CN107557330A - 植物来源细胞培养材料 - Google Patents

植物来源细胞培养材料 Download PDF

Info

Publication number
CN107557330A
CN107557330A CN201710872909.XA CN201710872909A CN107557330A CN 107557330 A CN107557330 A CN 107557330A CN 201710872909 A CN201710872909 A CN 201710872909A CN 107557330 A CN107557330 A CN 107557330A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
fibrous
cellulose nano
cnf
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710872909.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107557330B (zh
Inventor
M·于利佩图拉
P·劳伦
M·巴哈塔沙亚
娄艳茹
A·劳克凯恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UPM Kymmene Oy
Original Assignee
UPM Kymmene Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UPM Kymmene Oy filed Critical UPM Kymmene Oy
Publication of CN107557330A publication Critical patent/CN107557330A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107557330B publication Critical patent/CN107557330B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3637—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the origin of the biological material other than human or animal, e.g. plant extracts, algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L1/00—Compositions of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08L1/02—Cellulose; Modified cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L97/00—Compositions of lignin-containing materials
    • C08L97/02—Lignocellulosic material, e.g. wood, straw or bagasse
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2301/00—Characterised by the use of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08J2301/02—Cellulose; Modified cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/78—Cellulose

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)

Abstract

本发明涉及用于培养和转移细胞以及递送细胞的材料。所述材料包括植物来源的纤维素纳米纤维或其衍生物，其中所述纤维素纳米纤维是水凝胶或膜形式。本发明也提供制备这些材料和组合物及其应用的方法。

Description

植物来源细胞培养材料
本发明专利申请是国际申请号为PCT/FI2011/050939，国际申请日为2011年10月26日，进入中国国家阶段的申请号为201180062719.2，名称为“植物来源细胞培养材料”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及包含纤维素纳米纤维和/或其衍生物的植物来源的细胞培养和细胞递送组合物。
