of the invention can be carried out, for example, with second polymers or a mixture of second polymers included in the aqueous phase of the network of first polymers.
  • the process of the invention can be carried out with second polymers or a mixture of second polymers forming, for example, an array of second polymers included in the network of first polymers.
  • the formation or degradation of the various polymers or polymer network can be induced by the addition of one to four enzymes in step b).
  • concentration of these different enzymes may allow, for example, the control of the viscoelastic properties of the biomaterial of the invention.
  • the process of the invention can be carried out for example at a temperature of between 10 and 45 ° C.
  • the first and second polymers are as defined above.
  • the concentration of the first and / or second polymers may also be as previously described.
  • the method may further comprise in step b) the addition of a first enzyme capable of degrading said second polymers or the second polymer network.
  • the first enzyme is defined above. Its quantity is defined above.
  • the method may further comprise in step b) the addition of a second enzyme capable of degrading the bonds of the first polymer network.
  • the second enzyme is defined above. Its quantity is defined above.
  • the process may further comprise in step b) the addition of a third enzyme capable of inducing bonds between said first polymers.
  • the third enzyme is defined above. Its quantity is defined above.
  • the method may further comprise in step b) the addition of a fourth enzyme capable of inducing bonds between said second polymers.
  • the fourth enzyme is defined above. Its quantity is defined above.
  • the method may further comprise in step b) the addition of at least one active substance.
  • the active substance is defined above.
  • the method may further comprise a step c) of lyophilization of the biomaterial.
  • a step c) of lyophilization of the biomaterial According to the invention, it can also be a dehydration step.
  • the invention also relates to a device for controlled release of an active substance comprising the biomaterial of the present invention.
  • the release device can be chosen for example from the group comprising medical devices including contact lenses, electrodes, sensors, devices for care, dressings, soaked compresses, bandages, medical devices, surgical dressings, ophthalmic dressings, dental dressings, suture products, devices for therapies, orthopedic articles, surgical implants, patches, transdermal gels, active patches, stents and implants for soft tissues, devices for tissue engineering, reconstruction materials, devices for cell culture, media culture media.
  • the biomaterial of the present invention may, for example, partially or totally replace the material used in the aforementioned devices, especially the material in contact with the skin, mucous membranes, organs, bones, cells, etc.
  • the biomaterial according to the invention can thus make it possible to produce new cosmetics such as patches or beauty masks that can release a substance, for example a substance that promotes the well-being of the user or a cosmetic active agent, for example hyaluronic acid or retinol.
  • a substance for example a substance that promotes the well-being of the user or a cosmetic active agent, for example hyaluronic acid or retinol.
  • the biomaterial according to the invention may also make it possible to obtain gels that trap an active principle and capable of releasing said active ingredient by returning to the state of solution with a specific kinetics, for example gels or capsules releasing the active ingredient after a given time.
  • FIG. 1 represents the evolution of the release of Eosin over time in a biomaterial according to the invention
  • the arrow represents the resolubilization time of the gel comprising collagenase.
  • FIG. 2 represents the percentage of dextran blue salting as a function of time in a biomaterial according to the invention.
  • FIG. 3 represents the influence of the degradation of hyaluronic acid (1%) on the viscoelasticity (G ': squares, G ": triangles) of the physical gel at a given frequency (6.3 rad.s " 1 ) as a function of time in minutes.
  • 1 U / mL of hyaluronidase black symbols
  • 5 U / mL of hyaluronidase dark gray symbols
  • 10 U / mL of hyaluronidase light gray symbols
  • gelatin alone white symbols
  • FIG. 4 represents the influence of the degradation of hyaluronic acid (1%) on the formation of triple helices of the physical gel as a function of time in minutes.
  • 1 U / mL Hyaluronidase white symbols
  • no enzyme black symbols
  • gelatin alone gelatin alone
  • FIG. 5 represents the influence of the degradation of hyaluronic acid (1%) on the viscoelasticity (G ': squares, G ": triangles) of the chemical gel at a given frequency (6.3 rad.s " 1 ) as a function of time in minutes.
  • 1 U / mL of hyaluronidase black symbols
  • 5 U / mL of hyaluronidase dark gray symbols
  • 10 U / mL of hyaluronidase light gray symbols
  • gelatin alone white symbols
  • FIG. 6A shows the effect of hyaluronic acid on the viscoelasticity (G ': squares, G ": triangles) of a physical gel containing collagenase (1.12 ⁇ 10 -4 U / ml) at a given frequency. (6.3 rad.s -1 ) as a function of time: 1% hyaluronic acid (black symbols) and gelatin alone (white symbols).
  • FIG. 6B shows the evolution of the viscoelastic properties (G ': squares, G ": triangles) of the physical gels, in the presence of hyaluronic acid (1%) and as a function of time, containing different concentrations of collagenase: 0, 95XiO "4 U.mL “ 1 (black symbols), 1, 12XiO -4 U-InL “1 L (gray symbols), 1, 29x1 O ⁇ U.mL " 1 (white symbols).
  • FIG. 7A shows the effect of hyaluronic acid on the viscoelasticity (G ': squares, G ": triangles) of chemical gel containing collagenase (2.32XiO -4 U / mL) and transglutaminase (1 , 5 U / ml) at a given frequency (6.3 rad.s -1 ) as a function of time, 1% hyaluronic acid (black symbols) and gelatin alone (white symbols).
  • FIG. 7B shows the evolution of the viscoelastic properties (G 1 : squares, G ": triangles) of the chemical gels, in the presence of hyaluronic acid (1%) and as a function of time, transglutaminase containers (1, 5 U / ml) and different concentrations of collagenase: 2.06 x 10 -4 U.mL -1 (black symbols), 2.32 x 10 -4 U.mL -1 (gray symbols), 2.58 x 10 -4 U-InL "1 (white symbols).
  • FIG. 7B shows the evolution of the viscoelastic properties (G 1 : squares, G ": triangles) of the chemical gels, in the presence of hyaluronic acid (1%) and as a function of time, transglutaminase containers (1, 5 U / ml) and different concentrations of collagenase: 2.06 x 10 -4 U.mL -1 (black symbols), 2.32 x 10 -4 U.mL -1 (gra
  • FIG. 9 represents the influence of the degradation of hyaluronic acid (1%) on the viscoelasticity (G ': squares, G ": triangles) of chemical gel containing transglutaminase (1.5 U / ml) and collagenase (2.32XIfX 4 U / mL), at a given frequency (6.3 rad.s -1 ) as a function of time.
  • G ' squares, G ": triangles
  • transglutaminase 1.5 U / ml
  • collagenase (2.32XIfX 4 U / mL
  • FIG. 10 represents the release, as a function of time, at 40 ° C., of azure from different gelatin gels (7%) obtained with 1 U / ml of transglutaminase.
  • hyaluronic acid black bar
  • 1% hyaluronic acid gray bar
  • 1% hyaluronic acid white bar
  • 15U / mL of hyaluronidase white bar
  • Example 1 Process for preparing a biomaterial according to the invention
  • Type A1 gelatin was used in this example. It is marketed by SIGMA (registered trademark) (G2500) and comes from pigskin. Its extraction procedure is an acid treatment, its pHi is 8. Finally, it has a Bloom index of 300.
  • the hyaluronic acid used in this example is produced by the bacterium Steptrococcus Equi species. It was obtained by Fluka (Registered Trade Mark) (48178). It is a polysaccharide of about 1 million daltons. The carboxyl pKa of glucuronic acid is 2.4.
  • the alginate used in this example is extracted from the seaweed Macrocystis pyrifera. It is marketed by SIGMA (Registered trademark) (A 2158).
  • the fibrinogen used in this example is a type IV fibrinogen of bovine origin. It is marketed by SIGMA (registered trademark) (F 4753). It is 68% pure
  • the transglutaminase (TG) used was produced by Ajinomoto under the name Activa WM (registered trademark). It is secreted by the bacterium Sterptoverticillium sp. Its molecular weight is 43,000 and it has an activity of 100 ⁇ g -1 at 40 ° C.
  • the collagenase used in the examples is a zinc metalloprotease type IA, isolated from Clostridium histolyticum (Sigma, registered trademark, C-9891). Its molecular weight is 116,000. The maximum activity of the enzyme is obtained in the presence of CaCl 2 and NaCl. These elements have been shown to interfere with gelatin (results not provided), they have not been used in the collagenase activity assays in the examples of the present application.
  • Thermolysin is a type X protease isolated from Bacillus thermoproteolyticcus rokko (provided by SIGMA, P-1512). It is a zinc metalloprotease and its molecular weight is 34,600.
  • Trypsin is a serine protease isolated from the bovine pancreas. It is marketed by SIGMA (Registered Trade Mark), T-1426. It has a MW of 23,800. Prior to its conditioning by the preparer, the enzyme was treated with 2-1 tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl ketone (TPCK). ) to reduce chymotrypsin activity present with trypsin. Alginate lyase is extracted from Flavobacterium sp. It has an activity of 38730 U / g, it is marketed by SIGMA (registered trademark). (To 1603).
  • SIGMA registered trademark
  • the thrombin used is extracted from the bovine plasma, it has an activity of 34.8 U / mg. It is marketed by the SIGMA company. (T 4648).
  • a / Process for preparing a biomaterial comprising a first polymer network, a second polymer and a first enzyme a)
  • a biomaterial is manufactured comprising a first polymer network which is a gelatin gel, the second polymer which is hyaluronic acid and a first enzyme which is hyaluronidase.
  • the samples were prepared with a concentration of 7% gelatin, 1% hyaluronic acid (weight / volume ratio) and various concentrations of hyaluronidase (1, 5 and 10 U / ml).
  • the gelatin powder was incubated with 50 mM Tris-HCl buffer at pH 7.4 and stored for 15 minutes at 40 ° C., the hyaluronic acid is then deposited on the surface of the solution.
  • the preparation was then solubilized with stirring at 40 ° C. maximum for 15 minutes.
  • a hyaluronidase solution previously prepared in the same buffer at an initial concentration at least five times higher than the final concentration, is mixed with the gelatin and hyaluronic acid preparation.
  • a temperature ramp of 40 ° C. to 27 ° C. was applied to the solution, with a temperature drop of 0.5 ° C. per minute.
  • a biomaterial is produced comprising a first polymer network which is a gelatin gel, the second polymer which is alginate and a first enzyme which is alginate lyase.
  • the biomaterial consists of 5% gelatin, 1% alginate and 0.2 U / ml alginate lyase.
  • a 50 mM Tris-HCl buffer solution at pH 7.4 is added to gelatin powder.
  • An alginate solution is prepared beforehand (in the same buffer) and added to the gelatin. The mixture is incubated for 30 minutes at 40 ° C.
  • a solution of alginate lyase is then added to the reaction medium and the mixture is incubated at 27 ° C.
  • a biomaterial is made comprising a first polymer network which is an alginate gel, the second polymer which is gelatin and a first enzyme which is either collagenase, trypsin or thermolysin.
  • the biomaterial consists of 1% alginate, 1% gelatin and a protease.
  • Sodium alginate (0.1g) was dissolved in a freshly prepared solution of calcium-EDTA (282 mg CaCl 2 .2H 2 ⁇ and 798 mg Na 4 EDTA.2H 2 O in 10 mL) without heating.
  • a solution of 5% gelatin is prepared in water, the mixture is stored at 4 ° C for at least 4 hours before use.
  • the solutions are mixed so as to obtain final concentrations of 1% of alginate and 1% of gelatin, the mixture is incubated at 40 ° C. for 30 min.
  • a 3M solution of D-Glucono- ⁇ -lactone is prepared extemporaneously and 312 ⁇ L of the above mixture is added at the same time as the protease.
  • the concentration of final collagenase is 1, 12 ⁇ 10 5 U / ml.
  • the final concentration of thermolysin is 3.25. 10 "4 UZmI.
  • the final concentration of trypsin was 2.46. 10" 4 UZmI
  • the mixture is incubated at 40 0 C and then the gelatin is in the form of solution. If the mixture is incubated at a temperature of 25 ° C. or 10 ° C., the gelatin is in gel form.
