TW201538727A - 維持未分化性之培養材料 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題為提供一種體性幹細胞之培養方法(保存方法)，其不使用對體性幹細胞之分化機能有影響之DMSO等之化學藥品，代替以往實施的冷凍保存方法，對分化機能或細胞機能之劣化或生存率的影響極低。 本發明之解決手段為提供一種特徵為含有來自天然物的多醣類的維持體性幹細胞之未分化性之培養材料，以及一種分散有該未分化性維持材料的培養液、一種該培養液中漂浮有體性幹細胞而成之含有體性幹細胞之培養液、一種使用該來自天然物的多醣類的間葉系幹細胞之培養方法。

Description

維持未分化性之培養材料
本發明係關於一種維持體性幹細胞之未分化性的同時而培養該細胞之材料，詳細而言，係關於間葉系幹細胞等之體性幹細胞於活體外，例如在治療所必須的一定期間，抑制其分化，可保持使體性幹細胞之增殖‧分化活動停止的狀態(休眠狀態)之含有來自天然物的多醣類的培養材料。
間葉系幹細胞(MSC)為成骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、軟骨細胞、神經細胞或肝細胞等，為具有向屬於間葉系之細胞的分化能力之體性幹細胞(亦稱為活體幹細胞、組織幹細胞)的一種，對組織之再構築或修復之再生醫療的應用，例如炎症‧免疫抑制或組織修復、因血管新生之血流改善、抗老化(anti-aging)等之治療之外，期待對過去無治療法之疾病的應用。
分化多能性之間葉系幹細胞，不僅可由患者自身之骨髓、脂肪組織、滑膜、齒槽骨、齒根膜等之組織，亦可由 胎盤、臍帶血、臍帶之各種細胞等單離，故間葉系幹細胞之利用在生命倫理上障礙較低。又，間葉系幹細胞與ES細胞或iPS細胞相比癌化風險較低，期待早期的臨床應用。
將間葉系幹細胞作為細胞組織醫藥品或細胞組織醫療機器利用於臨床用途時，例如若假設為自體移植，則經過由患者體內取出細胞，於活體外培養使其增殖，自體移植回患者的步驟。此時，培養期間或其後之保管期間中，不變化成具有目的以外之形質的細胞，確保返回患者之細胞的有效性及安全性為重要。然而，因為間葉系幹細胞易發生分化或細胞老化，故可舉例其品質控制難，細胞之品質管理留下大大的課題。
當間葉系幹細胞於活體外培養時，關於其擴 增促進，研究有各種擴增胜肽(專利文獻1及專利文獻2)。又，報告有藉由於基礎培養基添加特定之增殖因子群與脂肪酸複合物，即使在無血清條件下亦導出與血清培養基之情形有同等以上的細胞增殖(專利文獻3)。另一方面，已知間葉系幹細胞之分裂次數有限度，細胞老化進展取決於分裂次數。關於經過何種程度之分裂增殖的細胞為止可以保證間葉系幹細胞之有效性，即臨床應用中之品質，到現在還沒有得到確立的見解。
因而，強烈企求能首先不使其品質劣化，度 過直至用於治療的期間，而高品質地保存由患者採取之間葉系幹細胞。不限於間葉系幹細胞，作為細胞之保存方 法，一般使用有以液體氮溫度冷凍保存的方法。冷凍及解凍伴隨著細胞之活性及機能損失，因此冷凍及解凍過程中在保護細胞的目的下添加二甲亞碸(DMSO)等之化學藥品至冷凍媒體中。DMSO具有高膜透過性，使細胞在冷凍過程中冰晶的形成降低，使膜損傷或胞器之脫水等最小化(專利文獻4)。
作為間葉系幹細胞之冷凍法以外的保存之途 徑，亦考慮不冷凍而以普通培養的同時來保存的方法。然而，此處成為問題的是，因培養環境所生之間葉系幹細胞的性質‧形質的變化。
一般而言，已知活體內構成細胞之周圍環境的細胞外基質，對結締組織細胞之分化狀態有化學性及物理性的影響，報告有對間葉系幹細胞之分化之系統決定亦有影響。
例如，研究有藉由將彈性控制成與in vivo生物環境類似之水凝膠上培養間葉系幹細胞，而向神經性、肌原性、骨原性細胞之分化誘導(非專利文獻1)。此一發現，意味著僅將間葉系幹細胞培養在具有1kPa以上之彈性率的水凝膠基材上，即向取決於培養環境之彈性特性等的系統分化，亦即未分化狀態崩解，品質劣化。
對於此，提案有藉由將間葉系幹細胞培養在經具有250Pa之彈性的I型膠原蛋白及纖網蛋白塗佈的丙烯醯胺凝膠上，將幹細胞之細胞周期向靜止狀態誘導或維持，而使生物活性持續的方法(非專利文獻2、專利文獻5)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2008/026634號小冊子
[專利文獻2]國際公開第2011/040500號小冊子
[專利文獻3]日本專利第4385076號說明書
[專利文獻4]日本特表2012-517823號公報
[專利文獻5]日本特表2010-532167號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Cell 126、677、2006
[非專利文獻2]Tissu Eng PartA 15,147,2009、
[非專利文獻3]REGENERATIVE MEDICINE AND TISSUE ENGINEERING-CELLS AND BIOMATERIALS、Daniel Eberli、2011 InTech
[非專利文獻4]Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759~765(2004)
前述於冷凍媒體使用DMSO等化學藥品的冷凍保存法，在融解過程中，對細胞給予顯著傷害(非專利文獻3)，以及對間葉系幹細胞之分化有影響的可能性(非 專利文獻4)被報告。
又，使用水凝膠作為前述細胞外基質之分化誘導中，被研究的培養基材之彈性在高數值範圍內，因此未發現到關於細胞成為靜止狀態或細胞之保存性能。
進而，作為培養基材提案有構成丙烯醯胺凝膠之丙烯醯胺單體，被指摘有神經毒毒性或肝毒性。一般而言，顯示活體適合性之構成水溶性聚合物或水凝膠的聚合性單體顯示細胞毒性之情形多，從由此等單體所得之高分子凝膠完全去除未反應單體實際上可說很困難，採用如此之高分子凝膠作為要求活體安全性之細胞培養基材等仍留有課題。
如此，至今雖有維持間葉系幹細胞之多能性 的同時實現保存時之生存率改善的各種提案，但代替使用DMSO等之化學藥品的冷凍保存方法、滿足期望之細胞的保存性、且沒有細胞毒性的疑慮之間葉系幹細胞的保存方法之提案依然仍未被提出。
本發明係鑒於該以往技術之狀況而成者，課 題為提供一種體性幹細胞之培養方法(保存方法)，其不使用對體性幹細胞之分化機能有影響之DMSO等之化學藥品，代替以往實施的冷凍保存方法，對分化機能或細胞機能之劣化或生存率的影響極低。
本發明者們為解決上述課題深入研究的結 果，發現於培養體性幹細胞之培養液中溶解或分散具有作為增黏或凝膠化劑之機能的來自天然物的多醣類，例如增黏性多醣類或奈米纖維狀多醣類時，該多醣類成為幹細胞培養的支架材料，其可使幹細胞分化的系統決定呈現幾乎不活性的休眠狀態。即發現，藉由將間葉系幹細胞漂浮在溶解或分散有來自天然物的多醣類的細胞培養液中的液中，可不使培養液冷凍，於培養條件下抑制間葉系幹細胞之分化，然後在期望的一定期間內維持初期狀態來保存(作為休眠狀態培養)。此處所謂之初期狀態，係指間葉系幹細胞向任何分化系統之分化皆尚未開始，為未分化之狀態的意思。且，發現藉由使用上述有增黏性多醣類或奈米纖維之形態的多醣類即來自天然物的多醣類，藉由使用蛋白酶等之一般細胞回收方法，可由培養液回收間葉系幹細胞，使間葉系幹細胞之再利用變為可能，而終致完成本發明。
