KR102368213B1

KR102368213B1 - 미분화성 유지 배양재료

Info

Publication number: KR102368213B1
Application number: KR1020167021720A
Authority: KR
Inventors: 사토루 키도아키; 유키에 쯔지; 히사토 하야시; 타케히사 이와마; 마사토 호리카와
Original assignee: 닛산 가가쿠 가부시키가이샤; 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2022-02-28
Also published as: TW201538727A; TWI671406B; US20170009209A1; EP3098306A4; US10316292B2; JP6512662B2; WO2015111734A1; KR20160110426A; JPWO2015111734A1; CN106103700A; EP3098306A1

Abstract

체성 줄기세포의 분화기능에 영향을 주는 DMSO 등의 화학약품 등을 이용하는 일 없이, 종래 실시되어 온 동결보존방법을 대신하는, 분화기능이나 세포기능의 열화나 생존율에 대한 영향이 매우 낮은 체성 줄기세포의 배양방법(보존방법)을 제공한다. 천연물 유래의 다당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 체성 줄기세포의 미분화성 유지 배양재료 그리고 이 미분화성 유지재료가 분산되어 이루어진 배양액, 이 배양액 중을 체성 줄기세포가 떠돌며 이루어진 체성 줄기세포 함유 배양액, 이 천연물 유래의 다당류를 이용하는 간엽계 줄기세포의 배양방법.

Description

미분화성 유지 배양재료{UNDIFFERENTIATED MAINTENANCE CULTURE MATERIAL}

본 발명은, 체성 줄기세포의 미분화성을 유지하면서 이 세포를 배양하는 재료에 관한 것으로, 상세하게는, 간엽계 줄기세포 등의 체성 줄기세포를 생체 외에서, 예를 들어 치료에 필요시 되는 일정기간, 그 분화를 억제하고, 체성 줄기세포의 증식·분화활동을 정지시킨 상태(휴면상태)를 유지할 수 있는, 천연물 유래의 다당류를 함유하는 배양재료에 관한 것이다.

간엽계 줄기세포(MSC)는, 골아세포, 지방세포, 근세포, 연골세포, 신경세포나 간세포 등, 간엽계에 속하는 세포로의 분화능을 갖는 것으로 여겨지는 체성 줄기세포(생체줄기세포, 조직줄기세포라고도 칭함)의 일종이며, 조직의 재구축이나 수복을 하는 재생치료에 대한 응용, 예를 들어, 염증·면역억제나 조직수복, 혈관신생에 의한 혈류의 개선, 항노화(안티에이징) 등의 치료 외에, 종래 치료법이 없었던 환자에 대한 응용이 기대되고 있다.

분화다능성의 간엽계 줄기세포는, 환자 자신의 골수, 지방조직, 활막, 치조골, 치근막 등의 조직에서뿐만 아니라, 태반, 제대혈, 제대의 여러 가지 세포 등으로부터 단리할 수 있는 점에서, 간엽계 줄기세포의 이용은 생명윤리 상의 문제성이 낮다. 또한 간엽계 줄기세포는, ES 세포나 iPS 세포에 비해 암화 리스크가 낮은 것으로 여겨지므로, 조기의 임상응용이 기대된다.

간엽계 줄기세포를 세포조직 의약품이나 세포조직 의료기기로서 임상용도로 이용할 때, 예를 들어 자가이식을 상정하면, 환자의 체내로부터 세포를 취출하고, 생체 외에서 배양해서 증식시켜, 환자에 자가 이식한다는 공정을 거치게 된다. 이때, 배양기간이나 그 후의 보관기간 중에, 목적 이외의 형질을 가진 세포로 변화하는 일 없이, 환자에게 되돌아가는 세포의 유효성 및 안전성을 확보하는 것이 중요해진다. 그러나, 간엽계 줄기세포는 분화나 세포노화를 일으키기 쉽기 때문에, 그 품질 컨트롤이 어려운 것을 들 수 있어, 세포의 품질관리에 큰 과제가 남아 있다.

간엽계 줄기세포를 생체 외에서 배양함에 있어서, 그 증폭촉진에 관하여, 다양한 증폭펩티드가 연구되어 있다(특허문헌 1 및 특허문헌 2). 또한, 특정의 증식인자군과 지방산 복합물을 기초배지에 첨가함으로써, 무혈청 조건하에서도 혈청배지의 경우와 동등 이상의 세포증식을 유도하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 3). 한편, 간엽계 줄기세포의 분열회수에는 한도가 있으며, 분열회수에 의존하여 세포의 노화가 진행되는 것이 알려져 있다. 간엽계 줄기세포의 유효성, 즉 임상응용에 있어서의 품질이, 어느 정도의 분열증식을 거친 세포까지 보증되는지에 대해서는, 현재도 확립된 지견은 얻지 못했다.

이에, 환자로부터 채취한 간엽계 줄기세포는 우선은 그 품질을 열화시키는 일 없이, 치료에 이용하기까지의 기간에 걸쳐, 고품질로 보존하는 것이 강하게 요구된다. 간엽계 줄기세포에 한정되지 않고, 세포의 보존방법으로서, 일반적으로 액체질소온도로 동결 보존하는 방법이 이용되고 있다. 동결 및 해동은 세포의 활성 및 기능손실을 수반하므로, 동결 및 해동 프로세스 중에 세포를 보호하는 목적으로 디메틸설폭사이드(DMSO) 등의 화학약품을 동결매체에 첨가한다. DMSO는 높은 막투과성을 갖고 있어, 세포가 동결되는 과정에 있어서 빙정의 형성을 저하시켜, 막손상이나 세포소기관의 탈수 등을 최소화하고 있다(특허문헌 4).

간엽계 줄기세포의 동결법 이외의 보존을 위한 접근법으로는, 동결을 하지 않고 통상의 배양을 하면서 보존하는 방법도 고려된다. 그러나, 여기서 문제가 되는 것은, 배양환경에 의해 발생할 수 있는 간엽계 줄기세포의 성질·형질의 변화이다.

일반적으로, 생체 내에 있어서 세포의 주위환경을 구성하는 세포외 매트릭스는, 결합조직세포의 분화상태에 화학적 및 물리적으로 영향을 주는 것이 알려져 있고, 간엽계 줄기세포의 분화의 계통결정에도 영향을 주는 것이 보고되어 있다.

예를 들어 탄성을 생체 내(in vivo)의 생물환경에 유사하도록 컨트롤된 하이드로겔 상에 있어서 간엽계 줄기세포를 배양함에 따른, 신경성, 근원성, 골원성의 세포로의 분화유도가 연구되고 있다(비특허문헌 1). 이 지견은, 간엽계 줄기세포를 1kPa 이상의 탄성률을 가진 하이드로겔 기재 상에서 배양하는 것만으로, 배양환경의 탄성특성 등에 의존한 계통으로 분화되고, 즉 미분화상태가 무너져, 품질이 열화되는 것을 의미한다.

이에 반해, 간엽계 줄기세포를, 250Pa의 탄성을 가진 I형 콜라겐 및 피브로넥틴에 의해 코팅된 아크릴아미드겔 상에서 배양함으로써, 줄기세포의 세포주기를 정지상태로 유도 또는 유지하고, 생물활성을 지속시키는 방법이 제안되어 있다(비특허문헌 2, 특허문헌 5).

국제공개 제2008/026634호 팜플렛 국제공개 제2011/040500호 팜플렛 특허 제4385076호 명세서 일본특허공표 2012-517823호 공보 일본특허공표 2010-532167호 공보

Cell 126, 677, 2006 Tissu Eng PartA 15, 147, 2009, REGENERATIVE MEDICINE AND TISSUE ENGINEERING - CELLS AND BIOMATERIALS, Daniel Eberli, 2011 InTech Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759~765(2004)

상기 서술한 동결매체에 DMSO 등의 화학약품을 이용한 동결보존법은, 융해과정에 있어서, 세포에 대하여 현저한 데미지를 주는 것이나(비특허문헌 3), 간엽계 줄기세포의 분화에 영향을 줄 가능성(비특허문헌 4)이 보고되어 있다.

또한, 상기 서술한 세포외 매트릭스로서 하이드로겔을 사용한 분화유도에 있어서는, 검토가 이루어지고 있는 배양기재의 탄성이 높은 수치범위에 있는 것으로부터, 세포가 정지상태가 되는 것이나 세포의 보존성능에 대하여 발견되지 않았다.

나아가 배양기재로서 제안되어 있는 아크릴아미드겔을 구성하는 아크릴아미드모노머에 대해서는, 신경독성이나 간독성이 있는 것이 지적되어 있다. 일반적으로, 생체 적합성을 나타낸 수용성 폴리머나 하이드로겔을 구성하는 중합성 모노머는 세포독성을 나타내는 경우가 많고, 이들 모노머로부터 얻어지는 고분자겔로부터 미반응 모노머를 완전히 제거하는 것은 사실상 곤란하다고 할 수 있고, 이러한 고분자겔을 생체 안전성이 요구되는 세포배양기재 등으로서 채용하기에는 과제가 남는다.

이와 같이, 지금까지도 간엽계 줄기세포의 다능성을 유지한 채로 보존시의 생존율 개선을 도모하기 위한 다양한 제안이 이루어지고 있는데, DMSO 등의 화학약품을 이용한 동결보존방법 대신에, 원하는 세포의 보존성을 만족시키면서, 세포독성의 우려가 없는, 간엽계 줄기세포의 보존방법의 제안은 아직 이루어지지 않았다.