技术背景
健康护理仍然是科学研究的最前沿。对发现与开发经济和更安全药物的需求不断上升。精确模仿在特定组织或器官中的细胞组织的能力是极其重要的。从体内系统到体外的精确复制需要细胞在三维(3D)中生长。在体外三维细胞培养的细胞中实现的“交互作用”是在生理条件下对细胞生长的精确模仿。事实上，三维细胞培养已在涉及再生医学、更好理解慢性病和为药物筛选和毒理试验提供优良的体外模型系统的努力中显示出重要性。因此，其出现被贴切地誉为“生物学的新维度”。
深入研究的努力正在持续以鉴定和开发适合三维细胞体外生长的“因子和支架”。在生理条件下的细胞不仅在它们之间有“交互作用”，也与细胞微环境即它们所在的胞外基质(ECM)相作用。ECM为细胞提供了结构支持并且也有助于信号传导和指导细胞命运。大多数情况下，细胞外基质由糖胺聚糖和纤维状蛋白构成，如胶原、弹性蛋白、层连蛋白和纤连蛋白自组装形成纳米纤维网络。三维细胞生长的理想支架应该能模仿天然ECM的结构、支持细胞的生长和维持、有适度互联孔的网络以便细胞高效迁移和向细胞转移营养。本质上，支架的机械和化学性质应引起天然状态下的细胞功能。
从合成和天然来源得到水凝胶已经成为三维细胞培养的合适支架。水凝胶的互联孔网络能保留大量的生物液体、促进氧气、营养和废弃物的输送。此外，大多数水凝胶能够在温和的细胞相容性条件下形成并且其生物学特性能通过表面化学性质进行调节。具有改良机械、化学和生物性质的经工程改造水凝胶有模仿ECM的潜力并因此确立其在三维细胞培养中的应用。三维细胞培养的市售产品为例如PuraMatrixTM(3DM公司(3DM Inc))和Matrigel(BD生物科学公司(BD Biosciences))。PuraMatrixTM是与ECM中天然的纤维胶原结构相似的自组装的肽纳米纤维，其纤维直径为5-10nm。它也有很高的含水量，通常为99.5％。美国专利7,449,180和WO2004/007683公开了肽水凝胶。Matrigel是通过小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物。此混合物与在许多组织中发现的复杂胞外环境相类似并被细胞生物学家用作细胞结构的基材。MaxGelTM ECM基质(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))是包括人ECM成分的混合物，其在室温下形成凝胶。
细菌纤维素已经在伤口愈合膜中应用并作为细胞培养的一种支架。细菌纤维素在细胞培养中的应用的限制在于发酵材料的固有结构；培养之后，BC在发酵罐气液界面形成非常紧密的膜。形成的膜对许多三维细胞培养任务而言太紧密以至于需要各种修饰来改善孔隙率，而这种孔隙率又是细胞渗透和形成细胞团所必需的。
水凝胶也在其它需要亲水性支持物质的培养类型任务中广泛使用，例如琼脂型水凝胶在用于各种微生物学目的的植物细胞、细菌和真菌培养中广泛使用。
美国专利5,254,471公开了由超细纤维制成的细胞培养载体。WO2009/126980公开了基于纤维素的水凝胶，其包含平均聚合度为150-6200的纤维素。
发现现有技术的解决方法在细胞培养中非常不令人满意。所有现有的二维和三维细胞培养方法和基质为了维持和倍增细胞需要在生物材料培养基中使用基于动物的化学物质或化合物。干细胞的维持要求极高并且还没有能保持干细胞存活的细胞培养用基质的简单解决方法。在细胞培养环境中存在基于动物的化合物会产生严重的免疫反应风险和不同种类的毒性问题，其最终会杀死培养的细胞。包含基于动物的添加物的细胞培养基质不适于在干细胞中使用，特别是如果干细胞用于组织移植和组织技术(工程)。此外，许多提出用于细胞培养基的聚合物无法耐受生理温度或对细胞有毒性。
发明概述
对能够向各种细胞类型提供三维或二维支持的改良细胞培养材料有明显的需求。这些功能性的三维细胞模型能够作为取代动物实验的药物开发工具应用并较目前使用的二维细胞模型更先进。培养细胞的运输也要求很高，例如当目标是组织转移或细胞治疗时。当开发不同的体外细胞模型时，需要在三维基质中转移培养的细胞团的可能性。现有的三维细胞培养生物材料无法在不严重破坏培养细胞的情况下用针头转移水凝胶基质。
因此本发明的目的在于提供新的至少部分解决或减轻在现有技术中所出现前述问题的方法。发明的目的通过包含具有独立权利要求中所述特征的纤维素纳米纤维或其衍生物的细胞培养或细胞递送组合物而实现。优选的实施方式在附属权利要求中揭示。
本发明基于纤维素纳米纤维和/或其衍生物在二维和三维细胞培养基质中的应用。本发明提供了纤维素纳米纤维和/或其衍生物在细胞培养基质中的应用。纤维素纳米纤维和/或其衍生物用作二维和三维细胞培养基质消除了使用基于动物的添加物的需要并且倍增和实现了在含有纤维素纳米纤维和/或其衍生物的基质中的细胞增殖。