即，本發明屬於使用來自天然物的多醣類的 細胞培養法，尤其是基於此培養系可使間葉系幹細胞的未分化性維持培養成為可能之獨自的發現。藉由發現使如此之培養成為可能的該多醣類的構造以及該溶解液或分散液的最適條件而完成本發明。
本發明中之間葉系幹細胞的維持未分化性培養的原理，不僅藉由實現以使間葉系幹細胞之細胞周期停止於靜止期的休眠狀態之培養，來抑制細胞分裂及增殖所伴隨的細胞壽命短縮以及老化的進行，還排除向不希望的表現型 分化所伴隨的細胞變化之可能性。如此之培養狀態，近似間葉系幹細胞置於在活體中稱為幹細胞區位之天然的細胞外環境時的生存狀況，依據本發明之培養法，係藉由活體模仿的手段解決課題者。
進而，本發明包含因休眠培養而間葉系幹細胞品質劣化的回避、解除休眠狀態來使用時之回收方法的確立、及經回收之間葉系幹細胞品質保持的確認。為了保存高品質之間葉系幹細胞來活用所必須的品質保持及回收，藉由使用來自天然物的多醣類，解決此等課題。
具體而言，本發明之第1觀點係關於一種維 持體性幹細胞之未分化性之培養材料，其含有來自天然物的多醣類。
第2觀點係關於第1觀點之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為奈米纖維形狀的多醣類。
第3觀點係關於第1觀點之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為增黏性多醣類。
第4觀點係關於第3觀點之維持未分化性之培養材料，其中，前述增黏性多醣類為甲基纖維素或迪優坦膠(Diutan Gum)。
第5觀點係關於第1觀點至第4觀點中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，前述體性幹細胞為間葉系幹細胞。
第6觀點係關於第1觀點至第5觀點中任一項之維持未分化性之培養材料，其在37℃、5體積%二氧化碳氛圍 之培養條件下的使用中，能將培養1日至30日後之體性幹細胞的未分化性及分化多能以與該幹細胞剛採取後同等之活性度保持。
第7觀點係關於第1觀點至第6觀點中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，於前述培養條件下進行體性幹細胞之培養時，可藉由酵素處理進行體性幹細胞之回收。
第8觀點係關於第2觀點及第5觀點至第7觀點中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為具有1nm至100nm之平均纖維徑(D)的奈米纖維之形態。
第9觀點係關於第2觀點及第5觀點至第8觀點中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，
前述多醣類為具有0.01μm至10μm之平均粒徑(d)的奈米纖維之形態。
第10觀點係關於第8觀點之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為平均纖維長(L)相對於平均纖維徑(D)之比(L/D)為2至500的奈米纖維之形態。
第11觀點係關於第2觀點及第5觀點至第10觀點中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，前述維持未分化性之培養材料為來自纖維素之天然物奈米纖維。
第12觀點係關於一種培養液，其特徵為由第1觀點至第11觀點中任一項之維持未分化性之培養材料溶解或分散於液中所成。
第13觀點係關於第12觀點之培養液，相對於前述培 養液之全體積量，前述維持未分化性之培養材料以0.0001%(w/v)至2%(w/v)之濃度溶解或分散所成。
第14觀點係關於一種含有體性幹細胞之培養液，其特徵為體性幹細胞漂浮於第12觀點或第13觀點所載之培養液的液中所成。
第15觀點係關於第14觀點之含有體性幹細胞之培養液，其中，相對於每單位體積(1mL)含有1.0×103~1.0×106之幹細胞的前述含有體性幹細胞之培養液的全體積量而言，前述維持未分化性之培養材料以0.0001%(w/v)至2%(w/v)之濃度漂浮於培養液中所成。
第16觀點係關於第14觀點或第15觀點之含有體性幹細胞之培養液，其進一步含有血清。
第17觀點係關於第16觀點之含有體性幹細胞之培養液，其中，前述血清係選自胎牛血清、人血清、馬血清及雞血清所成群。
第18觀點係關於第16觀點或第17觀點之含有體性幹細胞之培養液，其中，相對於前述含有體性幹細胞之培養液的全體積而言，以0.1體積%至50體積%之濃度含有前述血清。
第19觀點係關於第14觀點至第18觀點中任一項之含有體性幹細胞之培養液，其進一步含有細胞機能調節因子。
第20觀點係關於一種間葉系幹細胞之培養方法，其特徵為在來自天然物的多醣類的存在下，藉由將間葉系幹 細胞於活體外培養，將1日至30日培養後之該間葉系幹細胞的未分化性及分化多能以與該幹細胞剛採取後同等的活性度保持。
依據本發明之維持未分化性之培養材料，可不需要向培養基添加化學藥品或蛋白質、調製因子等，亦不需除去增殖因子，將再生醫療中有用性特別高之間葉系幹細胞維持在未分化之狀態(休眠狀態)下經過長期間地保存。
又，藉由使用本發明之維持未分化性之培養材料，可使自活體採取、選別、然後純化的間葉系幹細胞以高品質保持至用於實際治療的時間點為止。此處所謂“以高品質保持”，係指維持定義成為幹細胞之性質的未分化性及分化多能。又，依據本發明之間葉系幹細胞的培養方法，在一定期間之間葉系幹細胞的保存培養後，不需要特殊的操作，藉由細胞培養技術領域中一般使用的方法，例如使胰蛋白酶等之蛋白酶作用的方法，可達成高細胞回收率。
如此，本發明之維持未分化性之培養材料，具有以高品質保存培養間葉系幹細胞，及利用時的回收及調製容易之二個主要效果。
[圖1]圖1表示實施例1及實施例2之hMSC培養中以Calcein(鈣黃綠素)-AM/PI法之生死判定結果的圖。
[圖2]圖2表示實施例3至實施例7之hMSC培養中以Calcein-AM/PI法之生死判定結果的圖。
[圖3]圖3表示實施例1至實施例3之hMSC培養4週後之陽性標記染色結果的圖。
[圖4]圖4表示實施例1至實施例3之hMSC培養4週後之陰性標記染色結果的圖。
[圖5]圖5表示對照試驗之hMSC培養(1週)中以Calcein-AM/PI法之生死判定結果的圖。
[圖6]圖6表示實施例12之hMSC培養4週後之陽性標記染色結果的圖。
[圖7]圖7表示實施例12之hMSC培養4週後之陰性標記染色結果的圖。
[圖8]圖8表示實施例8所培養之hMSC之脂肪細胞分化誘導試驗後之以抗FABP4抗體之免疫染色試驗結果的圖。
[圖9]圖9表示實施例8所培養之hMSC之脂肪細胞分化誘導試驗後油紅O染色結果的圖。
[圖10]圖10表示實施例8所培養之hMSC之骨細胞分化誘導試驗後之阿察林紅(Azaline red)S染色試驗結果的圖。
[圖11]圖11表示實施例8所培養之hMSC之3週軟骨細胞分化誘導試驗後之以抗聚集蛋白聚糖抗體之細胞免 疫染色試驗結果的圖。
[圖12]圖12表示實施例8所培養之hMSC之4週軟骨細胞分化誘導試驗後之以抗聚集蛋白聚糖抗體之細胞免疫染色試驗結果的圖。
[欲實施發明之最佳形態]
以下詳細說明本發明之維持未分化性之培養材料。