본 발명은, 이러한 종래기술의 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 체성 줄기세포의 분화기능에 영향을 주는 DMSO 등의 화학약품을 이용하지 않고, 종래 실시되어 온 동결보존방법을 대신하는, 분화기능이나 세포기능의 열화나 생존율에 대한 영향이 매우 낮은 체성 줄기세포의 배양방법(보존방법)을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 체성 줄기세포를 배양하는 배양액 중에 증점 또는 겔화제로서의 기능을 갖는 천연물 유래의 다당류, 예를 들어 증점성 다당류나 나노화이버상 다당류를 용해 또는 분산시킨 결과, 해당 다당류가 줄기세포의 분화와 관련된 계통결정에 관하여 거의 불활성인 휴면상태에서의 줄기세포의 배양을 가능하게 하는 기반재료가 되는 것을 발견하였다. 즉, 간엽계 줄기세포를 천연물 유래의 다당류가 용해 또는 분산되어 이루어진 세포배양액 중에 액 중을 떠돌도록 용해 또는 분산시킴으로써, 배양액을 동결시키지 않고, 배양조건하에서 간엽계 줄기세포의 분화를 억제하고, 그리고 원하는 일정기간, 초기상태를 유지하고 보존할(휴면상태로서 배양할) 수 있는 것을 발견하였다. 여기서 초기상태란, 간엽계 줄기세포가 어떠한 분화계통에 대해서도 아직 분화를 개시하지 않은, 미분화의 상태를 가리킨다. 게다가, 상기 증점성 다당류나 나노화이버의 형태인 다당류와 같은 천연물 유래의 다당류를 이용함으로써, 프로테아제 등을 이용하는 일반적인 세포회수방법에 의해, 배양액으로부터의 간엽계 줄기세포의 회수가 가능하며, 간엽계 줄기세포의 재이용이 가능해지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은, 천연물 유래의 다당류를 이용한 세포배양법에 속하고, 특히 이 배양계가 간엽계 줄기세포의 미분화성 유지배양을 가능하게 하는 것이라는 독자적 발견에 기초한다. 이러한 배양을 가능하게 하는 해당 다당류의 구조 그리고 그 용해액 또는 분산액의 최적조건을 발견함으로써 본 발명이 완성된 것이다.

본 발명에 있어서의 간엽계 줄기세포의 미분화성 유지배양의 원리는, 간엽계 줄기세포의 세포주기를 정지기에 멈추고 휴면상태에서의 배양을 실현함으로써, 세포분열 및 증식에 수반되는 세포수명의 단축 그리고 노화의 진행을 억제할 뿐만 아니라, 원하지 않는 표현형으로의 분화에 수반되는 세포변화의 가능성을 배제하는 것에 있다. 이러한 배양상태는, 간엽계 줄기세포가 생체에 있어서, 줄기세포 닛시(ニッシェ(Niche))라 불리는 천연의 세포외 환경에 놓여져 있을 때의 생존상황에 가까운 것이며, 본 발명에 따른 배양법은, 생체모방적 수단에 의해 과제를 해결하는 것이다.

나아가 본 발명은, 휴면배양에 의한 간엽계 줄기세포의 품질열화의 회피, 휴면상태를 해제해서 이용할 때의 회수방법의 확립, 및 회수된 간엽계 줄기세포의 품질유지의 확인을 포함한다. 고품질의 간엽계 줄기세포를 보존하고 활용하기 위하여 필수시되는 품질 유지 및 회수를 위해서, 천연물 유래의 다당류를 이용함으로써, 이들 과제를 해결한다.

구체적으로는, 본 발명은, 제1 관점으로서, 천연물 유래의 다당류를 함유하는 체성 줄기세포의 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제2 관점으로서, 상기 다당류가 나노화이버 형상의 다당류인, 제1 관점에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제3 관점으로서, 상기 다당류가 증점성 다당류인, 제1 관점에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제4 관점으로서, 상기 증점성 다당류가 메틸셀룰로오스 또는 디우탄검인, 제3 관점에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제5 관점으로서, 상기 체성 줄기세포가 간엽계 줄기세포인, 제1 관점 내지 제4 관점 중 어느 하나에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제6 관점으로서, 37℃, 5체적% 이산화탄소 분위기의 배양조건하에서의 사용에 있어서, 1일간 내지 30일간 배양 후의 체성 줄기세포의 미분화성 및 다분화능을, 이 줄기세포의 채취 직후의 그것과 동등한 활성도로 유지할 수 있는, 제1 관점 내지 제5 관점 중 어느 하나에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제7 관점으로서, 상기 배양조건하에서 체성 줄기세포의 배양을 했을 때, 효소처리에 의해 체성 줄기세포의 회수가 가능한, 제1 관점 내지 제6 관점 중 어느 하나에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제8 관점으로서, 상기 다당류가, 1nm 내지 100nm의 평균섬유직경(D)을 갖는 나노화이버의 형태인, 제2 관점 및 제5 관점 내지 제7 관점 중 어느 하나에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제9 관점으로서, 상기 다당류가, 0.01μm 내지 10μm의 평균입자경(d)을 갖는 나노화이버의 형태인, 제2 관점 및 제5 관점 내지 제8 관점 중 어느 하나에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제10 관점으로서, 상기 다당류가, 평균섬유직경(D)에 대한 평균섬유길이(L)의 비(L/D)가 2 내지 500인 나노화이버의 형태인, 제8 관점에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제11 관점으로서, 상기 미분화성 유지 배양재료가, 셀룰로오스 유래의 천연물 나노화이버인, 제2 관점 및 제5 관점 내지 제10 관점 중 어느 하나에 기재된 미분화성 유지 배양재료에 관한 것이다.

제12 관점으로서, 제1 관점 내지 제11 관점 중 어느 하나에 기재된 미분화성 유지 배양재료가 액 중에 용해 또는 분산되어 이루어진, 배양액에 관한 것이다.

제13 관점으로서, 상기 미분화성 유지 배양재료가, 상기 배양액의 전체 체적량에 대하여 0.0001%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도로 용해 또는 분산되어 이루어진, 제12 관점에 기재된 배양액에 관한 것이다.

제14 관점으로서, 체성 줄기세포가 제12 관점 또는 제13 관점에 기재된 배양액의 액 중을 떠돌며 이루어진, 체성 줄기세포 함유 배양액에 관한 것이다.

제15 관점으로서, 상기 미분화성 유지 배양재료가, 단위체적(1mL)당 1.0×10³~1.0×10⁶의 줄기세포를 포함하는 상기 체성 줄기세포 함유 배양액의 전체 체적량에 대하여 0.0001%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도로 배양액 중을 떠돌며 이루어진, 제14 관점에 기재된 체성 줄기세포 함유 배양액에 관한 것이다.

제16 관점으로서, 추가로 혈청을 포함하는, 제14 관점 또는 제15 관점에 기재된 체성 줄기세포 함유 배양액에 관한 것이다.

제17 관점으로서, 상기 혈청이, 소태아혈청, 사람혈청, 말혈청 및 닭혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제16 관점에 기재된 체성 줄기세포 함유 배양액에 관한 것이다.

제18 관점으로서, 상기 혈청이, 상기 체성 줄기세포 함유 배양액의 전체 체적에 대하여 0.1체적% 내지 50체적%의 농도로 포함되는, 제16 관점 또는 제17 관점에 기재된 체성 줄기세포 함유 배양액에 관한 것이다.

제19 관점으로서, 추가로 세포기능 조절인자를 포함하는, 제14 관점 내지 제18 관점 중 어느 하나에 기재된 체성 줄기세포 함유 배양액에 관한 것이다.

제20 관점으로서, 천연물 유래의 다당류의 존재하에, 간엽계 줄기세포를 생체 외에서 배양함으로써, 1일간 내지 30일간 배양 후의 이 간엽계 줄기세포의 미분화성 및 다분화능을 이 줄기세포의 채취 직후와 동등한 활성도로 유지하는 것을 특징으로 하는, 간엽계 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.

본 발명의 미분화성 유지 배양재료에 의하면, 재생치료에 있어서 특히 유용성이 높은 간엽계 줄기세포를, 화학약품이나 단백, 조제인자 등의 배지에 대한 첨가나, 증식인자의 제거를 필요로 하지 않고, 미분화 상태를 유지(휴면상태)한 채로 장기간에 걸쳐 보존하는 것을 가능하게 한다.

또한 본 발명의 미분화성 유지 배양재료를 사용함으로써, 생체로부터 채취하고, 선별하고, 그리고 순화한 간엽계 줄기세포를, 실제 치료에 이용하는 시점까지 고품질로 유지하는 것이 가능해진다. 여기서 “고품질로 유지한다”는 것은, 줄기세포를 정의함에 있어서의 성질이 되는 미분화성 및 다분화능을 유지하는 것을 가리킨다. 또한 본 발명의 간엽계 줄기세포의 배양방법에 따르면, 일정기간의 간엽계 줄기세포의 보존배양 후에는, 특수한 조작을 필요로 하지 않고, 세포배양의 기술분야에 있어서 일반적으로 이용되고 있는 방법, 예를 들어 트립신 등의 프로테아제를 작용시키는 방법에 의해, 높은 세포회수율을 달성할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 미분화성 유지 배양재료는, 간엽계 줄기세포의 고품질로의 보존배양과, 이용에 있어서의 회수 및 조제의 용이함이라는 두 가지 주요한 효과를 갖는다.

