ES2212310T3 - Procedimiento y producto en los cuales se utiliza la notocorda de esturion para aliviar los sintomas de artritis. - Google Patents
Procedimiento y producto en los cuales se utiliza la notocorda de esturion para aliviar los sintomas de artritis.Info
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Abstract
La invención se refiere a una composición que incluye notocordes y extractos de éste en cantidades terapéuticas. La invención se refiere específicamente además a un procedimiento para tratar la artritis en mamíferos, y más particularmente la artritis reumatoide en humanos mediante la administración enteral de extractos de notocorde o mezclas de estos. En una realización preferente, el colágeno obtenido de los esturiones se administra por via enteral a un paciente humano a razón de 1,0 microgramos a 1,5 g por día.
Description
Procedimiento y producto en los cuales se utiliza
la notocorda de esturión para aliviar los síntomas de artritis.
La presente invención se refiere al uso de
notocorda para la fabricación de un medicamento para tratar los
síntomas de artritis en mamíferos y, más en concreto, por
administración entérica. La invención utiliza preferiblemente
notocorda de esturión colágeno derivado de notocorda de esturión, o
sus mezclas para suprimir las manifestaciones clínicas de la
artritis. La invención también se refiere a composiciones entéricas
que contienen notocorda y sus componentes estructurales para
suprimir y/o tratar artritis en mamíferos.
La artritis, y en particular la artritis
reumatoide (AR), es una enfermedad dolorosa y a menudo invalidante
que da lugar inicialmente a hinchazón e inflamación de las
articulaciones, pero a menudo progresa hasta deformar o destruir
completamente las articulaciones. Éste es un resultado de que el
cuerpo ataca por error a su propio cartílago. El cartílago es un
tipo especializado de tejido conectivo que se halla en humanos
adultos en tres formas: cartílago hialino o brillante; cartílago
elástico; y fibrocartílago. El cartílago hialino es el tipo que se
encuentra en los extremos de nervios ventrales, en articulaciones, y
en las paredes de los pasos respiratorios más grandes. El cartílago
hialino es el que proporciona una baja superficie de rozamiento para
evitar que el hueso roce en hueso durante el movimiento. A medida
que progresa la artritis, el cartílago se daña y el hueso también
puede empezar a erosionarse. Esto da lugar a dolor intenso y a la
destrucción última de la articulación propiamente dicha.
La artritis es un grupo de enfermedades que
afectan a las articulaciones y los tejidos componentes. Se conocen
varios tipos de artritis, y estos se pueden dividir en varios grupos
por sus manifestaciones patológicas o de curso clínico. La forma más
común de artritis es la Osteoartritis (OA). La osteoartritis se
produce principalmente por daño mecánico de las articulaciones, por
el uso repetitivo de articulaciones particulares como sucede en
atletas y trabajadores físicos, o por sobrecarga de articulaciones
estructurales, como sucede en las articulaciones de la rodilla de
individuos obesos.
La segunda forma más común de la enfermedad es
AR, que es una enfermedad multisistema crónica de etiología
desconocida. AR se caracteriza por inflamación crónica del sinovio
asociada con erosión considerable del cartílago y hueso, en
particular en y alrededor de las articulaciones. La AR se considera
actualmente una enfermedad autoinmune en la que el proceso
patológico parece iniciarse por la presentación de un autoantígeno
"reumatoide" desconocido por una célula presentadora de
antígeno. Estudios referentes a la historia familiar indican una
predisposición genética donde una secuencia particular de
aminoácidos en la tercera región hipervariable de la molécula
HLA-DR es un elemento genético importante que
transporta la susceptibilidad a AR. Véase Lipsky PE, "Rheumatoid
Arthritis" en Harrisons' Principles of Internal Medicine,
13ª ed. Mcgraw Hill, Inc., New York, NY.
El receptor de células T en células T CD4^{+},
que forman el blanco del antígeno, también desempeña un papel
importante en el proceso inflamatorio. La presentación del antígeno
produce la activación de células T CD4^{+}, con la consiguiente
secreción de citoquinas como interleuquina-2
(IL-2) e interferón-g
(IFN-g). Estas citoquinas inducen expansión clonal
de las células T y activación de la red de citoquina. Estas
citoquinas disparan la producción de moléculas de adhesión
endotelial (tal como ICAM-1) cuya expresión en
sinovio reumatoide mejora la activación de células inflamatorias en
las articulaciones. Véase Vitali C, Sciuto M, Bombardieri S,
"Immunotherapy in Rheumatoid Arthritis: A Review", Int J Art
Organs 1993: 16; 196-200.
La terapia moderna de las patologías artríticas
comienza con medicamentos antiinflamatorios no esteroidales tal como
aspirina, ácido antranílico e ibuprofeno; y las terapias más
agresivas implican medicamentos antirreumáticos modificadores de
enfermedad, tal como D-penicilamina, metotrexato y
sulfasalazina. Sin embargo, estos tratamientos a menudo son de
eficacia y tolerabilidad deficientes, produciendo una amplia gama de
serios efectos colaterales. La forma más severa de la enfermedad
puede requerir incluso cirugía.
Las nuevas terapias para tratar la artritis
incluyen modificadores de la respuesta inmune, terapia génica,
inhibidores enzimáticos, anticuerpos monoclonales y terapia
dietética. La terapia dietética para artritis ha recibido gran
cantidad de publicidad a lo largo de los años. Aunque, en la
actualidad, la base científica de los remedios dietéticos todavía
está en duda, hay razones válidas para considerar si una gestión
dietética puede modificar con éxito la actividad de la enfermedad a
medida que conocemos mejor su etiología y patología. La
"tolerancia oral" es un método conocido desde hace mucho tiempo
para inducir respuesta inmune periférica. Primero la describió Wells
en 1911 como un estado en el que se evita la analifaxis sistémica en
cobayos por previa alimentación de proteínas de huevo de gallina.
Véase Wells H, "Studies on the Chemistry of Anaphylaxis III.
Experiments with Isolated Proteins, Especially Those of Hen's
Eggs", J Infect Dis 1911:9:147-151.
Se considera, en concreto, que la tolerancia oral
es un candidato ideal a considerar como un tratamiento de AR a causa
de la etiología de la AR como una enfermedad autoinmune. Los
autoantígenos de administración oral han mostrado actividad en
varios modelos autoinmunes experimentales incluyendo
encefalomielitis autoinmune experimental, uveitis, miastenia,
diabetes, y artritis inducida por colágeno y adyuvante. Véase Weiner
HL, Friedman A, Miller A, Khoury SJ, Al-Sabbagh A,
Santos L, Sayegh M, Nussenblatt RB, Trentham DE, Hafler DA,
"Oral Tolerance: Immunologic Mechanisms and Treatment of
Animal and Human Organ-Specific Autoimmune Diseases
by Oral Administration of Autoantigens", Annu Rev lmmunol
1994; 12:809-837.
El mecanismo de cómo opera la tolerancia oral no
es claro, por el momento. Se considera que los mecanismos primarios
por los que un antígeno administrado oralmente induce tolerancia,
son mediante la generación de supresión activa o anergia clonal.