尚，本說明書中所謂「休眠培養」係指維持幹細胞在活體內存在時的特徵之狀態的培養，前述狀態為即使於活體外培養條件下亦實現使幹細胞之細胞周期以靜止期之狀態維持且未分化待機之狀態，即維持幹細胞於未分化狀態(初期狀態)(細胞成為休眠狀態)。
<維持未分化性之培養材料>
本發明之維持未分化性之培養材料含有來自天然物的多醣類，前述多醣類以奈米纖維形狀之多醣類(以下簡單稱為“奈米纖維”)、或增黏性多醣類較佳。
[奈米纖維(纖維素)原料]
作為本發明之維持未分化性之培養材料所使用之來自天然物的奈米纖維，可舉例經微細化之纖維素奈米纖維。
上述纖維素奈米纖維之原料，可使用例如木材、竹、 麻、黃麻、僅麻、棉、農作物或食物殘渣等來自植物的纖維素、或細菌纖維素、剛毛藻(Cladophora)、灰色植物(Glaucocystis)、法囊藻、海鞘纖維素等微生物產生或動物產生之纖維素。
上述來自植物之纖維素係由稱作微纖維之非常細的纖維進一步成束形成纖絲、片、纖維細胞之層級高次構造，細菌纖維素係由菌細胞所分泌之纖維素的微纖維以原本的粗細直接形成微細的網目構造。
作為本發明之維持未分化性之培養材料所使 用之纖維素奈米纖維的原料，較佳可舉例將上述農作物或食物殘渣等來自植物之纖維素、或微生物產生或是動物產生之纖維素以牛皮紙漿法或亞硫酸鹽紙漿法處理之纖維素、以及將該等以高壓均質機或磨機等粉碎之粉末纖維素。更佳為可舉例將非結晶部分以酸水解處理去除後，藉由粉碎及篩分得到的結晶纖維素。
[纖維素原料之微細化(粉碎)方法]
本發明中，如上述使用將此等纖維素原料粉碎而得之微細化纖維素奈米纖維較佳。纖維素原料之粉碎方法並無限定，但對於微細化至符合本發明目的之後述纖維徑及纖維長，以高壓均質機、磨床(石臼)、或是珠磨機等之媒體攪拌磨機之可得到強剪切力的方法較佳。
此等粉碎方法之中，尤其以使用高壓均質機 進行微細化較佳，例如日本特開2005-270891號公報或日 本專利第5232976號說明書所揭示之使用濕式粉碎法進行微細化(粉碎化)較佳。具體而言，可藉由將分散有纖維素原料之分散液(水分散液)，以高壓分別自一對噴嘴噴射使其互相衝突，而粉碎纖維素原料，例如可藉由使用Star Burst(註冊商標)系統((股)SUGINO MACHINE製之高壓粉碎裝置)或NanoVater(註冊商標)(吉田機械興業(股)之高壓粉碎裝置)來實施。
使用前述高壓均質機將纖維素原料微細化(粉 碎化)時，微細化或均質化之程度，取決於高壓均質機之向超高壓腔壓送之壓力、使其通過超高壓腔之次數(處理次數)、及水分散液中之纖維素濃度。
壓送壓力(處理壓力)通常為50~250MPa，較佳為150~245MPa。壓送壓力未滿50MPa時，纖維素之微細化不充分，無法得到由微細化所期待的效果。
又，微細化處理時之水分散液中之纖維素濃度為0.1質量%~30質量%，較佳為1質量%~10質量%。水分散液中之纖維素濃度若未滿0.1質量%則生產性非常低，若較30質量%高之濃度則粉碎效率低，無法得到期望的纖維素奈米纖維。
微細化(粉碎化)之處理次數並無特別限定，其依據前述水分散液中之纖維素濃度，例如纖維素濃度為0.1~1質量%時處理次數為1~100次的程度，1~10質量%時為1~1000次，較佳為10~200次。又，分散液之纖維素濃度超過30質量%之高濃度時，微細化需要數千次以上之處 理次數，及分散液成為妨礙操作程度的之高黏度化，因此由工業的觀點來看不切實際。
本發明所用之纖維素奈米纖維的平均粒徑(d) 為0.01μm至10μm，較佳為0.05μm至5μm。且本發明中，所謂纖維素奈米纖維之“平均粒徑”，係表示以稀薄條件分散於水中之無規捲曲狀態之纖維素奈米纖維的流體力學直徑的徑。平均粒徑若未滿0.01μm，則纖維素奈米纖維過於微細而得不到添加效果，即含有其之維持未分化性之培養材料的細胞浮游作用及細胞回收率降低。又，平均纖維徑若大於10μm，則失去維持未分化性之培養材料的透明性及細胞分散效果，細胞彼此形成凝集塊，未分化維持培養材料與細胞一起沉降，故得不到期待的效果。
本發明所用之纖維素奈米纖維的平均纖維徑 (D)為1nm至100nm，較佳為5nm至70nm，更佳為10nm至50nm。平均纖維徑若未滿1nm，則因纖維素奈米纖維過於微細而得不到添加效果，即自含有其的維持未分化性之培養材料之細胞回收率降低。又，平均纖維徑若大於100nm，則失去維持未分化性之培養材料的細胞分散效果，細胞彼此形成凝集塊，故得不到期待的效果。
又，本發明所用之纖維素奈米纖維的平均纖維長(L)為0.01μm至100μm，較佳為0.05μm至10μm。
本發明所用之纖維素奈米纖維的縱橫比(L/D) 由平均纖維長/平均纖維徑所得，通常為2~500，較佳為3~300，更佳為4~250。縱橫比未滿2時，作為維持未分 化性之培養材料不能充分得到在液中之分散性安定性，不能保持細胞之分散性。又，縱橫比超過500時，因為意味著纖維長變得極大，故誘發培養液之黏度增大等，誘發操作性之顯著降低。
且本發明中，纖維素奈米纖維之平均粒徑 (d)、平均纖維徑(D)及平均纖維長(L)如下所求。
‧平均粒徑(d)：後述製造例中將製作之纖維素分散液以成為0.01~0.1質量%用超純水稀釋，以超音波洗淨機30分鐘使其分散，使用大塚電子(股)製動態光散射測定儀(FDLS-3000、累積量法)、或Malvern公司製雷射繞射式粒度分布測定裝置(Mastersizer 2000、累積體積50%通過徑(D50))測定平均粒徑(d)。
且平均粒徑(d)係使用下述愛因斯坦‧斯托克斯之式，由擴散係數D作為流體力學直徑所求出。
d=kT/3πη 0D
d：粒徑(流體力學直徑)、k：波茲曼常數、T：絕對溫度、η0：溶劑之黏度
‧平均纖維徑(D)：將應研商事(股)製火棉膠支持膜以日本電子(股)製離子清潔器(JIC-410)施以親水化處理3分鐘。於此支持膜滴下數滴後述製造例中所製作之纖維素分散液(以超純水稀釋)，使其室溫乾燥，作為試料。將此試料以(股)日立製作所製透過型電子顯微鏡(TEM、H-8000)(10,000倍)以加速電壓200kV觀察。使用得到的影像，計測標本數：200~250根纖維素奈米纖維之各自的纖 維徑，將其數平均值作為平均纖維徑(D)。
‧平均纖維長(L)：將後述製造例中所製作之纖維素分散液，以二甲亞碸(DMSO)稀釋以使纖維素濃度成為0.001質量%，而使纖維素分散。將此施放至預先用濃硫酸將表面親水化處理之矽晶圓上，以110℃使其乾燥1小時成為試料。使用所得試料之以日本電子(股)製掃描型電子顯微鏡(SEM、JSM-7400F)(2,000倍)觀察的影像，計測標本數：150~250根纖維素奈米纖維各自的纖維長，將其數平均值作為平均纖維長(L)。
[增黏性多醣類]
來自天然物的甲基纖維素或迪優坦膠等之增黏性多醣類，在高濃度領域作為增黏劑作用。另一方面，1%以下之低濃度領域中對細胞等作為分散劑作用。然後已知若將此等增黏性多醣類以如此低濃度使用於細胞培養時，對培養操作等之操作無太大影響，可使細胞增殖安定化。這是因為藉由將增黏性多醣類以低黏度(例如作為分散劑)添加，抑制細胞對培養容器之接著或細胞彼此互相接著之細胞塊形成等的作用。然後藉由此作用，可抑制因細胞接著之細胞機能喪失或增殖阻礙、及因細胞塊中心部之營養不足或缺氧之細胞壞死。