도 1은, 실시예 1 및 실시예 2의 hMSC 배양에 있어서의 Calcein-AM/PI법에 의한 생사판정결과를 나타낸 도면이다.
도 2는, 실시예 3 내지 실시예 7의 hMSC 배양에 있어서의 Calcein-AM/PI법에 의한 생사판정결과를 나타낸 도면이다.
도 3은, 실시예 1 내지 실시예 3의 hMSC의 4주간 배양 후의 포지티브 마커 염색결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 실시예 1 내지 실시예 3의 hMSC의 4주간 배양 후의 네가티브 마커 염색결과를 나타낸 도면이다.
도 5는, 대조시험의 hMSC 배양(1주간)에 있어서의 Calcein-AM/PI법에 의한 생사판정결과를 나타낸 도면이다.
도 6은, 실시예 12의 hMSC의 4주간 배양 후의 포지티브 마커 염색결과를 나타낸 도면이다.
도 7은, 실시예 12의 hMSC의 4주간 배양 후의 네가티브 마커 염색결과를 나타낸 도면이다.
도 8은, 실시예 8에서 배양한 hMSC의 지방세포 분화유도시험 후의 항FABP4 항체에 의한 면역염색시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는, 실시예 8에서 배양한 hMSC의 지방세포 분화유도시험 후 Oil Red O염색의 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은, 실시예 8에서 배양한 hMSC의 골세포 분화유도시험 후의 Alizarin Red S 염색시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은, 실시예 8에서 배양한 hMSC의 3주간의 연골세포 분화유도시험 후의 항Aggrecan 항체에 의한 세포의 면역염색시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는, 실시예 8에서 배양한 hMSC의 4주간의 연골세포 분화유도시험 후의 항Aggrecan 항체에 의한 세포의 면역염색시험의 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 미분화성 유지 배양재료에 대하여 상세하게 설명한다.

또한 본 명세서에 있어서 「휴면배양」이란, 줄기세포가 생체 내에 존재해 있을 때의 특징인, 줄기세포의 세포주기가 정지기에 있는 상태로 유지되고, 아직 분화되지 않고 대기하여 이루어진 상태를, 생체 외 배양조건하에 있어서도 실현하는 것, 즉 줄기세포를 미분화 상태(초기상태)로 유지하는(세포를 휴면상태로 하는) 배양을 가리킨다.

<미분화성 유지 배양재료>

본 발명의 미분화성 유지 배양재료는, 천연물 유래의 다당류를 함유하는 것이며, 상기 다당류가 나노화이버 형상의 다당류(이하, 간단히 “나노화이버”라 칭함)이거나, 혹은 증점성 다당류인 것이 바람직하다.

[나노화이버(셀룰로오스) 원료]

본 발명의 미분화성 유지 배양재료에 사용되는 천연물 유래의 나노화이버로는, 미세화된 셀룰로오스 나노화이버를 들 수 있다.

상기 셀룰로오스 나노화이버의 원료는, 예를 들어, 목재, 대나무, 마, 황마, 양마, 코튼, 농작물 또는 식물잔사 등 식물유래의 셀룰로오스, 또는 박테리아 셀룰로오스, 대마디말(Cladophora), 회색식물(Glaucocystis), 발로니아, 호야 셀룰로오스 등, 미생물 생산 혹은 동물 생산의 셀룰로오스를 사용할 수 있다.

상기 식물유래의 셀룰로오스는 마이크로피브릴이라 불리는 매우 얇은 섬유가 다시 묶음이 되어 피브릴, 라멜라, 섬유세포와 단계적으로 고차구조를 형성하고 있는 것이며, 박테리아 셀룰로오스는 균세포로부터 분비된 셀룰로오스의 마이크로피브릴이, 그대로의 굵기로 미세한 망목구조를 형성하고 있는 것이다.

본 발명의 미분화성 유지 배양재료에 사용되는 셀룰로오스 나노화이버의 원료로는, 바람직하게는, 상기 서술한 농작물 또는 식물잔사 등 식물유래의 셀룰로오스, 또는 미생물산생 혹은 동물산생의 셀룰로오스를 크래프트펄프법 또는 설파이트펄프법으로 처리한 셀룰로오스, 그리고 이들을 고압 호모디나이저나 밀 등으로 분쇄한 분말 셀룰로오스를 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 비결정 부분을 산가수분해처리로 제거한 후, 분쇄 및 선별함으로써 얻어지는 결정 셀룰로오스를 들 수 있다.

[셀룰로오스 원료의 미세화(분쇄) 방법]

본 발명에 있어서, 상기 서술한 바와 같이 이들 셀룰로오스 원료를 분쇄하여 얻어지는 미세화한 셀룰로오스 나노화이버를 이용하는 것이 바람직하다. 셀룰로오스 원료의 분쇄방법은 한정되지 않으나, 본 발명의 목적에 맞는 후술하는 섬유직경 및 섬유길이까지 미세화하려면, 고압 호모디나이저, 그라인더(석구), 혹은 비즈밀 등의 매체교반밀과 같은, 강한 전단력이 얻어지는 방법이 바람직하다.

이들 분쇄방법 중에서도, 특히 고압 호모디나이저를 이용하여 미세화하는 것이 바람직하고, 예를 들어 일본특허공개 2005-270891호 공보나 특허 제5232976호 명세서에 개시된 바와 같은 습식분쇄법을 이용하여 미세화(분쇄화)하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 셀룰로오스 원료를 분산시킨 분산액(수분산액)을, 한 쌍의 노즐로부터 고압으로 각각 분사하여 충돌시킴으로써, 셀룰로오스 원료를 분쇄하는 것으로서, 예를 들어 Star Burst(등록상표) 시스템(Sugino Machine Limited Co., Ltd.제의 고압분쇄장치)이나 Nanovater(등록상표)(Yoshida Kikai Co., Ltd.의 고압분쇄장치)를 이용함으로써 실시할 수 있다.

상기 서술한 고압 호모디나이저를 이용하여 셀룰로오스 원료를 미세화(분쇄화)할 때, 미세화나 균질화의 정도는, 고압 호모디나이저의 초고압 챔버에 압송하는 압력과, 초고압 챔버에 통과시키는 횟수(처리횟수), 및 수분산액 중의 셀룰로오스 농도에 의존하게 된다.

압송압력(처리압력)은, 통상, 50~250MPa이며, 바람직하게는 150~245MPa이다. 압송압력이 50MPa 미만인 경우에는, 셀룰로오스의 미세화가 불충분해져, 미세화에 의해 기대되는 효과가 얻어지지 않는다.

또한, 미세화 처리시의 수분산액 중의 셀룰로오스 농도는 0.1질량%~30질량%, 바람직하게는 1질량%~10질량%이다. 수분산액 중의 셀룰로오스 농도가 0.1질량% 미만이면 생산성이 현저하게 낮고, 30질량%보다 높은 농도이면 분쇄효율이 낮아, 원하는 셀룰로오스 나노화이버가 얻어지지 않는다.

미세화(분쇄화)의 처리횟수는, 특별히 한정되지 않고, 상기 수분산액 중의 셀룰로오스 농도에 따라서도 다르지만, 예를 들어, 셀룰로오스 농도가 0.1~1질량%인 경우에는 처리횟수는 1~100회 정도이며, 1~10질량%에서는 1~1000회이며, 바람직하게는 10~200회이다. 또한, 분산액의 셀룰로오스 농도가 30질량%를 초과하는 고농도인 경우에는, 미세화하려면 수천회 이상의 처리횟수가 필요해지거나, 취급에 지장을 초래할 정도까지 분산액의 고점도화가 진행되므로, 공업적 관점에서 비현실적이다.

본 발명에 이용하는 셀룰로오스 나노화이버의 평균입자경(d)은, 0.01μm 내지 10μm, 바람직하게는 0.05μm 내지 5μm이다. 또한 본 발명에 있어서, 셀룰로오스 나노화이버의 “평균입자경”이란, 희박(希薄)조건으로 수중에 분산된 랜덤코일의 상태인 셀룰로오스 나노화이버의 유체역학적 직경의 지름을 나타내고 있다. 평균입자경이 0.01μm 미만이면, 셀룰로오스 나노화이버가 지나치게 미세함으로 인해 첨가효과가 얻어지지 않고, 즉, 이를 함유하는 미분화성 유지 배양재료의 세포부유작용 및 세포회수율이 저하된다. 또한 평균섬유직경이 10μm보다 크면, 미분화성 유지 배양재료의 투명성이나 세포분산효과를 잃고, 세포끼리 응집덩어리를 형성하거나, 세포와 함께 미분화유지 배양재료가 침강함으로써 기대한 효과가 얻어지지 않는다.

본 발명에 이용하는 셀룰로오스 나노화이버의 평균섬유직경(D)은, 1nm 내지 100nm, 바람직하게는 5nm 내지 70nm, 보다 바람직하게는 10nm 내지 50nm이다. 평균섬유직경이 1nm 미만이면, 셀룰로오스 나노화이버가 지나치게 미세함으로 인해 첨가효과가 얻어지지 않고, 즉, 이것을 함유하는 미분화성 유지 배양재료로부터의 세포회수율이 저하된다. 또한 평균섬유직경이 100nm보다 크면, 미분화성 유지 배양재료의 세포분산효과를 잃고, 세포끼리 응집덩어리를 형성함으로 인해 기대한 효과가 얻어지지 않는다.

또한 본 발명에 이용하는 셀룰로오스 나노화이버의 평균섬유길이(L)는, 0.01μm 내지 100μm, 바람직하게는 0.05μm 내지 10μm이다.

본 발명에 이용하는 셀룰로오스 나노화이버의 애스펙트비(L/D)는, 평균섬유길이/평균섬유직경으로부터 얻어지고, 통상 2~500이며, 바람직하게는 3~300이며, 보다 바람직하게는 4~250이다. 애스펙트비가 2 미만인 경우에는, 미분화성 유지 배양재료로서 액 중에서의 분산성 안정성이 충분히 얻어지지 않아, 세포의 분산성을 유지할 수 없다. 또한 애스펙트비가 500을 초과하는 경우에는, 섬유길이가 매우 커지는 것을 의미하는 점에서, 배양액의 점도증대 등을 유발하여, 취급성의 현저한 저하를 유발한다.