La artritis inducida por colágeno (AIC) en
animales experimentales es el modelo animal mejor conocido para AR
humana. Véase Durie FH, Fava RA, Noelle RJ,
"Collagen-Induced Arthritis as a Model of
Rheumatoid Arthritis", Véase Clin Immu and Immupath 1994;
73:11-18 y Staines, NA., Wooley, PH., "Collagen
Arthritis - What Can Teach Us?" Brit J Rheum
1994;33:798-807. Primero la describió Trentham en
1977, véase Trentham DE, Townes AS, Kang AH, "Autoimmunity to Type
II Collagen: An Experimental Model of Arthritis", J Exp
Med 1977;146:857-868, y se ha demostrado que se
asemeja suficientemente a la AR humana para ser reconocida ahora
como una herramienta experimental importante. Es inducida
generalmente en cepas susceptibles de animales experimentales (tal
como ratones y ratas) por inmunización con colágeno heterólogo tipo
II (CII) aislado de una especie heteróloga. Véase Courtenay JS,
Dallman MJ, Dayyan AD, Martin A, Mosedale B, "Immunization Against
Heterologous Type II Collagen Induced Arthritis in Mice",
Nature 1980;283-665. En una cepa susceptible
de ratones (DBA/1), la inmunización con CII inicia una respuesta
inmune humoral y celular combinada dirigida a tejidos de
articulación, donde se sitúa predominantemente el antígeno. Las
diferencias entre el modelo animal y la AR humana incluyen:
- (1)
- El modelo es un estado inducido y por lo tanto no se produce espontáneamente, como en humanos;
- (2)
- El modelo carece de muchas manifestaciones extra-articulares de la AR humana incluyendo nódulos subcutáneos y fibrosis pulmonar; y
- (3)
- La inducción de la enfermedad es de inicio rápido en el modelo, lo que difiere de humanos donde tarda típicamente años.
No obstante, la AIC es el mejor modelo animal
disponible para AR humana.
Se ha demostrado que la administración
intragástrica de colágeno Tipo II soluble (CII) antes de la
inmunización con CII suprime la incidencia de AIC en ratones DBN1
Lac J, y ratas WA/KIR. Véase Nagler-Anderson C,
Bober LA, Robinson ME, Siskind GW, Thorbecke GJ, "Suppression of
the Type II Collagen-Induced Arthritis by
Intragastric Administration of Soluble Type II Collagen", Proc
Nat/Acad Sci USA 1986;83:7443-7446 y Thompson
HSG, Harper N, Devan D, Staines NA, "Suppression of CIA by Oral
Administration of Type II Collagen: Changes in Immune and Arthritic
Responses Mediated by Active Peripheral Suppression",
Autoimmunity 1993;16:189-199.
También se ha demostrado que la artritis inducida
por adyuvante en ratas Lewis se suprime por administración oral de
CII soluble. Véase Zhang ZJ, Lee CSY, Lider O, Weiner H,
"Suppression of Adjuvant Arthritis in Lewis Rats by Oral
Administration of Type II Collagen", J Immunol
1990;145:2489-2493. El tipo de inmunógeno así como
el tipo de tolerágeno parecen ser muy importantes al ejercer su
efecto en inducir y proteger al animal.
El cartílago es producido por células llamadas
condrocitos que sintetizan y depositan alrededor de ellas una matriz
de macromoléculas que se conocen como colágeno y proteoglicanos. Una
función destacable del tejido de cartílago es que se rellena en
respuesta a fuerzas mecánicas ejercidas en él.
Se ha identificado varios tipos de colágeno que
proporcionan el carácter conectivo resistente del cartílago. Los
proteoglicanos constan principalmente de las moléculas de peso
molecular alto denominadas glicosaminoglicanos (GAG) que incluyen
ácido hialurónico y sulfato de condroitina. Los GAGs se conocían
previamente como mucopolisacáridos. Paroli, y otros, "A
Pharmacological Approach to Glicosaminoglicanos", Drugs Expth.
Clin. Res. VII (1) 9-20 (1991) presentan una
visión general de los GAGs y su aplicación en terapia OA.
Una revisión de los varios tipos de colágeno se
puede hallar en Protein Profile, Vol. 1, 1994, páginas
550-571; P. Sheterline, Ed. Holmdahl y otros, en un
artículo titulado "Autoimmune Recognition of Cartilage
Colagens", Annals of Medicine 25:251-264,
1993, exponen una revisión de la capacidad del sistema inmune para
discriminar entre auto y no auto-estructuras y una
explicación de cómo interactúa normalmente el sistema inmune con el
cartílago y cómo tales interacciones pueden conducir a artritis. El
colágeno Tipo II puede ser el tolerágeno oral mejor conocido para
artritis; sin embargo, puede haber otros tolerágenos potenciales
derivados de tejidos no cartilaginosos, tal como humor vítreo, tubos
neurales y retina neural.
La Patente de Estados Unidos 5.529.786 concedida
a Moore describe el uso de tejido animal conteniendo una cantidad
terapéutica de CII para el tratamiento de AR en humanos. Esta
patente describe el tejido animal como preferiblemente cartílago de
pollo obtenido de pollos de menos de aproximadamente un año de edad.
Otros tejidos animales descritos son cartílago bovino, el humor
vítreo de los ojos y otros varios animales.
La Patente de Estados Unidos 4.473.551 concedida
a Schinitsky describe una composición para el tratamiento de
patologías inflamatorias (tal como AR, OA, acné, psoriasis y
análogos) que incluye cartílago animal y glucosamina. Esta patente
describe el efecto sinérgico de una glucosamina y cartílagos de
cualquier fuente derivada,
incluyendo tiburón y otro animales marinos, ganado, cerdos, pollos y análogos.
incluyendo tiburón y otro animales marinos, ganado, cerdos, pollos y análogos.
La Patente de Estados Unidos 5.075.112 concedida
a Lane describe el uso de cartílago de tiburón finamente dividido
para inhibir el crecimiento de tumores, artritis, en particular AR,
y enfermedades inflamatorias con un componente vascular. Esta
patente no sugiere ni equipara el cartílago de tiburón con ningún
otro cartílago de mamífero o ave.
La Patente de Estados Unidos nº 5.399.347
concedida a Trentham y otros describe el uso de un componente de
cartílago altamente purificado, proteína entera de CII, para el
tratamiento de AR.
EP0254289 B1 de Koepff y otros describe el
tratamiento de artritis mediante la administración de colágeno
enzimáticamente hidrolizado de pieles de animales, huesos de
animales, tejido conectivo refinado o gelatina (colágeno Tipo I) que
tiene un peso molecular medio de 10 a 80 KD.
La artritis afecta a una población estimada de
40.000.000 (15% de la población) en los Estados Unidos. Con un
tiempo de supervivencia creciente de la población, la artritis
constituye uno de los mayores problemas médicos, sociales y
económicos existentes. La presente invención mejora los tratamientos
de artritis del estado de la técnica y ofrece varias ventajas con
respecto a las terapias actualmente aceptadas.