本发明人惊讶地发现植物来源的CNF水凝胶能在没有任何修饰的情况下作为仿生人ECM用于三维细胞培养。细胞增殖和活力数据表明CNF水凝胶能作为三维细胞支架的优选生物材料以用于药物开发、药物毒性试验和再生医学中应用以及进一步的体内细胞递送中基于高级功能性细胞的高通量筛选试验。
本发明人第一次描述植物来源的CNF水凝胶的物理和生物相容性质。植物纤维素在造纸和纺织工业中广泛使用并且是天然丰富的。天然的纤维素纳米纤维水凝胶是不透明的。在机械崩解之前对纤维素纸浆的化学修饰产生了光学透明的水凝胶。
本发明是基于对由分散在水性环境中的纤维素纳米纤维(CNF)组成的水凝胶的实验研究。纳米纤维的高亲水性是由于纤维素聚合物的羟基官能团并且部分由半纤维素多糖覆盖。
因此本发明第一方面提供了含有纤维素纳米纤维或其衍生物的细胞培养或细胞递送组合物，其中，所述纤维素纳米纤维是以水凝胶或膜的形式。
本发明的显著优点是细胞能够在没有细胞之外来源、基于动物或人的化学物的生物材料培养基上或其内部维持(和增殖)。细胞均匀分散在包含纤维素纳米纤维或其衍生物的培养基/基质上或其内部。细胞在培养基上或其内部分裂，开始增殖且细胞团开始自发生长，而不会在细胞培养平台底部积聚细胞。在纤维素纳米纤维或其衍生物中的细胞均匀分裂是生物材料发挥三维细胞培养基作用的前提。
本发明的进一步优点包括：纤维素纳米纤维和/或其衍生物是惰性的且不产生荧光背景。能注射含有纤维素纳米纤维或其衍生物的培养基。可注射性能由流变性质解释。能够采用注射从而细胞能够在基质中保持稳定并且它们在注射后于基质中均匀分布。
附图简要说明
图1是纤维素纳米纤维水凝胶的冷冻-TEM图像。天然CNF在左侧(A)，透明CNF在右侧(B)。
图2显示HepG2细胞在市售的细胞培养材料[MaxGelTM(西格玛-奥德里奇公司),HydroMatrixTM(西格玛-奥德里奇公司)和PuraMatrixTM(3DM公司)]、在两种不同的纤维素纳米纤维材料(天然CNF和透明CNF)和在添加纤连蛋白(FN)的CNF中的活性。在增殖AB试验中，细胞培养48小时并且对照细胞在相等的条件下于塑料表面培养。
图3显示天然CNF水凝胶中培养的ARPE-19细胞在用不同尺寸的注射器针头转移细胞之后的活性。活性用相对荧光强度表示。
图4显示不同分子量的葡聚糖(20kDa、70kDa、和250kDa)在1％天然纤维素纳米纤维水凝胶中的扩散。
图5是天然CNF膜上ARPE-19细胞的光学显微图像。CNF膜支持在图像上部的细胞生长，在图像下部细胞在细胞培养塑料上生长。放大倍率为20×。
图6显示细胞培养塑料上(A)的和天然纤维素纳米纤维水凝胶内(B)的HepG2细胞共聚焦显微部分图像。
图7显示通过动态振荡流变测量的0.5％CNF水凝胶的粘弹性质。0.5％天然CNF水凝胶G’(储能模量)和G”(损耗模量)的频率依赖性如图示。
图8显示相较0.5％水溶性聚合物聚丙烯酰胺(5000kDa)和CMC(250kDa)溶液，0.5％CNF水凝胶的粘度随着所应用剪切力的变化。
图9显示相较0.5％聚丙烯酰胺和CMC，0.5％CNF水凝胶的粘度随着所测量剪切率的变化。不同物理过程的典型剪切率在图中用箭头标记。
图10是在针头中流动的含有细胞的CNF水凝胶的示意图。高剪切率区域(低粘度)位于胶-针头界面而低剪切率区域(很高粘度)位于针头的中间。
图11显示0.7％天然CNF水凝胶在同心圆筒几何结构的流变仪中以40帕恒定压力下剪切时剪切率和粘度的演变。
图12显示0.7％的天然CNF水凝胶分散体在高剪切率剪切后相较用玻璃棒温和混合后的结构恢复。
图13显示0.5％天然CNF水凝胶(上排)和0.5％透明CNF水凝胶(下排)中两种砂砾悬浮液在17天内的稳定性。砂砾是CEN标准砂(EN 196-1)，平均颗粒尺寸为1-2mm和2-3mm。在室温存储样品。
图14显示酶促水解对纤维素纳米纤维胶悬浮能力的影响。砂砾是CEN标准砂(EN196-1)，平均颗粒尺寸为1-2mm。
图15是包埋在天然CNF水凝胶中的人ES细胞源性肝祖细胞的共聚焦显微图像。比例尺：70μm。
发明详述
本发明涉及含有纳米纤维素和/或其衍生物的细胞培养或细胞递送组合物，其中所述纤维素纳米纤维衍生物是以水凝胶或膜的形式。纤维素纳米纤维或其衍生物可获自非基于动物的材料如含有植物材料的原料。
除非另有说明，本说明书和权利要求中使用的术语具有在细胞培养中常用的含意。具体地，以下术语的含义说明如下。
术语“细胞培养或递送组合物”指含有纤维素纳米纤维或纤维素纳米纤维衍生物并用作细胞培养基或细胞递送的材料。所述组合物也能用于转移细胞或细胞团。纤维素纳米纤维能以水凝胶或膜的形式。所述化合物还可包含多种添加物如特定的细胞外基质组分、血清、生长因子、和蛋白质。