또한 본 발명에 있어서, 셀룰로오스 나노화이버의 평균입자경(d), 평균섬유직경(D) 및 평균섬유길이(L)는 이하와 같이 하여 구한 것이다.

·평균입자경(d): 후술하는 제조예에 있어서 제작한 셀룰로오스 분산액을 0.01~0.1질량%가 되도록 초순수로 희석하고, 초음파세정기로 30분간 분산시켜, Otsuka Electronics Co.,Ltd.제 동적 광산란측정기(FDLS-3000, cumulant법), 또는 Malvern Instruments, Ltd.제 레이저회절식 입도분포 측정장치(Mastersizer 2000, 누적체적 50% 통과경(D50))를 이용하여 평균입자경(d)을 측정하였다.

또한 평균입자경(d)은 하기 Stokes-Einstein의 식을 이용하여, 확산계수(D)로부터 유체역학적 직경으로서 구해진다.

d=kT/3πη₀D

d: 입자경(유체역학적 직경), k: 볼츠만 상수, T: 절대온도, η₀: 용매의 점도

·평균섬유직경(D): Okenshoji Co., Ltd.제 collodion 지지막을 JEOL Ltd.제 Ion Cleaner(JIC-410)로 3분간 친수화 처리를 실시하였다. 이 지지막에, 후술하는 제조예에 있어서 제작한 셀룰로오스 분산액(초순수로 희석)을 수 방울 적하하고, 실온 건조시켜, 시료로 하였다. 이 시료를 Hitachi, Ltd.제 투과형 전자현미경(TEM, H-8000)(10,000배)으로 가속전압 200kV로 관찰하였다. 얻어진 화상을 이용하여, 표본수: 200~250개의 셀룰로오스 나노화이버에 대하여 각각의 섬유직경을 계측하고, 그 수평균값을 평균섬유직경(D)으로 하였다.

·평균섬유길이(L): 후술하는 제조예에 있어서 제작한 셀룰로오스 분산액을, 셀룰로오스 농도가 0.001질량%가 되도록 디메틸설폭사이드(DMSO)에 의해 희석하고, 셀룰로오스를 분산시켰다. 이것을 미리 농황산을 이용하여 표면을 친수화 처리한 실리콘웨이퍼 상에 캐스트하고, 110℃에서 1시간 건조시켜 시료로 하였다. 얻어진 시료의 JEOL Ltd.제 주사형 전자현미경(SEM, JSM-7400F)(2,000배)으로 관찰한 화상을 이용하여, 표본수: 150~250개의 셀룰로오스 나노화이버에 대하여 각각의 섬유길이를 계측하고, 그 수평균값을 평균섬유길이(L)로 하였다.

[증점성 다당류]

천연물 유래의 메틸셀룰로오스나 디우탄검 등의 증점성 다당류는, 고농도영역에서는 증점제로서 작용한다. 한편 1% 이하와 같은 저농도영역에서는 세포 등에 대하여 분산제로서 작용한다. 그리고 이들 증점성 다당류를 이러한 저농도로 세포배양에 사용하면, 배양조작 등의 핸들링에 큰 영향을 주는 일 없이, 세포증식을 안정화시킬 수 있는 것이 알려져 있다. 이는, 증점성 다당류를 저점도로(이른바 분산제로서) 첨가함으로써, 세포의 배양용기에 대한 접착이나 세포끼리 서로 접착하는 것에 의한 세포덩어리 형성 등을, 억제하는 작용에 따른 것이다. 그리고 이 작용에 의해, 세포접착에 의한 세포기능상실이나 증식저해, 및 세포덩어리 중심부의 영양부족이나 산소결핍에 의한 네크로시스를 억제할 수 있다.

본 발명의 미분화성 유지 배양재료에 사용되는 천연물 유래의 증점성 다당류로는, 예를 들어 히알루론산, 젤란검, 탈아실화젤란검, 람산검(rhamsan gum), 디우탄검, 크산탄검, 카라기난, 잔탄검, 헥수론산, 후코이단, 펙틴, 펙틴산, 펙티닌산, 헤파란황산, 헤파린, 헤파리틴황산, 케라토황산, 콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 람난황산 및 이들의 염, 알긴산나트륨, 알긴산프로필렌글리콜에스테르 등 알긴산 유도체, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 그 나트륨 등의 염, 메틸하이드록시프로필셀룰로오스, 셀룰로오스 황산나트륨, 디알킬디메틸암모늄황산셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 키토산, 폴리쿼터늄-10 등의 양이온화셀룰로오스, 양이온화덱스트란 및 구아하이드록시프로필트리모늄클로라이드 등의 양이온화다당 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다.

그 중에서도, 본 발명의 미분화성 유지 배양재료로서, 메틸셀룰로오스 또는 디우탄검을 호적하게 사용할 수 있다.

<체성 줄기세포>

[간엽계 줄기세포]

본 발명의 미분화성 유지 배양재료가 배양대상이 되는 체성 줄기세포에는 간엽계 줄기세포(MSC), 조혈 줄기세포(HSC), 제대혈 줄기세포, 신경 줄기세포 등이 있는데, 특히 간엽계 줄기세포(MSC)를 대상으로 한다.

여러 가지 형태의 세포로 분화가능하고, 치료에 활용될 수 있는 간엽계 줄기세포는 통상, 성체로부터 채취하고, 선별하며, 그리고 순화한 것을 이용한다. 본 발명의 미분화성 유지 배양재료를 적용할 수 있는 간엽계 줄기세포로는, 환자로부터 직접 채취되는 임상용 초대 사람 간엽계 줄기세포뿐만 아니라, 시험연구용으로 이용할 수 있는 세포뱅크로부터 입수 가능한 간엽계 줄기세포나, 불사화된 간엽계 줄기세포주도 들 수 있다.

당업자라면 이미 알고 있는 바와 같이, 이들 간엽계 줄기세포는, 임상상의 적용의 관점에서 보면, 자가 소스 유래, 동종이계 소스유래 또는 이종간 소스유래의 어떠한 세포여도 된다. 또한 채취원은, 기증자 골수, 조직생검, 배아소스, 출생후 소스 등의 어떠한 채취원이어도 된다. 구체적으로는 장골능의 골수, 대퇴경골, 척추, 늑골 또는 다른 골수강 유래, 혹은 배아난황난, 태반, 제대, 골막, 태아 및 청년기의 피부 및 혈액을 포함하는 조직생검 유래 등의 채취원을 들 수 있다.

<배양액>

본 발명은, 상기 미분화성 유지 배양재료가 액 중에 분산되어 이루어지는 배양액에 관한 것이기도 하다.

상기 배양액은, 완충액 및/또는 액체배지를 포함한다.

상기 액체배지로는, 천연배지, 반합성배지, 합성배지 등 중, 동물세포의 배양에 이용되는 배지를 호적하게 사용할 수 있다. 이러한 배지로는, 예를 들어 윌리엄 배지 E(William's E배지), 햄 F10 배지(Ham's Nutrient Mixture F10), 햄 F12 배지(Ham's Nutrient Mixture F12), RPMI1640 배지, 이글 MEM 배지(Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles's Medium; DMEM), 알파 개변 이글 배지(α-Modified Eagles's Medium; α-MEM) 등을 들 수 있다.

또한 이 액체배지는, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인, 염소, 아미노산, 비타민, 사이토카인, 호르몬, 항생물질, 혈청, 지방산, 당 등을 함유할 수도 있다. 또한 액체배지에는 목적에 따라 기타 화학성분 혹은 생체성분을 1종류 이상 조합하여 첨가할 수도 있고, 예를 들어 소태아혈청, 사람혈청, 말혈청, 닭혈청인슐린, 트랜스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 에탄올아민, 아세렌산나트륨, 모노티오글리세롤, 2-메르캅토에탄올, 소혈청알부민, 피루브산나트륨, 폴리에틸렌글리콜, 각종 비타민, 각종 아미노산, 한천, 아가로스, 콜라겐, 메틸셀룰로오스, 각종 사이토카인, 각종 증식인자, 세포기능 조절인자 등을 첨가할 수 있다.

상기 배양액은, 상기 미분화성 유지 배양재료가, 이 배양액의 전체 체적량에 대하여 0.0001%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도, 바람직하게는 0.0005%(w/v) 내지 1%(w/v)의 농도로 분산되어 이루어진 것이 바람직하다.

<체성 줄기세포 함유 배양액>

나아가 본 발명은, 체성 줄기세포가 상기 배양액의 욕 중을 떠다니게 되는 체성 줄기세포 함유 배양액에 관한 것이기도 하다.

상기 체성 줄기세포 함유 배양액은, 단위체적(1mL)당 1.0×10³~1.0×10⁶의 줄기세포를 포함하는 상기 체성 줄기세포 함유 배양액의 전체 체적량에 대하여, 상기 미분화성 유지 배양재료가 0.0001%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도, 바람직하게는 0.0005%(w/v) 내지 1%(w/v)의 농도로 배양액 중을 떠돌며 이루어진 것이 바람직하다.

이 체성 줄기세포 함유 배양액에는, 상기 서술한 액체배지에 첨가 가능한 기타 화학성분 또는 생체성분, 즉 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인, 염소, 아미노산, 비타민, 사이토카인, 호르몬, 항생물질, 혈청, 지방산, 당 등을 첨가할 수도 있다. 예를 들어 소태아혈청, 사람혈청, 말혈청, 닭혈청 인슐린, 트랜스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 에탄올아민, 아세렌산나트륨, 모노티오글리세롤, 2-메르캅토에탄올, 소혈청알부민, 피루브산나트륨, 폴리에틸렌글리콜, 각종 비타민, 각종 아미노산, 한천, 아가로스, 콜라겐, 메틸셀룰로오스 외에, 각종 세포기능 조절인자, 선유아세포 증식인자, 상피 증식인자, 혈관내피 증식인자, 혈소판유래 증식인자, 간세포 증식인자 등을 추가로 첨가할 수 있다.