Como se explicará y demostrará a continuación, la
notocorda es un tejido único de grupos primitivos de
Osteichthyes, tal como esturión y lamprea. La notocorda aparece en el embrión postgastrulación como un mesodermo muy especializado. En vertebrados, la notocorda sirve como un núcleo alrededor del que se reúnen células mesodérmicas para formar las vértebras (es decir, la notocorda es el precursor de la columna vertebral), pero desaparece al final de la etapa embriónica. Sin embargo, en los cordados más primitivos, la notocorda se considera como un sustituto primitivo de una columna vertebral. El esturión y la lamprea conservan una cantidad considerable de tejido de notocorda en su columna vertebral incluso en la etapa adulta. El mesodermo regular da origen a los tejidos conectivos del cuerpo, tal como cartílago hialino y CII. De hecho, el colágeno de notocorda de esturión puede ser una forma precursora de CII, pero ciertamente no es CII. La notocorda y el cartílago son diferentes uno de otro desde los puntos de vista evolucional, de desarrollo, funcional y anatómico. Estas diferencias de características se demostrarán a continuación. La presente invención se refiere al uso de notocorda intacta y entera de esturión así como sus componentes estructurales y químicos (es decir, colágeno derivado de la notocorda) para el tratamiento de AR y OA.
Osteichthyes, tal como esturión y lamprea. La notocorda aparece en el embrión postgastrulación como un mesodermo muy especializado. En vertebrados, la notocorda sirve como un núcleo alrededor del que se reúnen células mesodérmicas para formar las vértebras (es decir, la notocorda es el precursor de la columna vertebral), pero desaparece al final de la etapa embriónica. Sin embargo, en los cordados más primitivos, la notocorda se considera como un sustituto primitivo de una columna vertebral. El esturión y la lamprea conservan una cantidad considerable de tejido de notocorda en su columna vertebral incluso en la etapa adulta. El mesodermo regular da origen a los tejidos conectivos del cuerpo, tal como cartílago hialino y CII. De hecho, el colágeno de notocorda de esturión puede ser una forma precursora de CII, pero ciertamente no es CII. La notocorda y el cartílago son diferentes uno de otro desde los puntos de vista evolucional, de desarrollo, funcional y anatómico. Estas diferencias de características se demostrarán a continuación. La presente invención se refiere al uso de notocorda intacta y entera de esturión así como sus componentes estructurales y químicos (es decir, colágeno derivado de la notocorda) para el tratamiento de AR y OA.
Se puede hallar corroboración de la posición del
Solicitante de que la notocorda difiere del cartílago en un artículo
de Miller y el titulado "Characterization of Notocorda
Collagen", publicado en Biochemical and Biophysical Research
Communications, Vol. 60, nº 1, 1974 y en un artículo de Matthews
titulado "Comparative Biochemistry of Chondroitin
Sulphate-Proteins of Cartilage and Notocord",
publicado en Biochem J., (1971), 125, 37-46.
Estas publicaciones explican la caracterización de notocorda de
esturión por propiedades cromatográficas, composición de
aminoácidos, contenido de hidratos de carbono, productos de clivaje
de bromuro de cianógeno de la cadena a de componentes, los
parámetros moleculares de hidrosilatos
tríptico-quimotrípticos de sulfato de
condroitina-proteína, y la fracción de sulfato de
condroitina-proteína en un gradiente de densidad de
cloruro de cesio. Estos análisis señalan algunas de las semejanzas
químicas, pero más importante aún, evidencian las distintas
diferencias químicas y estructurales entre cartílago y
notocorda.
La figura 1 es una representación gráfica de los
datos recogidos de las observaciones continuadas del Ejemplo IV.
La invención se refiere en general a la
administración entérica de notocorda y extractos de notocorda para
el tratamiento de artritis, específicamente AR. La fuente preferida
de notocorda es esturión. La notocorda de esturión está fácilmente
disponible, es eficaz y distinta del cartílago de pollo y bovinos.
El esturión se cría actualmente en cautividad por su carne y, en
consecuencia, se puede controlar la calidad (es decir, falta de
contaminantes) de la notocorda. Una ventaja del uso de notocorda de
esturión y los extractos derivados de ella es la facilidad de
combinar el material con componentes nutricionales que también son
eficaces en la supresión de AR. Una ventaja adicional es que la
notocorda intacta de esturión no está sujeta a rigurosa aprobación
normativa, como lo estaría un medicamento.
En el sentido en que se usa aquí y en las
reivindicaciones, el término "extractos de notocorda" significa
los componentes que se pueden extraer de la notocorda usando
técnicas de extracción adecuadas, e incluyen, por ejemplo, colágenos
de notocorda y GAG (incluyendo glucosamina y sulfato de
condroitina).
Se describe una composición para consumo oral por
mamíferos incluyendo al menos un componente seleccionado a partir
del grupo que consta de notocorda, extractos de notocorda y sus
mezclas. La composición puede estar en forma de una tableta, una
píldora, una cápsula, un líquido (es decir, suspensión acuosa u
oleosa), un preparado alimenticio o artículos alimenticios, una
fórmula entérica nutricionalmente completa o en forma de un
complemento nutricional.
Las composiciones de la invención pueden contener
de 10 \mug a 1000 mg de notocorda o extracto de notocorda por
gramo de composición. Cuando la composición tiene forma de un
líquido (es decir, suspensión acuosa o suspensión en aceite), el
componente notocorda puede incluir de 10 \mug a 700 g por litro;
más preferiblemente 10 \mug a 500 g por litro y muy
preferiblemente 50 \mug a 500 mg por litro. En una realización
preferida, la composición líquida contiene colágeno de notocorda a
una concentración de 10 \mug a 10,5 g por litro; 10 g a 20 g de
glucosamina por litro; o 8 g a 16 g de sulfato de condroitina por
litro.
En otra realización, la composición tiene forma
de una tableta, cápsula o píldora que contiene de 1,0 \mug a 2,0 g
de notocorda o un extracto de notocorda. En una realización más
preferida, la píldora o tableta contiene de 50 \mug a 500 mg de la
notocorda y/o extractos de notocorda.
También se describe el uso de notocorda para la
fabricación de un medicamento para tratar o reducir la incidencia de
los síntomas de artritis, específicamente AR en mamíferos,
administrando oralmente, al mamífero, durante un tiempo efectivo
para mitigar tales síntomas.
En el método de la presente invención, la
cantidad de notocorda consumida por día para un humano de 70 kg
puede oscilar de 10 \mug a 700 g por día. Más preferiblemente, la
dosis de notocorda puede oscilar de 10 \mug a 11 g por día y más
preferiblemente de 10 \mug a 1 g por día. El colágeno, como un
extracto de notocorda, se puede administrar a un humano de 70 kg en
una cantidad de 1 \mug a 1,05 g por día. Más preferida es la
administración de 1 \mug a 100 mg de colágeno purificado de
notocorda por día. El rango más preferido de dosis de colágeno
purificado de notocorda es 1 \mug a 10 mg por día. Se administra
típicamente glucosamina purificada de notocorda a un nivel de 1000
mg a 2000 mg por día por humano de 70 kg. La espuma purificada de
sulfato de condroitina de notocorda se administra a un nivel de 800
mg a 1600 mg por día. Los expertos en la técnica apreciarán que la
tasa de administración de la composición conteniendo notocorda
variará según muchos factores y que los niveles de dosificación
óptimos se pueden derivar sin experimentación indebida.
La composición y el método de la presente
invención también son aplicables a animales no humanos, tal como
perros y caballos. Muchos animales domesticados padecen AR y se
beneficiarían del descubrimiento aquí expuesto. Los niveles de
dosificación para humanos de 70 kg expuestos en el párrafo anterior
se pueden convertir a un rango de dosis por kilogramo de peso
corporal, y dicho rango se puede usar para animales. Por ejemplo, la
cantidad de notocorda consumida por día para un perro de 20 kg puede
oscilar de 2,9 \mum a 200 g por día.