  • B / Process for preparing a biomaterial comprising a first polymer network, a second polymer, a first enzyme and a second enzyme
  • a biomaterial comprising a first polymer network which is a gelatin gel, the second polymer which is hyaluronic acid, a first enzyme which is hyaluronidase and a second enzyme which is either collagenase or trypsin, ie thermolysin.
  • the biomaterials are prepared with the same experimental protocol as the biomaterial presented in Aa) and the protease (either collagenase, trypsin or thermolysin) is added to the gelatin solution.
  • the volume of the enzyme samples corresponds to at least 20% of the final volume, in order to optimize the distribution in the gelatin solution.
  • a single solution containing the first and the second enzyme is prepared in a water bath with electromagnetic stirring at 40 ° C. before being added to the gelatin.
  • the final collagenase concentration is 1.12 ⁇ 10 -4 U / ml
  • the final concentration of thermolysin is 3.25 ⁇ 10 -3 U / ml.
  • the final concentration of trypsin is 2.46. 10 3 U / ml.
  • a biomaterial comprising a first polymer network, a second polymer, a first enzyme and a third enzyme.
  • a biomaterial is made comprising a first polymer network which is a gelatin gel, the second polymer which is hyaluronic acid, a first enzyme which is hyaluronidase, and a third enzyme which is transglutaminase.
  • the samples were prepared with a concentration of 7% gelatin, 1% hyaluronic acid (weight to volume ratio), 1.5 U / ml of transglutaminase and different concentrations of hyaluronidase (1, 5 and 10 U / ml).
  • the gelatin powder was incubated with 50 mM Tris-HCl buffer at pH 7.4 and stored for 15 minutes at 40 ° C., the hyaluronic acid then being deposited on the surface of the solution.
  • the preparation was then solubilized with stirring at 40 ° C. maximum for 15 minutes.
  • a biomaterial is made comprising a first polymer network which is a fibrin gel, the second polymer which is hyaluronic acid, a first enzyme which is hyaluronidase, and a third enzyme which is thrombin.
  • the biomaterial contains 4.8 mg / mL fibrinogen, 0.24 mg / mL hyaluronic acid, 0.2 U / mL thrombin, 1 U / mL hyaluronidase, 2x10 2 mol / L CaCl 2 and 15x10 2 mol / L NaCl. All the constituents are dissolved in Tris-HCl buffer 50 mmol / L at pH 7.4 and preheated to 37 ° C. The fibrinogen is first mixed with CaCl 2 , NaCl and hyaluronic acid. Then the solution of thrombin and hyaluronidase is added to the reaction medium and the mixture is incubated at 37 ° C.
  • D / A method of manufacturing a biomaterial comprising a first polymer network, a second polymer, and a first, a second and a third enzyme.
  • a biomaterial comprising a first polymer network which is a gelatin gel, the second polymer which is hyaluronic acid and a first enzyme which is hyaluronidase, a second enzyme which is either collagenase or trypsin, ie thermolysin and a third enzyme which is transglutaminase.
  • This biomaterial is prepared as Ca) but this time a protease (either collagenase or trypsin or thermolysin) is added to the enzymatic mixture of transglutaminase and hyaluronidase.
  • the concentration of final collagenase is; 2,32.1CT 4 ; U / ml.
  • the final concentration of thermolysin is 6.5. 10 3 U / ml.
  • the final concentration of trypsin was 4.35. 10 ⁇ 3 U / ml.
  • the first polymer network is a gelatin gel, with or without the second enzyme which is collagenase and the third enzyme which is transglutaminase.
  • the samples were prepared with a concentration of 5% gelatin, 1 U / ml transglutaminase 0.1 mg / ml eosin (Sigma) and optionally 3.5. 10 "5 U / ml collagenase The gelatin powder was incubated with 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.4 containing eosin and stored for 15 minutes at 40 ° C. It was then solubilized with stirring at a maximum of 40 ° C. for 15 minutes A solution of transglutaminase and optionally collagenase, previously prepared in the same buffer at an initial concentration at least five times higher than the final concentration, is mixed with the gelatin preparation.
  • the purpose of this example is to show that gels not comprising a second polymer do not allow the controlled release of low molecular weight substance.
  • the gel containing the collagenase was formed in thirty minutes and became liquid again (solubilization time) in about twenty hours.
  • a second gel was also formed.
  • This second gel was composed of 5% gelatin, 1 U / ml of transglutaminase.
  • the release of eosin was monitored over time by spectophotometry at 517 nm, the signal increase is directly correlated to the release of eosin.
  • the release of eosin by the gel is continuous ( Figure 1) in the presence or absence of collagenase in the gel.
  • biomaterials used in this example are identical to those used in Example 2 except that eosin was replaced by Dextran blue (MW 2,000,000) to a final concentration of 5 mg / ml.
  • the monitoring of the release of dextran blue was carried out by spectophotometry at 620 nm, the increase of the signal is directly correlated with the release of dextran blue.
  • the release of molecules present in gels depends on the viscoelastic properties of the gel.
  • the release of active substance is only related to the resolubilization time of the gel. The release of active substance during the gel phase is therefore not controlled.
  • Example 4 Method for studying the elasticity and viscosity of the biomaterial
  • rheology The definition of rheology was established in 1929 by the American Society of Rheology. It includes all studies on the flow and deformation of materials. Its principle consists in applying a constraint (elongation, compression, shear, ...) to a sample and results in the deformation of this one. The relationship between stress and deformation depends on the intrinsic properties of the sample and the external conditions. The deformation used in rheology studies is the shearing motion. A particularly simple example of shearing relates to the movement of a sample between two flat surfaces, one of which is stationary and the other endowed with a displacement parallel to itself.
  • Oscillatory or dynamic analysis consists in imposing a shearing motion that oscillates with a given pulsation, ⁇ .
  • the stress (T) and the deformation (y) evolve sinusoidally over time, with the same pulsation but with a certain phase shift.
  • This ratio is called shear modulus. It is a complex number consisting of an elastic component (the module of conservation) and a viscous component (the loss module). Modules have the dimension of a constraint with a unit in Pascal (Pa).
  • phase shift ⁇ is connected to these two components by:
  • the conservation module is also called elastic module. It is clear that if ⁇ is between 0 and 45 °, the material has a more elastic behavior than viscous, whereas it is the opposite if ⁇ is between 45 and 90 °.
  • Gelling processes are characterized by a freeze point, which corresponds to the fraction of links created necessary for the formation of the gel.
  • the freezing time is determined by the time it takes to reach the freezing point.
  • the freezing time can be considered as the time required for the phase angle ⁇ , between a stress and an oscillating deformation, to reach a value of 45 ° and therefore that the ratio G 1 VG 'equals 1 .
  • the ratio G 1 VG 'equals 1 In that case :
  • This definition of the freezing point takes into account that the relaxation times are infinite in the linear domain of the gel and therefore that the viscoelastic parameters are independent of the measurement conditions.
  • the rheometer used is a RheoStress 150 from ThermoElectron (Trade Mark).
  • the rheometer system is cone / plane, with an imposed deformation (an imposed constraint is possible).
  • the control of the actual deformation was carried out by an iterative method which consists of applying a torque (a constraint) and recording the resulting deformation until obtaining the good deformation.
  • Two cones were used for the experiments. They are both made of titanium and have an angle of 2 °. On the other hand, they differ in their diameter, 35 mm for one and 60 mm for the other.
  • the rheometer was connected to an F6 cryostat (ThermoElectron) which thermostats the support on which the sample is based. In order to avoid evaporation, a system is used which consists in creating a humid chamber. In addition, silicone oil (50 mPa.s) was added in the channel of the support to avoid as much as possible the exchanges between the samples and the air.
  • F6 cryostat ThermoElectron
  • Rhéowin Trademark
  • Example 5 Study of the effect of the degradation of the second polymer on the polymer network.
  • the purpose of this example is to demonstrate the effect of the degradation of the second polymer by the first enzyme on the biomaterial of the invention.
  • the biomaterial tested comprises:
  • gelatin as the first polymer, gelatin and therefore as the first polymer network: a gelatin gel (gel (A)
  • hyaluronidase different concentrations were added to a solution of 7% gelatin and 1% hyaluronic acid. A temperature ramp of 40 ° C. to 27 ° C. was then applied for the gelation.
  • the hyaluronidase concentrations used are 1, 5, and 10 U / mL. This concentration range made it possible to evaluate the possible effect of the degradation of hyaluronic acid on the gelation, but also to quantify these effects.
  • a solution containing 1% of hyaluronic acid, 7% of gelatin and 1 U / ml of hyaluronidase was gelled according to the method described in Example 1. The formation of triple helices, over time, was followed in polarimetry and compared with that of the same solution in the absence of the enzyme.
  • the polarimeter used is a Jasco 1100 (registered trademark), equipped with an external cryostat Julabo F 25 with the temperature controlled by computer. It measures the angle with an accuracy of 0.001 °.
  • the glass cell used has an optical path of 0.1 dm and a volume of 1 ml.
  • the tank can be thermostated, thanks to a water jacket connected to the cryostat. The temperature, thus regulated, was measured directly in the tank by means of a probe connected to the polarimeter. All measurements of the study were made at 436 nm.
  • a computer has been connected to the polarimeter and software records the angle and temperature in the tank as a function of time.
  • the Jasco software is the “Spectra Manager” (registered trademark) while the cryostat is managed from the software "Julabo EasyTemp” (registered trademark).
  • the kinetics of formation of triple helices of gelatin are identical whatever the type of gel. After 900 minutes, the triple helix content varies between 25.5 and 27%.
  • Example 6 Study of the effect of the degradation of the second polymer on the first polymer network formed by the third enzyme.
  • a biomaterial comprising a first polymer network which is a gelatin gel, the second polymer which is hyaluronic acid, a first enzyme which is hyaluronidase, and a third enzyme which is transglutaminase.
  • the hyaluronidase concentrations used are 1, 5 and 10 U / mL
  • the degradation of I 1 AH has an effect on the value of G 'only on the shortest time. This is because the faster the solution gels, the faster G 1 increases. But whether it is after 900min or even from 150min, the G 'of the different samples are equivalent to that of the gel not containing HA. Whatever the state of degradation of the polysaccharide, it has no influence on the covalently bridged gelatin network.
  • the purpose of the example is to highlight the effect of the second polymer and the second enzyme on the gel (A).
  • the biomaterial tested comprises:
  • gelatin as the first polymer, gelatin and therefore as the first polymer network: a gelatin gel (gel (A)),
  • collagenase As the second enzyme: collagenase,
  • the samples were prepared with a concentration of 7% gelatin, 1% hyaluronic acid (weight-to-volume ratio) and different final concentrations of collagenase: 0.95. 10 ⁇ ; 1.12.10 "4;. 1, 29.10 ⁇ U / ml
  • the gelatin powder was incubated with Tris-HCl buffer 50mM pH 7.4 and stored for 15 minutes at 4 0 C, hyaluronic acid is then deposited on the surface of the solution It was then solubilized with stirring at a maximum of 40 ° C. for 15 minutes
  • a collagenase solution previously prepared in the same buffer at an initial concentration at least five times greater than the final concentration, is mixed with the gelatin and hyaluronic acid preparation.
  • the purpose of the example is to know if the double transition sol / gel then gel / sol catalyzed by the action of the second (collagenase) and third enzyme (transglutaminase) on the first polymer network (gelatin gel), is influenced by the presence of the second polymer (AH).
  • the samples were prepared with a concentration of 7% gelatin, 1% hyaluronic acid (weight / volume ratio), 1.5 U / ml of transglutaminase and various final concentrations of collagenase (2, 06. 10 "4; 2,32.1U”4;. 2,58.1U “4 U / ml) the gelatin powder was incubated with buffer Tris-HCl 50 mM pH 7.4 and stored for 15 minutes at 4 0 C, hyaluronic acid, is then deposited on the surface of the solution. It was then dissolved with stirring at 40 0 C for up to 15 minutes.