예를 들어 소태아혈청, 사람혈청, 말혈청, 닭혈청 등의 혈청의 경우, 체성 줄기세포 함유 배양액의 전체 체적에 대하여 0.1체적% 내지 50체적%, 바람직하게는 0.5체적% 내지 20체적%의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

[배양방법]

본 발명의 미분화성 유지 배양재료를 이용한 체성 줄기세포의 배양방법(휴면배양)의 일례를 이하에 기재한다.

우선, 상기 서술한 본 발명의 미분화성 유지 배양재료를, 상기 서술한 배양액(완충액 및/또는 상기 액체배지, 또한 이들 배지에 소태아혈청이나 사람혈청 등을 첨가한 액체배지)에 첨가하고, 이 미분화성 유지 배양재료를 배양액 중에 용해 또는 분산시켜, 용해액 또는 분산액의 상태로 한다.

이리하여 준비한 본 발명의 미분화성 유지 배양재료를 함유하는 배양액을, 동물세포의 배양에 일반적으로 이용되는 배양기: 샬레, 플라스크, 웰 플레이트, 플라스틱백, Teflon(등록상표)백 등의 적당한 용기 중에 준비하고, 여기에 적절한 완충액 등으로 현탁시킨 간엽계 줄기세포를, 단위체적(1mL)당 배지에 줄기세포수가 1.0×10³~1.0×10⁶이 되도록 파종한다. 이때, 혈청이나 세포기능 조절인자 등을 배양액에 추가로 첨가해도 된다.

미분화성 유지 배양재료의 분산배양액에 파종된 간엽계 줄기세포는, 통상 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 35℃ 내지 38℃, 예를 들어 37℃에서, 0체적 내지 10체적%, 바람직하게는 3체적 내지 7체적%, 예를 들어 5체적%의 이산화탄소 분위기에서, 세포배양용 인큐베이터 내에 있어서 배양할 수 있다.

세포배양 중에는 필요에 따라, 배양액을 교환하고, 배양환경을 신선하게 유지할 수도 있다. 배양액 교환에 있어서는, 예를 들어 미분화성 유지 배양재료로서 나노화이버를 이용한 경우, 소정의 원심력 조건으로 원심분리하고, 세포배양액 중에 분산되어 있는 나노화이버와 세포의 양자를 침강회수하고, 신선한 배양액으로 재분산함으로써 행할 수 있다.

예를 들어 상기 서술한 순서로, 37℃, 5체적% 이산화탄소 분위기의 배양조건하에서 본 발명의 미분화성 유지재료를 사용하고 간엽계 줄기세포 등의 체성 줄기세포를 배양함으로써, 1일간 내지 30일간 배양 후의 체성 줄기세포의 미분화성 및 다분화능을, 이 줄기세포의 채취 직후와 동등한 활성도로 유지할 수 있다.

[회수방법]

본 발명의 미분화성 유지재료를 사용한 배양조건하에서 체성 줄기세포의 배양을 했을 때, 트립신처리에 의해 체성 줄기세포의 회수가 가능하다.

본 발명의 미분화성 유지 배양재료를 사용함으로써, 휴면배양의 실시 후 2주간 이상, 예를 들어 30일을 경과한 후에도 간엽계 줄기세포 등의 체성 줄기세포의 미분화성을 유지하고, 분화능을 유지함과 함께, 세포노화를 억제할 수 있다.

실시예

이하에 실시예를 들어 본 발명의 특징을 보다 구체적으로 설명한다. 이하의 실시예에 나타낸 재료, 사용량, 비율, 처리내용 및 처리순서는, 본 발명의 취지를 벗어나지 않는 한 적당히 변경할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 이하에 나타낸 구체예에 의해 한정적으로 해석되어야 하는 것은 아니다.

[평균입자경(d)의 측정]

상기 서술한 [0026]에 기재된 순서에 따라, 동적 광산란측정으로부터 하기 제조예 1 내지 제조예 3에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버의 평균입자경(d)을 구하였다.

[평균섬유직경(D) 및 평균섬유길이(L)의 측정]

상기 서술한 [0026]에 기재된 순서에 따라, TEM 화상 및 SEM 화상으로부터 하기 제조예 1 내지 제조예 3에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버의 평균섬유직경(D) 및 평균섬유길이(L)를 구하고, 이들 값으로부터 애스펙트비(L/D)를 구하였다.

[제조예 1: 미결정 셀룰로오스 유래 셀룰로오스 나노화이버(MC1)의 제조]

시판의 미결정 셀룰로오스(Funakoshi Corporation제 칼럼크로마토그래피용 Funacel 분말 II) 1.5질량부에 순수 1,000질량부를 첨가하여 분산시킨 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 245MPa로 50회 분쇄처리를 행하고, 미결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액(MC1)을 얻었다.

[제조예 2: 미결정 셀룰로오스 유래 셀룰로오스 나노화이버(MC2)의 제조]

시판의 미결정 셀룰로오스(Funakoshi Corporation제 칼럼크로마토그래피용 Funacel 분말 II) 15질량부에 순수 1,000질량부를 첨가하여 분산시킨 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 245MPa로 150회 분쇄처리를 행하고, 미결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액(MC2)을 얻었다.

[제조예 3: 미결정 셀룰로오스 유래 셀룰로오스 나노화이버(MC3)의 제조]

시판의 미결정 셀룰로오스(Funakoshi Corporation제 칼럼크로마토그래피용 Funacel 분말 II) 15질량부에 순수 1,000질량부를 첨가하여 분산시킨 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 245MPa로 300회 분쇄처리를 행하고, 미결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액(MC3)을 얻었다.

[제조예 4: 펄프 유래 셀룰로오스 나노화이버(PC)의 제조]

시판의 크래프트펄프(Kokusai Pulp&Paper Co., Ltd.제 LBKP D-8, 고형분 46질량%) 22질량부에 순수 978질량부를 첨가하여 분산시킨 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 245MPa로 200회 분쇄처리를 행하고, 펄프유래 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액을 얻었다. 얻어진 분산액을 샬레에 측정하고, 110℃에서 1시간 건조를 행하고, 수분을 제거하여 잔사의 양을 측정하고, 농도를 측정하였다. 그 결과, 수중의 셀룰로오스 농도(고형분 농도)는, 1.0질량%였다. 이 분산액을 순수로 10질량배가 되도록 희석하고, 0.1질량% 수분산액(PC)을 얻었다.

[제조예 5: 박테리아 셀룰로오스 유래 셀룰로오스 나노화이버(BC)의 제조]

시판의 박테리아 셀룰로오스(UTAMA사제 PT.NIRAMAS, 아세트산수용액 중 셀룰로오스 고형분 약 0.5질량%) 200질량부를 가정용 믹서로 5분간 파쇄하였다. 얻어진 슬러리를 여과하고, 순수에 분산시킨 후에 pH를 측정하고, pH가 중성(6~7)이 될 때까지 동일한 수세를 반복하였다. 전체량을 1000질량부가 되도록 순수를 첨가한 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 200MPa로 300회 분쇄처리를 행하고, 박테리아 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액(BC)을 얻었다.

제조예 1 내지 제조예 5에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버에 대하여, 평균입자경(d), 평균섬유직경(D) 및 평균섬유길이(L)를 상기 서술한 순서에 따라서 측정하였다. 얻어진 결과 그리고 평균섬유직경(D) 및 평균섬유길이(L)로부터 구한 애스펙트비(L/D)를 나타낸다.

[표 1]

[실시예 1: MC1을 이용한 hMSC 배양]

[배양액의 조제]

제조예 1에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(MC1)의 0.1질량% 수분산액 100mL에, 시판의 고압증기 멸균가능한 분말배지(Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.제 둘베코 변법 이글배지 2) 100mL분을 첨가하였다. 이것을 30분 정도 마그네틱스터러로 교반하여 이 분말배지를 수분산액에 용해시킨 후, 121℃에서 15분간 고압증기 멸균하였다. 이 용액을 실온까지 냉각한 후, 이 용액에 시판의 L-글루타민용액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제 200mmol/L L-글루타민용액(×100))을 최종농도 2mM가 되도록 첨가하고, 다시 멸균한 10질량% 탄산수소나트륨 수용액을 1mL 첨가하였다. 용액으로부터 소량을 취출하고, pH 시험지를 사용하여 용액의 pH가 대략 pH 7.0~8.0인 것을 확인하였다. 이 용액에, 사용 전에 10체적%가 되도록 소태아혈청(이하 본 명세서 중에서는 FBS라 기재함)을 첨가하고, 0.1%(w/v) MC1 배양액으로 하였다. 또한, 목적에 따라 10체적%의 FBS를 포함한 DMEM 배지(Gibco(등록상표) DMEM, Powder, Low Glucose, Pyruvate 31600-034)를 MC1배양액애 추가 혼합함으로써, 배양액 중의 셀룰로오스 나노화이버 농도를 조절하였다(표 2 및 도 1 내지 도 4에 있어서의 NF 농도 참조).

[간엽계 줄기세포 MSC의 파종]

친수성 처리를 하지 않은 폴리스티렌 샬레인 직경 10cm의 저접착성 ASNOL 멸균 샬레(AS ONE Corporation제 GD90-15)에, 배지로서 0.025~0.1%(w/v) MC1 배양액을 10mL 넣고, 사람 간엽계 줄기세포(Lonza PT-2501; 이하 본 명세서에서는 hMSC라고 기재함)를 5.0×10⁵개/dish로 파종하였다. 이 파종한 세포를 5체적% 이산화탄소 중, 37℃에서 1일간 배양한 후, 샬레에 접착된 세포를 제거하기 위하여, 배양액을 새로운 ASNOL 멸균 샬레에 옮기고, 다시 4주간 배양을 계속하였다. 도중, 1주간 간격으로 배지교환을 위하여 배양액을 원심관에 회수하여 10℃에서 300g, 5분간 원심분리하고, 상청을 제거한 후 10체적% FBS를 포함한 새로운 DMEM 배지 10mL에 재현탁시켜 새로운 ASNOL 멸균 샬레에 옮겼다.

