WO2022074281A1 - Nuevo biomaterial para ingeniería tisular - Google Patents

Nuevo biomaterial para ingeniería tisular Download PDF

Info

Publication number
WO2022074281A1
WO2022074281A1 PCT/ES2021/070739 ES2021070739W WO2022074281A1 WO 2022074281 A1 WO2022074281 A1 WO 2022074281A1 ES 2021070739 W ES2021070739 W ES 2021070739W WO 2022074281 A1 WO2022074281 A1 WO 2022074281A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cartilage
cells
cell
stem cells
artificial tissue
Prior art date
Application number
PCT/ES2021/070739
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Miguel Alaminos Mingorance
Ramón CARMONA MARTOS
Víctor Sebastián Carriel Araya
Miguel Ángel MARTÍN PIEDRA
Olimpia ORTIZ ARRABAL
Óscar Darío GARCÍA GARCÍA
Ricardo FERNÁNDEZ VALADÉS
Original Assignee
Universidad De Granada
Servicio Andaluz De Salud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Granada, Servicio Andaluz De Salud filed Critical Universidad De Granada
Publication of WO2022074281A1 publication Critical patent/WO2022074281A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/60—Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue

Definitions

  • the present invention is within the field of biomedicine and tissue engineering. Specifically, it refers to a new biomaterial and an in vitro method of preparing it. It also refers to its uses in regenerative medicine.
  • Cartilage is a specialized connective tissue that has a special type of cell, called a chondrocyte, responsible for synthesizing a dense extracellular matrix (ECM) composed mainly of collagen fibers, or collagen and elastin, and proteoglycans.
  • ECM extracellular matrix
  • Common problems associated with cartilage are age-related degeneration of this tissue, traumatic injury, or tumor formation.
  • Cartilage has limited self-healing capacity due to the lack of blood vessels and nerves, and in most cases fibrocartilage is generated instead of native functional tissue. For this reason, surgical correction of the defect or damage may be necessary, although the outcome is often suboptimal.
  • Tissue engineering has emerged as a potential tool for tissue and organ repair through the use of cells, biomaterials, and growth factors.
  • various natural and synthetic frameworks, matrices or scaffolds have been studied, such as polyglycolic acid, polylactic acid, PEGDA, collagen, chitosan, hyaluronan, alginate, fiber-agarose, etc.
  • These scaffolds must be capable of promoting cell differentiation, migration and proliferation and must also be degradable, biocompatible and non-toxic.
  • most biomaterials are not capable of fully reproducing the ECM microenvironment of native cartilage. Due to these limitations, natural biomaterials obtained from decellularized tissues are currently being studied and used.
  • Decellularization is a process that allows obtaining a product made up of MEC that maintains the original structure, composition and mechanical properties, providing all the necessary stimuli for the cell proliferation and differentiation, making this material suitable for tissue engineering.
  • the structural and functional proteins of the ECM are highly conserved between species, allowing its implantation with very little chance of immunological rejection.
  • Several decellularized tissues have already been studied for cartilage generation, including adipose tissue, umbilical cord, cartilage itself, and others.
  • Cartilage tissue characteristically shows a low regenerative potential in vivo, and new replacement technologies capable of repairing cartilage injuries are needed.
  • cell therapies and tissue engineering strategies have been proposed, long-term results remain poor. None of these biomaterials were able to fully mimic the microenvironment of this tissue, so new biomaterials need to be developed.
  • the sturgeon is an ancient fish belonging to the order Acipenseriformes.
  • the skeleton of the sturgeon is composed mainly of cartilage, being a good source of this tissue for use in research.
  • Some previous works have studied the collagen and chondroitin sulfate molecules of this animal, although the structure and general composition of this cartilage is poorly understood. No studies using sturgeon cartilage in tissue engineering have been previously reported.
  • Fig. 1 Histological analysis of native and decellularized sturgeon cartilage.
  • A Hematoxylin-eosin (H-E) staining
  • B toluidine blue staining for the detection of sulfated proteoglycans (TB);
  • C DAPI fluorescence labeling to detect cell nuclei (DAPI).
  • the results obtained in both native (Native) and decellularized (DC) control cartilage (CTR) are shown, as well as in recellularized cartilage with mesenchymal cells of different origin (ADSCinvitro, BMSCinvitro, DPSCinvitro, WSCinvitro) and with elastic cartilage cells.
  • human (HECinvitro) between 15 and 21 days and between 30 and 35 days. All images have the same scale. The scale bar shown in the upper left image represents 300 pm.
  • Fig. 2 Histological analysis of native and decellularized sturgeon cartilage.
  • A Alcian blue staining to detect acid proteoglycans and polysaccharides (AB); B: Picrosihus red staining to detect collagen fibers (P).
  • CTR control cartilage
  • DC native (Native) and decellularized
  • ADSCinvitro native (Native) and decellularized
  • HECinvitro human elastic cartilage cells
  • All images have the same scale.
  • the scale bar shown in the upper left image represents 300 pm.
  • FIG. 3 Histograms depicting tissue structure preservation for RCDinvitro as determined by toluidine blue (A), Alcian blue (B), and Picrosirius red staining (C). Structure conservation was also determined for RCDinvivo by staining with toluidine blue (D), alcian blue (E) and Picrosirius red (F). The bars correspond to the mean ⁇ standard deviation, (a) represents significant differences with NCTR. (b) represents significant differences with DCD.
  • H-E Hematoxylin-eosin
  • TB toluidine blue
  • AB alcian blue
  • P picrosirius red
  • H-E Hematoxylin-eosin
  • TB toluidine blue
  • AB alcian blue
  • P picrosirius red
  • H-E Hematoxylin-eosin
  • TB toluidine blue
  • AB alcian blue
  • P picrosirius red
  • sturgeon cartilage as a new scaffold for cartilage tissue engineering.
  • DCD decellularized cartilage-derived
  • the scaffold was then recellularized with four different types of human mesenchymal stem cells (MSCs) derived from adipose tissue (ADSC), bone marrow (BMSC), dental pulp (DPSC), and Wharton's jelly from umbilical cord (WSC) and with chondrocytes.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • BMSC bone marrow
  • DPSC dental pulp
  • Wharton's jelly from umbilical cord
  • Wharton's jelly from umbilical cord
  • HEC human elastic bands
  • DCD preserved the fundamental properties of native cartilage after of having been subjected to the decellularization method, and the biosafety studies showed that the decellularized and recellularized cartilages were biocompatible in vivo, and the grafts were accepted by all the animals with a total absence of histological alterations.
  • a first aspect of the invention relates to cartilage from organisms of the subclass Chondrostei, hereinafter "cartilage of the invention", for use as a medicine or, alternatively, for use in medicine.
  • this aspect of the invention relates to cartilage from organisms of the order Acipenseriformes, hereinafter cartilage of the invention, for use as a medicament or, alternatively, for use in medicine.
  • the cartilage of the invention is from an organism of the Acipenseridae family, even more preferably, from the Acipenser genus, and even more preferably, from the Acipenser naccarii species.
  • organisms of the genus Arcipenser are understood as cellular organisms of the superkingdom Eukariota, ciate Opisthokonta, Kingdom Metazoa, Phylum Chordata, subphylum Craniata, superclass Actinopteri, subclass Chondrostei, Order Acipenseriformes, suborder Acipenseroidei, family Acipenseridae, subfamily Acipenserinae, tribe Acipenserinf, genus Acipenser
  • A. baieri (Siberian sturgeon), A. brevirostrum (short-nosed sturgeon), A. dabryanus (Yangtze sturgeon), A. fulvescens (lake sturgeon), A. gueldenstaedtii (Indian sturgeon ), A. meterostris (green sturgeon), A. mikadoi (Sakhali sturgeon), A. naccarii (Adriatic sturgeon), A. nudiventris (fringed beard sturgeon), A. oxyrinchus (Atlantic sturgeon), A.
  • oxyrinchus desotoi Gulf sturgeon
  • A. oxyrinchus oxyrinchus A. persicus (Persian sturgeon)
  • A. ruthenus sterlet
  • A. schrenckii Amur sturgeon
  • A. sinensis Choinese sturgeon
  • A. stellatus stellate
  • A. sturio common sturgeon
  • A. transmontanus white sturgeon.
  • Acipenser also refers to the genus of an organism having a nucleotide sequence homologous to the cytochrome b region of mitochondrial DNA with at least 70% identity to SEQ ID NO. 1, and more preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to SEQ ID NO: 1. More Preferably, the homologous sequence of mitochondrial DNA cytochrome b has 100% identity with SEQ ID NO: 1.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides between two nucleotide sequences when compared. Sequence comparison methods are known in the art, and include, but are not limited to, BLASTP, BLASTN, and FASTA (S.F. Altschul etal., "Basic Local Alignment Search Tool", J. Mol Biol. 1990 , 215, 403-410).
  • homologous nucleotide sequence refers to a sequence that is equivalent to the mitochondrial cytochrome b fragment of sequence SEQ ID NO: 1 from Acipenser, preferably Acipenser naccarii.
  • sequence that is equivalent means a nucleotide sequence that is within the cytochrome b or equivalent region in that particular Acipenser species, and performs the same function. The skilled person is able to identify these equivalent regions with routine protocols.
  • % identity refers to the percentage (%) identity between two or more nucleotide or amino acid sequences. % Identity is a count of the number of positions along the length of the alignment of two sequences where all of the nucleotides or amino acids at that position are identical. The % identity is calculated based on homologous sequences of the same length.
  • cartilage from organisms of the order Acipenseriformes to increase, restore or replace, partially or completely, the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ.
  • the diseased or damaged tissue is selected from the list consisting of: cartilage found on joint surfaces (articular cartilage), the ear, nose and/or trachea, bronchi, epiglottis, ribs, pubic symphysis, intervertebral disc, menisci, or any combination thereof.
  • the cartilage of the invention can be diluted, for example in acetic acid, and can be resolidified, giving it the desired shape. It can also be found as a lyophilized powder that could be reconstituted in the desired form. Said cartilage will not only have collagen, but all the additional components of cartilage.
  • the cartilage of the invention is diluted or lyophilized.
  • cartilage can be subjected to acid hydrolysis using a 0.7M solution of acetic acid (CH3-COOH) at a temperature close to 15°C and with constant agitation, using a cartilage/solution ratio. 1:10 (weight/volume) for 6-12 hours.
  • the diluted collagen can be further precipitated by addition of 12% sodium chloride (NaCl) solution and subsequent filtering.
  • the procedure would consist, for example, but not limited to, freezing the material at -20°C or, preferably, by immersion in liquid nitrogen, subsequently subjecting the frozen product to a vacuum chamber capable of extracting all the water in the cartilage at freezing temperatures.
  • Cartilage that has been previously diluted or lyophilized may comprise other ECM components, active ingredients and/or therapeutic agents.