  • a solution of hyaluronidase and transglutaminase is mixed with the gelatin and hyaluronic acid preparation.
  • the gelatin / HA system gels in 3.1 min while the gelatin system alone gels in 15 min.
  • the maximum viscoelasticity is also strongly increased in the presence of the polysaccharide since the value of G ' max is 264 Pa (50 Pa without AH) and that of G " max is 61.7 Pa (4.4 Pa without AH).
  • the total resolubilization time of the gel is 396 minutes against 152 minutes in the other case (FIG. 7).
  • the intrinsic viscoelasticity of hyaluronic acid thus causes the viscoelasticity of the system to increase more rapidly during gelation to give a stronger gel and finally limits its resolubilization by collagenase.
  • the double sol / gel (A) gel (A) / sol transition catalyzed by the action of the second and third enzymes on the first polymer network is influenced by the presence of the second polymer.
  • the purpose of the example is to know if the double transition sol / gel gel / sol catalyzed by the action of the second enzyme (collagenase) on the first polymer network (gelatin gel), is influenced by the degradation of the second polymer (AH) by the first enzyme (hyaluronidase).
  • the biomaterial is prepared according to the protocol of Example B.
  • Example 10 Study of the effect of the degradation of the second polymer by the first enzyme combined with the action of the second enzyme on the gel (A) formed by a third enzyme.
  • the purpose of the example is to know if the double transition sol / gel gel / sol catalysed by the action of the second enzyme (collagenase) on the polymer network (gelatin gel) formed by a third enzyme (transglutaminase) , is influenced by the degradation of the second polymer (AH) generated by the first enzyme (hyaluronidase).
  • the biomaterial is prepared according to the protocol of Example D.
  • the biomaterial tested includes:
  • gelatin as the first polymer, gelatin and thus as the first polymer network: a gelatin gel (gel (A))
  • transglutaminase As the third enzyme: transglutaminase, and
  • gelatin is at a concentration of 7% and transglutaminase at 1 U / ml in the various gels.
  • hyaluronic acid is at a concentration of 1% and hyaluronidase at 15 U / mL.
  • An enzymatic solution (either transglutaminase alone or transglutaminase and hyaluronidase) prepared in the same buffer is then mixed with the gelatin solution. The mixture is placed at 40 ° C.
  • a gel containing gelatin and transglutaminase (TG) and azure was thus obtained.
  • a gel comprising gelatin, Hyaluronic acid (HA), transglutaminase (TG) and azure were obtained.
  • a gel comprising gelatin of hyaluronic acid (HA) and transglutaminase (TG), hyaluronidase and azure was obtained.
  • a measurement of the release of azure as a function of time and as a function of the gel was carried out (FIG. 10) by measuring the optical density (OD at 630 nm) of the medium in which the different gels were located.
  • Example 12 release of hyaluronic acid by the biomaterial according to the invention
  • the biomaterial tested includes:
  • gelatin as the first polymer, gelatin and therefore as the first polymer network: a gelatin gel (gel (A)),
  • biomaterials all contain 3% gelatin and were obtained by incubation at 20 ° C.
  • hyaluronic acid is at a concentration of 1% and hyaluronidase at 15U / ml.
  • the gel was obtained by the following method: a solution of 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.4 was added to gelatin powder. A solution of hyaluronic acid at 1.5% was then added to the gelatin solution, and the mixture was incubated at 40 0 C for 15 min. For the gel containing hyaluronidase, a solution containing the enzyme, prepared in the same buffer, was then mixed with the gelatin solution and the mixture is placed at 20 ° C.
  • the release of hyaluronic acid from the gels was evaluated in polarimetry.
  • the polarimeter used was identical to that of Example 5. This release of substance is controlled according to the size and is controlled over time.
  • the biomaterial of the invention therefore allows a controlled release of hyaluronic acid included in a gelatin gel.
  • the modulation of the release of substance contained in the aqueous phase of a single gel is carried out by modifying the viscosity of the aqueous phase.
  • the biomaterial of the invention thus allows a controlled release of substances.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un biomatériau comprenant une phase aqueuse, un réseau de polymères, un second polymère inclus dans ce réseau et au moins une enzyme de dégradation du second polymère. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un biomatériau comprenant une phase aqueuse et un premier réseau de polymères constitué d'un premier polymère protéique ou saccharidique ou d'un mélange de premiers protéique ou saccharidique, dans lequel le premier réseau de polymères et la phase aqueuse forment un premier gel (A), le biomatériau comprenant : un second polymère protéique ou saccharidique ou un mélange de seconds polymères protéiques ou saccharidiques, soit en solution dans la phase aqueuse du gel (A), soit sous la forme d'un gel (B), et une première enzyme de dégradation dudit second polymère ou réseau de seconds polymères. La présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication des biomatériaux, ainsi qu'à des utilisations du biomatériau, notamment pour la libération de substances actives et à un dispositif de libération contrôlée de substances actives comprenant le biomatériau. Elle trouve notamment des applications dans les domaines cosmétique et pharmaceutique.

Description

BIOMATERIAU PERMETTANT LA DELIVRANCE CONTROLEE
D'ACTIFS
DESCRIPTION
Domaine technique de l'invention
La présente invention se rapporte à un biomatériau comprenant une phase aqueuse, un réseau de polymère, un second polymère indu dans le réseau et au moins une enzyme de dégradation du second polymère.
La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation dudit biomatériau.
La présente invention se rapporte à des utilisations du biomatériau, notamment pour la libération de substances actives et à un dispositif de libération contrôlée de substances actives comprenant le biomatériau.
Le biomatériau de l'invention trouve notamment des applications dans les domaines cosmétique et pharmaceutique.
Etat de la technique antérieure
Les gels sont utilisés du fait de leurs propriétés particulières dans de nombreux domaines, notamment alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Un gel est composé d'au moins deux composants dont l'un, très fortement majoritaire, correspond à un solvant liquide et l'autre est un composant que l'on peut qualifier de solide. Les deux composants sont continus à travers tout le milieu. La phase dite solide, constitue un réseau qui emprisonne la phase dite liquide correspondant au solvant, et l'empêche de s'écouler. L'ensemble du milieu se comporte comme un solide mou et élastique facile à déformer. Les gels sont classifiables selon le type de liens qui forment le réseau. Ainsi deux grands mécanismes de gélification se distinguent qui conduisent à des gels "physiques" ou à des gels "chimiques".
À partir d'une solution ou d'une dispersion à l'état liquide, la formation du gel est le résultat de la formation d'un réseau solide continu. On appelle cette transformation la transition solution/gel.
Un gel physique est un assemblage supramoléculaire constitué par des molécules liées entre elles par des liaisons de faible énergie (Van der Waals, liaisons hydrogènes, polaires, etc.). La stabilité de cet assemblage est associée à une plage précise de conditions physico-chimiques (pH, concentration en molécules, température, qualité du solvant, force ionique, etc.). En dehors de cette plage, le mélange est liquide. La transition sol/gel est donc réversible pour les gels physiques. Ainsi, une modification des paramètres du milieu peut entraîner la destruction de l'édifice et induire une transition gel-sol. Il est bien connu de l'art antérieur des compositions pour obtenir des gels "physiques". Les biogels sont obtenus essentiellement à partir de macromolécules ou polymères d'origine naturelle: protéines ou polysaccharides.
On connaît également dans l'état de l'art des gels qualifiés de "chimiques". Un gel chimique correspond à un assemblage supramoléculaire dont les molécules sont associées par des liaisons de forte énergie (covalentes). La stabilité de cet assemblage est donc très grande. Ces gels chimiques présentent une stabilité améliorée, le seul moyen d'effectuer une transition gel/solution consistant à détruire les liaisons covalentes du réseau. C'est pourquoi, la transition sol/gel des gels chimiques est dite irréversible.
Une famille de gels chimiques correspond aux gels catalysés enzymatiquement. Ce mode de gélification est surtout observé dans les grands processus biologiques. La coagulation sanguine, la cicatrisation, la formation de peau, l'assemblage des matrices extracellulaires sont des processus biologiques où le passage des protéines solubles à l'état de gel est indispensable. In vivo, un nombre limité d'enzymes par exemple les lysyloxydases, les transglutaminases, catalysent ces réactions. In vitro, la plus utilisée est la transglutaminase qui crée des ponts covalents entre les chaînes latérales des résidus lysine et glutamine des protéines.
Les Tgases catalysent ainsi la polymérisation des protéines responsables de la formation des réseaux gélifiés biologiques, Cette famille de protéines est ubiquitaire et on la retrouve aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Les Tgases permettent d'obtenir des gels à partir de nombreuses protéines dans l'industrie alimentaire, et notamment pour la fabrication du surimi ou le durcissement de nombreux dérivés carnés (Jambon, nourriture reconstituée, etc.). On peut citer, à titre d'exemples de protéines polymérisables, la gélatine, la fibrine, la gliadine, la myosine, la globuline (7S et 11S), l'actine, la myoglobine, les protéines du petit lait, notamment les caséines et la lactaglobuline, les protéines du soja, du blé et notamment la gluténine, du jaune et du blanc d'œuf, et notamment l'ovalbumine.
Un des gels protéiques les plus utilisés est le gel de gélatine. La gélatine est obtenue à partir du collagène qui est une protéine de structure. Le collagène est une molécule organisée en triple hélice. Ces triples hélices peuvent s'associer en fibrilles qui peuvent s'associer en fibres. La triple hélice de collagène est instable à la température du corps. La gélatine est obtenue par dénaturation du collagène. Les tissus contenant du collagène subissent ainsi un traitement acide ou alcalin, qui aboutit à la dénaturation de la triple hélice du collagène. La possibilité de faire des fibres est alors totalement perdue. Un traitement acide aboutit à la formation de gélatine de type A et un traitement alcalin à une gélatine de type B. La solution de gélatine est donc composée de chaînes isolées de collagène. Les utilisations de la gélatine étant multiples, il est parfois nécessaire de créer des gels de gélatine dans des conditions où les gels physiques n'existent pas (hautes températures, pH extrême ou force ionique particulière). Pour former le réseau nécessaire au gel, les chaînes de gélatine sont alors pontées par des liens covalents, et notamment par l'action des Tgases. Les gels ainsi obtenus sont des gels chimiques.
Une plus grande maîtrise des propriétés mécaniques des différents gels chimiques constitue donc un enjeu essentiel pour étendre leur potentialité.
L'analyse du vivant a révélé l'existence de systèmes extrêmement dynamiques. Dans les tissus vivants, les cellules sont en interaction avec une structure appelée la matrice extracellulaire (MEC)1 riche en protéines et assimilable à un gel au niveau macroscopique. Cette structure est principalement localisée sous les cellules épithéliales et autour des tissus conjonctifs. Les cellules peuvent synthétiser différents composants de la matrice extracellulaire tels que le collagène qui confère sa rigidité à la MEC ou la fibronectine qui intervient dans les mécanismes de l'adhérence cellulaire. Parallèlement, la cellule produit également des protéases qui engendrent la dégradation de la matrice extracellulaire. La cellule intervient donc simultanément dans la construction et la dégradation de la matrice extracellulaire. La structure de la matrice extracellulaire n'est donc pas une structure irréversible et statique mais correspond à un équilibre dynamique résultant de la balance entre les activités de construction et de dégradation des protéines synthétisées par la cellule.
De la même manière, les caillots formés suivant le mécanisme de coagulation sanguine constituent également des systèmes dynamiques. Ainsi, par une cascade de réactions enzymatiques, un caillot est formé à partir de protéines solubles s'organisant en réseau insoluble. Ce caillot sera ensuite éliminé au cours d'une autre réaction enzymatique..
Dans ces équilibres dynamiques, les réseaux de protéines s'associent pour devenir insolubles et former des gels, ce qui peut être assimilé à des transitions solution/gel. Dans le même temps, les réseaux protéiques sont également détruits par l'action de protéases, ce type de transition pouvant cette fois être assimilé à des transitions gel/solution. On assiste ainsi parfois à des transitions successives comme dans la coagulation où le caillot est formé en premier lieu, puis dégradé.