作為本發明之維持未分化性之培養材料所使用之來自天然物的增黏性多醣類，可舉例例如玻尿酸、結蘭膠、脫醯基化結蘭膠、鼠李聚糖、迪優坦膠、三仙膠、卡拉膠、 黃原膠、已醣醛酸、褐藻糖膠、果膠、果膠酸、果膠酯酸、硫酸乙醯肝素、肝素、硫酸類肝素、角質硫酸鹽、硫酸軟骨膠、德魯它門硫酸(Derutaman sulfate)、硫酸鼠李糖聚醣及該等之鹽、褐藻膠酸鈉、褐藻膠酸丙二醇酯等褐藻膠酸衍生物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧基甲基纖維素及其鈉等之鹽、甲基羥丙基纖維素、纖維素硫酸鈉、二烷基二甲基銨硫酸纖維素等之纖維素衍生物、幾丁聚醣、聚季銨鹽-10等之陽離子化纖維素、陽離子化葡聚醣及膠豆羥丙基三甲基氯化銨等之陽離子化多醣等較佳。
其中，作為本發明之維持未分化性之培養材料，適合使用甲基纖維素或迪優坦膠。
<體性幹細胞>
[間葉系幹細胞]
本發明之維持未分化性之培養材料之作為培養對象的體性幹細胞中，有間葉系幹細胞(MSC)、造血幹細胞(HSC)、臍帶血幹細胞、神經幹細胞等，尤其以間葉系幹細胞(MSC)作為對象。
可分化成各種型的細胞，活用於治療的間葉系幹細胞，通常使用自成體採取、選別，然後純化者。作為可適用於本發明之維持未分化性之培養材料之間葉系幹細胞，並非只有由患者直接採取之臨床用的初代人類間葉系幹細胞，還可舉例試驗研究用可用之可由細胞庫得到之間葉系 幹細胞，或不朽化間葉系幹細胞株。
如當業者所習知，由此等間葉系幹細胞臨床上之應用的觀點來看，可為來自自家來源、來自同種異系來源或來自異種間來源的任何細胞。又，採取源可為捐贈者骨髓、組織生檢、胚性來源、出生後來源等之任何採取源。具體而言，可舉例來自包含腸骨稜之骨髓、大腿頸骨、脊椎、肋骨或來自其他骨髓腔，或者胚性卵黃囊、胎盤、臍帶、骨膜、胎兒及青年期之皮膚及血液之組織生檢等之採取源。
<培養液>
本發明亦關於前述維持未分化性之培養材料分散於液中之所成之培養液。
前述培養液包含緩衝液及/或液體培養基。
作為上述液體培養基，可適合使用天然培養基、半合成培養基、合成培養基等之中用於動物細胞培養之培養基。作為如此之培養基，可舉例例如威廉培養基E(William’s E培養基)、漢氏F10培養基(Ham’s Nutrient Mixture F10)、漢氏F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、RPMI1640培養基、伊格爾MEM培養基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM)、阿爾發改良伊格爾培養基(α-Modified Eagles’s Medium；α-MEM)等。
又，該液體培養基可含有鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、胺基酸、維生素、細胞介素、荷爾蒙、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。又，於液體培養基可應其目的組合其他化學成分或生體成分一種類以上添加，例如胎牛血清、人血清、馬血清、雞血清胰島素、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、一硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、寒天、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素、各種細胞介素、各種生長因子、細胞機能調節因子等。
前述培養液係，相對於該培養液之全體積量而言，前述維持未分化性之培養材料為以0.0001%(w/v)至2%(w/v)的濃度，較佳為以0.0005%(w/v)至1%(w/v)的濃度分散者為宜。
<含有體性幹細胞之培養液>
進而，本發明係關於體性幹細胞漂浮在前述培養液浴中所成之含有體性幹細胞之培養液。
前述含有體性幹細胞之培養液係，相對於每單位體積(1mL)包含1.0×103~1.0×106之幹細胞的前述含有體性幹細胞之培養液的全體積量而言，前述維持未分化性之培養材料以0.0001%(w/v)至2%(w/v)的濃度，較佳為以0.0005%(w/v)至1%(w/v)的濃度漂浮在培養液中所成者為宜。
該含有體性幹細胞之培養液中，可添加於前 述液體培養基中可添加的其他化學成分或生體成分，即鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、胺基酸、維生素、細胞介素、荷爾蒙、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。例如胎牛血清、人血清、馬血清、雞血清胰島素、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、一硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、寒天、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素之外，可進一步添加各種細胞機能調節因子、纖維母細胞生長因子、上皮生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子、肝細胞生長因子等。
例如胎牛血清、人血清、馬血清、雞血清等之血清之情形，相對於體性幹細胞之培養液的全體積而言以0.1體積%至50體積%，較佳為以0.5體積%至20體積%的濃度添加為宜。
[培養方法]
使用本發明之維持未分化性之培養材料之體性幹細胞的培養方法(休眠培養)之一例記述如下。
首先，將上述本發明之維持未分化性之培養材料添加至前述培養液(緩衝液及/或上述液體培養基、或此等培養基中添加有牛胎兒兒血清或人血清等液體培養基)中，使該維持未分化性之培養材料溶解或分散於培養液中，成為溶解液或分散液之狀態。
將如此準備之含有本發明之維持未分化性之培養材料 的培養液準備至一般用於動物細胞培養的培養器：培養皿、燒瓶、孔盤、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋等之適當容器中，於此將懸濁於合適之緩衝液等的間葉系幹細胞，以每單位體積(1mL)之培養基中幹細胞數成為1.0×103~1.0×106來播種。此時，於培養液中可進一步添加血清或細胞機能調節因子等。
播種於維持未分化性之培養材料之分散培養液的間葉系幹細胞，通常可以10℃至40℃，較佳為35℃至38℃，例如以37℃，以0體積至10體積%，較佳為3體積至7體積%，例如以5體積%之二氧化碳氛圍，在細胞培養用恆溫箱內培養。
細胞培養中應需要亦可更換培養液，保持培養環境之新鮮。培養液更換，例如使用奈米纖維作為維持未分化性之培養材料時，可藉由以特定的離心力條件離心分離，將細胞培養液中分散之奈米纖維與細胞兩者沉降回收，再分散於新鮮之培養液中來進行。
例如以上述順序，藉由以37℃、5體積%二氧化碳氛圍之培養條件下培養使用本發明之未分化性維持材料之間葉系幹細胞等的體性幹細胞，培養1日至30日後之體性幹細胞的未分化性及分化多能可保持與該幹細胞剛採取後同等的活性度。
[回收方法]
於使用本發明之未分化性維持材料之培養條件下培養 體性幹細胞時，可藉由胰蛋白酶處理回收體性幹細胞。