  • Capsules, reservoirs, liposomes, vesicles, or implants can be incorporated that release the therapeutic agent or active ingredient in situ in a patient.
  • Therapeutic agents may include small organic molecules, proteins, such as antibodies, hormones, cytokines, chemokines, growth factors, viruses, nucleic acid molecules, such as aptamers or antisense or sense suppressor molecules, vectors, antibiotics, or microorganisms.
  • the diluted cartilage of the invention can also include other elements, such as carbon nanotubes; particles such as metal particles or hard tissue nanoparticles, magnetic particles, and imaging particles, such as radiopaque, ultrasound reflective, or fluorescent particles; fibers, such as hair filaments; and vesicles such as lipid vesicles/phosphorus lipids, liposomes and vesicles of slow release drugs. It may also comprise ECM components such as hyaluronic acid, elastin, oxytalan, elaunin, proteoglycans, glycosaminoglycans, fibrin, fibronectin, silk or other nano-micro fibrous materials, and collagen. It may also include hard tissue particles such as porous ceramics, tricalcium phosphate, silicone, glass, bioglass, phosphate glass, hydroxyapatite, or bone mineral preparations.
  • ECM components such as hyaluronic acid, elastin, oxytalan, elaunin, proteoglycan
  • the cartilage of the invention has been obtained by a method comprising: a) inducing cell lysis of cartilage cells by osmotic shock, b) removing cytoplasmic and nuclear material, c) promoting lipid dissociation , and d) dissociate intracellular proteins.
  • the cell lysis of step a) is induced by incubating the cartilage in bidistilled water (bFW) at room temperature with shaking.
  • the elimination of the cytoplasmic and nuclear material in step b) is carried out by incubating the cartilage in a 1% solution of sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • the lipid dissociation of step c) is carried out with a 3% Triton X-100 solution.
  • the dissociation of the intracellular proteins in step d) is carried out by incubating the cartilage in a 4% sodium deoxycholate (SDC) solution.
  • the cartilage of the invention can harbor cells.
  • the cells are preferably human, although they may be from any other organism, preferably any other animal (eg, but not limited to, dogs or horses).
  • the cells may be stem cells or differentiated cells.
  • the cells that are not stem cells for example, human hyaline, elastic, or fibrous cartilage chondrocytes, liver cells, epithelial cells (for example, keratinocytes), fibroblasts, or vascular cells, among others, can be used.
  • stem cells mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, embryonic stem cells preferably of non-human origin, induced pluripotent stem cells, adult stem cells or combinations thereof can be used.
  • the cells can be interstitially distributed within the biomaterial in any arrangement.
  • cells they can be homogeneously distributed throughout the biomaterial or distributed in defined zones, regions or layers within the biomaterial.
  • the incorporation of viable cells in the liquid cartilage suspension of the invention is preferably carried out under suitable conditions of temperature, neutral pH, ionic strength and purity to maintain viability.
  • Hard tissue particles can be incorporated into the biomaterial along with osteoblasts or chondrocytes, to produce an artificial bone or calcified cartilage substitute tissue.
  • the ratio of particles to biomaterial and cells will depend on the particle size and tissue properties required (eg, dense hard tissue or loosely packed).
  • the hard tissue particles as described herein may be incorporated into the ends of a linear construct produced from the biomaterial, to facilitate attachment of the construct in vivo, for example by screwing it directly into bone.
  • an artificial tissue hereinafter “artificial tissue of the invention”
  • cartilage of the invention comprising: a) the cartilage of the invention, and b) at least one cell, hereinafter “ cell of the invention.
  • the cell of the invention is a human cell.
  • the cell of the invention is selected from: human hyaline, elastic or fibrous cartilage chondrocytes, liver cells, epithelial cells (for example, keratinocytes), fibroblasts or vascular cells, among others, or any of their combinations.
  • the cell of the invention is a stem cell. More preferably the stem cell is selected from: mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, embryonic stem cells preferably of non-human origin, induced pluripotent stem cells, adult stem cells or combinations thereof. Even more preferably, it is a mesenchymal stem cell. More preferably, the mesenchymal stem cell is obtained from bone marrow, adipose tissue, liver, spleen, testes, menstrual blood, amniotic fluid, pancreas, periosteum, synovial membrane, skeletal muscle, dermis, pericytes, trabecular bone, umbilical cord, lung, dental pulp and peripheral blood.
  • mesenchymal stem cells is obtained from bone marrow, adipose tissue, liver, spleen, testes, menstrual blood, amniotic fluid, pancreas, periosteum, synovial membrane, skeletal muscle, dermis, pericy
  • the artificial tissue of the invention comprises a cell population, hereinafter "cell population of the invention".
  • cell population of the invention can be of autologous, allogeneic or xenogeneic origin. Preferably, they are of autologous origin.
  • Another aspect refers to the artificial tissue of the invention for its use in medicine, or alternatively, for its use as a medicine.
  • the diseased or damaged tissue is selected from the list consisting of: cartilage found on joint surfaces (articular cartilage), the ear, nose and/or trachea, bronchi, epiglottis, ribs (hyaline cartilage, which is the same type), symphysis pubis, intervertebral disc, menisci, or any of their combinations.
  • a biomaterial comprising viable cells can be stored under conditions that maintain viability but do not support cell growth, until ready for use.
  • the biomaterial can be stored at low temperature, eg, 0 to 10°C, or frozen ( ⁇ 0°C) in the presence of a preservative.
  • the biomaterial can be stored in cell culture medium at 37°C for short periods of time, or at lower temperatures (eg, 20°C) for longer periods.
  • the cells of any aspect of the invention can be genetically modified by any conventional method including, by way of illustration, without limitation, transgenesis processes, deletions or insertions in their genome that modify the expression of genes that are important for their basic properties (proliferation, migration, differentiation, etc.), or by inserting nucleotide sequences that encode proteins of interest, such as proteins with therapeutic properties. Therefore, in another preferred embodiment, the cells of any aspect of the invention have been genetically modified.
  • the progeny of a single clonal cell can be expanded by multiple passages without apparently suffering from any chromosomal abnormality, or loss of growth and differentiation properties.
  • cells of any aspect of the invention may be clonally expanded using any method suitable for cloning cell populations.
  • a proliferated population of cells can be physically harvested and plated onto a separate plate (or into the wells of a "multi-well” plate).
  • cells can be subcloned into a "multi-well” plate in a statistical ratio to facilitate the operation of placing a single cell in each well (eg, from about 0.1 to about one cell/well or even about 0.25 to 0.5 cells/well, such as 0.5 cells/well).
  • Cells can, of course, be cloned at low density (eg, into a Petri dish or other suitable substrate) and isolated from other cells using devices such as cloning rings.
  • the production of a clonal population can be expanded in any suitable culture medium.
  • the isolated cells can be cultured to a suitable point where their developmental phenotype can be assessed.
  • Another aspect of the invention relates to an artificial tissue of the invention comprising a population of isolated cells, comprising at least one cell of the invention, which is preferably an adult cell.
  • the cell population used in the invention comprises at least 20%, preferably 40% and even more preferably 50%, 60%, 80%, 90%, 95% or 99% of cells of the invention.
  • the cell population used in the invention comprises at least 20%, preferably 40% and even more preferably 50%, 60%, 80%, 90%, 95% or 99% of cells of the invention. .
  • adult stem cell means that the stem cell is isolated from a tissue or organ of a person or animal in a state of growth after the embryonic state.
  • the stem cells of the invention have been isolated in a postnatal state.
  • they have been isolated from a mammal, and more preferably from a human, including neonates, juveniles, adolescents, and adults.
  • subject includes any animal, in particular, vertebrate animals, preferably mammals, such as mice, rats, horses, pigs, rabbits, cats, sheep, dogs, cows, humans, etc.
  • mammal refers to any organism of the superkingdom Eukaryota, kingdom Metazoa, Phylum Chordata, class Mammalia. Therefore, the cells used in the artificial tissue of the invention can belong to any animal, preferably a mammal. In another even more preferred embodiment, the mammal is human.
  • biomaterial used in the present invention refers to materials suitable for coming into contact with the tissues of a subject for specific therapeutic, diagnostic, or preventive purposes. These materials must be biocompatible, that is, they must not cause any significant adverse response of the living organism after the interaction of the biomaterial with body tissues and fluids and, on occasion, must biodegrade, either chemically or physically, or by a combination of both. processes, to give rise to non-toxic components.
  • chondrocyte used in the present invention refers to a cell type present in cartilage, responsible for the production and maintenance of the cartilaginous matrix, which mainly comprises proteoglycans, glycosaminoglycans with low osmotic potential and fibers (especially collagen). ).
  • mesenchymal stem cells of mesodermal origin
  • mesenchymal stem cells have the capacity to differentiate towards the osteochondrogenic lineage.
  • mesenchymal stem cells proliferate and accumulate into a dense array of chondrogenic cells in the chondrification center.
  • These chondrogenic cells subsequently differentiate into chondroblasts capable of synthesizing the extracellular matrix of cartilage, which mainly comprises proteoglycans, glycosaminoglycans with low osmotic potential, and fibers.
  • the chondroblasts are then confined to a small space or lacuna that is no longer in contact with the newly created matrix and contains extracellular fluid.
  • the chondroblast at this stage has very little metabolic activity and is called a chondrocyte, which is generally inactive but can still secrete and degrade the extracellular matrix, depending on conditions.
  • culture refers to the growth of cells or tissues in a suitable medium.
  • said cell culture refers to growth of cells in vitro or ex vivo. In such cell culture, cells proliferate, but do not organize into tissues per se.
  • stem cell refers to a cell with clonogenic capacity, self-renewal and differentiation into multiple cell lineages.
  • mesenchymal stem cells have the ability to proliferate extensively and form colonies of cells with an elongated or spindle-shaped morphology.
  • stem cell refers to a pluripotent or multipotent cell, capable of generating one or more types of differentiated cells, and which, in addition, has the ability to self-regenerate, that is, to produce more stem cells.
  • the "totipotent stem cells” can give rise to both the embryonic components (such as the three embryonic layers, the germinal lineage and the tissues that will give rise to the yolk sac), as well as the extraembhonahos (such as the placenta). That is, they can form all cell types and give rise to a complete organism.
  • "Pluripotent stem cells” can form any type of cell corresponding to the three embryonic lineages (endoderm, ectoderm and mesoderm), as well as the germinal and yolk sac. They can, therefore, form cell lineages but from them a complete organism cannot be formed.
  • “Multipotent stem cells” are those that can only generate cells of the same layer or lineage embryonic of origin.
  • Bone marrow harbors at least two distinct stem cell populations: mesenchymal stem cells (MSCs) and hematopoietic stem cells (HSCs).
  • stem cells are selected from the group comprising mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, adult stem cells, or combinations thereof.
  • the stem cells are mammalian stem cells, preferably human.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells, preferably human mesenchymal stem cells.