La transition solution/gel dans ces processus biologiques est le plus souvent associée à la famille des transglutaminases mentionnée précédemment. La transition opposée, à savoir gel/solution est associée à l'activité antagoniste d'enzymes de type protéolytique.
Une des familles les plus étudiées est celle des métalloprotéinases de la matrice (MMP). Elles forment une famille d'endopeptidases dépendantes du zinc qui dégradent la plupart des protéines de la matrice extracellulaire. Il existe toutefois un grand nombre de protéases différentes. On peut citer, à titre d'exemple de familles de protéases, les serines protéases, telles que la trypsine, la matriptase, les Cystéines et Aspartate protéases, telles que les cathepsines B et L et les cathepsines D et G, les métalloprotéases et la famille ADAM.
Un grand nombre des enzymes orchestrant ce type de réaction, comme les transglutaminases ou encore les métalloprotéases sont caractérisées par les biochimistes et les enzymologistes.
Des gels présentant la capacité de transition solution/gel et gel/solution sont décrits dans le document WO 2006/056700 Ces gels comportent une phase aqueuse, un polymère et des enzymes capables de dégrader le polymère et de polymériser des monomères afin de former ledit polymère. Dans le document WO 2006/056700, les "monomères" peuvent être des macromolécules biologiques ou polymères. De plus dans ce document le terme "polymère" s'applique à un "réseau de polymères".
Les gels de l'état de la technique présentent des cinétiques de gélification et de resolubilisation programmées. Par ailleurs, les gels de l'état de la technique présentent des caractéristiques physiques maîtrisées, par exemple leur viscoélasticité. De plus, les caractéristiques physiques du réseau solide et de la phase aqueuse formant les gels de l'état de la technique sont modifiées de façon indissociable et simultanée. Ces inconvénients limitent le champ d'application de ces gels du fait de leurs caractéristiques physiques. Il est par exemple impossible selon l'état de la technique de modifier le réseau solide sans modifier la phase aqueuse ou de modifier la phase aqueuse sans modifier le réseau solide de gel.
Il existe donc un réel besoin de nouveaux biomatériaux, notamment sous forme de gels, dont on puisse modifier de façon contrôlée les propriétés physiques d'une seule des deux phases constituant le gel.
Il existe également un besoin de nouveaux biomatériaux gélifiés capables d'incorporer des molécules, notamment des molécules actives (par exemple cosmétique et/ou pharmaceutique), et de libérer de façon programmée ces molécules en modifiant de façon contrôlée les propriétés physiques d'une seule des deux phases constituant le biomatériau gélifié
Exposé de l'invention
L'invention permet précisément de répondre à ces besoins de l'art antérieur et de surmonter ces inconvénients en fournissant un biomatériau dans lequel les propriétés viscoélastiques du gel peuvent être modifiées et dans lequel la modification de ces propriétés est programmée.
La présente invention a notamment pour objet un biomatériau comprenant une phase aqueuse et un premier réseau de polymères constitué d'un premier polymère protéique ou saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères protéiques et/ou saccharidiques, dans lequel le premier réseau de polymères et la phase aqueuse forment un premier gel (A), le biomatériau comprenant :
(i) un second polymère protéique ou saccharidique ou un mélange de seconds polymères protéiques ou saccharidiques, le second polymère étant différent du premier polymère, et étant inclus dans le gai (A) soit en solution dans la phase aqueuse du gel (A), soit sous la forme d'un second réseau de polymères constituant un gel (B),
(ii) une première enzyme de dégradation dudit second polymère. Selon l'invention, par « réseau » il est entendu une association de molécules. Cette association entre les molécules peut être assurée par des interactions fortes ou faibles (liaisons covalentes, liaisons hydrogène, Van der Waals etc). Dans le cas de liaisons covalentes, l'association est une réticulation et le réseau est dit « réticulé ». Par polymère on entend une macromolécule, par exemple un polymère protéique ou saccharidique. Un réseau de polymères est une association de polymères protéiques ou une association de polymères saccharidiques. Le réseau de polymères peut constituer un gel.
Selon l'invention, par « phase aqueuse », il est entendu une solution aqueuse, par exemple de l'eau, par exemple encore une solution aqueuse tamponnée, par exemple à un pH souhaité, par exemple au moyen d'un tampon phosphate ou Tris ou tout tampon approprié connu de l'homme du métier comme tampon. Il peut s'agir, par exemple, d'un milieu permettant l'activité de la ou des enzymes présente(s) dans le biomatériau.
Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut être constitué d'un premier polymère protéique. Ce premier polymère protéique peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant la fibrine, la gliadine, la myosine, la globuline (7S et 11S), l'actine, la myoglobine, le collagène et ses dérivés, les protéines du lait, les protéines du soja, les protéines du blé, et les protéines du jaune et du blanc d'œuf, les protéines du pois, les protéines de féverole, les protéines du lin, les protéines de soie, la fibronectine, la laminine, l'élastine, la vitronectine, ou un mélange de ces polymères. Ce premier réseau de polymères peut donc être constitué d'un seul premier polymère protéique ou d'un mélange de premiers polymères protéiques.
Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut être constitué d'un premier polymère saccharidique. Ce premier polymère saccharidique peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant les carraghénanes, les alginates, le xanthane, le chitosan, la chitine, l'acide hyaluronique, les glycosaminoglycanes sulfatés, le glycogène, la cellulose^ et ses dérivés, les pectines, l'amidon et ses dérivés, les dextrans et les xylanes, ou un mélange de ceux-ci. Ce premier réseau de polymères peut donc être constitué d'un seul premier polymère saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères saccharidiques.
Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut également être constitué d'un mélange de premiers polymères protéiques et saccharidiques, choisi par exemple dans les groupes précités de polymères protéiques et saccharidiques.
Selon l'invention, le premier réseau de polymères peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant les gels de gélatine, de fibrine et d'alginate, étant entendu que ce premier réseau de polymères est constitué de polymères différents des seconds polymères.
Selon l'invention, la quantité du premier réseau de polymères ou mélange de premiers polymères peut-être comprise par exemple entre 0,1 et 20% en poids par rapport au poids total du biomatériau, de préférence de 0,5 à 10% en poids.
Selon l'invention, le second polymère est différent du polymère constituant le premier réseau de polymères. Ce second polymère peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant la fibrine, la gliadine, la myosine, la globuline (7S et 11S), l'actine, la myoglobine, le collagène et ses dérivés, les protéines du lait, les protéines du soja, les protéines du blé, et les protéines du jaune et du blanc d'œuf, les protéines du pois, les protéines de féverole, les protéines du Nn, les protéines de soie, la fibronectine, la laminine, l'élastine, la vitronectine, ou un mélange de ces polymères. Ce second polymère peut donc être constitué d'un seul polymère protéique ou d'un mélange de polymères protéiques.
Selon l'invention, le second polymère peut-être choisi par exemple dans le groupe comprenant, par exemple, les carraghénanes, les alginates, le xanthane, le chitosan, la chitine, l'acide hyaluronique, les glycosaminoglycanes sulfatés, le glycogène, la cellulose et ses dérivés, les pectines, l'amidon et ses dérivés, les dextrans et les xylanes, ou un mélange de ceux-ci. Ce second polymère peut donc être constitué d'un seul polymère saccharidique ou d'un mélange de polymères saccharidiques.
Selon l'invention, le second polymère peut également être constitué d'un mélange de second polymères protéiques et second polymères saccharidiques, par exemple choisis dans les groupes précités de polymères protéiques et saccharidiques.
Selon l'invention, le second polymère peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant la gélatine, la fibrine, l'acide hyaluronique et l'alginate, étant entendu que ce second polymère est différent du premier.
Selon l'invention, la quantité du second polymère ou mélange de seconds polymères peut être comprise entre 0,01 et 20% en poids par rapport au poids total du biomatériau, de préférence de 0,1 à 10 % en poids .
Selon l'invention, la première enzyme peut-être choisie par exemple dans le groupe comprenant les enzymes de la famille des métalloprotéinases, la famille des serines protéases, la famille des cystéines et aspartate protéases, la famille ADAM, les glycosidases dont l'amylase, la cellulase, la dextranase, la pullulanase, la pectinase, la chitinase, la xanthanase, la chitosanase, la hyaluronidase, et les lyases dont l'hydroxyacétyle lyase, la chondroïtinase, l'héparinase, l'alginate lyase.
Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la première enzyme peut-être comprise entre 2x107 et 50 U/ml, de préférence de 2x 10~6 à 20 U/ml.
Selon l'invention, le biomatériau peut comprendre en outre une seconde enzyme différente de la première enzyme et capable de dégrader le premier réseau de polymères, ledit premier réseau de polymères étant susceptible d'effectuer, sous l'action de ladite seconde enzyme, une transition gel (A) /solution.
Selon l'invention, la seconde enzyme, différente de la première enzyme, peut-être choisie par exemple dans le groupe comprenant les enzymes de la famille des métalloprotéinases, la famille des serines protéases, la famille des cystéines et aspartate protéases, la famille ADAM, les glycosidases dont l'amylase, la cellulase, la dextranase, la pullulanase, la pectinase, la chitinase, la xanthanase, la chitosanase, la hyaluronidase, et les lyases dont l'hydroxyacétyle lyase, la chondroïtinase, l'héparinase, et l'alginate lyase.
Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la seconde enzyme peut être comprise entre 2x107 et 50 U/ml, de préférence de 2x 10^ à 20 U/ml.
Selon l'invention, le biomatériau peut comprendre en outre une troisième enzyme différente des première et deuxième enzymes et capable d'induire des liaisons entre lesdits premiers polymères ou mélange de premiers polymères, ladite troisième enzyme étant susceptible de catalyser une transition solution/gel (A).
Selon l'invention, la troisième enzyme peut-être choisie par exemple dans le groupe comprenant la lysyl oxydase, les transglutaminases, les protéines disulfide isomérases, les sulfhydrile thiol oxydases, les peroxidases, les lipoxygènases, les épimèrases dont les alginates épimèrases, les glucuronate isomérases, la cellobiose épimèrase et les galactose-6-sulfurylases.
Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la troisième enzyme peut-être comprise entre 0,01 et 50 U/ml, de préférence de 0,1 à 5 U/ml.
Selon l'invention, le biomatériau peut comprendre en outre une quatrième enzyme différente des première, deuxième et troisième enzyme et capable d'induire des liaisons entre lesdits seconds polymères ou mélange de seconds polymères, ladite quatrième enzyme étant susceptible de catalyser une transition solution/gel (B).
Selon l'invention, la quatrième enzyme peut être choisie par exemple dans le groupe comprenant la lysyl oxydase, les transglutaminases, les protéines disulfide isomérases, les sulfhydrile thiol oxydases, les peroxidases, les lipoxygènases, les épimèrases dont les alginates épimèrases, les glucuronate isomérases, la cellobiose épimèrase et les galactose-6-sulfurylases.
Selon l'invention, la concentration dans le biomatériau de la quatrième enzyme peut être comprise entre 0,01 et 50 U/ml, de préférence de 0,1 à 5 U/ml.
Selon l'invention, la première, deuxième, troisième et quatrième enzyme sont des enzymes pouvant être, indépendamment, actives ou pouvant être activées
Selon l'invention, la phase aqueuse du biomatériau peut comprendre en outre une substance active. Cette substance active peut se trouver par exemple en solution dans la phase aqueuse du gel (A) et/ou dans le gel (B).
Selon l'invention, par « substance active » on entend toute substance ou composition ayant une activité biologique ou biochimique à la surface d'un organisme (microorganisme ou organisme pluricellulaire, par exemple peau, os, organe, etc.) ou dans un organisme. Cette substance active peut posséder par exemple des propriétés curatives ou préventives à l'égard de maladies humaines ou animales. Il peut s'agir de tout produit pouvant être administré à l'homme ou à l'animal, en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions organiques. Il peut s'agir de substances bactériostatiques et/ou bactéricides, d'antibiotiques, d'aseptisants, de colorants, etc.