术语“纤维素原料”表示可用于生成纤维素浆料、精制浆料或纤维素纳米纤维的任意纤维素原料源。所述原料可以基于任何含纤维素的植物材料。植物材料可以是木材。木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。非木材料可以来自农业残料、草或其它植物物质，如稻草、树叶、树皮、种子、壳、花、蔬菜或果实，来自棉花、玉米、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、亚麻、大麻、马尼拉麻、剑麻、黄麻、苎麻、洋麻、甘蔗渣、竹或芦苇。
术语“纤维素浆料”表示使用化学、机械、热机械或化学热机械的制浆法与任意纤维素原料分离的纤维素纤维。一般纤维的直径在15-25μm变化，长度超过500μm，但本发明不意在限于这些参数。
本发明中的纤维素结构上是I类纤维素。
术语“纤维素纳米纤维”表示来源于纤维素原料或纤维素纸浆的经分离纤维素纳米纤维(CNF)或纳米纤维束集合。纳米纤维通常具有高的长宽比：长度可能超过1微米而数均直径通常在200nm以下。纳米纤维束的直径也可以更大，但通常小于1μm。最小的纳米纤维类似于所谓的初级原纤，其通常直径为2-12nm。原纤或原纤束的尺寸取决于原料和崩解方法。纤维素纳米纤维还可以包含一些半纤维素；含量取决于植物来源。
采用合适的设备，如精制机、研磨机、均化器、胶体排除装置、磨擦研磨机、超声近距离声波定位器、流化器如微流化器、大流化器或流化器型均化器从纤维素原料、纤维素浆料或精制浆料中机械崩解纤维素纳米纤维。优选地，“纤维素纳米纤维”是机械崩解的材料。
“纤维素纳米纤维”或“纤维素纳米纤维和/或其衍生物”也能是任何化学或物理修饰的纤维素纳米纤维或纳米纤维束的衍生物。化学修饰可以基于例如纤维素分子的羧甲基化(carboxymethylation)、氧化如TEMPO-氧化、酯化或醚化反应。也可以通过在纤维素表面上进行阴离子、阳离子或非离子型物质或其任意组合的物理吸附来实现修饰。所述修饰可以在制备纤维素纳米纤维之前、之后或过程中进行。某些修饰可引起人体内能降解的CNF材料。
合适地，纤维素原料如纤维素纸浆在机械崩解前用酸或碱预处理。预处理通过对纤维素纸浆进行酸处理产生效果，优选用盐酸以去除任何电荷超过+1的带正电离子，之后用含有电荷为+1的带正电离子的无机碱处理，优选氢氧化钠，其中Na+离子替换之前的离子。此预处理提供了“纤维素纳米纤维”出色的成胶性质和透明性。此预处理的产物被称作酸碱预处理或离子交换的“纤维素纳米纤维”。
“纤维素纳米纤维”的微生物纯度是完成细胞培养必要的。因此，采用水凝胶或膜形式的“纤维素纳米纤维”在细胞培养实验前灭菌。除此以外，使原纤化之前和期间的产品微生物污染最小是很重要的。在原纤化之前，优选当纸浆还是无菌时在漂白阶段之后立刻从纸浆厂无菌收集纤维素纸浆。
纤维素纳米纤维有几个广泛使用的同义词。例如：例如：纳米纤维素、纳米原纤化的纤维素(CNF)、纳米原纤纤维素、纤维素纳米纤维、纳米级原纤化的纤维素、微原纤纤维素、微原纤化的纤维素(CNF)、或纤维素微原纤。通过某些微生物生产的纤维素纳米纤维有多个同义词，如细菌纤维素、微生物纤维素(MC)、生物纤维素、nata de coco(椰果)(NDC)或coco de nata。
本发明所述的纤维素纳米纤维是与所谓的纤维素须不同的材料，已知的纤维素须为：纤维素纳米须、纤维素纳米晶体、纤维素纳米棒、棒状纤维素微晶或纤维素纳米线。在一些情况下，例如Kuthcarlapati等(Metals Materials and Processes 20(3):307-314,2008)对两种材料使用类似的术语，其中研究的材料称为“纤维素纳米纤维”，尽管它明确地称为纤维素纳米须。通常作为纤维素纳米纤维的这些材料沿纤维结构不具有无定形区段，这得到更刚性的结构。纤维素须还比纤维素纳米纤维更短；通常长度小于1微米。
单独的纤维素纳米纤维与前述ECM中胶原纤维的直径很相近，例如4-10nm。因此，基于CNF的水凝胶能用作三维细胞基质。
在本发明的细胞培养实验中，使用两种纤维素纳米纤维：不透明的天然纤维素纳米纤维(CFN)和光学透明的纤维素纳米纤维(CNF)，其为TEMPO氧化的纤维素。在实施例、材料和方法部分详细描述该材料。
术语“纤维素纳米纤维水凝胶”指纤维素纳米纤维的水性分散体。
术语“纤维素纳米纤维膜”指湿或干的纤维素纤维的片状形式。膜通常由稀释的纤维素纳米纤维分散体用合适的过滤器通过真空过滤设备过滤生产。溶剂浇筑也可能用以得到前述的膜结构。得到的膜能在使用前以湿或干的状态如此使用。
本发明的纤维素纳米纤维或其衍生物可包括化学或物理修饰纤维素纳米纤维或纳米纤维束衍生物。
本发明的细胞培养或药物递送组合物可另外包括选自特定细胞外基质组分、血清、生长因子、和蛋白质的合适添加物。
本发明也涉及细胞培养或细胞递送基质，其中基质包括活细胞和形成水凝胶的细胞培养或细胞递送组合物并且其中细胞在三维或二维排列的基质中出现。