  • adult stem cell refers to that stem cell that is isolated from a tissue or an organ of an animal in a state of growth subsequent to the embryonic state.
  • the stem cells of the invention are isolated in a postnatal state. They are preferably isolated from a mammal, and more preferably from a human, including neonates, juveniles, adolescents, and adults.
  • Adult stem cells can be isolated from a wide variety of tissues and organs, such as bone marrow (mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells), adipose tissue, cartilage, epidermis, hair follicle, skeletal muscle, heart muscle, intestine, liver, nervous tissue , etc.
  • embryonic stem cell refers to cells derived from the inner cell mass of embryos at the blastocyst stage, with the capacity for self-renewal and pluripotent differentiation into all types of adult cells.
  • Embryonic stem cells are capable of indefinite proliferation in vitro, remaining in an undifferentiated state and with a normal karyotype through prolonged culture. They also have the ability to differentiate into cells of all three embryonic germ layers (mesoderm, endoderm, and ectoderm) (Itskovitz-Eldor, et al., Mol. Med. 6:88-95, 2000) and to the germinal lineage.
  • the stem cells of the invention are not embryonic stem cells.
  • hematopoietic stem cell refers to an adult stem cell with the capacity to give rise to hematopoietic lineages, both myeloid (monocytes and macrophages, neutrophils, basophils, eosinophils, erythrocytes, megakaryocytes/platelets, dendritic cells) and lymphoid (T lymphocytes, B cells, NK cells). This cell type is mainly found in the bone marrow.
  • mesenchymal stem cell refers to a multipotent stromal cell, originating from the mesodermal germ layer, that can differentiate into a variety of cell types, including osteocytes (bone cells), chondrocytes (cartilage cells) and adipocytes (fat cells), among others. Markers expressed by mesenchymal stem cells include CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71, and Stro-1 as well as the adhesion molecules CD106, CD166, and CD29.
  • mesenchymal stem cells include CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71, and Stro-1 as well as the adhesion molecules CD106, CD166, and CD29.
  • MSCs can be obtained from, but not limited to, bone marrow, adipose tissue (such as subcutaneous adipose tissue), liver, spleen, testes, menstrual blood, amniotic fluid, pancreas, periosteum, synovial membrane, skeletal muscle, dermis, pericytes, trabecular bone, human umbilical cord, lung, dental pulp, and peripheral blood.
  • adipose tissue such as subcutaneous adipose tissue
  • liver spleen
  • testes menstrual blood
  • amniotic fluid pancreas
  • periosteum synovial membrane
  • skeletal muscle skeletal muscle
  • dermis pericytes
  • trabecular bone human umbilical cord
  • human umbilical cord lung
  • dental pulp and peripheral blood.
  • MSCs can be obtained from any of the above tissues, such as from bone marrow, dental pulp, subcutaneous adipose tissue or umbilical cord.
  • MSCs can be isolated from bone marrow by methods known to those of skill in the art. In general, such methods consist of isolating cells from bone marrow aspirates, and subsequently seeding the isolated cells in tissue culture plates in medium containing fetal bovine serum. These methods are based on the ability of MSCs to adhere to plastic, so that while non-adherent cells are removed from culture, adhered MSCs can be expanded in culture dishes. MSCs can also be isolated from subcutaneous adipose tissue following a similar procedure, known to those skilled in the art.
  • the mesenchymal stem cells are obtained from umbilical cord, preferably from human umbilical cord, as well as from dental pulp, preferably human.
  • pluripotent stem cell or “pluripotent stem cell” and grammatical equivalents are used interchangeably in the context of the present invention to refer to undifferentiated or poorly differentiated cells, of any species, with the ability to divide indefinitely without losing their properties and capable of forming any cell of the three embryonic lineages (mesoderm, endoderm, ectoderm), as well as the germinal lineage when cultured under certain conditions.
  • the invention contemplates the use of any type of pluripotent stem cell that is capable of generating progeny from any of the three germ layers, including cells derived from embryonic tissue, fetal tissue, adult and other sources.
  • Pluripotent cells suitable for use in the present invention include embryonic stem cells, embryonal carcinoma cells, induced pluripotent cells (iPS), and primordial germ cells. Also, the invention contemplates the use of pluripotent stem cells from any species including, without limitation, human, mouse, rat, bovine, sheep, hamster, pig cells and the like.
  • induced pluripotent stem cell or "PS” as used herein refers to cells that are substantially identical genetically to a differentiated somatic cell from which they are derived, but display similar characteristics in terms of differentiation. and proliferative capacity to pluripotent embryonic stem cells.
  • active ingredient means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect in the diagnosis or cure or that mitigates, treats or prevents a disease, or that affects the structure or function of the human body or other animals.
  • biologically derived active ingredients include growth factors, hormones, and cytokines.
  • a variety of therapeutic agents are known in the art and can be identified by their effects. Certain therapeutic agents are capable of regulating cell proliferation and differentiation. Examples include chemotherapeutic nucleotides, drugs, hormones, etc.
  • drug refers to any substance used for the prevention, diagnosis, alleviation, treatment, or cure of disease in man and animals.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the decellularization protocol used was a combination of several previously described protocols [Vinatier C et al. Trends in Biotechnology. 2009;27(5):307-14, Oliveira et al. PLOS ONE. 2013;8(6):e66538, Philips C et al. Annals of Biomedical Engineering. 2018;46(11) : 1921-37] optimized for cartilage decellularization based on the use of different types of detergents and enzymatic treatment.
  • the discs were incubated in bidistilled water (bH2O) at room temperature with shaking for 24 h to induce cell lysis by osmotic shock [Pu L et al. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials.
  • MSC human mesenchymal cells
  • HEC human elastic cartilage chondrocytes
  • WSCs umbilical cord Wharton's jelly stem cells
  • AmnioMAXTM medium Gibco; 17001-074
  • HEC HEC were cultured with expansion medium composed of 10% FBS, L-glutamine 2 mM (Sigma-Aldrich; G7513), 88% Dulbecco's Modified Eagle's Medium I Nutrient Mix F-12 HAM (DMEM-F12) (Sigma-Aldrich; D8437) and 1% Antifungal I Antibiotics. Cultures were incubated at 37°C and 5% CO2 and the medium was changed 3 times per week. Cells were dissociated before reaching confluency using 0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid solution (Gibco; 25300062).
  • DCD recellularized DCD
  • RCDs were incubated at 37°C with 5% CO2 for 2-3 h to allow cell adhesion. Then, 1 mL of each specific medium was added to each well and the RCDs were incubated for 24 h. A non-recellularized DCD was used as a negative control. All these samples were cultured until 15-21 days (t1) and 30-35 days (t2), changing the medium twice a week.
  • the efficiency of decellularization was evaluated by quantifying residual DNA in decellularized tissues and with H-E and DAPI.
  • the DNA content obtained for DCD was 19.92 ⁇ 5.79 ng/mg of tissue, which is consistent with the requirements of decellularized tissues [Crapo PM. Biomaterials. 2011 ;32(12):3233-43], H-E and DAPI showed that the process was able to remove all nuclei from the tissue compared to NCTR (Fig. 1A and 1C), thus confirming the quantification result and showing that the decellularization process was carried out successfully.
  • H-E revealed that cartilage retains its general structure after decellularization.
  • Analysis of ECM composition in DCD revealed that TB and AB remained stable after decellularization, although P showed a significant decrease in staining in DCD (p ⁇ 0.0001) (Fig. 1A-B, 2, 3A- C).
  • ADSCinvitro In vitro RCD with ADSC (ADSCinvitro) was the one that presented the highest number of cells at t1 and in vitro RCD with DPSC (DPSCinvitro) at t2, while in vitro RCD with BMSC (BMSCinvitro) was the one that had fewer cells on the surface at t1 and in vitro RCD with HEC (HECinvitro) at t2 (Fig. 1A and 1C).
  • NCTR did not present significant differences in proteoglycan content when compared to the rest of the global groups (ADSCinvitro, BMSCinvitro, DPSCinvitro, WSCinvitro and HECinvitro). ) (Table 1). However, it was observed that there were some differences if compared with each specific group (Fig. 1B). DPSCinvitro-t2 showed the greatest reduction in the amount of proteoglycans compared to NCTR (p ⁇ 0.0001) (Fig. 3A).
  • Table 1 Analysis of extracellular matrix components determined by staining with toluidine blue (TB), alcian blue (AB) and picrosirius red (P) in each global group of samples.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un tejido artificial formado por cartílago de organismos Ascipenser (esturión) y células, así como su uso como medicamento, en particular para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido u órgano enfermo o dañado, concretamente cartílago

Description

DESCRIPCIÓN
NUEVO BIOMATERIAL PARA INGENIERÍA TISULAR
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina e ingeniería tisular. Específicamente, se refiere a un nuevo biomaterial y un método in vitro de preparación del mismo. También se refiere a sus usos en medicina regenerativa.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El cartílago es un tejido conectivo especializado que tiene un tipo de célula especial, llamado condrocito, responsable de sintetizar una matriz extracelular densa (MEC) compuesta principalmente de fibras de colágeno, o colágeno y elastina, y proteoglicanos. Hay tres tipos de cartílago en el cuerpo humano (hialino, elástico y fibroso) que se diferencian principalmente en la composición y estructura de la MEC, lo que resulta en diferentes propiedades y funciones. Los problemas comunes asociados con el cartílago son la degeneración de este tejido relacionada con la edad, las lesiones traumáticas o la formación de tumores. El cartílago tiene una capacidad de autorregeneración limitada debido a la falta de vasos sanguíneos y nervios y, en la mayoría de los casos, se genera fibrocartílago en lugar del tejido funcional nativo. Por esta razón, podría ser necesaria una corrección quirúrgica del defecto o daño, aunque el resultado suele ser subóptimo.
La ingeniería de tejidos se ha convertido en una herramienta potencial para la reparación de tejidos y órganos mediante el uso de células, biomatehales y factores de crecimiento. En la reparación del cartílago, se han estudiado vahos armazones, matrices o andamios (scaffolds) naturales y sintéticos como el ácido poliglicólico, ácido poliláctico, PEGDA, colágeno, quitosano, hialuronano, alginato, fibhna-agarosa, etc. Estos andamios deben ser capaces de promover la diferenciación celular, la migración y la proliferación y también deben ser degradables, biocompatibles y no tóxicos. Sin embargo, la mayoría de los biomatehales no son capaces de reproducir totalmente el microambiente de la MEC del cartílago nativo. Debido a estas limitaciones, actualmente se están estudiando y utilizando biomatehales naturales obtenidos de tejidos descelulahzados. La descelulahzación es un proceso que permite obtener un producto compuesto por MEC que mantiene la estructura, composición y propiedades mecánicas originales, proporcionando todos los estímulos necesarios para la proliferación y diferenciación celular, haciendo que este material sea apto para la ingeniería de tejidos. Además, las proteínas estructurales y funcionales de la MEC están altamente conservadas entre las especies, lo que permite su implantación con muy poca probabilidad de rechazo inmunológico. Ya se han estudiado vahos tejidos descelulahzados para la generación de cartílago, incluido el tejido adiposo, el cordón umbilical, el propio cartílago y otros.