藉由使用本發明之維持未分化性之培養材 料，即使實施休眠培養後2週以上，例如經過30日後，仍能維持間葉系幹細胞等之體性幹細胞的未分化性，保持分化能力，同時可抑制細胞老化。
[實施例]
舉出以下的實施例更具體地說明本發明之特徵。以下實施例所示材料、使用量、比例、處理內容及處理順序，只要不脫離本發明之趣旨便可適宜變更。因此，本發明之範圍不應解釋限定成以下所示之具體例。
[平均粒徑d之測定]
依循前述[0026]所載順序，藉由動態光散射測定求得下述製造例1至製造例3所得之纖維素奈米纖維的平均粒徑d。
[平均纖維徑D及平均纖維長L之測定]
依循前述[0026]所載順序，藉由TEM影像及SEM影像求得下述製造例1至製造例3所得之纖維素奈米纖維的平均纖維徑D及平均纖維長L，並由此等之值求得縱橫比L/D。
[製造例1：來自微結晶纖維素的纖維素奈米纖維 (MC1)之製造]
於市售之微結晶纖維素(Funakoshi(股)製 管柱色層分析法用Funacell粉末II)1.5質量份中加入純水1,000質量份使其分散後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)以245MPa進行50此粉碎處理，得到來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維的水分散液(MC1)。
[製造例2：來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維(MC2)之製造]
於市售之微結晶纖維素(Funakoshi(股)製 管柱色層分析法用Funacell粉末II)15質量份中加入純水1,000質量份使其分散後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)以245MPa進行150次粉碎處理，得到來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維的水分散液(MC2)。
[製造例3：來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維(MC3)之製造]
於市售之微結晶纖維素(Funakoshi(股)製 管柱色層分析法用Funacell粉末II)15質量份中加入純水1,000質量份使其分散後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)以245MPa進行300次粉碎處理，得到來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維的水分散液 (MC3)。
[製造例4：來自紙漿之纖維素奈米纖維(PC)之製造]
於市售之牛皮紙漿(國際紙紙漿商事(股)製 LBKP D-8、固形分46質量%)22質量份中加入純水978質量份使其分散後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)以245MPa進行200次粉碎處理，得到來自紙漿之纖維素奈米纖維的水分散液。將所得之分散液放入培養皿測量，以110℃進行1小時間乾燥，除去水分測定殘渣的量，並測定濃度。其結果，水中之纖維素濃度(固形分濃度)為1.0質量%。將此分散液以純水以成為10質量倍稀釋，得到0.1質量%水分散液(PC)。
[製造例5：來自細菌纖維素之纖維素奈米纖維(BC)之製造]
於市售之細菌纖維素(UTAMA社製 PT.NIRAMAS，乙酸水溶液中纖維素固形分約0.5質量%)200質量份以家庭用混合器解碎5分鐘。將所得的漿液過濾，於純水中使其分散後測定pH，重複同樣的水洗步驟直到pH成為中性(6~7)為止。加入純水使全量成為1000質量份後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)以200MPa進行300次粉碎處理，得到來自細菌纖維素之纖維素奈米纖維的水分散液(BC)。
對於製造例1至製造例5所得之纖維素奈米 纖維，依循前述順序測定平均粒徑d、平均纖維徑D及平均纖維長L。顯示由所得之結果以及平均纖維徑D及平均纖維長L求出縱橫比(L/D)。
[實施例1：使用MC1之hMSC培養]
[培養液之調製]
於製造例1所得之纖維素奈米纖維(MC1)的0.1質量%水分散液100mL中，添加市售之可高壓蒸氣滅菌的粉末培養基(日水製藥(股)製 杜爾貝科改良伊格爾培養基2)100mL分量。將此以磁力攪拌器攪拌約30分鐘使該粉末培養基溶解於水分散液後，以121℃進行高壓蒸氣滅菌15分鐘。此溶液冷卻至室溫後，於此溶液中添加市售之L-麩醯胺酸溶液(和光純藥工業(股)製 200mmol/L L-麩醯胺酸溶液(×100))使終濃度成為2mM，進而添加經滅菌之10質量%碳酸氫鈉水溶液1mL。由溶液取出少量，使用pH試驗紙確認溶液之pH為約pH7.0~8.0。於此溶液中，以使用前之10體積%添加胎牛血清(以下本說明書中以 FBS記載)，成為0.1%(w/v)MC1培養液。又，藉由應其目的追加混合包含10體積%FBS的DMEM培養基(Gibco(註冊商標)DMEM、Powder、Low Glucose、Pyruvate31600-034)至MC1培養液，調節培養液中纖維素奈米纖維濃度(參照表2及圖1至圖4中之NF濃度)。
[間葉系幹細胞MSC之播種]
於未親水性處理之聚苯乙烯培養皿即直徑10cm之低接著性Azunoru滅菌培養皿(As one(股)製 GD90-15)中，放入作為培養基之0.025~0.1%(w/v)MC1培養液10mL，以5.0×105個/dish播種人類間葉系幹細胞(Lonza PT-2501；以下本說明書中記載為hMSC)。將此播種後之細胞在5體積%二氧化碳中、以37℃培養1日後，為了取出接著於培養皿之細胞，將培養液移至新的Azunoru滅菌培養皿，進而持續培養4週。途中，每1週為了進行培養基更換，將培養液回收於離心管以10℃、300g、5分鐘離心分離，去除上清液後以含有10體積%FBS之新的DMEM培養基10mL使其再懸濁，並移至新的Azunoru滅菌培養皿。
培養後1~4週的各時間點回收培養液，依循以下之順序，進行以Calcein-AM/PI法之細胞生死判定、以胰蛋白酶處理之細胞回收、以未分化標記之免疫染色。
<以Calcein-AM/PI法之生死判定>
由培養1~4週後回收之各培養液取出0.5mL，以10 ℃、300g、5分鐘離心分離，去除上清液，以1mL之磷酸緩衝液(以下稱為PBS)洗淨奈米纖維(以下稱為NF)沉澱物。重複2次洗淨後，於NF沉澱物中加入Calcein-AM/PI液0.5mL並混合，在5體積%二氧化碳中，以37℃放置30分鐘。接著，進行PBS洗淨2次，於NF沉澱物中加入0.5mL之DMEM培養基使其懸濁，將該懸濁液移至24孔盤在相位差顯微鏡觀察及螢光顯微鏡下確認綠螢光(活細胞)‧紅螢光(死細胞)。所得結果表示於圖1及圖2。
<以胰蛋白酶處理之細胞回收>