细胞可以是任何细胞。任何真核细胞，如动物细胞、植物细胞和真菌细胞以及原核细胞如细菌细胞都在本发明的范围之内。
取决于细胞种类，实验在三维或二维中实施，例如，细胞在CNF膜或胶中培养或者细胞在CNF水凝胶或CNF膜中均匀分散。本发明的具体例子公开了视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)自发形成单层，而人肝癌细胞(HepG2)从单层或细胞集落中产生。
细胞可由任何本领域已知的检测手段或染料检测。
本发明也涉及制备如前述权利要求中任一项所述组合物的方法，所述方法包括以下步骤:提供纤维素纳米纤维和/或其衍生物；可选混合所述纤维素纳米纤维和/或其衍生物与水；和向细胞培养或递送的合适环境中转移或放置纤维素纳米纤维和/或其衍生物或得到的混合物。
纤维素纳米纤维水凝胶或膜或其衍生物或本发明的组合物可用作细胞递送材料。
纤维素纳米纤维水凝胶或膜或其衍生物或细胞培养或细胞递送组合物能用作临床应用的递送材料。
本发明涉及纤维素纳米纤维或其衍生物或本发明所述组合物作为体外维持细胞的培养基或培养基的化合物用于实验室和/或工业目的的微生物应用。
组合物包括可用于固定细胞或酶的纤维素纳米纤维或其衍生物。
本发明也涉及培养细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：提供细胞；使细胞与含有纤维素纳米纤维或其衍生物的细胞培养组合物接触以形成基质；和在所述三维或二维排列的基质中培养细胞。
本发明还涉及组合物、方法或应用，其中细胞为真核细胞。
本发明还涉及组合物、方法或应用，其中细胞为原核细胞。原核细胞包括微生物如厌氧或好氧细菌、病毒、或真菌如酵母菌和霉菌。
本发明还提供组合物、方法或应用，其中细胞为干细胞。
纤维素纳米纤维的去除可用例如酶降解纤维素纳米纤维完成。合适的酶是例如市售可得的纤维素酶。培养的细胞系也可遗传工程改造成在培养系统中产生所需的酶。
本发明也涉及从细胞生长或细胞培养材料中去除纤维素纳米纤维或其衍生物的方法；所述方法包括以下步骤：提供包含细胞生长培养基和细胞和任选药物的材料；用水性或非水性液体稀释所述材料；和通过倾倒去除纤维素纳米纤维。适度离心能用于在倾倒之前沉淀细胞和细胞聚集物。
本发明人惊讶地发现植物来源的CNF水凝胶能在没有任何修饰的情况下作为仿生人ECM用于三维细胞培养。细胞增殖和活力数据表明CNF水凝胶能作为三维细胞支架的优选生物材料以用于药物开发、药物毒性试验和再生医学以及进一步的体内细胞递送中基于高级功能细胞的高通量筛选试验。
本发明第一次公开植物来源的CNF水凝胶的物理和生物相容性质。植物纤维素在造纸和纺织工业中广泛使用并是天然丰富的。天然的纤维素纳米纤维水凝胶是不透明的。在机械崩解之前对纤维素纸浆的化学修饰产生了光学透明的水凝胶。
本发明的纤维素纳米纤维能以水凝胶或干或湿膜形式使用。CNF水凝胶的凝胶强度能通过稀释简单地改变。具有相似性之的纤维素纳米纤维或其衍生物对细胞无毒。
如果纤维素纳米纤维水凝胶与UV交联的细胞培养水凝胶如透明质酸或PEG水凝胶相比，CNF材料被认为毒性小得多。UV交联胶中需要有害的引发剂以启动成胶而CNF水凝胶是自发形成的。CNF水凝胶的非共价本质使得能通过稀释调整孔隙率。
细胞在纤维素纳米纤维水凝胶中均匀分散并能在没有细胞培养平台底部沉淀的情况下自动开始复制和生长成三维细胞团。所有目前使用的市售三维细胞培养基需要添加粘附肽，从而细胞在细胞培养平台上会形成三维结构。
根据本发明的纤维素纳米纤维或其衍生物能在没有粘附肽时使用。细胞附着于平台并自发均匀分布在纤维素纳米纤维水凝胶中。细胞由于纤维素纳米纤维提供的机械支持而均匀悬浮于连续相。显著较高的屈服应力针对沉淀使细胞和生长的细胞团稳定。
植物来源的纤维素纳米纤维水凝胶在没有粘附肽和/或特制孔隙率时发挥功能，而细菌纤维素纳米纤维需要粘附肽。细菌纤维素已经在发酵后直接使用，其中所得膜结构被认为比本发明的水凝胶例如来自纤维素纳米纤维的水凝胶坚固。因而现有技术方法需要另外的工艺使得水凝胶基质更为多孔。
含有胶形式纤维素纳米纤维的细胞培养基的坚固度能在不影响细胞培养性质的情况下调节。源自细菌的纤维素纳米纤维也比其他来源的纤维素纳米纤维更厚并因而不能根据细胞培养自由修饰。
细胞在三维基质内或基质上生长。所述材料可注射或是有合适表面拓扑结构的片状膜。
CNF的性质就三维细胞培养而言接近最佳：透明、无毒性、高粘度、高悬浮力、高保水性、良好机械粘附、非基于动物、接近ECM尺寸、对盐、温度或pH不敏感、不降解、无自荧光。CNF因为材料的化学结构而具有可忽略的荧光背景。另外，CNF胶对细胞没有毒性。