El tejido del cartílago muestra característicamente un bajo potencial de regeneración in vivo, y se necesitan nuevas tecnologías de reemplazo capaces de reparar las lesiones del cartílago. Aunque se han propuesto numerosas terapias celulares y estrategias de ingeniería de tejidos, los resultados a largo plazo siguen siendo deficientes. Ninguno de estos biomateriales pudo imitar completamente el microambiente de este tejido, por lo que es necesario desarrollar nuevos biomateriales.
El esturión es un pez ancestral perteneciente al orden Acipenseriformes. El esqueleto del esturión está compuesto principalmente de cartílago, siendo una buena fuente de este tejido para uso en investigación. Algunos trabajos previos han estudiado el colágeno y las moléculas de sulfato de condroitina de este animal, aunque la estructura y composición general de este cartílago es poco conocida. No se ha informado previamente de estudios que utilicen cartílago de esturión en la ingeniería de tejidos.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Análisis histológico del cartílago de esturión nativo y descelulahzado. A: Tinción con hematoxilina-eosina (H-E); B: tinción con azul de toluidina para la detección de proteoglicanos sulfatados (TB); C: mareaje de fluorescencia DAPI para detectar núcleos celulares (DAPI). Se muestran los resultados obtenidos en el cartílago control (CTR) tanto nativo (Native) como descelulahzaco (DC), así como en el cartílago recelularizado con células mesenquimales de distinto origen (ADSCinvitro, BMSCinvitro, DPSCinvitro, WSCinvitro) y con células de cartílago elástico humano (HECinvitro) entre 15 y 21 días y entre 30 y 35 días. Todas las imágenes tienen la misma escala. La barra de escala que muestra la imagen superior izquierda representa 300 pm.
Fig. 2. Análisis histológico del cartílago de esturión nativo y descelulahzado. A: Tinción con azul alcián para detectar proteoglicanos ácidos y polisacáhdos (AB); B: tinción con rojo picrosihus para detección de fibras de colágeno (P). Se muestran los resultados obtenidos en el cartílago control (CTR) tanto nativo (Native) como descelulahzaco (DC), así como en el cartílago recelularizado con células mesenquimales de distinto origen (ADSCinvitro, BMSCinvitro, DPSCinvitro, WSCinvitro) y con células de cartílago elástico humano (HECinvitro) entre 15 y 21 días y entre 30 y 35 días. Todas las imágenes tienen la misma escala. La barra de escala que muestra la imagen superior izquierda representa 300 pm.
Fig. 3. Histogramas que representan la preservación de la estructura del tejido para RCDinvitro determinado por azul de toluidina (A), azul alcián (B) y tinción de rojo Picrosirius (C). La conservación de la estructura también se determinó para RCDinvivo mediante tinción con azul de toluidina (D), azul alcián (E) y rojo Picrosirius (F). Las barras corresponden a la media ± desviación estándar, (a) representa diferencias significativas con NCTR. (b) representa diferencias significativas con DCD.
Fig. 4. Tinción con hematoxilina-eosina (H-E), azul de toluidina (TB), azul alcián (AB) y rojo picrosirius (P) de DCDinvivo (A) y ADSCinvivo (B) a los 12, 30 y 60 días. Todas las imágenes tienen la misma escala. La barra de escala que muestra la imagen superior izquierda representa 300 pm.
Fig 5. Tinción con hematoxilina-eosina (H-E), azul de toluidina (TB), azul alcián (AB) y rojo picrosirius (P) de BMSCinvivo (A) y DPSCinvivo (B) a los 12, 30 y 60 días. Todas las imágenes tienen la misma escala. La barra de escala que muestra la imagen superior izquierda representa 300 pm.
Fig. 6. Tinción con hematoxilina-eosina (H-E), azul de toluidina (TB), azul alcián (AB) y rojo picrosirius (P) de WSCinvivo (A) y HECinvivo (B) a los 12, 30 y 60 días. Todas las imágenes tienen la misma escala. La barra de escala que muestra la imagen superior izquierda representa 300 pm.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han demostrado el uso del cartílago de esturión como un nuevo andamio (scaffold) para la ingeniería de tejidos del cartílago. Primero, se generó un andamio derivado de cartílago descelularizado (DCD). Luego, el andamio se recelularizó con cuatro tipos diferentes de células madre mesenquimales humanas (MSC) derivadas de tejido adiposo (ADSC), médula ósea (BMSC), pulpa dental (DPSC) y gelatina de Wharton del cordón umbilical (WSC) y con condrocitos elásticos humanos (HEC). Se realizaron estudios in vitro e in vivo para analizar histológicamente la estructura e integración de los diferentes sustitutos del cartílago. El DCD preservó las propiedades fundamentales del cartílago nativo después de haber sido sometido al método de descelularización, y los estudios de bioseguridad demostraron que los cartílagos descelularizados y recelularizados eran biocompatibles in vivo, y los injertos fueron aceptados por todos los animales con total ausencia de alteraciones histológicas.
BIOMATERIAL DE LA INVENCIÓN
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a cartílago de organismos de la subclase Chondrostei, de ahora en adelante “cartílago de la invención”, para su uso como medicamento o, alternativamente, para su uso en medicina.
Preferiblemente, este aspecto de la invención se refiere a cartílago de organismos del orden Acipenseriformes, de ahora en adelante cartílago de la invención, para su uso como medicamento o, alternativamente, para su uso en medicina.
Preferiblemente, el cartílago de la invención es de un organismo de la familia Acipenseridae, aún más preferiblemente, del género Acipenser y aún más preferiblemente, de la especie Acipenser naccarii.
En esta memoria, se entiende por “organismos del género Arcipenser” a organismos celulares del superreino Eukariota, ciado Opisthokonta, Reino Metazoa, Phylum Chordata, subphylum Craniata, superclase Actinopteri, subclase Chondrostei, Orden Acipenseriformes, suborden Acipenseroidei, familia Acipenseridae, subfamilia Acipenserinae, tribu Acipenserinf, género Acipenser
Se han descrito numerosas especies dentro de este género. A modo de ejemplo no limitativo: A. baerii (esturión siberiano), A. brevirostrum (esturión de nariz corta), A. dabryanus (esturión del Yangtze), A. fulvescens (esturión de lago), A. gueldenstaedtii (esturión de Rusia), A. medirostris (esturión verde), A. mikadoi (esturión de Sakhali), A. naccarii (esturión del Adriático), A. nudiventris (esturión barba de flecos), A. oxyrinchus (esturión del Atlántico), A. oxyrinchus desotoi (esturión del Golfo), A. oxyrinchus oxyrinchus, A.persicus (esturión de Persia), A. ruthenus (esterlete), A. schrenckii (esturión Amur), A. sinensis (esturión de China), A. stellatus (esturión estrellado), A. sturio (esturión común), A. transmontanus (esturión blanco).
Alternativamente, “Acipenser” también se refiere al género de un organismo que tiene una secuencia nucleotídica homologa de la región citocromo b del ADN mitocondrial con una identidad de al menos un 70% con la SEQ ID NO. 1 , y más preferiblemente una identidad de al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , 96%, 97%, 98%, o 99% con la SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente, la secuencia homologa del citocromo b del ADN mitocondrial tiene una identidad del 100% con la SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1
Acipenser naccarii cytochrome c oxidase subunit II gene, partial cds (GenBank: AY547412.1) tggcacatccatcacaattaggattccaagacgcggcctcacctgtaatagaagaacttctccacttccatgaccacacactaatg attgtcttcctaatcagcactctagtactttacattattgtggccatggtgtcaactaaactaacaaacaaatatgtactggattcccaa gaaattgaaattgtatgaacagtactcccagcagtaattttaatcttaattgccctaccttcccttcgaattctttacctaatagacgaga ttaatgacccccacctgacaattaaagctataggacaccaatgatactgaagttatgaatatacggactatgaagacctgggcttc gactcctacataatccctacacaagacctcgccccagggcaattccgactcctagaagcagaccatcgaatggtagtgcccata gaatccccaattcgagttctagtttccgcagaagacgtactccactcctgagcggtgccagccctgggcatcaaaatagacgcag tgcccggacgcctaaatcaaacagcctttattacctcacgaccgggagtctattatggccaatgttctgaaatctgcggagctaacc acagcttcatgccaattgtagttgaagcagtccccctagaacactttgaaaactgat
El término “identidad”, como se usa aquí, se refiere a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas cuando se comparan. Los métodos de comparación de las secuencias son conocidos en el estado del arte, e incluye, pero no se limita a, BLASTP, BLASTN, y FASTA (S.F. Altschul etal., “Basic Local Alignment Search Tool”, J. Mol Biol. 1990, 215, 403-410).
El término "secuencia de nucleótidos homologa", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia que es equivalente al fragmento del citocromo b mitocondrial de secuencia SEQ ID NO: 1 de Acipenser, preferiblemente Acipenser naccarii. La expresión "una secuencia que es equivalente" significa una secuencia de nucleótidos que está dentro del citocromo b o región equivalente en esa especie de Acipenser en particular, y realiza la misma función. La persona experta es capaz de identificar estas regiones equivalentes con protocolos de rutina.
El término "% de identidad", como se entiende en esta invención, se refiere al porcentaje (%) de identidad entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El % de identidad es un recuento del número de posiciones sobre la longitud de la alineación de dos secuencias donde todos los nucleótidos o aminoácidos en esa posición son idénticos. El % de identidad se calcula en base a secuencias homologas de la misma longitud.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a cartílago de organismos del orden Acipenseriformes para aumentar, restaurar o reemplazar, parcial o completamente, la actividad funcional de un tejido u órgano enfermo o dañado. En una realización preferida, el tejido enfermo o dañado se selecciona de la lista que consiste en: cartílago que se encuentra en las superficies articulares (cartílago articular), la oreja, la nariz y/o la tráquea, bronquios, epiglotis, costillas, sínfisis del pubis, disco intervertebral, meniscos, o cualquiera de sus combinaciones.
El cartílago de la invención puede ser diluido, por ejemplo en ácido acético, y se puede volver a solidificar, dándole la forma que se desee. También puede encontrarse como polvo liofilizado que podría reconstituirse con la forma deseada. Dicho cartílago no solo poseerá colágeno, sino todos los componentes adicionales del cartílago.
Por tanto, en otra realización preferida, el cartílago de la invención se encuentra diluido o liofilizado.