Selon l'invention, la substance active peut être choisie par exemple dans le groupe comprenant, les bactériostatiques, les bactéricides, les vasodilatateurs, les colorants dont l'éosine, le bleu de dextran, le bleu de méthylène, le bleu azur, des protéines, des saccharides dont l'acide hyaluronique et les alginates, un liposome, une nanoparticule, une micelle, les antiacnéiques, les antiallergiques, les anxiolytiques, les antiasthmatiques, les anticancéreux, les hypolipémiants , les contraceptifs hormonaux, les antidépresseurs, les antidiabètiques, les antalgiques, les antiasthéniques, les antihypertenseurs, les antifongiques, les antibiotiques, les somnifères, les traitements hormonaux, les antimigraineux, les médicaments du surpoids, les antiparkinsoniens, les neuroleptiques, les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les inducteurs d'ovulation, les fluidifiants bronchiques, les antitussifs, les inducteurs d'ésrection et les antiulcereux.
Selon l'invention, il peut s'agir d'une substance active seule ou d'un mélange de substances actives.
Selon l'invention, la quantité de substance active peut dépendre par exemple de facteurs tels que son activité et de la dose souhaitée par l'utilisateur. La dose souhaitée peut être aisément déterminée par l'homme du métier puisqu'il peut s'agir par exemple de doses connues pour des produits connus.
Selon l'invention, le biomatériau de la présente invention peut donc être utilisé pour la libération contrôlée d'au moins une substance active.
L'invention se rapporte également à un procédé de préparation d'un biomatériau tel que décrit précédemment comprenant les étapes suivantes : a) formation en phase aqueuse d'un premier réseau de polymères constitué d'un premier polymère protéique ou saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères protéiques ou saccharidiques, le premier polymère protéique ou saccharidique ou mélange de premiers polymères protéiques ou saccharidiques formant ledit premier réseau de polymères, b) addition d'un second polymère protéique ou saccharidique ou un mélange de seconds polymères protéiques ou saccharidiques, différent du premier polymère ou du mélange de premiers polymères, l'étape d'addition étant effectuée avant la formation du premier réseau de polymères.
Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé, par exemple, avec des seconds polymères ou un mélange de seconds polymères inclus dans la phase aqueuse du réseau de premiers polymères.
Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé avec des seconds polymères ou un mélange de seconds polymères formant, par exemple, un réseau de seconds polymères inclus dans le réseau de premiers polymères.
Selon l'invention, la formation ou la dégradation des différents polymères ou réseau de polymères peut être induite par l'ajout d'une à quatre enzymes à l'étape b). La concentration de ces différentes enzymes peut permettre, par exemple le contrôle des propriétés viscoélastiques du biomatériau de l'invention.
Selon l'invention, le procédé de l'invention peut être réalisé par exemple à une température comprise entre 10 et 45°C.
Les premiers et second polymères sont tels que définis ci- dessus. La concentration des premiers et/ou des seconds polymères peut également être telle que décrite précédemment.
Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une première enzyme capable de dégrader lesdits seconds polymères ou le second réseau de polymères. La première enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus.
Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une seconde enzyme capable de dégrader les liaisons du premier réseau de polymères. La deuxième enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus. Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une troisième enzyme capable d'induire des liaisons entre lesdits premiers polymères. La troisième enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus.
Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'une quatrième enzyme capable d'induire des liaisons entre lesdits seconds polymères. La quatrième enzyme est définie ci-dessus. Sa quantité est définie ci-dessus.
Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre à l'étape b) l'addition d'au moins une substance active. La substance active est définie ci-dessus.
Selon l'invention, le procédé peut comprendre en outre une étape c) de lyophilisation du biomatériau. Selon l'invention, il peut s'agir également d'une étape de déshydratation. Ces étapes permettent de stocker sur de longues périodes le matériau de la présente invention, pour ensuite le réhydrater pour utilisation.
L'invention se rapporte également à un dispositif de libération contrôlée d'une substance active comprenant le biomatériau de la présente invention.
Selon l'invention, le dispositif de libération peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant les dispositifs médicaux dont les lentilles de contact, les électrodes, les capteurs, les dispositifs pour les soins, les pansements, les compresses imbibées, les bandages, les pansements chirurgicaux, les pansements ophtalmiques, les pansements dentaires, les produits de sutures, les dispositifs pour les thérapies, les articles orthopédiques, les implants chirurgicaux, les patchs, les gels transdermiques, les patchs actifs, les endoprothèses et les implants pour tissus mou, les dispositifs pour l'ingénierie tissulaire, les matériaux de reconstruction, dispositifs pour la culture cellulaire, les milieux de culture des supports de culture. Le biomatériau de la présente invention peut par exemple, remplacer partiellement ou en totalité le matériau utilisé dans les dispositifs précités, notamment le matériau en contact avec la peau, les muqueuses, les organes, les os, les cellules, etc.
Dans le domaine cosmétique, le biomatériau selon l'invention peut ainsi permettre de réaliser de nouveaux cosmétiques tels que des patchs ou des masques de beauté pouvant relarguer une substance, par exemple une substance favorisant le bien être de l'utilisateur ou un actif cosmétique, par exemple l'acide hyaluronique ou le rétinol.
Dans le domaine pharmaceutique ou cosmétique, le biomatériau selon l'invention peut également permettre d'obtenir des gels emprisonnant un principe actif et capables de relarguer ledit principe actif en repassant à l'état de solution avec une cinétique déterminée, par exemple des gels ou des gélules relarguant le principe actif après un temps donné.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront encore à la lecture de la description qui suit, en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
La figure 1 , représente l'évolution de la libération d'Eosine au cours du temps dans un biomatériau selon l'invention, la flèche représente le temps de resolubilisation du gel comprenant la collagénase.
La figure 2 représente le pourcentage de relargage de bleu dextran en fonction du temps dans un biomatériau selon l'invention.
La figure 3 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) du gel physique à une fréquence donnée (6,3 rad.s"1) en fonction du temps en minutes. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs). La figure 4 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%) sur la formation de triples hélices du gel physique en fonction du temps en minutes. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles blancs), sans enzyme (symboles noirs) et gélatine seule (symboles gris).
- La figure 5 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) du gel chimique à une fréquence donnée (6,3 rad.s"1) en fonction du temps en minutes. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs).
La figure 6 A représente l'effet de l'acide hyaluronique sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) d'un gel physique contenant de la collagènase (1 ,12XiO"4 U/mL) à une fréquence donnée (6,3 rad.s"1) en fonction du temps. 1% d'acide hyaluronique (symboles noirs) et gélatine seule (symboles blancs).
La figure 6 B représente l'évolution des propriétés viscoélastiques (G' : carrés, G": triangles) des gels physiques, en présence d'acide hyaluronique (1%) et en fonction du temps, contenant différentes concentrations de collagènase : 0,95XiO"4 U.mL"1 (symboles noirs), 1 ,12XiO-4 U-InL"1 L (symboles gris), 1 ,29x1 O^ U.mL"1 (symboles blancs).
La figure 7 A représente l'effet de l'acide hyaluronique sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) de gel chimique contenant de la collagènase (2,32XiO"4 U/mL) et de la transglutaminase (1 ,5 U/ml) à une fréquence donnée (6,3 rad.s"1) en fonction du temps. 1% d'acide hyaluronique (symboles noirs) et gélatine seule (symboles blancs).
La figure 7 B représente l'évolution des propriétés viscoélastiques (G1 : carrés, G": triangles) des gels chimiques, en présence d'acide hyaluronique (1%) et en fonction du temps, contenants de la transglutaminase (1 ,5 U/ml) et différentes concentrations de collagènase : 2,06XiO"4 U.mL"1 (symboles noirs), 2,32XiO"4 U.mL"1 (symboles gris), 2,58XiO-4 U-InL"1 (symboles blancs). La figure 8 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) du gel physique contenant de la collagènase (1 ,12x10'4 U/mL), à une fréquence donnée (6,3 rad.s"1) en fonction du temps. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs).
La figure 9 représente l'influence de la dégradation de l'acide hyaluronique (1%), sur la viscoélasticité (G' : carrés, G" : triangles) de gel chimique contenant de la transglutaminase (1,5 U/ml) et de la collagènase (2,32XIfX4 U/mL), à une fréquence donnée (6,3 rad.s"1) en fonction du temps. 1 U/mL de hyaluronidase (symboles noirs), 5 U/mL de hyaluronidase (symboles gris foncés), 10 U/mL de hyaluronidase (symboles gris clairs) et gélatine seule (symboles blancs).
La figure 10 représente le relargage, en fonction du temps, à 400C, de bleu azur à partir de différents gels de gélatine (7%) obtenus avec 1 U/mL de transglutaminase. Sans acide hyaluronique (barre noire), avec 1 % d'acide hyaluronique (barre grise) avec 1% d'acide hyaluronique et 15U/mL de hyaluronidase (barre blanche).
EXEMPLES
Exemple 1 : Procédé de préparation d'un biomatériau selon l'invention
Une gélatine de type A1 a été utilisée dans cet exemple. Elle est commercialisée par la société SIGMA (Marque enregistrée) (G2500) et est issue de la peau de porc. Sa procédure d'extraction est un traitement acide, son pHi est égal à 8. Enfin, elle a un indice de Bloom de 300.
L'acide hyaluronique utilisé dans cet exemple est produit par la bactérie Steptrococcus Equi species. Il a été obtenu par la société Fluka (Marque enregistrée) (48178). C'est un polysaccharide d'à peu près 1 million de daltons. Le pKa des carboxyles de l'acide glucuronique est de 2,4.
L'alginate utilisé dans cet exemple est extrait de l'algue Macrocystis pyrifera. Il est commercialisé par la société SIGMA (Marque enregistrée) (A 2158).
Le fibrinogène utilisé dans cet exemple est un fibrinogène de type IV d'origine bovine. Il est commercialisé par la société SIGMA (Marque enregistrée) (F 4753). Il est pur à 68%
La transglutaminase (TG) utilisée a été produite par la société Ajinomoto sous le nom d'Activa WM (marque enregistrée). Elle est sécrétée par la bactérie Sterptoverticillium sp. Son poids moléculaire est de 43 000 et elle a une activité de 100 U.g"1 à 40 0C.
La collagènase utilisée dans les exemples, est une zinc métalloprotéase de type IA, isolée à partir de Clostridium histolyticum (Sigma, marque enregistrée, C-9891). Son poids moléculaire est de 116 000. L'activité maximum de l'enzyme est obtenue en présence de CaC^ et de NaCI. Il a été montré que ces éléments interfèrent avec la gélatine (résultats non fournis), ils n'ont pas été utilisés dans les tests d'activité de la collagènase dans les exemples de la présente demande.
La thermolysine est une protéase de type X isolé de Bacillus thermoproteolyticcus rokko (fournie par SIGMA, P-1512). C'est une métalloprotéase à zinc et son poids moléculaire est de 34 600.
La trypsine est une serine protéase isolée à partir du pancréas bovin. Elle est commercialisée par SIGMA (marque de enregistrée), T- 1426. Elle possède un P.M. de 23 800. Avant son conditionnement par le préparateur, l'enzyme a été traitée par du 2-1 tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl cétone (TPCK) afin de réduire l'activité chymotrypsine présente avec la trypsine. L'alginate lyase est extraite de Flavobacterium sp. Elle présente une activité de 38730 U/g, elle est commercialisée par la société SIGMA (marque de enregistrée). (A 1603).
La thrombine utilisée est extraite du plasma bovin, elle présente une activité de 34.8 U/mg. Elle est commercialisée par la société SIGMA. (T 4648).
A/ Procédé de préparation d'un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère et une première enzyme a) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique et une première enzyme qui est la hyaluronidase.
Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume) et différentes concentrations de hyaluronidase (1 ,5 et 10 U/ml). La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 0C, l'acide hyaluronique est alors déposé en surface de la solution. La préparation a été ensuite solubilisée sous agitation à 40 0C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de hyaluronidase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique.
Afin d'obtenir un gel physique, une rampe de température de 40 0C à 27 0C a été appliquée à la solution, avec une baisse de température de 0,5 0C par minute. b) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est de l'alginate et une première enzyme qui est l'alginate lyase.
Le biomatériau est constitué de 5% de gélatine, de 1% d'alginate et de 0,2U/ml_ d'alginate lyase. Afin d'obtenir ce gel, une solution de tampon Tris-HCI 5OmM à pH 7,4, est ajoutée à de la poudre de gélatine. Une solution d'alginate est préparée au préalable (dans le même tampon) et ajoutée à la gélatine. Le mélange est incubé 30 minutes à 400C. Une solution d'alginate lyase est ensuite ajoutée au milieu réactionnel et le mélange est incubé à 27°C. c) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel d'alginates, le second polymère qui est de la gélatine et une première enzyme qui est soit la collagénase, soit la trypsine, soit la thermolysine.
Le biomatériau est constitué de 1% d'alginate, de 1% de gélatine et d'une protéase. L'alginate de sodium (0.1g) est dissous dans une solution fraîchement préparée de calcium-EDTA (282 mg CaCl2.2H2θ and 798 mg Na4EDTA.2H2O dans 10 mL) sans chauffage. Une solution de gélatine à 5% est préparée dans de l'eau, le mélange est conservé à 4°C pendant au moins 4 heures avant utilisation. Les solutions sont mélangées de façon à obtenir des concentrations finales de 1% d'alginate et 1% de gélatine, le mélange est incubé à 400C pendant 30 min. Une solution à 3 M de D-Glucono-δ-lactone est préparée extemporanément et on en ajoute 312 μL au mélange précédent en même temps que la protéase. La concentration de collagénase finale est de 1 ,12.105 U/ml. La concentration finale de thermolysine est de 3,25. 10"4 UZmI. La concentration finale de trypsine est de 2,46. 10"4 UZmI Le mélange est incubé à 400C et la gélatine est alors sous forme de solution. Si le mélange est incubé à une température de 25°C ou 100C, la gélatine est sous forme de gel. B/ Procédé de préparation d'un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère, une première enzyme et une seconde enzyme
Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase et une seconde enzyme qui est soit la collagénase, soit la trypsine, soit la thermolysine.
Les biomatériaux sont préparés avec le même protocole expérimental que le biomatériau présenté en A-a) et de la protéase (soit la collagénase, soit la trypsine, soit la thermolysine) est ajoutée à la solution de gélatine. Le volume des échantillons d'enzyme correspond au moins à 20% du volume final, afin d'optimiser la répartition dans la solution de gélatine. Une seule solution contenant la première et la seconde enzyme est préparée dans un bain marie sous agitation électromagnétique à 400C avant d'être ajoutée à la gélatine. La concentration de collagénase finale est de 1.12.10"4 U/ml. La concentration finale de thermolysine est de 3,25. 10 "3 U/ml. La concentration finale de trypsine est de 2,46. 103 U/ml.
C/ Procédé de préparation d'un biomatériau selon l'invention comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère, une première enzyme et une troisième enzyme. a) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase, et une troisième enzyme qui est la transglutaminase.
Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume), 1 ,5 U/ml de transglutaminase et différentes concentrations de hyaluronidase (1 ,5 et 10 U/ml). La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 0C, l'acide hyaluronique, est alors déposé en surface de la solution. La préparation a été ensuite solubilisée sous agitation à 40 0C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de hyaluronidase et de transglutaminase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique. b) Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de fibrine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase, et une troisième enzyme qui est la thrombine.
Le biomatériau contient 4,8 mg/mL de fibrinogène, 0,24 mg/mL d'acide hyaluronique, 0,2 U/mL de thrombine, 1 U/mL de hyaluronidase, 2x102 mol/L de CaCI2 et 15x102 mol/L de NaCI. L'ensemble des constituants est mis en solution dans du tampon Tris-HCI 50 mmol/L à pH 7,4 et préchauffé à 370C. Le fibrinogène est au préalable mélangé au CaCI2, au NaCI et à l'acide hyaluronique. Ensuite la solution de thrombine et de hyaluronidase est ajoutée au milieu réactionnel et le mélange est incubé à 37°C.
D/ Procédé de fabrication d'un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères, un second polymère, et une première, une seconde et une troisième enzyme.
Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique et une première enzyme qui est la hyaluronidase, une seconde enzyme qui est soit la collagénase, soit la trypsine, soit la thermolysine et une troisième enzyme qui est la transglutaminase.
Ce biomatériau est préparé comme le C-a) mais cette fois-ci une protéase (soit la collagénase soit la trypsine soit la thermolysine) est ajoutée au mélange enzymatique de transglutaminase et de hyaluronidase. La concentration de collagénase finale est de ; 2,32.1CT4; U/ml. La concentration finale de thermolysine est de 6,5. 103 U/ml. La concentration finale de trypsine était de 4,35. 10~3 U/ml.
Exemple 2 : Libération de l'éosine par des gels
Dans cet exemple, le premier réseau de polymères est un gel de gélatine, avec ou sans la seconde enzyme qui est la collagénase et la troisième enzyme qui est la transglutaminase.
Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 5% de gélatine, 1 U/ml de transglutaminase 0,1 mg/ml d'éosine (Sigma) et éventuellement 3,5. 10"5 U/ml de collagénase. La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 contenant l'éosine et conservée pendant 15 minutes à 4 0C. Elle a été ensuite solubilisée sous agitation à 40 0C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de transglutaminase et éventuellement de collagénase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine.
Le but de cet exemple est de montrer que les gels ne comprenant pas de second polymère ne permettent pas la libération contrôlée de substance de faible poids moléculaire.
Le gel contenant la collagénase a été formé en trente minutes et est redevenu liquide (temps de solubilisation) en une vingtaine d'heures.
Un second gel a également été formé. Ce second gel était composé de 5% de gélatine, 1 U/ml de transglutaminase. La libération de l'éosine a été suivie au cours du temps par spectophotométrie à 517 nm, l'augmentation du signal est directement corrélée à au relargage d'éosine. La libération de l'éosine par le gel est continue (Figure 1) en présence ou en absence de collagénase dans le gel.
Exemple 3 : Libération du bleu dextran par un gel
Les biomatériaux utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux utilisés dans l'exemple 2, sauf que l'éosine a été remplacée par le bleu Dextran (PM 2 000 000) à une concentration finale de 5 mg/ml.
Le suivi de la libération du bleu de dextran a été effectué par spectophotométrie à 620 nm, l'augmentation du signal est directement corrélée à au relargage de bleu dextran..
Aucun relargage du bleu de dextran n'a été observé tant que le gel est sous forme de gel (Figure 2) Le relargage du colorant a été observé lors de la solubilisation du gel, c'est à dire 24 heures après la gélification.
La libération de molécules présentes dans des gels dépend des propriétés viscoélastiques du gel. Ici la libération de substance active est uniquement liée au temps de resolubilisation du gel. Le relargage de substance active pendant la phase gel n'est pas donc pas contrôlée.
Exemple 4: Méthode d'étude de l'élasticité et de la viscosité du biomatériau
L'étude de l'élasticité et de la viscosité des gels a été effectuée en étudiant les paramètres rhéologiques du gel.
La définition de la rhéologie a été établie en 1929 par la Société Américaine de Rhéologie. Elle comprend l'ensemble des études sur les flux et les déformations des matériaux. Son principe consiste à appliquer une contrainte (élongation, compression, cisaillement, ...) à un échantillon et résulte en la déformation de celui-ci. La relation entre la contrainte et la déformation dépend des propriétés intrinsèques de l'échantillon et des conditions extérieures. La déformation utilisée lors des études en rhéologie est le mouvement de cisaillement. Un exemple particulièrement simple de cisaillement concerne le mouvement d'un échantillon entre deux surfaces planes, dont l'une est immobile et l'autre dotée d'un déplacement parallèle à elle-même.
Sous l'effet du cisaillement, les couches planes de l'échantillon s'écoulent parallèlement les unes aux autres, avec des vitesses différentes. La couche au contact de la surface mobile se déplace avec elle à la même allure alors que celle au contact de la surface immobile ne se déplace pas ; c'est ce que l'on appelle l'hypothèse de non glissement à la paroi. De là s'établit un gradient de vitesse de déplacement des couches et deux grandeurs caractérisent le cisaillement :
- La vitesse de cisaillement qui correspond à la variation de vitesse entre les couches limites. Elle est exprimée comme l'inverse d'un temps (s 1),
- La contrainte de cisaillement T qui est relative aux forces de frottement tangentielles entre les différentes couches. Son unité est le Pascal (Pa).
L'analyse oscillatoire ou dynamique consiste à imposer un mouvement de cisaillement qui oscille avec une pulsation donnée, ω. Dans ce cas, la contrainte (T) et la déformation (y) évoluent de façon sinusoïdale au cours de temps, avec la même pulsation mais avec un certain déphasage. Plusieurs grandeurs sont caractéristiques :
Le déphasage δ entre la déformation et la contrainte.
Le rapport G* = (τo)/( γo), où T0 et γo représentent respectivement la contrainte et la déformation d'amplitude maximale.
Ce rapport est appelé module de cisaillement. C'est un nombre complexe constitué d'une composante élastique (le module de conservation) et d'une composante visqueuse (le module de perte). Les modules ont la dimension d'une contrainte avec une unité en Pascal (Pa).
3 M = 6M + ^ (;U)
Le déphasage δ est relié à ces deux composantes par :
G'= G*cos δ
G"= G*sin δ De ce fait :
Tan δ = G1VG'
Pour un système purement visqueux, le déphasage entre la contrainte et la déformation est égal à 90°, ainsi la valeur de G1 = 0, le G" est déterminé comme le module visqueux. Par contre, pour un solide élastique, c'est G" qui est égal à 0. Le module de conservation est aussi appelé module élastique. Il est clair que si δ est compris entre 0 et 45°, le matériau a un comportement plus élastique que visqueux, alors que c'est l'inverse si δ est compris entre 45 et 90°.
Les processus de gélification sont caractérisés par un point de gel, qui correspond à la fraction de liens créés nécessaire à la formation du gel. Le temps de gel est lui déterminé par le temps qu'il faut pour atteindre le point de gel.
En rhéologie, le temps de gel peut être considéré comme le temps nécessaire pour que l'angle de déphasage δ, entre une contrainte et une déformation oscillante, atteigne une valeur de 45° et donc que le rapport G1VG' soit égal à 1. Dans ce cas :
- Lorsque G">G', et tan δ > 1 , on peut considérer que l'échantillon est liquide.
- Lorsque G'>G", et tan δ < 1 , l'échantillon est gélifié - Lorsque G'=G" et tan δ =1 , on est au point de gel.
Cette définition du point de gel, prend en considération que les temps de relaxation sont infinis dans le domaine linéaire du gel et donc que les paramètres viscoélastiques sont indépendants des conditions de mesure.
Une autre façon de considérer le point de gel est le contrôle, par le rhéomètre, de la déformation oscillatoire.
Dans les exemples ci-dessous, le rhéomètre utilisé est un RheoStress 150 de chez ThermoElectron (Marque déposée). Le système du rhéomètre est Cône/plan, avec une déformation imposée (une contrainte imposée est possible). Le contrôle de la déformation réelle a été effectué par une méthode itérative qui consiste à appliquer un couple (une contrainte) et à enregistrer la déformation résultante jusqu'à obtenir la bonne déformation.
Deux cônes ont été utilisés pour les expériences. Ils sont tous deux constitués de titane et ont un angle de 2°. Par contre, ils diffèrent au niveau de leur diamètre, de 35 mm pour l'un et de 60 mm pour l'autre.