將培養1~4週後回收之各培養液的1培養盤分移入離心管，以10℃、300g、5分鐘離心分離，分成上清液與沉澱物。將沉澱物以10mL之PBS洗淨2次，亦回收此上清液，將全部的上清液以10℃、430g、3分鐘離心，得到沉澱物。將所得之全部沉澱物統整為一個，於此加入與沉澱物大約等量之胰蛋白酶液(和光純約工業(股)製、0.25%(w/v)Trypsin-1mmol/l EDTA‧4Na Solution with Phenol Red)，以37℃放置5分鐘。之後，將含有10體積%FBS之DMEM培養基加入胰蛋白酶液的倍量，混合後以10℃、300g、5分鐘離心，分成上清液與沉澱物。上清液進一步以10℃、430g、3分鐘離心分離後，去除上清液。 所得沉澱物與先前分開的沉澱物一起，懸濁於新的含有10體積%FBS之DMEM培養基10mL中，再播種於直徑 10cm之經親水處理的細胞培養用聚苯乙烯培養盤(Tissue culture polystyrene，以下本說明書中記載為TCPS)。將此經再播種之細胞於5體積%二氧化碳中，以37℃放置一晚，確認生著於培養盤之細胞。將此生著細胞以與上述相同之胰蛋白酶液處理，以37℃放置5分鐘後，以胰蛋白酶液之倍量以上~最大約10mL之程度加入含有10體積%FBS之DMEM培養基並混合，以10℃、430g、3分鐘離心分離，然後，將所得沉澱細胞懸濁於新的含有10體積%FBS之數mL的DMEM培養基中。使用血球計計測此懸濁物。
又，細胞播種時，作為比較對象，以5.0×105個/dish播種hMSC至直徑10cm之TCPS中之含有10體積%FBS的DMEM培養基中，播種翌日回收細胞及計數。此時之細胞數作為回收率100%，算出供於前述培養之細胞的回收率。所得結果表示於下述表2。此處於未分化性維持材料之細胞附著率，係藉由於以奈米纖維分散液培養翌日的時間點，將未附著於分散奈米纖維而沉降附著於培養培養盤之細胞數進行上述胰蛋白酶處理之回收並計測之細胞數自比較對象之細胞數扣除來求出。這是因為直接計測浮游細胞之數有困難性。
[休眠性之確認]
關於是否以維持間葉系幹細胞之性質的休眠狀態進行培養，觀察間葉系幹細胞特徵之各種標記蛋白質的表現狀 態，並評估。
培養1~4週後，將藉由胰蛋白酶處理自實施例1之MC1回收的細胞以5.0×103個/cm2(9.5×103個/孔)播種至24孔盤中，播種後之細胞於5體積%二氧化碳中，以37℃放置一晚。
此細胞中使用人類間葉系幹細胞之標記抗體(陽性標記：6種，陰性標記：5種)進行免疫螢光染色，評估細胞之休眠性。免疫螢光染色藉由以下之方法進行。將細胞以PBS洗淨後，以4%聚甲醛‧磷酸緩衝液固定，洗淨後以含有1%(w/v)牛血清白蛋白及10體積%驢血清之PBS(阻斷緩衝液)進行阻斷處理。經此處理後之細胞以稀釋成適宜濃度之小鼠單株抗體於4℃反應一晚，洗淨除去1次抗體後，使其與螢光異硫氰酸鹽(FITC)標識抗小鼠抗體於室溫反應1小時。洗淨後，經標識之細胞在螢光顯微鏡下確認是否發出綠螢光(陽性及表現強度)。培養4週後的免疫染色結果表示於圖3及圖4。
且作為對照試驗，將與實施例1至實施例3中所使用者相同繼代數6之hMSC以於實施例所進行之相同播種條件來培養，進行對標記抗體之免疫螢光染色。
[實施例2：使用MC2之hMSC培養]
使用製造例2所得之纖維素奈米纖維(MC2)的0.1質量%水分散液，以與實施例1相同的方法進行培養基調製，調製0.1%(w/v)MC2培養液。使用此以與實施例1相 同的方法進行hMSC之播種及培養，培養1~4週後，進行以Calcein-AM/PI法之生死判定、以胰蛋白酶之細胞回收及休眠性確認。
[實施例3：使用MC3之hMSC培養]
使用製造例3所得之纖維素奈米纖維(MC3)的0.1質量%水分散液，以與實施例1相同的方法進行培養基調製，調製0.1%(w/v)MC3培養液。使用此以與實施例1相同的方法進行hMSC之長期培養，進行以Calcein-AM/PI法之生死判定、細胞回收及休眠性確認。
[實施例4：使用PC之hMSC培養]
使用製造例4所得之纖維素奈米纖維(PC)的0.1質量%水分散液，以與實施例1相同的方法進行培養基調製，調製0.1%(w/v)PC培養液。且，於hMSC培養使用TCPS，進行細胞之生死判定，及以胰蛋白酶之細胞回收。又，本實施例中，於培養翌日的時間點亦進行細胞回收。
[實施例5：使用BC之hMSC培養]
使用製造例5所得之纖維素奈米纖維(BC)的0.1質量%水分散液，以與實施例1相同的方法進行培養基調製，調製0.1%(w/v)BC培養液。且，於hMSC培養使用TCPS，進行細胞之生死判定，及以胰蛋白酶之細胞回 收。
[實施例6：使用甲基纖維素之hMSC培養]
使用甲基纖維素(M0387，Aldrich公司製：ME)調製1.0質量%水分散液，使用此以與實施例1相同的方法進行培養基調製，調製1.0%(w/v)甲基纖維素培養液。且，於hMSC培養使用Azunoru滅菌培養皿，進行細胞之生死判定，及以胰蛋白酶之細胞回收。又，本實施例中，於培養3日後之時間點亦進行細胞回收。
[實施例7：使用迪優坦膠之hMSC培養]
使用迪優坦膠(KELCO CRETE DG-F，三晶股份有限公司製：DU)的1.0質量%水分散液，以與實施例1相同的方法進行培養基調製，調製1.0%(w/v)迪優坦膠培養液。且，於hMSC培養使用Azunoru滅菌培養皿，進行生死判定，及以胰蛋白酶之細胞回收。又，本實施例中，於培養3日後之時間點亦進行細胞回收。
[結果：細胞生死判定]
如圖1及圖2所示，實施例1至實施例3之任一者中，相對於4週後觀察到顯示活細胞(綠螢光)之Calcein-AM染色像，觀察到顯示死細胞(紅螢光)之PI染色細胞的頻率極低。即，由此觀察結果，顯示藉由MC1~MC3之奈米纖維分散培養液，hMSC可培養4週以上。又，實施例 4及實施例5中，1週後亦觀察Calcein-AM染色像，顯示藉由PC及BC之奈米纖維分散培養液亦可培養hMSC。
又，雖實施例1及實施例2中培養中之細胞彼此以數個至十個之程度凝集的樣子明顯，但實施例3中4週後之活細胞的分散狀態良好，故理解MC3之奈米纖維分散培養液特別對各個幹細胞提供均質之培養環境。
[結果：細胞之回收率]
如表2所示，實施例1至實施例5之任一者中，可確認到於播種翌日細胞附著於維持未分化性之培養材料，尤其是實施例1至實施例3及實施例5中可確認到超過80%的細胞附著率。且，實施例6(甲基纖維素)及實施例7(迪優坦膠)中，由於如後述一定之培養期間後可回收細胞，故此等實施例中亦可以說是於播種翌日細胞附著於維持未分化性之培養材料。
又，實施例1至實施例3中，得到4週後可回收約40~60%之細胞的結果。尤其是使用實施例1之MC1的培養中，得到最高的回收率，4週長期培養後可回收61.2%之細胞。
又，實施例4、實施例6及實施例7中，確認到一定的培養期間後可回收細胞。
由此等結果可理解，奈米纖維分散培養液及增黏性多醣類分散培養液之任一，對hMSC之回收‧再播種之再生著為有效。理解到尤其是使用同樣來自微結晶纖維素之奈 米纖維的水分散液(MC1至MC3)之實施例1至實施例3中，使用之奈米纖維的長度長的條件下細胞回收率上升，尤其來自微結晶纖維素之奈米纖維的奈米纖維分散溶液，對hMSC之回收‧再播種後之再生著為有效。
[結果：休眠性確認]
如圖3所示，於使用奈米纖維分散培養液之培養4週後的時間點，對於陽性標記之STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，實施例1-3之任一者細胞中皆顯示與對照試驗同程度的正常表現。