배양 후 1~4주간의 각 시점에서 배양액을 회수하고, 이하의 순서에 따라, Calcein-AM/PI법에 의한 세포의 생사판정, 트립신처리에 의한 세포의 회수, 미분화마커에 의한 면역염색을 행하였다.

<Calcein-AM/PI법에 의한 생사판정>

1~4주간의 배양 후에 회수한 각 배양액으로부터 0.5mL를 취출하고, 10℃에서 300g, 5분간 원심분리하여 상청을 제거하고, 나노화이버(이하, NF라고 칭함) 침전물을 1mL의 인산완충액(이하, PBS라고 칭함)으로 세정하였다. 2회 세정을 반복한 후 NF 침전물에 Calcein-AM/PI액을 0.5mL 첨가하여 혼합하고, 5체적% 이산화탄소 중, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 다음에, PBS세정을 2회 행하고, NF 침전물에 0.5mL의 DMEM 배지를 첨가하여 현탁시키고, 그 현탁액을 24웰 플레이트에 옮겨 위상차현미경 관찰 및 형광현미경하에서 녹형광(생세포)·적형광(사세포)을 확인하였다. 얻어진 결과를 도 1 및 도 2에 나타낸다.

<트립신처리에 의한 세포의 회수>

1~4주간의 배양 후에 회수한 각 배양액 1 디쉬분을 원심관에 옮기고, 10℃에서 300g, 5분간 원심분리하여 상청과 침전물로 나누었다. 침전물을 10mL의 PBS로 2회 세정하고, 이 상청도 회수하고, 모든 상청을 10℃에서 430g, 3분간 원심하여, 침전물을 얻었다. 얻어진 모든 침전물을 하나로 합하고, 여기에 침전물과 대략 등량의 트립신액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제, 0.25%(w/v) Trypsin-1mmol/l EDTA·4Na Solution with Phenol Red)을 첨가하고, 37℃에서 5분간 인큐베이트하였다. 그 후, 10체적% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 트립신액의 배량 첨가하고, 혼합한 후 10℃에서 300g, 5분간 원심하여 상청과 침전물로 나누었다. 상청을 다시 10℃에서 430g, 3분간 원심분리한 후, 상청을 제거하였다. 얻어진 침전물과 먼저 나눈 침전물을 모두, 새로운 10체적% FBS를 포함하는 DMEM 배지 10mL에 현탁시키고, 직경 10cm의 친수처리된 세포배양용 폴리스티렌 디쉬(Tissue culture polystyrene, 이하 본 명세서 중에서는 TCPS라 기재함)에 재파종하였다. 이 재파종한 세포를 5체적% 이산화탄소 중, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트한 결과, 디쉬에 생착된 세포가 확인되었다. 이 생착된 세포를 상기와 동일한 트립신액으로 처리하고, 37℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 10체적% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 트립신액의 배량 이상~최대 추가로 10mL 정도 첨가하고, 혼합하여, 10℃에서 430g, 3분간 원심분리하고, 그리고, 얻어진 침전세포를 새로운 10체적% FBS를 포함한 수 mL의 DMEM 배지에 현탁시켰다. 이 현탁물을 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 계측하였다.

또한 세포파종시에, 비교대상으로서, hMSC를 직경 10cm의 TCPS에 10체적% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 5.0×10⁵개/dish 파종하고, 파종 다음날 세포를 회수 및 카운트하였다. 이때의 세포수를 회수율 100%로 하고, 상기 서술한 배양에 제공한 세포의 회수율을 산출하였다. 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 여기서 미분화성 유지재료에 대한 세포의 부착율은, 나노화이버 분산액으로 배양한 다음날 시점에서, 분산 나노화이버에 부착되지 않고 배양디쉬에 침강부착된 세포수를 상기 서술한 트립신 처리에 의한 회수를 행하여 계측한 세포수를, 비교대상인 세포수로부터 차감함으로써 구하였다. 이는 부유한 세포의 수를 직접 계측하는 것의 곤란성 때문이다.

[휴면성의 확인]

간엽계 줄기세포의 성질을 유지한 휴면상태에서의 배양이 행해졌는지 여부에 대하여, 간엽계 줄기세포를 특징짓는 각종 마커단백질의 발현상태를 관찰하고, 평가하였다.

1~4주간의 배양 후, 트립신처리에 의해 실시예 1의 MC1로부터 회수한 세포를 24웰 플레이트에 5.0×10³개/cm²(9.5×10³개/웰)로 파종하고, 파종한 세포를 5체적% 이산화탄소 중, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다.

이 세포에, 사람 간엽계 줄기세포의 마커항체(포지티브 마커: 6종, 네가티브 마커: 5종)를 이용하여 면역형광염색을 행하고, 세포의 휴면성을 평가하였다. 면역형광염색은 이하의 방법으로 행하였다. 세포를 PBS로 세정 후, 4% 파라포름알데히드·인산완충액으로 고정하고, 세정 후에 1%(w/v) 소혈청 알부민 및 10체적% 당나귀혈청을 포함한 PBS(블로킹버퍼)로 블로킹 처리하였다. 이 처리한 세포를 적당한 농도로 희석한 마우스 모노클로날 항체와 4℃에서 하룻밤 반응시키고, 1차 항체를 세정 제거 후, 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC) 표식 항마우스항체와 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정 후, 표식된 세포가 형광현미경하에서 녹형광(양성 및 발현강도)을 발하는지 여부를 확인하였다. 4주간 배양 후의 면역염색결과를 도 3 및 도 4에 나타낸다.

또한 대조시험으로서, 실시예 1 내지 실시예 3에 있어서 사용한 것과 동등한 계대수 6의 hMSC를 실시예에서 행한 것과 동일한 파종조건으로 배양하고, 마커항체에 대한 면역형광염색을 행하였다.

[실시예 2: MC2를 이용한 hMSC 배양]

제조예 2에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(MC2)의 0.1질량% 수분산액을 이용하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 배지조제를 행하여, 0.1%(w/v) MC2 배양액을 조제하였다. 이것을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 hMSC의 파종 및 배양을 행하고, 1~4주간의 배양 후, Calcein-AM/PI법에 의한 생사판정, 트립신에 의한 세포의 회수 및 휴면성의 확인에 대하여 행하였다.

[실시예 3: MC3을 이용한 hMSC 배양]

제조예 3에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(MC3)의 0.1질량% 수분산액을 이용하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 배지조제를 행하여, 0.1%(w/v) MC3 배양액을 조제하였다. 이를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 hMSC의 장기배양, Calcein-AM/PI법에 의한 생사판정, 세포의 회수 및 휴면성의 확인을 행하였다.

[실시예 4: PC를 이용한 hMSC 배양]

제조예 4에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(PC)의 0.1질량% 수분산액을 이용하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 배지조제를 행하여, 0.1%(w/v) PC 배양액을 조제하였다. 또한, hMSC의 배양에는 TCPS를 이용하여, 세포의 생사판정, 및 트립신에 의한 세포의 회수를 행하였다. 또한 본 실시예에서는, 배양 다음날의 시점에 대해서도 세포의 회수를 행하였다.

[실시예 5: BC를 이용한 hMSC 배양]

제조예 5에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(BC)의 0.1질량% 수분산액을 이용하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 배지조제를 행하여, 0.1%(w/v) BC 배양액을 조제하였다. 또한, hMSC의 배양에는 TCPS를 이용하여, 세포의 생사판정, 및 트립신에 의한 세포의 회수를 행하였다.

[실시예 6: 메틸셀룰로오스를 이용한 hMSC 배양]

메틸셀룰로오스(M0387, Aldrich사제: ME)를 이용하여 1.0질량% 수분산액을 조제하고, 이를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 배지조제를 행하여, 1.0%(w/v) 메틸셀룰로오스 배양액을 조제하였다. 또한, hMSC의 배양에는 ASNOL 멸균 샬레를 이용하여, 세포의 생사판정, 및 트립신에 의한 세포의 회수를 행하였다. 또한 본 실시예에서는, 배양 3일 후의 시점에 대해서도 세포의 회수를 행하였다.

[실시예 7: 디우탄검을 이용한 hMSC 배양]

디우탄검(KELCO CRETE DG-F, Sansho Co., Ltd.제: DU)의 1.0질량% 수분산액을 이용하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 배지조제를 행하여, 1.0%(w/v) 디우탄검 배양액을 조제하였다. 또한, hMSC의 배양에는 ASNOL 멸균 샬레를 이용하여, 생사판정, 및 트립신에 의한 세포의 회수를 행하였다. 또한 본 실시예에서는, 배양 3일 후의 시점에 대해서도 세포의 회수를 행하였다.

[결과: 세포생사판정]

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 실시예 3의 모든 계에 있어서도, 생세포(녹형광)를 나타낸 Calcein-AM 염색상은 4주간 후에도 관찰되는 것에 반해, 사세포(적형광)를 나타낸 PI 염색세포는 극히 저빈도의 관찰에 그쳤다. 즉, 이 관찰결과로부터, MC1~MC3의 나노화이버 분산배양액에 의해, hMSC를 4주간 이상 배양가능한 것이 나타났다. 또한 실시예 4 및 실시예 5에 있어서도, 1주간 후에 Calcein-AM 염색상이 관찰되고, PC 및 BC의 나노화이버 분산배양액에 의해서도 hMSC를 배양가능한 것이 나타났다.