También se describe el uso de cantidades
terapéuticas de notocorda extraída de un animal del orden
Osteichthyes o la familia Acipenseridae,
preferiblemente el género Acipenser, y triturada en
condiciones limpias o estériles para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de AR. La notocorda se trata
preferiblemente con un agente esterilizante o mediante un proceso de
esterilización antes del almacenamiento y la ingestión. La
administración oral de la notocorda o un componente de la misma se
puede realizar con otros componentes comestibles, tal como en un
complemento nutricional, un preparado alimenticio o en una fórmula
nutricionalmente completa.
Las tres especies principales de esturión criadas
actualmente en la industria de la cría acuática son esturión blanco
(Acipenser transmontanus), esturión italiano (Acipenser
naccarii) y esturión siberiano (Acipenser baeri). El
esturión es un pez cartilaginoso de la familia Acipenseridae,
que no tiene huesos duros. El esturión está ampliamente extendido en
la zona templada norte del planeta.
El esturión es una de las criaturas más antiguas
de la tierra, que no ha cambiado en los últimos 300 millones de
años. El esturión blanco, el pez de agua dulce más grande de
Norteamérica, puede alcanzar hasta 906 kg (2.000 libras). El
esturión, buscado en otro tiempo para la producción de caviar, se ha
apreciado recientemente por la calidad de su carne. El esturión
blanco se cría ahora en granjas, interiores, en aguas recicladas de
pozos y se puede adquirir de numerosas fuentes comerciales (por
ejemplo, Stolt Sea Farm California, L.L.C., Elverta, California,
bajo la denominación comercial de Belusa® White Sturgeon).
Aunque la notocorda de esturión se describe aquí
preferiblemente para el tratamiento/reducción de artritis, se
contempla que también sería útil la notocorda de otros cordados. Los
cordados son animales de phylum chordata y tienen, al menos
en alguna etapa de su desarrollo, una notocorda, un sistema nervioso
central situado dorsalmente, y branquias.
Los inventores han demostrado que la notocorda de
esturión y sus extractos descritos en esta invención son efectivos
al tratar experimentalmente artritis inducida en ratones. Como se ha
explicado anteriormente, los modelos de artritis en ratones y ratas
se aceptan en la comunidad médica como altamente predictivos de la
eficacia en humanos.
La heterogenicidad química de la notocorda de
esturión con respecto a otros tejidos conteniendo colágeno, tal como
cartílago de esturión, cartílago de pollo y cartílago bovino, se
basa en las variaciones de hidroxilación, constituyentes
aminoácidos, configuraciones de glicosilación, entrecruzamiento,
conformación y análogos. Los experimentos siguientes (Experimentos
1.1 a 1.4) se realizaron con el fin de comparar la notocorda de
esturión, el cartílago de esternón de pollo y el colágeno purificado
de cada uno en lo que respecta al perfil de aminoácidos, digestión
de
fluidos gástricos simulados, digestión de tripsina y liberación de hexosamina.
fluidos gástricos simulados, digestión de tripsina y liberación de hexosamina.
Experimento
1.1
En este Experimento, la composición de
aminoácidos de notocorda de esturión se comparó con la composición
de aminoácidos de cartílago de esternón de pollo. Las muestras de la
notocorda de esturión se obtuvieron de Stolt Sea Farm California,
L.L.C., de Elverta, CA, y el cartílago de pollo se obtuvo de Tyson
Farms, Inc., de Springdale, Arkansas.
Se congeló con nitrógeno líquido y pulverizó un
peso igual de cada muestra. Las muestras se hidrolizaron a
aminoácidos en 22 horas a 110ºC en 6 M HCI. Los aminoácidos se
separaron por cromatografía de intercambio iónico, derivaron con
ninhidrina y determinaron con un colorímetro. El perfil de
aminoácidos se determinó, usando un analizador de aminoácidos
Beckman modelo 6300. Los resultados de este análisis se exponen en
la Tabla 3 como residuos por 100.
Se puede ver por la Tabla 3 que el contenido de
proteína en base en peso en seco es aproximadamente el mismo para
cada muestra, pero las frecuencias de serina, fenilalanina, lisina,
4-hidroxiprolina (H Pro), y
5-hidroxilisina (HLys) son más notablemente
diferentes.
Además, la composición de aminoácidos del
colágeno aislado de notocorda de esturión y CII bovino (colágeno
bovino tipo II de Sigma) se comparó con la composición de
aminoácidos de CII de pollo (colágeno tipo II de pollo de Sigma). El
colágeno de notocorda de esturión se aisló como se describe en el
Ejemplo V siguiente. Los resultados de este análisis se exponen en
la Tabla 4 como residuos por 100.
La Tabla 4 resume la composición de aminoácidos
de CII de pollo, CII bovino y colágeno de notocorda de esturión
purificados. Los perfiles de aminoácido de CII de pollo purificado y
CII bovino purificado son similares; sin embargo, hay diferencias
sustanciales entre CII de pollo purificado y colágeno de notocorda
de esturión purificado (es decir, serina, isoleucina y leucina).
La Tabla 5 también ilustra diferencias
significativas entre los dos tejidos (notocord de esturión y
cartílago de pollo) y los tres colágenos purificados (CII de pollo,
CII bovino, y colágeno de notocorda de esturión).
Los expertos en química de colágeno apreciarán
rápidamente la importancia de HPro (para obtener lugares para
entrecruzamiento dentro del colágeno) y HLys (para obtener lugares
de unión para glicanos, glicosaminas y análogos que impactarán
probablemente en la toleragenoicidad) y sus niveles relativos
(puesto que esta relación es un determinante importante de los tipos
de colágeno). Así, las diferencias de los niveles de dichos
aminoácidos son significativas. Además, la relación de HLys a HPro
en colágeno de tipo I de bacalao y colágeno tipo III bovino es 0,11
y 0,07, respectivamente (datos no mostrados).
Además, las diferencias absolutas acumulativas en
puntos porcentuales entre los colágenos son mayores entre CII de
pollo y colágeno de notocorda de esturión (263 puntos porcentuales)
que entre CII de pollo y CII bovino (126 puntos porcentuales). Esto
significa que el CII bovino está más próximo al CII de pollo en
composición química que el colágeno de notocorda de esturión al CII
de pollo. Igualmente, la diferencia en la composición de aminoácidos
entre cartílago de pollo y notocorda de esturión era 228 puntos
porcentuales, indicando que contienen colágeno muy diferente uno de
otro. Estas conclusiones implican que la notocorda de esturión y el
colágeno que contiene son claramente diferentes del cartílago de
pollo y del colágeno tipo II ("CII") en general.
Como se ha observado anteriormente, estas
diferencias suscitan una duda considerable de si la notocorda de
esturión funcionaría de la misma manera que el cartílago de pollo o
CII de pollo en un modelo AIC de AR. Los experimentos 1.2 a 1.4
refuerzan las diferencias entre notocorda y otros tejidos.