又，如圖4所示，關於陰性標記之CD11b、CD14、 CD19、CD34、CD45，顯示與對照試驗同程度的免疫染色螢光強度，確認到hMSC之性質即使於培養4週後亦幾乎保持正常。
[實施例8至實施例10：使用MC1之細胞無接著培養培養皿上的MSC培養]
[培養液之調整]
依循與實施例1相同條件及順序調製培養液。
[間葉系幹細胞MSC之播種]
於直徑10cm之細胞無接著培養培養皿(Greiner製 CellStar664970)中，放入作為培養基之0.02質量%、0.017質量%、0.0125質量%的MC1培養液10mL，以5.0×105個/dish播種hMSC。為了每隔1週培養基更換而將培養液回收至離心管以10℃、300g、5分鐘離心分離，去除上清液後將沉澱物以含有10質量%FBS之新的DMEM培養基10mL再懸濁，放回原本之細胞無接著培養培養皿。於培養1~4週後的各時間點回收培養液，依循段落[0046][0047][0048]所記載之順序，進行以Calcein-AM/PI法之細胞生死判定、以胰蛋白酶處理之細胞回收及以未分化標記之細胞免疫染色。
[分化多能保持之確認]
對於經回收之細胞，為了確認其是否以保持分化多能 之休眠狀態進行培養，使用市售之分化誘導培養基(R & D Systems製 人類間葉系幹細胞 分化誘導套組 sc006)分別進行向脂肪細胞、骨細胞及軟骨細胞之分化誘導。將此經分化之細胞使用標記抗體進行免疫染色，確認此等細胞具有向各種細胞系分化的能力。
〈以MC1培養基之培養及細胞回收〉
將hMSC以0.02%MC1培養液培養2週後，以與段落所記載之順序同樣地以胰蛋白酶處理來回收。
〈向脂肪細胞之分化誘導〉
將自MC1培養基回收之hMSC再懸濁至於αMEM(life technologies製 MEMα 12560-056)添加10%FBS、青黴素‧鏈黴素、麩醯胺酸的基本培養基中，以2.1×104個/cm2再播種至放有滅菌蓋玻片之24孔盤中。 培養至100%鋪滿後，將培養基更換成於基本培養基添加向脂肪細胞之分化誘導劑。每隔3、4日將放有分化誘導劑之培養基更換成新鮮的，持續培養3週。第1~3週取出蓋玻片，進行經培養之hMSC的油紅O染色及以抗FABP4抗體之免疫染色。
〈向骨細胞之分化誘導〉
為了防止向骨細胞分化誘導中的細胞剝離，添加1μg/mL之纖網蛋白溶液至放入滅菌蓋玻片的24孔盤中， 以37度處理3~30小時。將自MC1培養基回收之hMSC再懸濁至於αMEM(life technologies製 MEMα 12560-056)添加10%FBS、青黴素‧鏈黴素及麩醯胺酸的基本培養基中，然後以4.2×103個/cm2再播種至準備好的24孔盤。培養一晚後，將培養基更換成於基本培養基中添加骨細胞之分化誘導劑。每隔3、4日將放有分化誘導劑之培養基更換成新鮮的，持續培養4週。第2~4週取出蓋玻片，進行培養細胞之茜素紅S染色。
〈向軟骨細胞之分化誘導〉
將自MC1培養基回收之hMSC以DMEM(FBS-)調整成1.0×106個/mL，為了使其形成細胞凝集塊，於TCPS中適量放入的3%甲基纖維素/DMEM中以每10μL(10,000個)注入。培養一晚後，以經火焰滅菌之藥匙舀出細胞塊，以PBS清洗並於腔室玻片系統(Nunc製 Lab-Tek腔室玻片系統178599JP)的各孔中各移入1個。於各孔中各加入100μL之於DMEM/F-12(Life Technologies製 DMEM/F-12 11320-033)中添加ITS Supplement(sc006附屬品)、青黴素‧鏈黴素及麩醯胺酸之基本培養基中進而加入軟骨分化誘導劑者。每隔2~3日進行培養基更換持續培養4週。第3、4週進行以抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)抗體之細胞免疫染色。
[製造例6：來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維
(MC4)之製造]
於市售之微結晶纖維素(CEOLUS、PH-101、旭化成化學藥品公司製)1.5質量份中加入純水1,000質量份使其分散後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)，以220Mpa進行50次粉碎處理，得到來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維的水分散液(MC4)。
[製造例7：來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維(MC5)之製造]
於市售之微結晶纖維素(CEOLUS、PH-101、旭化成化學藥品公司製)1.5質量份中加入純水1,000質量份使其分散後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)，以220Mpa進行100次粉碎處理，得到來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維的水分散液(MC5)。
[製造例8：來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維(MC6)之製造]
於市售之微結晶纖維素(CEOLUS、PH-101、旭化成化學藥品公司製)1.5質量份中加入純水1,000質量份使其分散後，使用(股)SUGINO MACHINE製高壓粉碎裝置(Star Burst系統)，以220Mpa進行150次粉碎處理，得到來自微結晶纖維素之纖維素奈米纖維的水分散液(MC6)。
對於製造例6至製造例8所得之纖維素奈米纖維，依循前述順序測定平均纖維徑D及平均纖維長L。 顯示由所得結果以及平均纖維徑D及平均纖維長L求出之縱橫比(L/D)。
[2倍濃度DMEM培養液之調製]
於超純水50mL中添加市售之可高壓蒸氣滅菌的粉末培養基(日水製藥(股)製 杜爾貝科改良伊格爾培養基2)100mL分量。將此以磁力攪拌器攪拌約30分鐘使該粉末培養基溶解於水分散液後，以121℃進行高壓蒸氣滅菌15分鐘。此溶液冷卻至室溫後，於此溶液中添加市售之L-麩醯胺酸溶液(和光純藥工業(股)製 200mmol/L L-麩醯胺酸溶液(×100))使終濃度成為4mM，進而添加經滅菌之10質量%碳酸氫鈉水溶液1mL調製2倍濃度DMEM。由溶液取出少量，使用pH試驗紙確認溶液之pH為約pH7.0~8.0。
[實施例11：使用MC4之hMSC的培養]
於製造例6所得之纖維素奈米纖維(MC4)的蒸氣滅菌完的0.1質量%水分散液中，等量混合滅菌完之2倍濃度DMEM(青黴素‧鏈黴素亦2倍濃度)而調整成0.05%之培養液。此培養液以成為10%FBS添加FBS，以與實施例1 相同的方法將hMSC播種至低接著性Azunoru培養盤(As one公司製)進行培養，回收細胞，然後進行以未分化標記之細胞免疫染色。
[實施例12：使用MC5之hMSC的培養]
於製造例7所得之纖維素奈米纖維(MC5)的蒸氣滅菌完的0.1質量%水分散液中，等量混合滅菌完之2倍濃度DMEM(青黴素‧鏈黴素亦2倍濃度)而調整成0.05%之培養液。此培養液以成為10%FBS添加FBS，以與實施例1相同的方法將hMSC播種至低接著性Azunoru培養盤進行培養，回收細胞，然後進行以未分化標記之細胞免疫染色。