细胞能在CNF胶上长期培养或生长，例如2-7天或甚至更长的时间。细胞也能在水凝胶中短期培养或仅仅悬浮，例如几分钟到数小时。细胞用纳米纤维素纤维基质作为用作平台的生长支架/支持物。细胞形成团簇，因而表明纤维素纳米纤维作为三维细胞培养支架的可用性。细胞层状生长或细胞聚集在CNF胶上或之内，这取决于沉积方法和细胞类型。
无毒CNF水凝胶就研究细胞而言与基于人ECM的MaxGelTM是一样好的ECM。其细胞活力甚至比在PuraMatrixTM或HydroMatrixTM中更高。不向CNF水凝胶添加基于人或动物的ECM组分。然而，向基于CNF的体系添加纤连蛋白或胶原IV在某些情况下能是有益的。基于扩散研究，CNF水凝胶高度可渗透并自由促进氧气、营养和细胞水溶代谢物的交换。
冷冻透射电子显微镜显示CNF水凝胶由单独纤维素纳米原纤维和纤维束的混合物组成。CNF的尺寸与天然人胶原相似，所述天然人胶原为天然ECM组分并常用作细胞支持物。CNF水凝胶的强度(弹性)作为所用频率的函数从0.01到1Hz保持几乎恒定。流变性数据显示在一个帕的剪切应力内剪切粘度从静息的约数百千帕(低剪切应力)下降到几帕。所述表现对于生物材料水凝胶是相当独特的。这实现了极好的悬浮能力和细胞支持且通过剪切稀化性质使CNF水凝胶中的细胞能进行所需简单扩散和注射而不论所用针头的尺寸，这种性质早先在其它细胞培养生物材料水凝胶中并没有得到。所述机械弹性和刚性就用于三维细胞培养生长和细胞注射的CNF水凝胶而言是最佳的。
本发明的优点在于纤维素纳米纤维或其衍生物的纤维网络尺寸与胶原纳米纤维的天然ECM网络非常接近。另外，纤维素纳米纤维或其衍生物是非基于动物的材料，例如，没有疾病转移的风险。目前，大多数市售产品是从动物中分离的。另外，发明提供了调节CNF材料物理形式的可能性，从水凝胶到能使用的膜。
可注射的水凝胶由于很高的屈服应力在细胞周围形成支持性基质。CNF膜是透光和高度多孔的。与替代物相比大规模生产是简单的。
天然纤维素纳米纤维对细胞没有毒性。在纤维素纳米颗粒或其衍生物的情况中与对照(仅细胞)相比细胞增殖翻倍。细胞能在CNF水凝胶上长期控制(例如2-7天)。细胞用纤维素纳米纤维基质作为生长平台。细胞形成团簇，其表明纤维素纳米纤维或其衍生物作为三维细胞培养支架的可用性。细胞在CNF胶中层状生长。纤维素纳米纤维或其衍生物具有可忽略的荧光背景。纤维素纳米纤维水凝胶有最佳的弹性、刚性、剪切应力、机械粘附性和多孔性以用作三维和二维细胞培养基质。
在水性环境下，纤维素纳米纤维形成分散纳米纤维或纳米纤维束的连续水凝胶网络。即使在极低的浓度条件下，所述凝胶也通过彼此缠结的高度水合原纤维形成。所述原纤维还可以通过氢键相互作用。采用机械搅拌容易破坏该宏观结构，即凝胶在剪切应力升高时开始流动。纤维素纳米纤维水凝胶和/或其衍生物之前未描述用作细胞培养材料。
本发明的应用包括为生物技术研究提供细胞培养材料。含有CNF的细胞生长或细胞培养基可用于维持和培养细胞以及转移细胞。本发明提供细胞培养基，其可使用于例如组织工程和伤口愈合。其它应用包括例如药物剂量应用、生物技术或生物医药和其剂量以及三维药物的功能性细胞测试试验。CNF水凝胶的独特流变性质能用于基于水凝胶可注射性的多个应用，如在眼内、肌肉内或皮下治疗中注射溶于CNF水凝胶的细胞或药物。
给出以下实施例以进一步说明本发明，但这些实施例并不意在限制本发明的范围。本领域技术人员能根据描述以多种方式对本发明进行修改。
实施例
材料和方法
CNF水凝胶的制备
不透明的天然CNF水凝胶(1.7重量％)通过湿纤维素纸浆纤维的高压均质化得到。因此，该工艺的直接产物是稀释的纤维素纳米纤维水凝胶。透明的CNF水凝胶(0.9重量％)通过相似的经化学修饰纤维素纸浆(TEMPO氧化的纤维素纸浆)的均质化工艺得到。样品经高压灭菌。对于细胞研究，CNF水凝胶稀释至合适浓度并用机械混合或超声处理均质化。天然CNF和透明CNF的冷冻-TEM图像如图1所示。天然纤维素纳米纤维水凝胶由单独纤维素纳米原纤维和纤维束的混合物构成(图1A)。最小纤维的直径约为7nm，然而大多数纤维素材料形成50-100nm的束状结构。由于材料的缠结和成束性，精确长度尺度无法从图像中估计，但看来显然单独纳米纤维长数微米。光学透明的CNF水凝胶的冷冻-TEM图像显示均匀分布的单独纤维素纳米纤维网络。这些纳米纤维的直径约为7nm，长度超过1微米。纳米纤维具有100-200nm长度的直区段，之后是沿着纤维轴的大幅扭转。这些直区段由高度结晶的纤维素结构域组成-弯曲位点由无定形部分形成。
CNF膜的制备：
CNF膜通过含水0.2重量％的天然CNF分散体的真空过滤制备。在过滤后，重量不足的湿膜在55℃的烘箱中干燥48小时。干燥膜是光滑且不透明的，克重为70-80克/米2。
酶促水解
CNF水凝胶的酶促降解通过用Celluclast 1.5LFG,CCN0367(诺维信(Novozymes),pHopt 5),Prot.90毫克/毫升水解含有0.5％水凝胶的砂砾来证明。天然CNF的降解在pH5、50℃下进行4天，透明CNF的降解在pH7、21℃下进行1小时。酶剂量是5mg酶对1克CNF。