Los procesos de obtención de cartílago líquido o liofilizado son conocidos en el estado del arte. Por ejemplo, pero sin limitarnos, el cartílago se puede someter a hidrólisis ácida utilizando una solución al 0,7M de ácido acético (CH3-COOH) a una temperatura cercana a los 15°C y con agitación constante, utilizando una proporción cartílago/solución de 1 :10 (peso/volumen) durante 6-12 horas. Si se desea, se puede precipitar posteriormente el colágeno diluido mediante adición de una solución de cloruro sódico (NaCI) al 12% y filtrado posterior. En el caso del cartílago liofilizado, el procedimiento consistiría, por ejemplo, pero sin limitarnos, a congelar el material a -20°C o, preferentemente, mediante inmersión en nitrógeno líquido, sometiendo posteriormente el producto congelado a una cámara de vacío capaz de extraer toda el agua del cartílago a temperaturas de congelación.
El cartílago que ha sido previamente diluido o liofilizado puede comprender otros componentes de la MEC, principios activos y/o agentes terapéuticos.
Pueden incorporarse cápsulas, depósitos, liposomas, vesículas o implantes que liberan el agente terapéutico o principio activo in situ en un paciente.
Los agentes terapéuticos pueden incluir pequeñas moléculas orgánicas, proteínas, tales como anticuerpos, hormonas, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, virus, moléculas de ácido nucleico, tales como aptámeros o moléculas supresoras antisentido o sentido, vectores, antibióticos o microorganismos.
En el cartílago de la invención diluido también puede incluir otros elementos, como nanotubos de carbono; partículas tales como partículas metálicas o nanopartículas de tejido duro, partículas magnéticas y partículas de formación de imágenes, tales como partículas radioopacas, reflectantes de ultrasonido o fluorescentes; fibras, como filamentos capilares; y vesículas tales como vesículas de lípidos/lípidos de fósforo, liposomas y vesículas de fármacos de liberación lenta. También puede comprender componentes de la MEC como ácido hialurónico, elastina, oxitalán, elaunina, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, fibrina, fibronectina, seda u otros materiales nano-micro fibrosos y colágeno. También puede incluir partículas de tejido duro como cerámica porosa, fosfato tricálcico, silicona, vidrio, biovidrio, vidrio de fosfato, hidroxiapatita o preparaciones minerales óseas.
MÉTODO DE OBTENCIÓN DEL BIOMATERIAL DE LA INVENCIÓN
En otra realización preferida, el cartílago de la invención se ha obtenido por un método que comprende: a) inducir la lisis celular de las células del cartílago mediante choque osmótico, b) eliminar el material citoplasmático y nuclear, c) promover la disociación de lípidos, y d) disociar las proteínas intracelulares.
Más preferiblemente, la lisis celular del paso a) se induce incubando el cartílago en agua bidestilada (bFW) a temperatura ambiente con agitación. En otra realización preferida la eliminación del material citoplasmático y nuclear del paso b) se realiza incubando el cartílago en una solución al 1% de sodio-dodecil-sulfato (SDS). En otra realización preferida, la disociación de lípidos del paso c) se realiza con una solución de Triton X-100 al 3%. En otra realización preferida, la disociación de las proteínas intracelulares del paso d) se realiza mediante la incubación del cartílago en una solución de desoxicolato de sodio (SDC) al 4%.
TEJIDO ARTIFICIAL DE LA INVENCIÓN
El cartílago de la invención puede albergar células. Las células son preferiblemente humanas, aunque pueden ser de cualquier otro organismo, preferiblemente de cualquier otro animal (por ejemplo, pero sin limitarnos, perros o caballos). Además, las células pueden ser células madre o células diferenciadas. Entre las células que no son células madre, por ejemplo, se pueden emplear condrocitos de cartílago hialino, elástico o fibroso humano, células hepáticas, células epiteliales (por elemplo, queratinocitos), fibroblastos, o células vasculares, entre otras. Entre las células madre, se pueden emplear células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias preferiblemente de origen no humano, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas o combinaciones de las mismas.
Cuando el cartílago de la invención se encuentra diluido, las células se pueden distribuir intersticialmente dentro del biomaterial en cualquier disposición. Por ejemplo, las células pueden distribuirse homogéneamente por todo el biomaterial o distribuirse en zonas, regiones o capas definidas dentro del biomaterial. La incorporación de células viables en la suspensión líquida del cartílago de la invención se realiza preferiblemente en condiciones adecuadas de temperatura, pH neutro, fuerza iónica y pura para mantener la viabilidad.
Las partículas de tejido duro pueden incorporarse al biomaterial junto con osteoblastos o condrocitos, para producir un hueso artificial o un tejido sustituto de cartílago calcificado. La relación de partículas a biomaterial y células dependerá del tamaño de partícula y las propiedades del tejido requeridas (por ejemplo, tejido duro denso o empacado suelto).
En algunas realizaciones, las partículas de tejido duro como se describen en el presente documento pueden incorporarse en los extremos de una construcción lineal producida a partir del biomaterial, para facilitar la unión de la construcción in vivo, por ejemplo atornillándola directamente en el hueso.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un tejido artificial, de ahora en adelante “tejido artificial de la invención”, que comprende: a) el cartílago de la invención, y b) al menos una célula, de ahora en adelante “célula de la invención”.
En una realización preferida, la célula de la invención es una célula humana. En otra realización preferida la célula de la invención se selecciona de entre: condrocitos de cartílago hialino, elástico o fibroso humano, células hepáticas, células epiteliales (por ejemplo, queratinocitos), fibroblastos o células vasculares, entre otras, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida, la célula de la invención es una célula madre. Más preferiblemente la célula madre se selecciona de entre: células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias preferiblemente de origen no humano, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas o combinaciones de las mismas. Aún más preferiblemente, es una célula madre mesenquimal. Más preferiblemente, la célula madre mesenquimal se obtiene a partir de médula ósea, tejido adiposo, hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical, pulmón, pulpa dental y sangre periférica.
Aún más preferiblemente, el tejido artificial de la invención comprende una población celular, de ahora en adelante “población celular de la invención”. Tanto la célula de la invención, como la población celular de la invención, pueden ser de origen autólogo, alogénico o xenogénico. Preferiblemente, son de origen autólogo.
Otro aspecto se refiere al tejido artificial de la invención para su uso en medicina, o alternativamente, para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado. Más preferiblemente, el tejido enfermo o dañado se selecciona de la lista que consiste en: cartílago que se encuentra en las superficies articulares (cartílago articular), la oreja, la nariz y/o la tráquea, bronquios, epiglotis, costillas (cartílago hialino, que es el mismo tipo), sínfisis del pubis, disco intervertebral, meniscos o cualquiera de sus combinaciones.
Para reducir y/o prevenir la muerte o el daño celular, un biomateñal que comprende células viables puede almacenarse en condiciones que mantengan la viabilidad pero que no apoyen el crecimiento celular, hasta que esté listo para su uso. Por ejemplo, el biomateñal puede almacenarse a baja temperatura, por ejemplo, de 0 a 10°C o congelarse (<0°C) en presencia de un cñoprotector. El biomateñal se puede almacenar en medio de cultivo celular a 37°C durante cortos períodos de tiempo, o a temperaturas más bajas (por ejemplo, a 20°C) durante periodos más largos.
Si se desea, las células de cualquier aspecto de la invención pueden modificarse genéticamente mediante cualquier método convencional incluyendo, a modo de ilustración, sin limitación, procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma que modifiquen la expresión de genes que son importantes por sus propiedades básicas (proliferación, migración, diferenciación, etc.), o mediante la inserción de secuencias de nucleótidos que codifiquen proteínas de interés como, por ejemplo, proteínas con propiedades terapéuticas. Por tanto, en otra realización preferida, las células de cualquier aspecto de la invención han sido modificadas genéticamente.
En ciertos casos, la progenie de una sola célula clonal puede expandirse mediante numerosos pases, sin que aparentemente sufra ninguna anomalía cromosómica, o la pérdida de sus propiedades de crecimiento y diferenciación.
Por tanto, si se desea, las células de cualquier aspecto de la invención se pueden expandir clonalmente usando un método adecuado para clonar poblaciones celulares. Por ejemplo, una población proliferada de células puede recolectarse físicamente y sembrarse en una placa separada (o en los pocilios de una placa de "múltiples pocilios"). Otra opción es que las células se pueden subclonar en una placa de "múltiples pocilios" en una relación estadística para facilitar la operación de colocar una sola célula en cada pocilio (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente una célula / pocilio o incluso aproximadamente 0,25 a 0,5 células / pocilio, como 0,5 células / pocilio). Por supuesto, las células pueden clonarse a baja densidad (por ejemplo, en una placa de Petri u otro sustrato adecuado) y aislarse de otras células usando dispositivos tales como anillos de clonación. La producción de una población clonal se puede expandir en cualquier medio de cultivo adecuado. En cualquier caso, las células aisladas se pueden cultivar hasta un punto adecuado en el que se pueda evaluar su fenotipo de desarrollo. Otro aspecto de la invención se refiere a un tejido artificial de la invención que comprende una población de células aisladas, que comprende al menos una célula de la invención, que, preferiblemente, es una célula adulta. En una realización preferida, la población celular empleada en la invención comprende al menos el 20%, preferiblemente el 40% e incluso más preferiblemente el 50%, 60%, 80%, 90%, 95% o 99% de células de la invención. En una realización preferida, la población celular empleada en la invención comprende al menos el 20%, preferiblemente el 40% e incluso más preferiblemente el 50%, 60%, 80%, 90%, 95% o 99% de células de la invención.
El término "célula madre adulta" significa que la célula madre se aísla de un tejido u órgano de una persona o animal en un estado de crecimiento después del estado embrionario. Preferiblemente, las células madre de la invención se han aislado en un estado posnatal. Preferiblemente, se han aislado de un mamífero y, más preferiblemente, de un ser humano, incluidos neonatos, jóvenes, adolescentes y adultos.
El término "sujeto" incluye cualquier animal, en particular, animales vertebrados, preferiblemente mamíferos, tales como ratones, ratas, caballos, cerdos, conejos, gatos, ovejas, perros, vacas, seres humanos, etc. El término mamífero, como se entiende aquí, se refiere a cualquier organismo del superreino Eukaryota, reino Metazoa, Phylum Chordata, clase Mammalia. Por tanto, las células que se emplean en el tejido artificial de la invención pueden pertenecer a cualquier animal, preferiblemente un mamífero. En otra realización incluso más preferida, el mamífero es el ser humano.