[實施例13：使用MC6之hMSC的培養]
於製造例8所得之纖維素奈米纖維(MC6)的蒸氣滅菌完的0.1質量%水分散液中，等量混合滅菌完之2倍濃度DMEM(青黴素‧鏈黴素亦2倍濃度)而調整成0.05%之培養液。此培養液以成為10%FBS添加FBS，以與實施例1相同的方法將hMSC播種至低接著性Azunoru培養盤(As one公司製)進行培養，回收細胞，然後進行以未分化標記之細胞免疫染色。
[對照試驗：使用DMEM之hMSC培養]
作為對照試驗，將hMSC以DMEM(含有10%FBS)播 種至低接著性Azunoru培養盤進行培養，進行細胞之生死判定、將培養基離心分離的細胞回收。
[結果：細胞之回收率]
表4表示實施例8至實施例13及使用DMEM(無NF)之hMSC培養(對照試驗)的細胞附著率及細胞回收率。
如表4所示，實施例8之使用0.02質量%之MC1的培養中，使用細胞無接著培養皿時，得到4週後可回收83.4%之細胞的結果。實施例9及實施例10中，雖然以MC1濃度分別為0.017%及0.0125%之稀薄條件進行培養，任一者皆得到60~80%之高細胞回收率。
另一方面，工業規模品MC4至MC6的系列中，實施例11之使用MC4的培養與實施例13之使用MC6的培養中，2週後為止細胞回收率停在40%的程度，實施例12之使用MC5的培養中，於此等系列之中得到最高細胞回收率，2週後可回收72%、4週後可回收53%之細胞。
由此等結果可理解，實施例1至實施例3及實施例8至實施例13的來自微結晶纖維素的奈米纖維分散溶液，對hMSC之回收及再播種的再生著為有效。
[結果：休眠性確認]
如圖6所示，實施例12之使用工業規模MC5的分散培養後，於4週的時間點陽性標記之STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105顯示與對照試驗同程度的正常表現。
又，如圖7所示，關於陰性標記之CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45，亦顯示與對照試驗同程度的免疫染色螢光強度，確認到hMSC的性質於培養4週後幾乎保持正常。
[結果：分化誘導能之確認]
為了確認顯示最高細胞回收率的實施例8中，分散培 養後回收之hMSC是否保持分化多能，以與段落[0061]至[0063]之記載同樣地，調查作為MSC幹細胞性保持的基準之分別向脂肪細胞、骨細胞及軟骨細胞的3方向性分化能力之有無。
顯示實施例8所培養之hMSC的脂肪細胞分化試驗後，以抗FABP4抗體之hMSC免疫染色試驗的結果(參照圖8)及油紅O染色的結果(參照圖9)。
其結果如圖8所示，回收後進行脂肪分化誘導之hMSC中顯示FABP4的顯著表現，同時如圖9所示，確認到脂肪滴的蓄積(油紅O染色)。由此等確認經分散培養之hMSC保持脂肪細胞分化能力。
又，顯示實施例8所培養之hMSC的骨細胞分化試驗後阿察林紅(Azaline red)S染色試驗的結果(參照圖10)。
如圖10所示，由於進行骨細胞分化誘導之hMSC被茜素紅強烈地染色，因此可確認經分散培養之hMSC保持骨細胞分化誘導能力。
進而，實施例8所培養之hMSC的骨細胞分化試驗3週後及4週後，進行以抗聚集蛋白聚糖抗體之免疫染色(參照圖11及圖12)。
如圖11、12所示，進行3週及4週之軟骨細胞分化誘導的hMSC中確認到聚集蛋白聚糖的顯著表現，可確認保持軟骨細胞分化能力。
依據上述，確認到實施例8中經回收之hMSC保持有脂肪細胞、骨細胞及軟骨細胞之三方向性分化能力。

Claims (20)

  1. 一種維持體性幹細胞之未分化性之培養材料，其特徵為含有來自天然物的多醣類。
  2. 如請求項1之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為奈米纖維形狀之多醣類。
  3. 如請求項1之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為增黏性多醣類。
  4. 如請求項3之維持未分化性之培養材料，其中，前述增黏性多醣類為甲基纖維素或迪優坦膠(Diutan Gum)。
  5. 如請求項1至請求項4中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，前述體性幹細胞為間葉系幹細胞。
  6. 如請求項1至請求項5中任一項之維持未分化性之培養材料，其在37℃、5體積%二氧化碳氛圍之培養條件下的使用中，能將培養1日至30日後之體性幹細胞的未分化性及分化多能以與該幹細胞剛採取後同等之活性度保持。
  7. 如請求項1至請求項6中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，於前述培養條件下進行體性幹細胞之培養時，可藉由酵素處理進行體性幹細胞之回收。
  8. 如請求項2及請求項5至請求項7中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為具有1nm至100nm之平均纖維徑(D)的奈米纖維之形態。
  9. 如請求項2及請求項5至請求項8中任一項之維 持未分化性之培養材料，前述多醣類為具有0.01μm至10μm之平均粒徑(d)的奈米纖維之形態。
  10. 如請求項8之維持未分化性之培養材料，其中，前述多醣類為平均纖維長(L)相對於平均纖維徑(D)之比(L/D)為2至500的奈米纖維之形態。
  11. 如請求項2及請求項5至請求項10中任一項之維持未分化性之培養材料，其中，前述維持未分化性之培養材料為來自纖維素之天然物奈米纖維。
  12. 一種培養液，其特徵為由如請求項1至請求項11中任一項之維持未分化性之培養材料溶解或分散於液中所成。
  13. 如請求項12之培養液，其中，相對於前述培養液之全體積量，前述維持未分化性之培養材料以0.0001%(w/v)至2%(w/v)之濃度溶解或分散所成。
  14. 一種含有體性幹細胞之培養液，其特徵為由體性幹細胞漂浮於如請求項12或請求項13之培養液的液中所成。
  15. 如請求項14之含有體性幹細胞之培養液，其中，相對於每單位體積(1mL)含有1.0×103~1.0×106之幹細胞的前述含有體性幹細胞之培養液的全體積量而言，前述維持未分化性之培養材料以0.0001%(w/v)至2%(w/v)之濃度漂浮於培養液中所成。
  16. 如請求項14或請求項15之含有體性幹細胞之培養液，其進一步含有血清。
  17. 如請求項16之含有體性幹細胞之培養液，其中，前述血清係選自胎牛血清、人血清、馬血清及雞血清所成群。
  18. 如請求項16或請求項17之含有體性幹細胞之培養液，其中，相對於前述含有體性幹細胞之培養液的全體積而言，以0.1體積%至50體積%之濃度含有前述血清。
  19. 如請求項14至請求項18中任一項之含有體性幹細胞之培養液，其進一步含有細胞機能調節因子。
  20. 一種間葉系幹細胞之培養方法，其特徵為在來自天然物的多醣類的存在下，藉由將間葉系幹細胞於活體外培養，將1日至30日培養後之該間葉系幹細胞的未分化性及分化多能以與該幹細胞剛採取後同等的活性度保持。
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