HepG2细胞
HepG2细胞的来源
人肝癌(HepG2)细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市)获得。
HepG2细胞的维持培养
HepG2细胞在补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素(吉布可公司(Gibco))、2mM的L-谷氨酰胺(吉布可公司)、100mM丙酮酸钠(吉布可公司)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，吉布可公司)中维持。细胞在75cm2培养瓶中于95％相对湿度、5％CO2大气的培养箱内37℃维持。细胞每周两次以1：4的分流比通过胰蛋白酶化1：10传代。培养基每48小时更换，细胞以90％的融合度次代培养。
HepG2细胞在CNF水凝胶上的三维培养
将纤维素纳米纤维水凝胶放置在96孔组织培养板的底部，溶于生长培养基的HepG2细胞悬液在CNF水凝胶顶部接种或与之混合，所述悬液含有每孔25000-50000个细胞。CNF水凝胶的浓度范围为0.01％-1％。
ARPE-19细胞
ARPE-19细胞的来源
自发产生的视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市)获得。
ARPE-19细胞的维持培养
ARPE-19细胞培养于达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)：营养混合物F12的1：1混合物，其补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞在7％CO2大气下37℃培养。生长培养基每2-3天更换，培养物在第24-30次传代使用。
在CNF膜上培养ARPE-19细胞
将纤维素纳米纤维水凝胶放置在96孔组织培养板的底部，溶于生长培养基的ARPE-19细胞悬液在水凝胶顶部接种或与之混合，所述悬液含有每孔25000-50000个细胞。水凝胶的浓度范围为0.01％-1％。
来源于人ES细胞的肝祖细胞
人胚胎干细胞的维持培养
本研究中使用人胚胎干细胞(hES)细胞系H9(威斯康辛国际干细胞库，“WISCBank”c/o WiCell研究院，美国威斯康辛州麦迪逊)。H9细胞在基质胶包被的组织培养板上于mTeSR1培养基中常规培养并通过用1mg/ml分散酶(干细胞技术公司(StemCellTechnologies))传代。在此条件下，干细胞形成二维(2D)单层集落。
hES细胞在CNF中的三维培养
H9细胞集落与0.3％天然CNF或0.3％透明CNF混合并在TeSR1培养基中培养。hES细胞在CNF中形成三维细胞簇。在某些实验中，0.3％CNF与58μg/ml人纤连蛋白(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))混合。
来源于H9细胞的肝祖细胞在CNF中的三维培养
H9细胞按照公开的方案分化成肝祖细胞，持续11天[Hay DC,Zhao D,Fletcher J,Hewitt ZA,McLean D,Urruticoechea-Uriguen A,Black JR,Elcombe C,Ross JA,Wolf R,Cui W.Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stemcells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo(显示概括体内肝脏发育的标记物的来自人胚胎干细胞的肝细胞有效分化)，Stem Cells，2008年4月；26(4):894-902)]。所得的肝祖细胞在三维环境中用0.3％天然CNF或0.3％透明CNF培养7天。在一些实验中，0.3％CNF与13μg/ml小鼠IV型胶原(西格玛-奥德里奇公司)混合。
活/死细胞染色
CNF中的H9细胞簇和肝祖细胞用CellTracker Blue CMAC(20μM)染色活细胞，碘化丙锭(25μg/ml)染色死细胞。细胞的图像通过共焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5MPSMDFLIM)在用于CellTracker Blue CMAC的405nm激发波长和用于碘化丙锭的514nm获取。
细胞活力/增殖的阿尔玛蓝检测