Le rhéomètre était relié à un cryostat F6 (ThermoElectron) qui permet de thermostater le support sur lequel repose l'échantillon. Afin d'éviter l'évaporation, un système est employé qui consiste à créer une chambre humide. En plus, de l'huile de silicone (50 mPa.s) a été ajoutée dans la rigole du support permettant d'éviter au maximum les échanges entre les échantillons et l'air.
Le rhéomètre était contrôlé par un ordinateur et un logiciel, Rhéowin (Marque déposée).
Exemple 5 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère sur le réseau de polymère. Le but de cet exemple est de mettre en évidence l'effet de la dégradation du second polymère par la première enzyme sur le biomatériau de l'invention.
Dans cet exemple, la préparation des gels a été faite selon les procédés décrits dans l'exemple 1 A-a).
Les composés utilisés dans cet exemple sont identiques à ceux présentés dans l'exemple 1 A-a).
Les différentes mesures d'élasticité du biomatériau ont été réalisées avec le rhéomètre présenté dans l'exemple 4.
Dans les exemples, l'élasticité du biomatériau, ou module élastique a été mesurée selon la méthode présentée dans l'exemple 4
Dans les exemples, la viscosité du biomatériau a été mesurée avec la méthode présentée dans l'exemple 4.
Dans cet exemple, le biomatériau testé comprend :
- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A)
- comme second polymère : l'acide hyaluronique, et
- comme première enzyme : la hyaluronidase,
Dans cet exemple, différentes concentrations de hyaluronidase ont été ajoutées à une solution de gélatine à 7% et d'acide hyaluronique à 1%. Une rampe de température de 400C à 27°C a été ensuite appliquée pour la gélification. Les concentrations de hyaluronidase utilisées sont de 1 , 5, et 10 U/mL. Cette gamme de concentration a permis d'évaluer l'effet éventuel de la dégradation de l'acide hyaluronique sur la gélification, mais également de quantifier ces effets.
Pour tous les gels contenant de la hyaluronidase, l'élasticité semble converger, au bout de 900 minutes, vers un G' de valeur équivalente à celui du gel physique de gélatine seule. A ce même temps, on remarque que la viscosité (G") diminue en fonction de la concentration de hyaluronidase (figure 3). Ce résultat montre donc que la dégradation de l'acide hyaluronique peut s'effectuer dans le milieu gélifié.
Aucun effet des oligomères, produits de dégradation de l'acide hyaluronique, n'a été observé sur la gélification du gel physique (résultats non fournis).
Afin de montrer que la dégradation du second polymère n'agit pas sur le réseau de polymères, le biomatériau a été observé par polarimétrie.
Une solution contenant 1% d'acide hyaluronique, 7% de gélatine et 1 U/mL de hyaluronidase a été gélifiée selon le procédé décrit dans l'exemple 1. La formation de triples hélices, au cours du temps, a été suivie en polarimétrie et comparée avec celle de la même solution en absence de l'enzyme.
Le polarimètre utilisé est un Jasco 1100 (Marque déposée), muni d'un cryostat externe Julabo F 25 avec la température gérée par ordinateur. Il mesure l'angle avec une précision de 0,001°. La cellule en verre utilisée a un trajet optique de 0,1 dm et un volume de 1 mL. La cuve peut être thermostatée, grâce à une jaquette à circulation d'eau reliée au cryostat. La température, ainsi régulée, a été mesurée directement dans la cuve par le biais d'une sonde reliée au polarimètre. Toutes les mesures de l'étude ont été faites à 436 nm.
Un ordinateur a été connecté au polarimètre et un logiciel enregistre l'angle et la température dans la cuve en fonction du temps. Le logiciel du Jasco est le "Spectra Manager" (Marque déposée) tandis que le cryostat est géré à partir du logiciel "Julabo EasyTemp"(Marque déposée).
Comme le montrent les courbes de la figure 4, la cinétique de formation de triples hélices de gélatine est identique quel que soit le type de gel. Au bout de 900 minutes, la teneur en triple hélice varie entre 25,5 et 27%. L'activité de la hyaluronidase, ainsi que ses produits de dégradation, n'ont donc pas de répercussion sur le réseau physique: la formation du réseau de protéines se fait donc indépendamment du remodelage de la phase soluble.
Exemple 6 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère sur le premier réseau de polymères formé par la troisième enzyme.
Dans cet exemple, on fabrique un biomatériau comprenant un premier réseau de polymères qui est un gel de gélatine, le second polymère qui est l'acide hyaluronique, une première enzyme qui est la hyaluronidase, et une troisième enzyme qui est la transglutaminase. Le protocole étant décrit dans l'exemple 1 C-a)
Différentes concentrations de hyaluronidase ont été ajoutées à une solution de gélatine à 7% et d'AH à 1 %. La gélification du gel chimique est obtenue par l'ajout de 1 ,5 U/mL de transglutaminase à une température de 40 0C.
Comme pour le gel physique, les concentrations de hyaluronidase utilisées sont de 1 , 5 et 10 U/mL
La dégradation de I1AH n'a d'effet sur la valeur du G' que sur les temps les plus courts. Ceci est lié au fait que plus la solution gélifie rapidement, plus le G1 augmente rapidement. Mais que ce soit au bout de 900min ou même à partir de 150min, les G' des différents échantillons sont équivalents à celui du gel ne contenant pas d'AH. Quel que soit l'état de dégradation du polysaccharide, il n'a pas d'influence sur le réseau gélatine ponté de façon covalente.
La dépolymérisation de l'acide hyaluronique a, par contre, beaucoup d'influence sur la viscosité des gels. En effet, quelle que soit la quantité d'enzyme, le G" atteint un maximum avant de chuter jusqu'à la valeur de la gélatine (figure 5). Cette exemple montre que la dégradation d'un second polymère (HA) compris dans la phase aqueuse d'un réseau de polymère (gélatine) induit par une troisième enzyme (transglutaminase) formant un gel (gel A), n'influence pas l'élasticité (G') mais seulement la viscosité de la phase aqueuse (G").
Exemple 7 : Etude de l'effet du second polymère et de la seconde enzyme sur le qel(A) du biomatériau selon l'invention
Le but de l'exemple est de mettre en évidence l'effet du second polymère et de la seconde enzyme, sur le gel (A).
Dans cet exemple, le biomatériau testé comprend :
- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A)),
- comme second polymère : l'acide hyaluronique,
- comme deuxième enzyme : la collagénase,
Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume) et différentes concentrations finales de collagénase : 0,95. 10^ ; 1.12.10"4; 1 ,29.10^ U/ml. La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris-HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 0C, l'acide hyaluronique est alors déposé en surface de la solution. Il a été ensuite solubilisé sous agitation à 40 0C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de collagénase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique.
Afin d'obtenir un gel physique, une rampe de température de 40 0C à 27 0C a été appliquée à la solution, avec une baisse de température de 0,5 °C par minute.
En présence d'acide hyaluronique, le biomatériau gélifie en 31 min (contre 40 min sans polysaccharide), montre un G'max de 116,5 Pa, un G"max 64,4 Pa et ne présente pas de resolubilisation totale au bout de 900 min (estimée comme G'=G"), bien que la valeur de G1 diminue avec le temps au-delà de 170 min. Ainsi, la cinétique et la viscoélasticité des gels changent considérablement selon les modifications, physicochimiques et/ou moléculaires, apportées par le polysaccharide. (Figure 6 A). Il est possible d'obtenir une resolubilisation totale du gel (avec comme référence G'=G" pour le temps de transition gel/sol), en utilisant une concentration de 1 ,29XiO-4 UZmL de collagénase (Figure 6 B).
Ainsi nous avons montré qu'une double transition sol/gel puis gel/sol tel que décrit dans WO 2006/056700, est possible en intégrant un second polymère (HA).
Exemple 8 : Etude de l'effet du second polymère et de la seconde enzyme sur le qel(A) formé par la troisième enzyme du biomatériau selon l'invention
Le but de l'exemple est de savoir si la double transition sol/gel puis gel/sol catalysée par l'action des seconde (collagénase) et troisième enzyme (transglutaminase) sur le premier réseau de polymères (gel de gélatine), est influencée par la présence du second polymère (AH).
Pour la préparation du biomatériau, les échantillons ont été préparés avec une concentration de 7% de gélatine, 1% d'acide hyaluronique (rapport poids sur volume), 1 ,5 U/ml de transglutaminase et différentes concentrations finales de collagénase (2,06. 10"4 ; 2,32.1U"4; 2,58.1U"4 U/ml). La poudre de gélatine a été incubée avec du tampon Tris- HCI 50 mM à pH 7,4 et conservée pendant 15 minutes à 4 0C, l'acide hyaluronique, est alors déposée en surface de la solution. Il a été ensuite solubilisé sous agitation à 40 0C au maximum pendant 15 minutes. Une solution de hyaluronidase et de transglutaminase, préparée au préalable dans le même tampon à une concentration initiale au moins cinq fois supérieure à la concentration finale, est mélangée à la préparation de gélatine et d'acide hyaluronique. Le système gélatine/AH gélifie en 3,1 min alors que le système gélatine seule gélifie en 15 min. La viscoélasticité maximum est aussi fortement augmentée en présence du polysaccharide puisque la valeur de G'max est de 264 Pa (50 Pa sans AH) et celle de G"max de 61 ,7 Pa (4,4 Pa sans AH). Enfin, le temps de resolubilisation totale du gel est de 396 min contre 152 min dans l'autre cas (figure 7).
La viscoélasticité intrinsèque de l'acide hyaluronique amène donc la viscoélasticité du système à augmenter plus rapidement lors de la gélification pour donner un gel plus fort et enfin limite sa resolubilisation par la collagènase.
Ainsi la double transition sol/gel(A) gel(A)/sol catalysée par l'action des seconde et troisième enzyme sur le premier réseau de polymères, est influencée par la présence du second polymère.
Exemple 9 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère par la première enzyme combiné à l'action de la seconde enzyme sur le qel(A) d'un biomatériau selon l'invention
Le but de l'exemple est de savoir si la double transition sol/gel gel/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagènase) sur le premier réseau de polymères (gel de gélatine), est influencée par la dégradation du second polymère (AH) par la première enzyme (hyaluronidase).
Le biomatériau est préparé selon le protocole de l'exemple B.
L'évolution de la viscoélasticité est différente selon la quantité de Hase utilisée (Figure 8). Par rapport au biomateriau avec de I1AH et sans Hase , les paramètres rhéologiques chutent de façon plus importante. Une synergie s'établit entre les activités de la collagènase et de la hyaluronidase, observable aussi bien au niveau du module de perte qu'au niveau du module de conservation. Ainsi la double transition sol/gel(A) gel(A)/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagénase) sur le réseau de polymères (gel de gélatine), est influencé par la dégradation du second polymère (AH) par la première enzyme (hyaluronidase).
Les mêmes conclusions peuvent être émises lorsque l'on remplace, lors de la préparation du biomatériau, la collagénase par la thermolysine ou la trypsine, comme décrit dans l'exemple 1 B.
Exemple 10 : Etude de l'effet de la dégradation du second polymère par la première enzyme combiné à l'action de la seconde enzyme sur le gel(A) formé par une troisième enzyme.
Le but de l'exemple est de savoir si la double transition sol/gel gel/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagénase) sur le réseau de polymères (gel de gélatine) formé par une troisième enzyme (la transglutaminase), est influencée par la dégradation du second polymère (AH) générée par la première enzyme (hyaluronidase).
Le biomatériau est préparé selon le protocole de l'exemple D.
Les caractéristiques du biomatériau, avec de l'AH, dépendent de la concentration en hyaluronidase utilisée (Figure 9).
Ainsi une synergie semble s'établir, entre les deux hydrolases, qui aboutit à une baisse plus importante de la viscoélasticité par rapport à au biomatériau sans Hase.