Experimento
1.2
En este Experimento, se suspendieron preparados
pulverizados de cartílago de pollo y notocorda de esturión en Fluido
Gástrico Simulado USP (United States Pharmacopoeia, 23, 1994, página
2053) e incubaron a 37ºC durante 3 horas. Se filtró una porción de
cada digesta a intervalos especificados y se analizaron los
filtrados en busca de HPro y HLys que se consideran marcadores para
colágeno. Los filtrados también se analizaron por cromatografía de
exclusión de tamaño. Los cromatógrafos de exclusión de tamaño se
generaron en un instrumento Hewlett-Packard Modelo
1090M con Shodex Protein Column KW-803; 8 x 300 mm;
tamaño de partícula 7 \mum; Waters P/N 35946 y una inyección de 20
\mum. Se utilizó una fase móvil de 600 volúmenes de agua, 400
volúmenes de acetonitrilo y 0,8 volúmenes de ácido trifluoroacético
a temperatura ambiente a un caudal de 0,3 ml/minuto durante 60
minutos. La detección se realizó por absorbancia UV a 214 nm.
La Tabla 6 expone la solubilización de colágeno
(medida como concentración de HPro y HLys en función del tiempo) en
el fluido de digestión después de filtración a través de una
membrana de polisulfona de 0,45 \mum.
Comparación de la digestión de fluidos
gástricos simulados
Notocorda de esturión frente a
cartílago de esternón de
pollo
La Tabla 6 demuestra que en fluido gástrico
simulado, la notocorda se solubiliza a una velocidad que excede
considerablemente de la velocidad de solubilización del cartílago de
pollo. Sin quedar vinculado a ninguna teoría concreta, se estima que
la notocorda se solubiliza más fácilmente en virtud de su matriz
menos desarrollada de cadenas de sulfato de condroitina,
proteoglicanos y polipéptidos. Además, estos datos sugieren que la
notocorda podría tener potencialmente una ventaja sobre el cartílago
como un tolerágeno administrado entéricamente, puesto que es
solubilizada más fácilmente por los jugos gástricos. Si la notocorda
se solubiliza más fácilmente puede reducir, teóricamente la dosis
requerida y/o acelerar el impacto terapéutico.
El cromatógrafo de exclusión de tamaño indicó
para digestas de tiempo 0 un máximo a aproximadamente 43 minutos
para cartílago de pollo, esencialmente ausente con notocorda. A 45
minutos de la digestión, las digestas de notocorda y cartílago de
pollo comienzan a divergir sustancialmente. Por ejemplo, hay picos
sustanciales entre aproximadamente 30 minutos y 40 minutos para la
digesta de notocorda que están ausentes o reducidos en gran medida
en la digesta de cartílago de pollo. Muy interesante es un pico a
aproximadamente 43 minutos, donde el pico de notocorda es
aproximadamente un quinto del tamaño del pico de cartílago de pollo.
También aparecen diferencias similares para la digestión a 90 y 180
minutos. Este Experimento demuestra además las diferencias
sustanciales y significativas entre la notocorda de esturión y el
cartílago de pollo.
Experimento
1.3
Se suspendieron preparados pulverizados de
cartílago de pollo y notocorda en solución tampón 0,05M TRIS, pH
7,5, conteniendo tripsina (Tipo XIII de Sigma) a 1 mg/14 mg de
tejido seco, e incubaron a 37ºC durante 4 horas. Se filtró cada
digesta y los filtrados "se aplicaron a péptido" por HPLC de
Fase Inversa usando un Hewlett-Packard Modelo 1090M
con Péptido y Proteína Vydac C18; 4,6 x 250 mm; columna de 5 \mum
de tamaño de partícula (The Separations Group; P/N 218TP54) y dos
fases móviles: la fase móvil A era 0,08% ácido trifluoroacético en
agua y la fase móvil B era 0,08% ácido trifluoroacético en
acetonitrilo. El volumen de inyección de 25 \mul fluyó a 0,8
ml/minuto a 40ºC durante 90 minutos según el gradiente de elución
siguiente. La detección se realizó por absorbancia UV a 214 nm y a
280 nm.
\newpage
Programa de elución de
gradiente
Se evidenció un número considerable de
diferencias cualitativas y cuantitativas entre las digestas de
notocorda y cartílago que indican que la tripsina estaba clivando
los tejidos en posiciones diferentes. Este hecho indica que las
secuencias de aminoácidos son considerablemente diferentes una de
otra en estos tejidos. Más específicamente, a detección de 214 nm y
a aproximadamente 17 minutos, el cartílago de pollo produjo un pico
que era más de dos veces el pico de notocorda de esturión en el
mismo tiempo. A detección de 280 nm, el cartílago produjo un pico a
aproximadamente 50 minutos que era al menos un orden de magnitud
mayor que el pico correspondiente de
notocorda.
notocorda.
Experimento
1.4
En este Experimento se realizaron digestas en
ácido trifluoroacético (TFA) de cartílago de pollo y notocorda de
esturión para evaluar el contenido de galactosamina y glucosamina de
cada tejido. La galactosamina y glucosamina son componentes
monoméricos de síntesis de polímeros GAG. El contenido de hexosamina
puede estar relacionado con un potencial inmunogénico o de
tolerágeno de un tejido.
Se hidrolizaron preparados pulverizados de cada
tejido, y la galactosamina y glucosamina liberadas por cada tejido
se midieron por HPLC como derivados AQC (6
Aminoquinolil-N-Hidroxisuccimidilo
carbamato). La hidrólisis se realizó durante 14 horas a 120ºC en
1,35 M TFA. Las concentraciones de galactosamina y sus equivalentes
de sulfato de condroitina (el sulfato de condroitina es un
copolímero de N-acetil-galactosamina
sulfato y ácido glucurónico), así como las concentraciones de
glucosamina y sus equivalentes de ácido hialurónico (el ácido
hialurónico es un copolímero de N-acetilglicosamina
y ácido glucurónico) se presentan en la Tabla 7. Las hexosaminas
liberadas por hidrólisis TFA se separaron y detectaron por HPLC
usando un Hewlett-Packard Modelo 1090M y un Brownlee
Spher-5 RP-8; 4,6 x 250 nm; columna
de tamaño de partícula de 5 \mum (Alltech P/N 141033) y dos fases
móviles: La fase móvil A era 0,15 M sodio acetato, 0,019 M
trietilamina, 10 mg/l disodio EDTA; pH 5,0; y la fase móvil B era 70
volúmenes A + 30 volúmenes acetonitrilo. El volumen de inyección de
20 \mul fluyó a 0,6 ml/minuto a 40ºC durante 50 minutos según el
gradiente de elución siguiente. La detección se realizó por
absorbancia UV a
248 nm.
248 nm.
Programa de elución de
gradiente
Este experimento es un medio de comparar el
contenido de proteoglicano de cada tejido que es una medida
aproximada de su carácter como un inmunógeno/tolerágeno. Los datos
presentados de la Tabla 7 ilustran claramente la diferencia de los
dos tejidos.
\newpage
Comparación de la liberación de
hexosamina
Notocorda de esturión frente a cartílago de
esternón de
pollo
En conclusión, los datos presentados en los
Experimentos 1.1 a 1.4 evidencian varias diferencias significativas
entre cartílago de pollo y notocorda de esturión: (1) composición de
aminoácidos; (2) péptidos de hidrólisis en base a digestión de
fluidos gástricos simulados; (3) secuencia de aminoácidos en base a
digestión de tripsina; y (4) contenido de proteoglicano. Además, el
colágeno purificado de notocorda de esturión era considerablemente
diferente de CII bovino.