El término "biomaterial" empleado en la presente invención hace referencia a materiales aptos para entrar en contacto con los tejidos de un sujeto con propósitos terapéuticos específicos, de diagnóstico, o con propósitos preventivos. Estos materiales deben ser biocompatibles, es decir, no deben causar ninguna respuesta adversa significativa del organismo vivo tras la interacción del biomaterial con los tejidos y fluidos corporales y, en ocasiones, debe biodegradarse, ya sea química o físicamente, o por una combinación de ambos procesos, para dar origen a componentes no tóxicos. El término "condrocito" empleado en la presente invención hace referencia a un tipo celular presente en el cartílago, responsable de la producción y mantenimiento de la matriz cartilaginosa, la cual comprende fundamentalmente proteoglucanos, glucosaminoglucanos de bajo potencial osmótico y fibras (sobre todo, colágeno). La organización de este tipo celular en el cartílago difiere en función del tipo de cartílago y el tejido en donde se encuentre. En referencia al hueso o al cartílago, las células madre mesenquimales (de origen mesodérmico) tienen capacidad para diferenciarse hacia el linaje osteocondrogénico. Durante el proceso de formación del cartílago (condrogénesis), las células madre mesenquimales proliferan y se acumulan en un conjunto denso de células condrogénicas en el centro de condrificación. Estas células condrogénicas se diferencian posteriormente a condroblastos capaces de sintetizar la matriz extracelular del cartílago, que comprende fundamentalmente proteoglucanos, glucosaminoglucanos de bajo potencial osmótico y fibras. A continuación, los condroblastos quedan confinados en un espacio pequeño o laguna que ya no está en contacto con la matriz de nueva creación y que contiene líquido extracelular. El condroblasto en dicho estadio tiene muy escasa actividad metabólica y se denomina condrocito, que es generalmente inactivo pero aún puede secretar y degradar la matriz extracelular, dependiendo de las condiciones.
El término "cultivo" o "cultivo celular" empleado en la presente invención hace referencia al crecimiento de células o de tejidos en un medio adecuado. En la presente invención, dicho cultivo celular se refiere a un crecimiento de las células in vitro o ex vivo. En tal cultivo celular, las células proliferan, pero no se organizan en los tejidos per se.
El término "célula madre" hace referencia a una célula con capacidad clonogénica, de autorrenovación y de diferenciación en múltiples linajes celulares. En particular, las células madre mesenquimales tienen la capacidad de proliferar extensamente y formar colonias de células de morfología elongada o fusiforme. Tal como se usa en la presente invención, la expresión "célula madre" se refiere a una célula pluripotente o multipotente, capaz de generar uno o más tipos de células diferenciadas, y que, además, posee la capacidad de autorregenerarse, es decir, de producir más células madre. Las "células madre totipotentes" pueden dar lugar tanto a los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como a los extraembhonahos (como la placenta). Es decir, pueden formar todos los tipos celulares y dar lugar a un organismo completo. Las "células madre pluripotentes" pueden formar cualquier tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes celulares pero a partir de ellas no se puede formar un organismo completo. Las "células madre multipotentes" son aquellas que sólo pueden generar células de su misma capa o linaje embrionario de origen. La médula ósea alberga al menos dos poblaciones de células madre distintas: células madre mesenquimales (MSCs) y células madre hematopoyéticas (HSCs). En el contexto de la presente invención, las células madre son seleccionadas del grupo que comprende células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, o combinaciones de las mismas. En una realización particular, las células madre son células madre de un mamífero, preferiblemente humanas. En una realización particular, las células madre son células madre mesenquimales, preferiblemente células madre mesenquimales humanas.
El término "célula madre adulta" se refiere a aquella célula madre que es aislada de un tejido o un órgano de un animal en un estado de crecimiento posterior al estado embrionario. Preferiblemente, las células madre de la invención son aisladas en un estado postnatal. Preferiblemente son aisladas de un mamífero, y más preferiblemente de un humano, incluyendo neonatos, juveniles, adolescentes y adultos. Se pueden aislar células madre adultas de una gran variedad de tejidos y órganos, como médula ósea (células madre mesenquimales y células madre hematopoyéticas), tejido adiposo, cartílago, epidermis, folículo piloso, músculo esquelético, músculo cardíaco, intestino, hígado, tejido nervioso, etc.
El término "célula madre embrionaria" o "ESC" se refiere a las células derivadas de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, con capacidad de auto-renovación y de diferenciación pluripotente en todos los tipos de células adultas. Las células madre embrionarias son capaces de proliferar indefinidamente in vitro, manteniéndose en un estado indiferenciado y con un cariotipo normal a través del cultivo prolongado. También tienen la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (mesodermo, endodermo y ectodermo) (Itskovitz-Eldor, et al., Mol. Med. 6:88-95, 2000) y al linaje germinal.
Métodos para la obtención de células madre embrionarias son ampliamente conocidos y pueden ser puestos en práctica por el experto sin necesidad de experimentación excesiva.
En otra realización preferida, las células madre de la invención no son células madre embrionarias.
El término "célula madre hematopoyética" o "HSC" hace referencia a una célula madre adulta con capacidad de dar lugar a los linajes hematopoyéticos tanto mieloides (monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, células dendríticas) como linfoides (linfocitos T, células B, células NK). Este tipo celular se encuentra fundamentalmente en la médula ósea. El término "célula madre mesenquimal" o "MSC", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula estromal multipotente, originada a partir de la capa germinal mesodermal, que puede diferenciarse en una variedad de tipos de células, incluyendo osteocitos (células de hueso), condrocitos (células de cartílago) y adipocitos (células de grasa), entre otras. Los marcadores expresados por las células madre mesenquimales incluyen CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71 y Stro-1 así como las moléculas de adhesión CD106, CD166, y CD29. Entre los marcadores negativos para las MSCs (no expresados) están los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14, y las moléculas coestimuladoras CD80, CD86 y CD40 así como la molécula de adhesión CD31. Las MSC pueden ser obtenidas a partir de, sin quedar limitado a, médula ósea, tejido adiposo (tal como el tejido adiposo subcutáneo), hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical humano, pulmón, pulpa dental y sangre periférica. Las MSC, de acuerdo con la invención, pueden obtenerse a partir de cualquiera de los tejidos anteriores, tal como a partir de médula ósea, de pulpa dental, de tejido adiposo subcutáneo o de cordón umbilical. Se pueden aislar MSC de médula ósea mediante procedimientos conocidos por el experto en la materia. En general, dichos métodos consisten en aislar células de aspirados de médula ósea, y posteriormente sembrar las células aisladas en placas de cultivo de tejido en medio que contiene suero fetal bovino. Estos métodos se basan en la capacidad de las MSC de adherirse al plástico, de forma que mientras que las células no adherentes se retiran del cultivo, las MSC adheridas pueden expandirse en placas de cultivo. Las MSC también pueden aislarse de tejido adiposo subcutáneo siguiendo un procedimiento similar, conocido para el experto en la materia. Un método para aislar MSC de médula ósea o de tejido adiposo subcutáneo ha sido descrito previamente (De la Fuente et al., Exp. Cell Res. 2004, Vol. 297: 313:328). En una realización particular de la invención, las células madre mesenquimales son obtenidas a partir de cordón umbilical, preferiblemente de cordón umbilical humano, así como de la pulpa dentaria, preferentemente, humana.
Los términos "célula madre pluripotente" o "célula troncal pluripotente" y equivalentes gramaticales se usan de forma indistinta en el contexto de la presente invención para referirse a células no diferenciadas o poco diferenciadas, de cualquier especie, con capacidad para dividirse indefinidamente sin perder sus propiedades y capaces de formar cualquier célula de los tres linajes embrionarios (mesodermo, endodermo, ectodermo), así como el linaje germinal cuando se cultivan en ciertas condiciones. La invención contempla el uso de cualquier tipo de célula madre pluripotente que sea capaz de generar una progenie de cualquiera de las tres capas germinativas incluyendo células derivadas de tejido embrionario, tejido fetal, tejido adulto y otras procedencias. Células pluripotentes adecuadas para su uso en la presente invención incluyen células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, células pluripotentes inducidas (¡PS) y células germinales primordiales. Asimismo, la invención contempla el uso de células madre pluripotentes de cualquier especie incluyendo, sin limitación, células humanas, de ratón, de rata, bovinas, de oveja, de hámster, de cerdo y similares.
El término "célula madre pluripotente inducida" o "¡PS", según se usa en la presente invención, se refiere a células que son sustancialmente idénticas genéticamente a una célula somática diferenciada de la que derivan, pero que muestran características similares en cuanto a diferenciación y capacidad proliferativa a las células madre embrionarias pluripotentes.
Como se usa en este documento, el término "ingrediente activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico o la curación o que logre mitigar, tratar o prevenir una enfermedad, o que afecte la estructura o función del cuerpo humano o de otros animales. Los ejemplos de ingredientes activos de origen biológico incluyen factores de crecimiento, hormonas y citocinas. Se conocen en la técnica una variedad de agentes terapéuticos y pueden identificarse por sus efectos. Ciertos agentes terapéuticos son capaces de regular la proliferación y diferenciación celular. Los ejemplos incluyen nucleótidos quimioterapéuticos, medicamentos, hormonas, etc.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y las vahantes de la misma no pretenden excluir otras características técnicas, suplementos, componentes o pasos. Para los expertos en la técnica, otros objetos, ventajas y características de la invención se entenderán en parte a partir de la descripción y en parte a partir de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención. EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Los siguientes ejemplos específicos proporcionados en este documento de patente sirven para ¡lustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen sólo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de la invención que se reivindica en este documento. Por tanto, los ejemplos descritos a continuación ¡lustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Materiales y métodos.
Obtención de cartílago del esturión (Acipenser naccarii) y descelularización
Este estudio se realizó utilizando cartílago obtenido de la región de la cabeza de Acipenser naccarii (esturión) que fue proporcionado por la piscifactoría ubicada en Riofrío, Granada, España. Los esturiones se sacrificaron, se extrajo el cartílago, se limpió y se congeló inmediatamente a -20 °C hasta el momento de su procesamiento.
Antes del proceso de descelularización, el cartílago se descongeló a temperatura ambiente (TA). Se obtuvieron discos de cartílago (n = 40) con un diámetro de 8 mm y un grosor aproximado de 1 mm utilizando un punzón de biopsia (Kay Medical) y cuchillas quirúrgicas del n° 10. Estos discos se sumergieron en una solución que constaba de 10 mi de solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma-Aldrich; D8662) con antibióticos / antimicóticos (Sigma- Aldhch; A5955) [Pu L et al. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2018; 106(2):619-31] durante 10 minutos. Algunos de estos discos (n = 7) se almacenaron como controles nativos (NCTR). El resto de discos inició el proceso de descelularización.