또한 실시예 1 및 실시예 2에서는 배양 중에 세포끼리가 수개 내지 10개 정도 응집해 있는 모습이 현저하지만, 실시예 3에서는 4주간 후의 생세포의 분산상태가 좋은 점에서, MC3의 나노화이버 분산배양액이 특히 개개의 줄기세포에 대하여 균질한 배양환경을 제공하고 있는 것으로 이해된다.

[결과: 세포의 회수율]

표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 내지 실시예 5의 어느 것에 있어서도, 파종 다음날 미분화성 유지 배양재료가 세포에 부착되어 있는 것을 확인할 수 있고, 특히 실시예 1 내지 실시예 3 및 실시예 5에서는 80%를 초과하는 세포부착율이 확인되었다. 또한 실시예 6(메틸셀룰로오스) 및 실시예 7(디우탄검)에 있어서도, 후술하는 바와 같이 일정한 배양기간 후에 있어서 세포를 회수할 수 있는 점에서, 이들 실시예에 있어서도 파종 다음날 미분화성 유지 배양재료가 세포에 부착되어 있다고 할 수 있다.

또한 실시예 1 내지 실시예 3에서는, 4주간 후에 있어서 약 40~60%의 세포를 회수할 수 있다는 결과가 얻어졌다. 특히 실시예 1의 MC1을 이용한 배양에 있어서, 가장 높은 회수율이 얻어지고, 4주간의 장기 배양 후에 있어서 61.2%의 세포를 회수할 수 있었다.

또한 실시예 4, 실시예 6 및 실시예 7에 있어서도, 일정한 배양기간 후에 세포를 회수할 수 있는 것이 확인되었다.

이들 결과로부터, 나노화이버 분산배양액 및 증점성 다당류분산 배양액 모두, Hmsc의 회수·재파종의 재생착에 유효한 것으로 이해된다. 특히 동일한 미결정 셀룰로오스 유래 나노화이버의 수분산액(MC1 내지 MC3)을 사용한 실시예 1 내지 실시예 3에 있어서는, 사용한 나노화이버의 길이가 긴 조건에 있어서 세포회수율이 상승되고, 특히 미결정 셀룰로오스 유래 나노화이버의 나노화이버분산 용액에 있어서는, hMSC의 회수·재파종 후의 재생착에 유효한 것으로 이해된다.

[표 2]

[결과: 휴면성 확인]

도 3에 나타낸 바와 같이, 나노화이버 분산배양액을 이용한 배양 후 4주간의 시점에서, 포지티브 마커인 STRO-1, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105에 대하여, 실시예 1-3의 어떤 세포에 있어서도 대조시험과 동일한 정도의 정상 발현을 나타냈다.

또한 도 4에 나타낸 바와 같이, 네가티브 마커인 CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45에 관해서도, 대조시험과 동일한 정도의 면역염색 형광강도를 나타내고, hMSC의 성질을 4주간 배양 후에 있어서도 거의 정상적으로 유지되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 8 내지 실시예 10: MC1을 이용한 세포무접착 배양샬레 상에서의 MSC 배양]

[배양액의 조정]

실시예 1과 동일한 조건 및 순서에 따라 배양액을 조제하였다.

[간엽계 줄기세포 MSC의 파종]

직경 10cm의 세포무접착 배양샬레(Greiner Bio-One제 CellStar664970)에, 배지로서 0.02질량%, 0.017질량%, 0.0125질량%의 MC1 배양액을 10mL 넣고, hMSC를 5.0×10⁵개/dish로 파종하였다. 1주간 간격으로 배지교환을 위하여 배양액을 원심관에 회수해서 10℃에서 300g, 5분간 원심분리하고, 상청을 제거한 후 침전물을 10질량% FBS를 포함한 새로운 DMEM 배지 10mL에 재현탁시켜, 원래의 세포무접착 배양샬레에 되돌렸다. 배양 후 1~4주간의 각 시점에서 배양액을 회수하고, 단락 [0046], [0047], [0048]에 기재된 순서에 따라, Calcein-AM/PI법에 의한 세포의 생사판정, 트립신처리에 의한 세포의 회수 및 미분화마커에 의한 세포의 면역염색을 행하였다.

[다분화능 유지의 확인]

회수된 세포에 대하여, 다분화능을 유지한 휴면상태에서의 배양이 행해졌는지 여부를 확인하기 위하여, 시판의 분화유도배지(R&D Systems제 사람 간엽계 줄기세포 분화유도키트 sc006)를 이용하여 지방세포, 골세포 및 연골세포에 대한 분화유도를 각각 행하였다. 이 분화시킨 세포를 마커항체를 이용하여 면역염색하고, 이들 세포가 각각의 세포계에 대한 분화능을 갖고 있는지 확인하였다.

hMSC를 0.02% MC1 배양액으로 2주간 배양 후, 단락 [0047]에 기재된 순서와 마찬가지로 트립신처리에 의해 회수하였다.

<지방세포에 대한 분화유도>

MC1 배지로부터 회수한 hMSC를 αMEM(life technologies제 MEMα 12560-056)에 10% FBS, 페니실린·스트렙토마이신, 글루타민을 첨가한 기본배지에 재현탁하고, 멸균한 커버글라스가 들어간 24웰 플레이트에 2.1×10⁴개/cm²로 재파종하였다. 100% 컨플루엔트가 될 때까지 배양한 후, 기본배지에 지방세포의 분화유도제를 첨가한 것에 배지를 교환하였다. 3, 4일 간격으로 분화유도제가 들어간 배지를 신선한 것으로 교환하고, 3주간 배양을 계속하였다. 1~3주간째에 커버글라스를 취출하고, 배양한 hMSC의 Oil Red O 염색 및 항FABP4 항체에 의한 면역염색을 행하였다.

<골세포에 대한 분화유도>

골세포에 대한 분화유도 중인 세포의 박리를 방지하기 위하여, 1μg/mL의 피브로넥틴 용액을 멸균한 커버글라스가 들어간 24웰 플레이트에 첨가하여, 37도에서 3~30시간 처리하였다. MC1 배지로부터 회수한 hMSC를, αMEM(life technologies제 MEMα 12560-056)에 10% FBS, 페니실린·스트렙토마이신 및 글루타민을 첨가한 기본배지에 재현탁하고, 그리고 준비해둔 24웰 플레이트에 4.2×10³개/cm²로 재파종하였다. 하룻밤 배양 후, 기본배지에 골세포의 분화유도제를 첨가한 것에 배지를 교환하였다. 3, 4일 간격으로 분화유도제가 들어간 배지를 신선한 것으로 교환하고, 4주간 배양을 계속하였다. 2~4주간째에 커버글라스를 취출하고, 배양세포의 Alizarin Red S 염색을 행하였다.

<연골세포에 대한 분화유도>

MC1 배지로부터 회수한 hMSC를 DMEM(FBS-)으로 1.0×10⁶개/mL로 조정하고, 그것을, 세포응집덩어리를 형성하기 위하여, TCPS에 적량 넣은 3% 메틸셀룰로오스/DMEM 중에 10μL(10,000개)씩 주입하였다. 하룻밤 배양 후, 화염 멸균한 약시로 세포덩어리를 건져내고, PBS로 씻어 챔버 슬라이드 시스템(Nunc제 LAB-TEK 챔버 슬라이드 시스템 178599JP)의 각 웰에 1개씩 옮겼다. DMEM/F-12(Life Technologies제 DMEM/F-12 11320-033)에 ITS Supplement(sc006 부속품), 페니실린·스트렙토마이신 및 글루타민을 첨가한 기본배지에 추가로 연골분화유도제를 첨가한 것을 각 웰에 100μL씩 첨가하였다. 2~3일 간격으로 배지교환을 하여 4주간 배양을 계속하였다. 3, 4주간째에 항Aggrecan 항체에 의한 세포의 면역염색을 행하였다.

[제조예 6: 미결정 셀룰로오스 유래 셀룰로오스 나노화이버(MC4)의 제조]

시판의 미결정 셀룰로오스(Ceolus, PH-101, Asahi Kasei Corporation제) 1.5질량부에 순수 1,000질량부를 첨가하여 분산시킨 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 220MPa로 50회 분쇄처리를 행하고, 미결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액(MC4)을 얻었다.

[제조예 7: 미결정 셀룰로오스 유래 셀룰로오스 나노화이버(MC5)의 제조]

시판의 미결정 셀룰로오스(Ceolus, PH-101, Asahi Kasei Corporation제) 1.5질량부에 순수 1,000질량부를 첨가하여 분산시킨 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 220MPa로 100회 분쇄처리를 행하고, 미결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액(MC5)을 얻었다.

[제조예 8: 미결정 셀룰로오스 유래 셀룰로오스 나노화이버(MC6)의 제조]

시판의 미결정 셀룰로오스(Ceolus, PH-101, Asahi Kasei Corporation제) 1.5질량부에 순수 1,000질량부를 첨가하여 분산시킨 후, Sugino Machine Limited Co., Ltd.제 고압분쇄장치(Star Burst시스템)를 이용하여, 220MPa로 150회 분쇄처리를 행하고, 미결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 수분산액(MC6)을 얻었다.

제조예 6 내지 제조예 8에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버에 대하여, 평균섬유직경(D) 및 평균섬유길이(L)를 상기 서술한 순서에 따라 측정하였다. 얻어진 결과 그리고 평균섬유직경(D) 및 평균섬유길이(L)로부터 구한 애스펙트비(L/D)를 나타낸다.