A pesar de la demostración anterior de que la
notocorda de esturión y su colágeno es cualitativa y
cuantitativamente diferente de cartílago de pollo y CII hallados
dentro, los autores de la presente invención consideraron que la
investigación de la eficacia de la notocorda estaba garantizada
puesto que la notocorda de esturión es altamente digestible, de bajo
costo, y se puede adquirir de un ambiente altamente controlado. Los
Ejemplos siguientes comparan la actividad de notocorda de esturión y
colágeno derivado de ella con varios tejidos conteniendo colágeno,
incluyendo cartílago de pollo. Todos los ejemplos siguientes se
realizaron según las directrices actuales para el bienestar de los
animales.
Estos Ejemplos se realizaron para investigar la
efectividad de la notocorda de esturión en la protección de ratones
con artritis inducida por colágeno (AIC). Se obtuvieron ratones
hembra de la cepa DBA/1 Lac J, de aproximadamente
6-8 semanas de edad, de Jackson Laboratories de Bar
Harbor, Maine. Se aclimataron tres grupos de 20 ratones por grupo a
su entorno durante 7 días. Se suministró a todos los animales un
pienso de ratón estándar (Purina Certified Mouse Chow #5015; 11% en
peso de grasa; sin colágeno) y agua para consumo ad
libitum.
Los días -10, -7, -5 y -2 antes de la
inmunización, los ratones se sensibilizaron con una de tres
composiciones de prueba; albúmina sérica bovina (BSA, una proteína
tolerogénicamente inerte en AIC), gelatina de piel de bacalao, o
notocorda de esturión. Albúmina sérica bovina (una proteína derivada
de tejido no conectivo) y gelatina de piel de bacalao (una proteína
derivada de otro tejido conectivo conteniendo colágeno Tipo I de
pescado) sirvieron como controles negativos. La notocorda de
esturión se obtuvo de esturión criado en granja y pulverizó en
nitrógeno líquido. El nivel de cada composición de prueba se
equilibró a una dosis de proteína de 300 \mug en base al contenido
de proteína (incluyendo colágeno). Se disolvieron/suspendieron
artículos de prueba en 0,01 M ácido acético y se administró 0,3 ml
por dosis a cada ratón con una aguja de alimentación con punta de
bola.
El día 0, los ratones se inmunizaron en la base
de la cola con 100 \mug de CII bovino que se emulsionó en
Adyuvante de Freund completo (CFA). El día 7 se administró una
segunda dosis de refuerzo de 100 \mup CII bovino en CFA por la
misma vía. El día 14, se inyectó a los ratones por vía subcutánea
100 \mug de lipopolisacárido (LPS). Este protocolo representa una
inducción suave de AIC.
Se inspeccionó diariamente en los ratones el
inicio de AIC, caracterizado por eritema y edema. Las extremidades
se evaluaron clínicamente y graduaron en una escala de 0 a 3 (0,
ausencia de artritis; 1, hinchazón suave y eritema; 2, hinchazón y
eritema de tarso y tobillo; 3, anquilosis y deformidad ósea). Los
ratones que no desarrollaron artritis se marcaron como negativos
para artritis. Todos los ratones fueron sacrificados por CO_{2} el
día 50.
Los días 20, 28, 40 y 50, el grupo alimentado con
notocorda de esturión tenía de forma consistente menos animales con
AIC que los alimentados con BSA o gelatina de piel de bacalao (Tabla
8). El % inicial calculado en base a los datos del día 50 mostró que
78% y 79% de los ratones alimentados con BSA y gelatina de piel de
bacalao, respectivamente, tenían AIC, mientras que solamente 58% de
los ratones alimentados con notocorda de esturión evidenciaron AIC.
Además, el día medio de inicio de AIC para el grupo alimentado con
notocorda de esturión se retardó 13 días en comparación con los
grupos de control negativo. La puntuación media de la severidad era
más alta para el grupo alimentado con gelatina de piel de bacalao
seguido del grupo alimentado de BSA, y el grupo alimentado con
notocorda de esturión tenía la puntuación de severidad más baja. Los
datos sugieren aquí que la notocorda de esturión es eficaz en el
retardo y la atenuación de AIC en comparación con BSA o gelatina de
piel de bacalao.
Para evaluar la efectividad de notocorda de
esturión en la protección de ratones contra AIC, este experimento se
realizó de forma similar al Ejemplo 2.1 a excepción de que el
protocolo de inmunización se modificó ligeramente. El protocolo
experimental empleado en este experimento representa una inducción
más intensa de AIC en comparación con la del Ejemplo 2.1.
Los ratones eran de la cepa DBA/1 Lac J
suministrados por Jackson Laboratories de Bar Harbor, Maine. Todos
los ratones eran hembras y de aproximadamente 6-8
semanas de edad. Tres grupos de 15-18 ratones por
grupo se aclimataron a su entorno durante 7 días. Se suministró un
pienso de ratón estándar y agua para consumo ad libitum.
Los días -10, -7, -5 y -2 antes de la
inmunización, los ratones se sensibilizaron mediante una de tres
muestras de prueba: 1) vehículo; 2) gelatina de piel de bacalao; y
3) notocorda de esturión. Se utilizó gelatina de piel de bacalao
(colágeno Tipo I) como un control negativo. La notocorda de esturión
se obtuvo de esturión criado en granja y se pulverizó en nitrógeno
líquido como se ha descrito previamente. El nivel de cada
composición de prueba se equilibró a 300 \mug de colágeno por
dosis. Las composiciones de prueba se disolvieron/suspendieron en
0,01 M ácido acético y se administró 0,3 ml a cada ratón con una
aguja de alimentación con punta de bola.
El día 0, los ratones se inmunizaron en la base
de la cola con 100 \mug de CII bovino emulsionado en CFA. El día
14, se extrajo sangre retroorbitalmente de cinco animales de cada
grupo y se analizó el título de anticuerpo de colágeno II antitipo
en el suero con un método ELISA para confirmar que los animales
estaban preparados. El día 21, se inyectó a los ratones por vía
subcutánea 50 \mug de LPS.
El título de anticuerpo CII para los ratones
inmunizados alimentados con vehículo incrementó a 0,89 \pm 0,27 en
comparación con el título medio de anticuerpo CII para ratones no
inmunizados de 0,03. Esto indica que los animales se prepararon por
inmunización CII. Por otra parte, los ratones tolerizados con
notocorda de esturión mostraron una reducción considerable (-76%) en
el título de anticuerpo CII, lo que sugiere que su sistema inmune
estaba desensibilizado en comparación con el grupo alimentado con
vehículo. Estas conclusiones están de acuerdo con los datos de
anticuerpo de Nagler-Anderson y otros,
"Suppression of Type II Collagen-Induced
Arthritis by Intragastric Administration of Soluble Type II
Collagen", Proc. Nat/Acad. Sci. U.S.A.,
1986:83;7443-7446 y las conclusiones clínicas
expuestas en la Tabla 10. Aunque había cierta reducción sobre el
control de vehículo, la reducción observada en el grupo alimentado
con gelatina de piel de bacalao no era significativa.