El protocolo de descelularización utilizado fue una combinación de varios protocolos descritos previamente [Vinatier C et al. Trends in Biotechnology. 2009;27(5):307-14, Oliveira et al. PLOS ONE. 2013;8(6):e66538, Philips C et al. Annals of Biomedical Engineering. 2018;46(11 ) : 1921 - 37] optimizados para la descelularización del cartílago basada en el uso de diferentes tipos de detergentes y un tratamiento enzimático. En primer lugar, los discos se incubaron en agua bidestilada (bH2O) a temperatura ambiente con agitación durante 24 h para inducir la lisis celular mediante choque osmótico [Pu L et al. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2018;106(2):619-31], Luego, los discos se transfirieron a una solución al 1% de sodio-dodecil-sulfato (SDS) (Invitrogen; 24730020) [Zhang X et al. Gene. 2016;579(1):8-16] para eliminar el material citoplasmático y nuclear. Para eliminar el SDS, se realizaron 3 lavados de 30 minutos cada uno con bH2O a 4°C y luego los discos se transfirieron a una solución de Tritón X-100 al 3% (Sigma-Aldrich; X100-500ML) [Philips C et al. Annals of Biomedical Engineering. 2018;46(11):1921-37] para promover la disociación de lípidos. Posteriormente, se repitieron los 3 lavados y los discos se incubaron en una solución de desoxicolato de sodio (SDC) al 4% (Sigma-Aldrich; D6750-100G) [Philips C et al. Annals of Biomedical Engineering. 2018;46(11):1921-37] para disociar las proteínas intracelulares. Finalmente, se repitieron los 3 lavados y el tratamiento enzimático se realizó por duplicado. En este tratamiento, se utilizaron 100 mg / L de DNasa (Sigma-Aldrich; DN25-1G) y 20 mg / L de RNasa (Sigma-Aldrich; R4875-500MG) [Philips C et al. Annals of Biomedical Engineering. 2018;46(11):1921-37] en PBS a pH 7,5 y 37 °C durante 45 minutos. Para detener la reacción, se utilizó PBS frío. Luego, se realizaron 5 lavados con PBS durante 15 minutos cada uno para eliminar los residuos de detergente y enzima [Pu L et al. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2018;106(2):619-31], Los discos de cartílago descelularizado (DCD) se almacenaron en PBS a 4°C para su uso posterior. Todos los detergentes se diluyeron en bH2O para evitar la pérdida de agua durante el proceso, ya que la estructura del tejido puede verse afectada [Badylak SF et al. Acta Biomaterialia. 2009;5(1): 1 -13], Todas las incubaciones con los detergentes se realizaron a TA, con agitación y durante 24 h.
Evaluación de ADN residual en discos de cartílago descelularizado (DCD)
Para probar la eficiencia del proceso de descelularización, se extrajo ADN de NCTR y DCD usando QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante, por triplicado y cuantificado midiendo la absorbancia a 260/280 nm usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
Cultivo de MSC y HEC
MSC (células mesenquimales humanas) y HEC (condrocitos de cartílago elástico humano) se obtuvieron previamente a partir de cultivos primarios que estaban disponibles en el Grupo de Ingeniería de Tejidos del Departamento de Histología de la Universidad de Granada. Se cultivaron ADSC (células madre derivadas del tejido adiposo), BMSC (células madre derivadas de la médula ósea) y DPSC (células madre derivadas de la pulpa dental) utilizando medio de cultivo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich; D6429) complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (Sigma-Aldrich; F7524) y antibióticos / antimicóticos al 1%. Las WSC (células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical) se cultivaron en medio AmnioMAX ™ (Gibco; 17001-074) como se describió anteriormente [Horvai A. Anatomy and Histology of Cartilage. In: Link TM, editor. Cartilage Imaging: Significance, Techniques, and New Developments. New York, NY: Springer New York; 2011. p. 1-10], Se cultivaron HEC con medio de expansión compuesto de FBS al 10%, L-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich; G7513), 88% de medio de Eagle modificado de Dulbecco I mezcla de nutrientes F-12 HAM (DMEM-F12) (Sigma-Aldrich; D8437) y 1 % de antibióticos I antimicóticos. Los cultivos se incubaron a 37°C y 5% CO2 y el medio se cambió 3 veces por semana. Las células se disociaron antes de alcanzar la confluencia usando una solución de tripsina-etilendiaminotetraacético al 0,05% (Gibco; 25300062).
Recelularización del cartílago
Para la recelularización de DCD, fue necesario crear moldes a base de agarosa tipo I al 3,5% (Sigma-Aldrich; A4718) en PBS en placas de 24 pocilios (Sigma-Aldrich; CLS3527) utilizando un punzón de biopsia para obtener el tamaño de los DCD, y se colocó un DCD en cada uno de estos moldes. Tras ello, se cultivaron 30.000 células de cada tipo por DCD (n = 7 para cada tipo de célula) para generar DCD recelulahzados (RCD), que pasaron a denominarse RCD- ADSC, RCD-BMSC, RCD-DPSC, RCD-WSC y RCD-HEC, según el tipo celular utilizado para la recelularización. Los RCD se incubaron a 37°C con un 5% CO2 durante 2-3 h para permitir la adhesión celular. Luego, se agregó 1 mL de cada medio específico a cada pocilio y los RCD se incubaron durante 24 h. Se utilizó un DCD no recelularizado como control negativo. Todas estas muestras se cultivaron hasta los 15-21 días (t1) y 30-35 días (t2), cambiando el medio dos veces por semana.
Evaluación in vivo
Para el análisis in vivo, se injertaron 3 DCD y 3 RCD de cada tipo celular (RCD in vivo) (n = 18) en animales de laboratorio. Cada muestra se cortó por la mitad antes de la cirugía y se injertó en seis ratones Foxnlnu desnudos atímicos inmunodeficientes machos de 6 semanas de edad (n = 6 muestras por ratón). Brevemente, los animales se anestesiaron profundamente con ketamina y acepromazina y los diferentes sustitutos de cartílago se injertaron subcutáneamente en la zona dorsal de cada animal. Cada ratón se injertó con una muestra de cada tipo (DCD in vivo, ADSC in vivo, BMSC in vivo, DPSC in vivo, WSC in vivo y HEC in vivo). Después de 12, 30 o 60 días, los animales fueron sacrificados y los diferentes implantes fueron recolectados para análisis histológico.
Análisis histológico
Todas las muestras (NCTR, DCD, RCD in vitro, DCD in vivo y RCD in vivo) se fijaron en formaldehído al 4% durante 24 horas a TA y en agitación para análisis histológico. Luego, las muestras se deshidrataron mediante una serie de alcoholes (70-100%) y xilol y se embebieron en parafina. Las muestras se seccionaron a 5 pm de espesor utilizando un micrótomo, se rehidrataron y tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) para evaluar la estructura general de las diferentes muestras de cartílago. Para detectar la presencia de núcleos celulares, las muestras se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories). Para evaluar la presencia de fibras de colágeno, las muestras se tiñeron con rojo picrosiñus (P). La histoquímica de azul alcián (AB) [Alfonso-Rodríguez C-A et al. PLOS ONE. 2014;9(11):e112457] y azul de toluidina (TB) se utilizó para identificar los proteoglicanos del cartílago. Después de la tinción, se obtuvieron imágenes de microscopía óptica utilizando un microscopio Eclipse 90¡ (Nikon) con un aumento de 100x. Las imágenes se procesaron más con ImageJ para cuantificar la señal de tinción para TB, AB y P.
Análisis estadístico
Para cada grupo de muestras específico y global, se calcularon las medias ± desviación estándar. Además, cuando se consideraron varios tiempos de estudio (dos tiempos in vitro y tres tiempos in vivo), se calcularon las medias ± desviación estándar para el grupo global de muestras correspondientes al mismo tipo de tejido en diferentes períodos de tiempo (por ejemplo, muestras ADSCinvitro correspondiente a t1 y t2). El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS Statistics 23 (IBM). Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para determinar la normalidad de cada distribución y la prueba de Mann-Whitney se utilizó para detectar diferencias específicas entre dos grupos. P<0,0001 definió diferencias estadísticamente significativas, ajustadas por la corrección del valor de p de Bonferroni ya que en este estudio se realizaron más de 300 comparaciones simultáneamente.
RESULTADOS
Descelularización del cartílago
La eficiencia de la descelularización se evaluó mediante la cuantificación del ADN residual en los tejidos descelulañzados y con H-E y DAPI. El contenido de ADN obtenido para la DCD fue de 19,92 ± 5,79 ng / mg de tejido, lo que concuerda con los requisitos de los tejidos descelulañzados [Crapo PM. Biomateñals. 2011 ;32(12):3233-43], H-E y DAPI mostraron que el proceso fue capaz de eliminar todos los núcleos del tejido en comparación con NCTR (Fig. 1A y 1C), confirmando así el resultado de cuantificación y mostrando que el proceso de descelularización se llevó a cabo con éxito. Además, H-E reveló que el cartílago conserva su estructura general después de la descelularización. El análisis de la composición de ECM en DCD reveló que TB y AB permanecieron estables después de la descelularización, aunque P mostró una disminución significativa de la tinción en DCD (p<0,0001) (Fig. 1A-B, 2, 3A-C).
Análisis histológico de muestras de DCD recelularizadas mantenidas in vitro Se analizaron histoquímicamente RCD in vitro para determinar si las células eran capaces de adherirse al cartílago descelularizado en t1 y t2. H-E y DAPI mostraron que en todas las muestras de RCD in vitro las células estaban adheridas a la superficie y tendían a crecer y formar una capa delgada irregular. RCD in vitro con ADSC (ADSCinvitro) fue el que presentó mayor número de células en t1 y RCD in vitro con DPSC (DPSCinvitro) en t2, mientras que RCD in vitro con BMSC (BMSCinvitro) fue el que menos células tuvo en superficie en t1 y RCD in vitro con HEC (HECinvitro) en t2 (Fig. 1A y 1C).
Se analizaron las posibles variaciones en RCD in vitro ECM utilizando tinciones TB, AB y P. TB mostró que NCTR no presentó diferencias significativas en el contenido de proteoglicanos al compararlo con el resto de los grupos globales (ADSCinvitro, BMSCinvitro, DPSCinvitro, WSCinvitro y HECinvitro) (Tabla 1). Sin embargo, se observó que existían algunas diferencias si se comparaba con cada grupo específico (Fig. 1 B). DPSCinvitro-t2 mostró la mayor reducción en la cantidad de proteoglicanos en comparación con NCTR (p<0,0001) (Fig. 3A). También se realizó una comparación global para DCD, revelando que hubo una disminución significativa en ADSCinvitro, DPSCinvitro, WSCinvitro y HECinvitro (Tabla 1). En este caso, DPSCinvitro-t2 también tuvo el contenido más bajo en proteoglicanos (Fig. 3A).
También se midieron las variaciones en la composición de proteoglicanos con AB. En general, no se encontraron diferencias estadísticas cuando se compararon los grupos globales con NCTR o DCD (Tabla 1). Sin embargo, algunos grupos específicos fueron estadísticamente diferentes a los controles, con WSCinvitro-t2 mostrando la mayor reducción significativa de estas moléculas y HECinvitro-t1 el mayor aumento (p<0,0001) (Fig. 2A y 3B).