[표 3]

[2배 농도 DMEM 배양액의 조제]

초순수 50mL에 시판의 고압증기 멸균가능한 분말배지(Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.제 둘베코 변법 이글배지 2) 100mL분을 첨가하였다. 이것을 30분 정도 마그네틱 스터러를 이용하여 교반해서 이 분말배지를 수분산액에 용해시킨 후, 121℃에서 15분간 고압증기 멸균하였다. 이 용액을 실온까지 냉각한 후, 이 용액에 시판의 L-글루타민용액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제 200mmol/L L-글루타민용액(×100))을 종농도 4mM가 되도록 첨가하고, 다시 멸균한 10질량% 탄산수소나트륨 수용액을 1mL 첨가하여 2배농도 DMEM을 조제하였다. 이 용액으로부터 소량을 취출하고, pH시험지를 사용하여 용액의 pH가 대략 pH7.0~8.0인 것을 확인하였다.

[실시예 11: MC4를 이용한 hMSC의 배양]

제조예 6에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(MC4)의 증기멸균완료된 0.1질량% 수분산액에, 멸균완료된 2배농도 DMEM(페니실린·스트렙토마이신도 2배농도)을 등량 혼합하여 0.05%의 배양액을 조제하였다. 이 배양액에 10% FBS가 되도록 FBS를 첨가하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 저접착성 ASNOL DISH(AS ONE Corporation제)에 hMSC를 파종하여 배양을 행하고, 세포를 회수하고, 그리고 미분화마커에 의한 세포의 면역염색을 행하였다.

[실시예 12: MC5를 이용한 hMSC의 배양]

제조예 7에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(MC5)의 증기멸균완료된 0.1질량% 수분산액에, 멸균완료된 2배농도 DMEM(페니실린·스트렙토마이신도 2배농도)을 등량혼합하여 0.05%의 배양액을 조제하였다. 이 배양액에 10% FBS가 되도록 FBS를 첨가하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 저접착성 ASNOL DISH에 hMSC를 파종하여 배양을 행하고, 세포를 회수하고, 그리고 미분화마커에 의한 세포의 면역염색을 행하였다.

[실시예 13: MC6을 이용한 hMSC의 배양]

제조예 8에서 얻어진 셀룰로오스 나노화이버(MC6)의 증기멸균완료된 0.1질량% 수분산액에, 멸균완료된 2배농도 DMEM(페니실린·스트렙토마이신도 2배농도)을 등량혼합하여 0.05%의 배양액을 조제하였다. 이 배양액에 10% FBS가 되도록 FBS를 첨가하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 저접착성 ASNOL DISH에 hMSC를 파종하여 배양을 행하고, 세포를 회수하고, 그리고 미분화마커에 의한 세포의 면역염색을 행하였다.

[대조시험: DMEM을 이용한 hMSC 배양]

대조시험으로서, hMSC를 DMEM(10% FBS 포함함)으로 저접착성 ASNOL DISH에 파종한 것을 배양하고, 세포의 생사판정, 배지의 원심분리에 의한 세포의 회수를 행하였다.

[결과: 세포의 회수율]

표 4에 실시예 8 내지 실시예 13 및 DMEM(NF 없음)을 이용한 hMSC 배양(대조시험)의 세포부착율 및 세포회수율을 나타낸다.

표 4에 나타낸 바와 같이 실시예 8의 0.02질량%의 MC1을 이용한 배양에서는 세포무접착 샬레를 이용한 경우, 4주간 후에 83.4%의 세포를 회수할 수 있다는 결과가 얻어졌다. 실시예 9 및 실시예 10에서는, MC1의 농도를 각각 0.017% 및 0.0125%로 희박한 조건으로 배양을 행하였으나, 모두 60~80%로 높은 세포회수율이 얻어졌다.

한편, 공업스케일품 MC4 내지 MC6의 시리즈에 있어서는, 실시예 11의 MC4를 이용한 배양과 실시예 13의 MC6을 이용한 배양에서는 2주간 후까지의 세포회수율이 40% 정도에 그쳤으나, 실시예 12의 MC5를 이용한 배양에서는 이들 시리즈 중에서 가장 높은 세포회수율이 얻어지고, 2주간 후에 72%, 4주간 후에 53%의 세포를 회수할 수 있었다.

이들 결과로부터, 실시예 1 내지 실시예 3 및 실시예 8 내지 실시예 13의 미결정 셀룰로오스 유래의 나노화이버 분산용액은 특히 hMSC의 회수 및 재파종의 재생착에 유효한 것을 이해할 수 있다.

[표 4]

[결과: 휴면성 확인]

도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 12의 공업스케일 MC5를 이용한 분산배양 후, 4주간의 시점에서 포지티브 마커인 STRO-1, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105는 대조시험과 동일한 정도의 정상적인 발현을 나타냈다.

또한 도 7에 나타낸 바와 같이, 네가티브 마커인 CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45에 관해서도, 대조시험과 동일한 정도의 면역염색 형광강도를 나타내고, hMSC의 성질을 4주간 배양 후에 있어서 거의 정상적으로 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

[결과: 분화유도능의 확인]

가장 높은 세포회수율을 나타낸 실시예 8에 대하여, 분산배양 후에 회수된 hMSC가 다분화능을 유지하고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 단락 [0061] 내지 [0063]에 기재된 방법과 마찬가지로, MSC의 줄기세포성 유지의 기준으로 되어 있는 지방세포, 골세포 및 연골세포의 3방향성 분화능의 유무를 각각 조사하였다.

실시예 8에서 배양한 hMSC의 지방세포 분화시험 후, 항FABP4 항체에 의한 hMSC의 면역염색시험의 결과(도 8 참조) 및 Oil Red O 염색의 결과(도 9 참조)를 나타낸다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 회수 후, 지방분화유도를 행한 hMSC에서는 FABP4의 현저한 발현을 나타냄과 함께, 도 9에 나타낸 바와 같이 지방적(脂肪滴)의 축적이 보였다(Oil Red O 염색). 이들로부터 분산배양한 hMSC의 지방세포분화능의 유지를 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 8에서 배양한 hMSC의 골세포분화시험 후의 Alizarin Red S 염색시험의 결과(도 10 참조)를 나타낸다.

도 10에 나타낸 바와 같이 골세포분화유도를 행한 hMSC는 Alizarin Red에 의해 강하게 염색된 점에서, 분산배양한 hMSC의 골세포분화유도능의 유지를 확인할 수 있었다.

나아가, 실시예 8에서 배양한 hMSC의 골세포분화시험 3주간 후 및 4주간 후의 항Aggrecan 항체에 의한 면역염색을 행하였다(도 11 및 도 12 참조).

도 11, 12에 나타낸 바와 같이 3주간 및 4주간의 연골세포분화유도를 행한 hMSC에서는 Aggrecan의 현저한 발현이 보이고, 연골세포분화능의 유지를 확인할 수 있었다.

이상에 의해 실시예 8에 있어서 회수된 hMSC는 지방세포, 골세포 및 연골세포의 3 방향성 분화능을 유지하고 있는 것이 확인되었다.

Claims

결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버를 함유하는 간엽계 줄기세포의 미분화성 유지 배양재료.
제1항에 있어서,
37℃, 5체적% 이산화탄소 분위기의 배양조건하에서의 사용에 있어서, 1일간 내지 30일간 배양 후의 간엽계 줄기세포의 미분화성 및 다분화능을, 이 줄기세포의 채취 직후의 그것과 동등한 활성도로 유지할 수 있는, 미분화성 유지 배양재료.
제2항에 있어서,
상기 배양조건하에서 간엽계 줄기세포의 배양을 했을 때, 효소처리에 의해 간엽계 줄기세포의 회수가 가능한, 미분화성 유지 배양재료.
제1항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노화이버가, 1nm 내지 100nm의 평균섬유직경(D)을 갖는 나노화이버의 형태인, 미분화성 유지 배양재료.
제1항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노화이버가, 0.01μm 내지 10μm의 평균입자경(d)을 갖는 나노화이버의 형태인, 기재된 미분화성 유지 배양재료.
제4항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노화이버가, 평균섬유직경(D)에 대한 평균섬유길이(L)의 비(L/D)가 2 내지 500인 나노화이버의 형태인, 미분화성 유지 배양재료.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 미분화성 유지 배양재료가 액 중에 용해 또는 분산되어 이루어진, 배양액.
제7항에 있어서,
상기 미분화성 유지 배양재료가, 상기 배양액의 전체 체적량에 대하여 0.0001%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도로 용해 또는 분산되어 이루어진, 배양액.
간엽계 줄기세포가 제7항에 기재된 배양액의 액 중을 떠다니게 되는, 간엽계 줄기세포 함유 배양액.
제9항에 있어서,
상기 미분화성 유지 배양재료가, 단위체적(1mL)당 1.0×10³~1.0×10⁶의 간엽계 줄기세포를 포함하는 상기 배양액의 전체 체적량에 대하여 0.0001%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도로 배양액 중을 떠다니게 되는, 간엽계 줄기세포 함유 배양액.
결정 셀룰로오스 유래의 셀룰로오스 나노화이버의 존재하에, 간엽계 줄기세포를 생체 외에서 배양함으로써, 1일간 내지 30일간 배양 후의 이 간엽계 줄기세포의 미분화성 및 다분화능을 이 줄기세포의 채취 직후와 동등한 활성도로 유지하는 것을 특징으로 하는, 간엽계 줄기세포의 배양방법.
제11항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노화이버가, 1nm 내지 100nm의 평균섬유직경(D)을 갖는 나노화이버의 형태인, 배양방법.
제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노화이버가, 0.01μm 내지 10μm의 평균입자경(d)을 갖는 나노화이버의 형태인, 배양방법.
제12항에 있어서,
상기 셀룰로오스 나노화이버가, 평균섬유직경(D)에 대한 평균섬유길이(L)의 비(L/D)가 2 내지 500인 나노화이버의 형태인, 배양방법.
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