Se inspeccionó diariamente en los ratones el
inicio de AIC, caracterizada por eritema y edema. Las extremidades
se evaluaron clínicamente y graduaron en una escala de 0 a 6 (0,
ausencia de artritis; 0,5, uno o varios dedos hinchados o solamente
hinchada la pata; 1, toda la pata hinchada; 2, toda la pata hinchada
severamente; 3, suave deformidad después de la disminución de la
inflamación; 4, deformidad severa; 5, anquilosis suave con pérdida
parcial de la función de articulación en la pata; 6, anquilosis
severa con pérdida total de función de articulación en la pata).
Todos los ratones se sacrificaron con CO_{2} el día 35.
La incidencia porcentual de AIC era más alta en
todos los tratamientos en comparación con el Ejemplo 2.1,
confirmando la naturaleza dura del protocolo de inducción AIC
empleado en este Ejemplo. No obstante, el grupo alimentado con
notocorda de esturión tenía puntuaciones de severidad
considerablemente más bajas (P<0,05) que los alimentados con
vehículo o gelatina de piel de bacalao. Estas conclusiones son
consistentes con los resultados del Ejemplo 2.1 que indican que la
notocorda de esturión es eficaz en la atenuación de AIC.
Este experimento se realizó para comparar la
efectividad del cartílago de pollo y la notocorda de esturión en la
protección de ratones contra AIC. Este Experimento se realizó de
manera similar al Ejemplo II. Los grupos de tratamiento eran los
siguientes:
El Grupo 1 sirvió como el control. Se obtuvo
cartílago de pollo (cartílago xifoide en el esternón) de una fuente
comercial y se pulverizó en nitrógeno líquido y usó para el Grupo 2.
Se utilizó notocorda de esturión como se ha descrito anteriormente
para el grupo 3. El nivel de dosis (300 \mug/dosis) se seleccionó
en base a datos previos.
El procedimiento de sensibilización consistía en
disolver/suspender cada muestra en 0,01 M ácido acético y se
administró 0,3 ml a cada ratón con una aguja de alimentación con
punta de bola los días 10, -7, -5 y -2 antes de la inmunización. El
día 0, los ratones se inmunizaron en la base de la cola con 100
\mug de CII bovino que se emulsionó en CFA. El día 21, se inyectó
a los ratones, por vía subcutánea, 50 \mug de LPS.
Los pesos corporales de cada ratón se registraron
los días 0, 21, 28 y 35. Se inspeccionó diariamente en los ratones
el inicio de AIC, que se caracterizó por eritema y edema. Las
extremidades se evaluaron clínicamente y graduaron en una escala de
0 a 6, como se ha descrito previamente.
Los datos presentados en la Tabla 11 demuestran
que la notocorda de esturión es eficaz en la atenuación de AIC. De
hecho, el grupo alimentado con notocorda de esturión era el único
grupo que era considerablemente (p<0,05) diferente del grupo de
control en la puntuación de severidad. Había una mejora numérica de
la puntuación de severidad por cartílago de pollo, pero no era
considerablemente diferente del grupo de control.
Además y muy importante, la Tabla 11 evidencia
inesperadamente que el único grupo en ganar peso era el grupo de
notocorda de esturión. El cartílago de pollo evidenció realmente una
pérdida de peso de 10%. Cuando los animales se someten a trauma o
enferman, reducen típicamente su ingestión de alimento, lo que da
lugar a pérdida de peso como se ve aquí en el grupo del cartílago de
pollo. Así, estos datos soportan además la creencia de los autores
de la invención de que la notocorda de esturión no se parece nada al
cartílago de pollo y de hecho puede ser mejor.
Para evaluar la respuesta a dosis de notocorda de
esturión en proteger ratones contra la AIC, este experimento se
realizó de manera similar a los Ejemplos II y III. Los ratones eran
de la cepa DBA/1 Lac J suministrados por Jackson Laboratories de Bar
Harbor, Maine. Todos los ratones eran hembras y de aproximadamente
6-8 semanas de edad. Ocho grupos de
10-15 ratones por grupo se aclimataron a su entorno
durante 7 días. Se suministró a todos los animales un pienso de
ratón estándar y agua para consumo ad libitum.
Los días -10, -7, -5 y -2 antes de la
inmunización, los ratones se sensibilizaron con notocorda de
esturión. Como el control negativo se utilizó un grupo alimentado
con vehículo solamente, y como el control positivo se utilizó un
grupo alimentado con una dosis efectiva de dexametasona (0,1 mg/kg
per os). La notocorda de esturión se obtuvo de esturión criado en
granja y pulverizó en nitrógeno líquido. El nivel de dosis de
notocorda de esturión se equilibró a 1, 3, 10, 30, 100 o 300 \mug
de colágeno por dosis en base al contenido de proteína y colágeno.
La notocorda de esturión se disolvió/suspendió en 0,01 M ácido
acético y se administró 0,3 ml a cada ratón con una aguja de
alimentación con punta de bola.
El día 0, los ratones se inmunizaron en la base
de la cola con 100 \mug de CII bovino que se emulsionó en CFA. El
día 21 se inyectó a los ratones por vía subcutánea 50 \mug de
LPS.
Se inspeccionó diariamente en los ratones el
inicio de AIC, caracterizado por eritema y edema. Las extremidades
se evaluaron clínicamente y graduaron en una escala de 0 a 6 como se
describe en el Ejemplo III.
La dexametasona (un agente conocido para reducir
AIC) redujo considerablemente la incidencia porcentual y la
puntuación de severidad (Tabla 12). La incidencia porcentual de AIC
también se redujo en todos los grupos alimentados con notocorda de
esturión, independientemente del nivel de dosis (a excepción del Día
35 en el grupo de 3,160 mg/dosis). La puntuación de severidad
también se redujo el día 26 en todos los grupos alimentados con
notocorda de esturión de manera dependiente de la dosis. Además, el
grupo alimentado con 1,053 mg de notocorda de esturión por dosis
redujo considerablemente (P<0,05) la puntuación de severidad el
día 35 (una reducción del 50%) y una reducción de 20% de la
incidencia porcentual. Estas conclusiones son consistentes con los
resultados de los Ejemplos anteriores de que la notocorda de
esturión es eficaz para atenuar la AIC.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los inventores siguieron observando cuatro grupos
seleccionados (grupo de control de vehículo, grupo de 0,104 mg/dosis
de notocorda de esturión, grupo de 1,053 mg/dosis de notocorda de
esturión, y grupo de dexametasona) hasta el día 79. Las puntuaciones
de severidad trazadas contra los días
post-sensibilización se hallan en la
figura 1.
figura 1.
Por los datos generados es evidente que el grupo
de control alimentado con vehículo mostró una progresión normal de
la enfermedad, mientras que la dexametasona era capaz de suprimir
considerablemente la puntuación de severidad. El efecto supresor de
la notocorda de esturión duró hasta el día 79 en el grupo alimentado
con 1,053 mg/dosis. El grupo alimentado con 0,105 mg/dosis también
mostró un efecto similar hasta el día 70.
Este experimento se realizó para mostrar el
efecto del colágeno aislado de notocorda de esturión en la
protección de ratones contra AIC. Este Experimento se realizó de
manera similar a los Ejemplos II, III y IV.