Ainsi la double transition sol/gel - gel/sol catalysée par l'action de la seconde enzyme (collagénase) sur le réseau de polymères (gel de gélatine) formé par une troisième enzyme (la transglutaminase), est influencée par la dégradation du second polymère (AH) générée par la première enzyme (hyaluronidase). Les mêmes conclusions peuvent être émises lorsque l'on remplace, lors de la préparation du biomatériau, la collagénase par la thermolysine ou la trypsine, comme décrit dans l'exemple 1 D.
Exemple 11 : libération du bleu azur par le biomatériau selon l'invention
Dans cet exemple, le relargage de bleu azur à partir d'un biomatériau a été étudié. Le biomatériau testé comprend :
- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A))
- comme second polymère : l'acide hyaluronique
- comme première enzyme : la hyaluronidase,
- comme troisième enzyme : la transglutaminase, et
- du bleu azur.
Dans le présent exemple, la gélatine est à une concentration de 7% et la transglutaminase à 1 U/mL dans les différents gels. Lorsqu'il est présent l'acide hyaluronique est à une concentration de 1% et la hyaluronidase à 15 U/mL.
Une solution de tampon Tris-HCI 5OmM à pH 7,4, contenant 1 ,25mg/mL de bleu azur (SIGMA (Marque enregistrée)) est ajoutée à de la poudre gélatine. Une solution d'acide hyaluronique à 1 ,5% est ensuite ajoutée à la solution de gélatine, le mélange est incubé à 40°C pendant 30min. Une solution enzymatique (soit transglutaminase seule, soit transglutaminase et hyaluronidase), préparée dans le même tampon, est ensuite mélangée à la solution de gélatine. Le mélange est placé à 400C.
Un gel contenant de la gélatine et de la transglutaminase (TG) et du bleu azur a donc été obtenu. Un gel comprenant de la gélatine, de l'acide hyaluronique (AH), de la transglutaminase (TG) et du bleu azur a été obtenu. Enfin un gel comprenant de la gélatine de l'acide hyaluronique (AH) et de la transglutaminase (TG), de la hyaluronidase et du bleu azur a été obtenu.
Une mesure de la libération du bleu azur en fonction du temps et en fonction du gel a été effectuée (Figure 10) par mesure de la densité optique (DO à 630nm) du milieu dans lequel se trouvaient les différents gels.
La mesure de la libération du bleu azur est fonction des composants du gel (Figure 10).
Cette expérience démontre clairement, que le biomatériau de l'invention permet la libération de substances et que cette libération est contrôlée.
Exemple 12 ; libération da l'acide hyaluronique par le biomatériau selon l'invention
Dans cet exemple, le relargage d'acide hyaluronique à partir d'un biomatériau a été étudié. Le biomatériau testé comprend :
- comme premier polymère la gélatine et donc comme premier réseau de polymères: un gel de gélatine (gel (A)),
- comme second polymère : l'acide hyaluronique
- comme première enzyme : la hyaluronidase
Les biomatériaux contiennent tous 3% de gélatine et ont été obtenus par une incubation à 200C. Lorsqu'il est présent, l'acide hyaluronique est à une concentration de 1% et la hyaluronidase à 15U/mL.
Le gel a été obtenu par le procédé suivant: une solution de tampon Tris-HCI 5OmM à pH 7,4, a été ajoutée à de la poudre gélatine. Une solution d'acide hyaluronique à 1 ,5% a ensuite été ajoutée à la solution de gélatine, puis le mélange a été incubé à 400C pendant 15 min. Pour le gel contenant de la hyaluronidase, une solution contenant l'enzyme, préparée dans le même tampon, a été ensuite mélangée à la solution de gélatine et le mélange est placée à 200C.
Le relargage d'acide hyaluronique à partir des gels a été évalué en polarimétrie. Le polarimètre utilisé était identique à celui de l'exemple 5. Ce relargage de substance est contrôlé en fonction de la taille et est contrôlé dans le temps.
Figure imgf000038_0001
Le biomatériau de l'invention permet donc un relargage contrôlé de l'acide hyaluronique inclus dans un gel de gélatine.
La modulation du relargage de substance contenue dans la phase aqueuse d'un gel simple est effectuée par modification de la viscosité de la phase aqueuse.
Le biomatériau de l'invention permet donc un relargage contrôlé de substances.

Claims

Revendications
1. Biomatériau comprenant une phase aqueuse et un premier réseau de polymères constitué d'un premier polymère protéique ou saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères protéiques ou saccharidiques, dans lequel le premier réseau de polymères et la phase aqueuse forment un premier gel (A), le biomatériau comprenant : un second polymère protéique ou saccharidique ou un mélange de seconds polymères protéiques ou saccharidiques, le second polymère étant différent du premier polymère, et étant inclus dans le gel (A) soit en solution dans la phase aqueuse du gel (A), soit sous la forme d'un second gel (B), une première enzyme de dégradation dudit second polymère.
2. Biomatériau selon la revendication 1, dans lequel le polymère protéique est choisi dans le groupe comprenant la fibrine, la gliadine, la myosine, la globuline (7S et 11S), l'actine, la myoglobine, le collagène et ses dérivés, les protéines du lait, les protéines du soja, les protéines du blé, et les protéines du jaune et du blanc d'œuf, les protéines du pois, les protéines de féverole, les protéines du lin, les protéines de soie, la fibronectine, la laminine, l'élastine, la vitronectine.
3. Biomatériau selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le polymère saccharidique est choisi dans le groupe comprenant les carraghénanes, les alginates, le xanthane, le chitosan, la chitine, l'acide hyaluronique, les glycosaminoglycanes sulfatés, le glycogène, la cellulose et ses dérivés, les pectines, l'amidon et ses dérivés, les dextrans et les xylanes.
4. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la première enzyme est choisie dans le groupe comprenant les enzymes de la famille des métalloprotéinases, la famille des serines protéases, la famille des cystéines et aspartate protéases, la famille ADAM, les glycosidases dont l'amylase, la cellulase, la dextranase, la pullulanase, la pectinase, la chitinase, la xanthanase, la chitosanase, la hyaluronidase, et les lyases dont l'hydroxyacétyle lyase, la chondroïtinase, l'héparinase, l'alginate lyase.
5. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant une seconde enzyme différente de la première enzyme et capable de dégrader le premier réseau de polymères, ledit premier réseau de polymères étant susceptible d'effectuer, sous l'action de ladite seconde enzyme, une transition gel (A) /solution..
6. Biomatériau selon la revendication 5, dans lequel ladite seconde enzyme est choisie dans le groupe comprenant les enzymes de la famille des métalloprotéinases, la famille des serines protéases, la famille des cystéines et aspartate protéases, la famille ADAM , les glycosidases dont l'amylase, la cellulase, la dextranase, la pullulanase, la pectinase, la chitinase, la xanthanase, la chitosanase, la hyaluronidase, et les lyases dont l'hydroxyacétyle lyase, la chondroïtinase, l'héparinase, et l'alginate lyase.
7. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le biomatériau comprend une troisième enzyme différente des première et deuxième enzymes et capable d'induire des liaisons entre lesdits premiers polymères ou mélange de premiers polymères, ladite troisième enzyme étant susceptible de catalyser une transition solution/gel (A).
8. Biomatériau selon la revendication 7, dans lequel ladite troisième enzyme est choisie dans le groupe comprenant la lysyl oxydase, les transglutaminases, la thrombine, les protéines disulfide isomérases, les sulfhydrile thiol oxydases, les peroxidases, les lipoxygènases, les épimèrases dont les alginates épimèrases, les glucuronate isomérases, la cellobiose épimèrase et les galactose-6-sulfurylases.
9. Biomatériau selon l'une quelconques des revendications 1 à 8, dans lequel le biomatériau comprend une quatrième enzyme différente des première, deuxième et troisième enzyme et capable d'induire des liaisons entre lesdits seconds polymères ou mélange de seconds polymères, ladite quatrième enzyme étant susceptible de catalyser une transition solution/gel (B).
10. Biomatériau selon la revendication 9, dans lequel ladite quatrième enzyme est choisie dans le groupe comprenant la lysyl oxydase, les transglutaminases, la thrombine, les protéines disulfide isomérases, les sulfhydrile thiol oxydases, les peroxidases, les lipoxygènases, les épimèrases dont les alginates épimèrases, les glucuronate isomérases, la cellobiose épimèrase et les galactose-6-sulfurylases.
11. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le premier réseau de polymères est choisi dans le groupe comprenant les gels de gélatine, de fibrine et d'alginate.
12. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , dans lequel la quantité du premier réseau de polymères ou mélange de premiers polymères est comprise entre 0,1 et 20% en poids par rapport au poids total du biomatériau.
13. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel la quantité du second polymère ou mélange de seconds polymères est comprise entre 0,01 et 20% en poids par rapport au poids total du biomatériau.
14. Biomatériau selon l'une quelconques des revendications 1 à 13, dans lequel une substance active se trouve en solution dans la phase aqueuse du gel (A) et/ou dans le gel (B).
15. Biomatériau selon la revendication 14, dans laquelle ladite substance active est choisie dans le groupe comprenant les bactériostatiques, les bactéricides, les colorants dont l'éosine, le bleu de dextran, le bleu de méthylène, le bleu azur, des protéines, des saccharides dont l'acide hyaluronique et les alginates, un liposome, une nanoparticule une micelle, les antiacnéiques, les antiallergiques, les anxiolytiques, les antiasthmatiques, les anticancéreux, les hypolipémiants , les contraceptifs hormonaux, les antidépresseurs, les antidiabètiques, les antalgiques, les antiasthéniques, les antihypertenseurs, les antifongiques, les antibiotiques, les somnifères, les traitements hormonaux, les antimigraineux, les médicaments du surpoids, les antiparkinsoniens, les neuroleptiques, les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les inducteurs d'ovulation, les fluidifiants bronchiques, les antitussifs, les inducteurs d'érection et les antiulcereux.
16. Procédé de préparation d'un biomatériau tel que défini dans la revendication 1 comprenant les étapes suivantes : a) formation en phase aqueuse d'un premier réseau de polymères constitué d'un premier polymère protéique ou saccharidique ou d'un mélange de premiers polymères protéique ou saccharidique, le premier polymère protéique ou saccharidique ou mélange de premiers polymères protéique ou saccharidique formant ledit premier réseau de polymères, b) addition d'un second polymère protéique ou saccharidique ou un mélange de seconds polymères protéique ou saccharidique, différent du premier polymère ou du mélange de premiers polymères, capable de former un second réseau de polymères l'étape d'addition étant effectuée avant la formation du premier réseau de polymères.
17. Procédé selon la revendication 16, comprenant en outre à l'étape b) l'addition d'une première enzyme capable de dégrader lesdits seconds polymères ou le second réseau de polymères.
18. Procédé selon la revendication 16 ou 17, comprenant en outre à l'étape b) l'addition d'une seconde enzyme capable de dégrader les liaisons dudit premier réseau de polymères.
19. Procédé selon la revendication 18, comprenant en outre entre à l'étape b) l'ajout d'une troisième enzyme capable d'induire des liaisons entre lesdits premiers polymères.
20. Procédé selon la revendication 19, comprenant en outre entre à l'étape b) l'addition d'une quatrième enzyme capable d'induire des liaisons entre lesdits seconds polymères.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, dans lequel au moins une substance active est ajoutée à l'étape b)
22. Dispositif de libération contrôlée d'une substance active comprenant le biomatériau tel que défini dans les revendications 1 à 14.
23. Dispositif selon la revendication 22, dans lequel le dispositif est choisi dans le groupe comprenant les dispositifs médicaux dont les lentilles de contact, les électrodes, les capteurs, les dispositifs pour les soins, les pansements, les compresses imbibées, les bandages, les pansements chirurgicaux, les pansements ophtalmiques, les pansements dentaires, les produits de sutures, les dispositifs pour les thérapies, les articles orthopédiques, les implants chirurgicaux, les patchs, les gels transdermiques, les patchs actifs, les endoprothèses et les implants pour tissus mou, les dispositifs pour l'ingénierie tissulaire, les matériaux de reconstruction, dispositifs pour la culture cellulaire, les milieux de culture, des supports de culture.
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