La cuantificación de las fibras de colágeno mediante tinción P reveló que los grupos globales WSCinvitro y HECinvitro tenían significativamente menos tinción de colágeno que NCTR (p<0,0001) (Tabla 1). Sin embargo, la comparación con grupos específicos mostró que BMSCinvitro-t2 fue el que presentó menor señal P (p<0,0001). Por otro lado, se observó que los grupos globales ADSCinvitro, WSCinvitro y HECinvitro tenían un contenido de colágeno significativamente mayor que el DCD (p<0,0001) (Cuadro 1). Específicamente, HECinvitro-t2 mostró el mayor aumento en la intensidad del colágeno (Fig. 2B y 3C).
Finalmente, también se realizó una comparación entre los tiempos dentro de cada grupo. En general, la cantidad de proteoglicanos determinada por TB tendió a caer entre t1 y t2 excepto para ADSCinvitro en el que hubo un aumento. Para HECinvitro, el contenido de estas moléculas no se alteró con el tiempo (Fig. 1 B). Para la tinción AB, todos los resultados también tendieron a disminuir, excepto para DPSCinvitro, que mostró un aumento de proteoglicanos (Fig. 2A). No se observaron diferencias significativas en el contenido de colágeno presente en ADSinvitro, WSCinvitro y HECinvitro entre t1 y t2, pero hubo una disminución en el caso de BMSCinvitro y DPSCinvitro (Fig. 2B) (p<0,0001).
Análisis histológico de muestras de DCD recelularízadas injertadas ¡n vivo
Después de 12, 30 y 60 días in vivo, se evaluó la biocompatibilidad, integración y alteraciones estructurales en DCD in vivo y RCD in vivo. Ninguno de los animales presentó signos de necrosis o inflamación. H-E reveló que ninguno de los constructos presentaba alteraciones histológicas (oncogénesis, inflamación, hemorragia, fibrosis, etc.). Además, no hubo infiltración de las células huésped en las construcciones. En cambio, los tejidos tendían a ser encapsulados por tejido conectivo del hospedador. No se observó vascularización del tejido (fig. 4, 5 y 6).
Para todas las construcciones in vivo, también se realizó un análisis de alteración de ECM en grupos globales y específicos. TB determinó que solo el grupo global BMSC in vivo tuvo una disminución significativa en el contenido de proteogl ¡canos en comparación con NCTR (p<0,0001) (Tabla 1). Para grupos específicos, observamos que DCD in vivo-12d fue el grupo con el mayor aumento de proteoglicanos, mientras que BMSC in vivo-Q0d mostró la mayor disminución. Los grupos globales BMSC in vivo, WSC in vivo y HEC in vivo exhibieron una reducción significativa con respecto a DCD (Tabla 1). Específicamente, DCD in vivo-12d y BMSC in vivo-Q0d también mostraron el mayor incremento y reducción de proteoglicanos (Fig. 3D, 4A y 5A).
Los resultados correspondientes a la tinción AB revelaron que no existían diferencias entre NCTR y DCD con el resto de grupos en general. DCD in v/vo-12d fue el que mostró una mayor disminución en la intensidad de AB en comparación con NCTR y DCD, mientras que BMSC in v/vo-12d mostró el mayor aumento de proteoglicanos en comparación con NCTR (p<0,0001) (Fig. 3E, 4A y 5A).
Se encontraron resultados similares en la tinción de colágeno entre NCTR y grupos globales, sin diferencias estadísticamente significativas (Tabla 1). Sin embargo, hubo un incremento en el contenido de colágeno en los grupos globales DPSC in vivo, WSC in vivo y HEC in vivo en comparación con DCD (p<0,0001) (Tabla 1). Para grupos específicos, ADSC in v/vo-12d mostró una mayor reducción en el contenido de colágeno en comparación con NCTR (p<0,0001). ADSC in v/vo-12d y HEC in vivo-Q0d fueron los que presentaron una elevación y una disminución de la señal P en comparación con DCD, respectivamente (p<0,0001) (Fig. 3F, 4B y 6B). Una comparación del curso temporal de las muestras in vivo mostró algunas diferencias entre los grupos. En general, se encontró un aumento significativo en el contenido de colágeno según lo determinado por P entre las muestras de 12 y 60 días (p<0,0001), pero esta tendencia no fue clara para los proteoglicanos (Fig. 4-6).
Figure imgf000022_0001
Tabla 1. Análisis de componentes de la matriz extracelular determinados mediante tinción con azul de toluidina (TB), azul alcián (AB) y rojo picrosirius (P) en cada grupo global de muestras.
Los valores corresponden a medias ± desviaciones estándar, a: las diferencias con NCTR son estadísticamente significativas, b: las diferencias con DCD son estadísticamente significativas.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Tejido artificial que comprende: a) Cartílago de organismos del orden Acipenseriformes, y b) al menos una célula.
2.- El tejido artificial según la reivindicación anterior, donde el organismo pertenece a la familia Acipenseridae.
3.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el organismo pertenece al género Acipenser.
4.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el organismo pertenece al género Acipenser y a la especie Acipenser naccarii.
5.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la célula es una célula madre que se selecciona de entre: células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias no humanas, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas o combinaciones de las mismas.
6.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la célula madre es una célula madre mesenquimal.
7.- El tejido artificial según la reivindicación 6, donde la célula madre mesenquimal se obtiene a partir de médula ósea, tejido adiposo, hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical, pulmón, pulpa dental y sangre periférica.
8.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso como medicamento.
9.- El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.
10.- El tejido artificial según la reivindicación 9, donde el tejido o un órgano enfermo o dañado se selecciona de la lista que consiste en: cartílago que se encuentra en las superficies articulares (cartílago articular), la oreja, la nariz y/o la tráquea, bronquios, epiglotis, costillas, sínfisis del pubis, disco intervertebral, meniscos, o cualquiera de sus combinaciones.
PCT/ES2021/070739 2020-10-09 2021-10-11 Nuevo biomaterial para ingeniería tisular WO2022074281A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP202031030 2020-10-09
ES202031030A ES2905713A1 (es) 2020-10-09 2020-10-09 Nuevo biomaterial para ingenieria tisular

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022074281A1 true WO2022074281A1 (es) 2022-04-14

Family

ID=81126475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2021/070739 WO2022074281A1 (es) 2020-10-09 2021-10-11 Nuevo biomaterial para ingeniería tisular

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2905713A1 (es)
WO (1) WO2022074281A1 (es)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2212310T3 (es) * 1997-07-02 2004-07-16 Abbott Laboratories Procedimiento y producto en los cuales se utiliza la notocorda de esturion para aliviar los sintomas de artritis.
TW201904591A (zh) * 2017-06-29 2019-02-01 鄧文炳 鱘龍魚軟骨萃取物的製備方法及其延緩老化之用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2212310T3 (es) * 1997-07-02 2004-07-16 Abbott Laboratories Procedimiento y producto en los cuales se utiliza la notocorda de esturion para aliviar los sintomas de artritis.
TW201904591A (zh) * 2017-06-29 2019-02-01 鄧文炳 鱘龍魚軟骨萃取物的製備方法及其延緩老化之用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EHAB KHEIR ET AL.: "Development and characterization of an acellular porcine cartilage bone matrix for use in tissue engineering", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH PART A, vol. 99, no. 2, 19 November 2011 (2011-11-19), pages 283 - 294, XP055217527, ISSN: 1549-3296, DOI: 10.1002/jbm.a.33171 *
SUTHERLAND AMANDA J., CONVERSE GABRIEL L., HOPKINS RICHARD A., DETAMORE MICHAEL S.: "The Bioactivity of Cartilage Extracellular Matrix in Articular Cartilage Regeneration", ADVANCED HEALTHCARE MATERIALS, vol. 4, 7 January 2015 (2015-01-07), pages 1 - 25, XP055931880, ISSN: 2192-2659, DOI: 10.1002/adhm.20140016 5 *
ZHANG XI ET AL.: "Biochemical characterisation and assessment of fibril-forming ability of collagens extracted from Bester sturgeon Huso huso x Acipenser ruthenus", FOOD CHEMISTRY, vol. 160, 24 March 2014 (2014-03-24), pages 305 - 312, XP028660372, ISSN: 0308-8146, DOI: 10.1016/j.foodchem. 2014.03.07 5 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2905713A1 (es) 2022-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chang et al. Human acellular cartilage matrix powders as a biological scaffold for cartilage tissue engineering with synovium‐derived mesenchymal stem cells
Gimble et al. Differentiation potential of adipose derived adult stem (ADAS) cells
Malladi et al. Effect of reduced oxygen tension on chondrogenesis and osteogenesis in adipose-derived mesenchymal cells
Hwang et al. Regulation of osteogenic and chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells in PEG-ECM hydrogels
Díaz-Prado et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells for regenerative medicine
Ferraro et al. Human adipose CD34+ CD90+ stem cells and collagen scaffold constructs grafted in vivo fabricate loose connective and adipose tissues
US9381273B2 (en) Scaffolds with oxygen carriers, and their use in tissue regeneration
Barry Biology and clinical applications of mesenchymal stem cells
US20200179567A1 (en) Regionally specific tissue-derived extracellular matrix
Jin et al. Transplantation of human placenta-derived mesenchymal stem cells in a silk fibroin/hydroxyapatite scaffold improves bone repair in rabbits
US20060134781A1 (en) Three-dimensional cell culture system
JP2015109834A (ja) 脂肪由来の幹細胞および格子
WO2011041240A1 (en) Tissue transplant compositions and methods for use
Farrell et al. A comparison of the osteogenic potential of adult rat mesenchymal stem cells cultured in 2-D and on 3-D collagen glycosaminoglycan scaffolds.
JP2015535424A (ja) ヒト線維芽細胞の分化
Lee et al. Comparison of isolation, expansion and cryopreservation techniques to produce stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) with better regenerative potential
KR101799653B1 (ko) 세포배양을 위한 부착기질 및 이의 제조방법
JP2022501118A (ja) 脂肪由来幹細胞およびゼラチンを含む生体材料ならびにその製造方法
JP5964956B2 (ja) 胎児の組織からの親細胞バンクの調製
WO2020060520A2 (en) Isolated septal cartilage exosome used for generating cartilage tissue
WO2022074281A1 (es) Nuevo biomaterial para ingeniería tisular
KR20180085698A (ko) BMP2 및 TGFβ3 발현 미니서클벡터를 이용하여 분화 유도된 연골세포
Castro-Piedra et al. Aislamiento de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo del pliegue inguinal murino: un protocolo para obtener lo mejor de pequeñas muestras
Debnath et al. Comparative analysis of chondrogenesis from cartilage tissue and alginate encapsulated human adipose stem cells
Ha Biomimetic scaffolds for stem cell-based tissue engineering

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21877056

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21877056

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1