Los ratones eran de la cepa DBA/1 Lac J
suministrados por Jackson Laboratories de Bar Harbor, Maine. Todos
los ratones eran hembras y de aproximadamente 6-8
semanas de edad. Tres grupos de 10-15 ratones por
grupo se aclimataron a su entorno durante 7 días. Se suministró a
todos los animales pienso de ratón estándar y agua para consumo
ad libitum.
Los días -10, -7, -5 y -2 antes de la
inmunización, los ratones se sensibilizaron por colágeno de
notocorda. La notocorda de esturión se obtuvo de esturión criado en
granja y el colágeno se extrajo y purificó por el método descrito en
Eyre y Muir, The Distribution of Different Molecular Species of
Collagen in Fibrous, Elastic and Hyaline Cartilages of the Pig'',
Biochem J (1975) 151;595-602. El colágeno de
notocorda se disolvió/suspendió en 0,01 M ácido acético y se
administró 0,3 ml a cada ratón con una aguja de alimentación con
punta de bola. Los niveles de dosis comprobadas eran 30 o 100 \mug
por dosis por animal.
El día 0, los ratones se inmunizaron en la base
de la cola con 100 \mug de CII bovino que se emulsionó en CFA. El
día 21, se inyectó a los ratones por vía subcutánea 50 \mug de
LPS.
Se inspeccionó diariamente en los ratones el
inicio de AIC, caracterizado por eritema y edema. Las extremidades
se evaluaron clínicamente y graduaron en una escala de 0 a 6 como se
ha descrito previamente. La Tabla 13 expone los resultados de este
experimento.
Las puntuaciones de severidad se redujeron en
ambos grupos alimentados con colágeno de notocorda de esturión. El
grupo alimentado con 30 \mug mostró una reducción de 42% de la
puntuación de severidad el día 35 en comparación con el grupo de
control alimentado con vehículo. El grupo alimentado con 100 \mug
mostró una disminución en el porcentaje de incidencia. Esto es
consistente con los datos previamente publicados por Zhang ZJ, CSY
Lee, O Lider, HL Weiner, "Suppression of Adjuvant Arthritis in
Lewis Rats by Oral Administration of Type II Collagen", J.
Immuno (1990), 145; 2489-2493. También se
observó que ambos grupos alimentados con colágeno de notocorda de
esturión evidenciaron un aumento de peso corporal.
Este experimento se realizó para investigar la
efectividad de notocorda de esturión en la protección de ratones
contra AIC crónica inducida utilizando CII humano (a diferencia de
otros ejemplos en esta aplicación que usaron CII bovino). Se
obtuvieron ratones hembra de la cepa DBA/1 Lac J, de aproximadamente
6-8 semanas de edad, de Jackson Laboratories de Bar
Harbor, Maine. Los animales se aclimataron a su entorno durante 7
días. Se suministró un pienso de ratón estándar (dieta Teklad) y
agua para consumo ad libitum.
La inducción de AIC crónica se logró inmunizando
cada ratón el día 0 y el día 21 en la base de la cola con 50 mg de
humano CII, que se emulsionó en CFA. Los animales en el grupo de
control de vehículo y el grupo de dexametasona de control recibieron
0,01 M ácido acético los días -10, -7, -5, y -2 y 0,1 mg
dexametasona/kg BW los días 21 y 35, respectivamente. Los ratones
que recibieron notocorda de esturión se dividieron en tres grupos y
recibieron una dosis de 100 mg de colágeno por dosis
disuelta/suspendida en 0,01 M ácido acético y se administró 0,3 ml.
El grupo 1 recibió notocorda de esturión los días -10, -7, -5, y -2;
el grupo 2, los días 7, 10, 12, y 14; el grupo 3, los días 28, 31,
33, y 35.
Se inspeccionó diariamente en los ratones el
inicio de AIC, caracterizado por eritema y edema. Las extremidades
se evaluaron clínicamente y graduaron en una escala de 0 a 6 (0,
ausencia de artritis; 0,5, uno o varios dedos hinchados o solamente
hinchada la pata; 1, toda la pata hinchada; 2, toda la pata hinchada
severamente; 3, suave deformidad después de disminuir la
inflamación; 4, deformidad severa; 5, anquilosis suave con pérdida
parcial de la función de articulación en la pata; 6, anquilosis
severa con pérdida total de función de articulación en la pata).
Todos los ratones se sacrificaron con CO_{2} el día 35.
Todos grupos dosificados con notocorda de
esturión tenían una puntuación de severidad más baja que el grupo de
control de vehículo. En concreto, el grupo 2 era muy efectivo al
suprimir la incidencia porcentual y la puntuación de severidad (una
reducción de 52% el día 49) en comparación con el grupo de control
de vehículo. Estas conclusiones son consistentes con los resultados
de AIC potenciada con LPS, pero, además, ilustraron que la notocorda
de esturión es eficaz en un modelo de AIC crónica y de manera
independiente de no-antígeno. El modelo usado y los
resultados pueden implicar que la notocorda de esturión puede ser
efectiva en la artritis reumatoide crónica humana.
La comunidad médica está buscando constantemente
mejores tratamientos para la artritis. Esta invención proporciona el
uso de notocorda y su extractos (es decir, colágeno de notocorda)
para administración oral para disminuir el inicio de artritis y
reducir la intensidad de la enfermedad. La notocorda de esturión es
especialmente adecuada para inclusión en fórmulas nutricionales y
suplementos. Además, la notocorda de esturión es barata y de
suministro abundante y fiable.
Claims (13)
1. Una composición útil para consumo oral por
mamíferos que consta de notocorda de cordados para uso como un
medicamento.
2. La composición de la reivindicación 1, donde
dicha notocorda es notocorda de un animal de la familia de
Osteichthyes o Acipenseridae.
3. La composición de la reivindicación 2, donde
dicha notocorda es notocorda de esturión.
4. La composición de la reivindicación 1, donde
dicha composición está en forma de dosis sólida conteniendo de 1,0
\mug a 2,0 g de notocorda.
5. La composición de la reivindicación 4, donde
dicha forma de dosis sólida tiene forma de una tableta, cápsula,
píldora o polvo.
6. La composición de la reivindicación 5, donde
dicha tableta, cápsula o píldora contiene de 50 \mug a 500 mg de
notocorda.
7. La composición de la reivindicación 1, donde
dicha composición tiene forma líquida conteniendo dicha notocorda en
una concentración de 10 \mug a 700 g por litro.
8. Uso de una composición que incluye notocorda
de cordado para fabricar un medicamento para reducir la incidencia
de los síntomas de artritis en mamíferos, para administración oral
en una cantidad y durante un tiempo efectivo para mitigar tales
síntomas.
9. El uso de la reivindicación 8, donde dicha
notocorda es notocorda de esturión.
10. El uso de la reivindicación 9, donde dicha
administración es a la tasa de 10 \mug a 700 g por día de
notocorda.
11. Uso de notocorda que se ha sacado de un
animal del orden Osteichthyes o la familia
Acipensiridae y triturada para fabricar un medicamento para
el tratamiento de artritis reumatoide en un animal, para
administración oral de cantidades terapéuticas.
12. El uso de la reivindicación 11, donde dicha
notocorda se ha de administrar en un medio líquido.
13. El uso de la reivindicación 11, donde dicha
notocorda es notocorda de esturión.
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