细胞活力通过阿尔玛蓝TM细胞活性试验试剂盒(Biotium公司(Biotium Inc.),美国加利福尼亚州海达德)定量。将纤维素纳米纤维水凝胶放置在96孔组织培养板的底部，溶于生长培养基的HepG2/ARPE-19细胞悬液在水凝胶顶部接种或与之混合，所述悬液含有每孔25000-50000个细胞。水凝胶的浓度范围为1％-0.01％。在37℃，5％CO2和95％相对湿度的培养箱中于纤维素纳米纤维水凝胶上培养细胞后，细胞活力和增殖作为天数的函数进行测量。
在48小时之后，阿尔玛蓝直接加入96孔板的培养基中，终浓度为10％。平板孵育5小时后暴露于530nm的激发波长，并用590nm的发射波长检测荧光。活力百分比表示为CNF水凝胶存在时的荧光计数占没有纤维素纳米纤维水凝胶(细胞在塑料表面生长)时的荧光计数的百分比。
背景荧光测量(阴性对照)从含有溶于培养基的水凝胶和染料试剂但没有细胞的孔中测定。计算所有荧光测量的平均值和标准偏差，然后根据背景修正并表示为相对荧光。
共聚焦激光显微术
在水凝胶上培养的HepG2细胞的活性和三维HepG2球体的形成用由钙黄绿素AM和溴乙啡锭二聚体组成的Live/活性/细胞毒性试验试剂盒(英杰公司(Invitrogen))评估。
简要地，HepG2细胞悬浮于含有或不含纤连蛋白(fibronecin)的1％天然和透明CNF水凝胶。将溶于水凝胶的细胞悬液转移到有细胞的各孔中。向各孔中加入细胞培养基。水凝胶包封的HepG2细胞培养5天并且培养基每48小时更新。在5天后，从孔中移除培养基，包封细胞用PBS洗涤并在含有0.2μM钙黄绿素AM和1.0μM溴乙啡锭二聚体的‘活/死’溶液中室温孵育约45分钟。活细胞用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，Leica SP2倒置显微镜，瑞士苏黎世)成像，所述显微镜装有氩激光器(488nm/35mW)、HC PL APO 10x/0.4CS和HC PL APO20x/0.7CS(空气)目镜、有空气加热系统的小型培养箱(生命成像/服务公司(LifeImaging/Services),瑞士)、和CO2混合器(Okolab)。图像从两个检测器获得(一个用于钙黄绿素，另一个用于溴乙啡锭二聚体)。图像用Imaris 7.0(Bitplane)生成并编辑。没有进行卷积。
实施例1
不同细胞培养材料中HepG2细胞的细胞活力比较
将纤维素纳米纤维水凝胶放置在96孔组织培养板的底部，溶于维持生长培养基的HepG2细胞悬液在水凝胶顶部接种或与之混合，所述悬液含有每孔25000-50000个细胞。水凝胶的浓度范围为1％-0.01％。在37℃，5％CO2和95％相对湿度的培养箱中于纤维素纳米纤维水凝胶上培养细胞之后，表明细胞活力和增殖的荧光强度作为天数的函数进行测量。
三种市售可得的细胞培养材料用作参照三维培养材料：MaxGelTM(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、HydroMatrixTM(西格玛-奥德里奇公司)和PuraMatrixTM(3DMInc.)。所有研究材料的实验步骤设置是相同的。
HepG2细胞活力通过阿拉马蓝TM细胞活力试验试剂盒(Biotium公司(BiotiumInc.)，美国加利福尼亚州海达德)定量，如上面材料和方法部分,用于细胞活力/增殖的阿拉马蓝试验所示。
就研究材料而言HepG2细胞的活力百分比示于图2。两种纤维素纳米纤维水凝胶即天然和透明CNF显示比市售HydroMatrixTM或PuraMatrixTM参比材料活力高。如果将纤连蛋白添加入CNF水凝胶，其活力接近市售的MaxGelTM。另外，两种水凝胶中的增殖和细胞活力作为细胞浓度的函数呈线性增长。这个观察结果支持水凝胶模仿人ECM组分的假设。其含有ECM的所有关键组成。
实施例2
用注射器针头转移ARPE-19细胞
ARPE-19细胞(每孔25000个细胞)在96孔板底部的CNF基质中接种和培养。用不同尺寸的注射器针头转移细胞后的ARPE-19细胞活力如图3所示。同样的现象也在其它细胞类型如HepG2和ES细胞中得到。
用注射器针头转移ARPE-19细胞的更详细说明如下：对于图3中的转移1，细胞与1.66％CNF孵育48小时，之后细胞用注射器(20G-27G)向96孔板转移约100μl。细胞在用注射器转移后孵育24小时，测量CNF中的细胞活力。
对于转移2，在1.66％CNF中孵育24小时的细胞用27G注射器转移进新鲜培养基(约2ml)。细胞在转移后孵育24小时，之后细胞再次用注射器(20G-27G)向96孔板转移约100μl，再孵育24小时并测量在1.66％CNF中双重转移细胞的活力。
这些实验证明在CNF水凝胶中转移细胞是可能的，转移过程成功并且细胞是活的且在注射器转移中保持存活。此现象即使用最小针号的27G也能获得，没有观察到与转移过程中所用针号相关的截留。两次转移的样品(转移2)显示较低的增殖率，这最可能由于在实验开始时24小时的较短孵育时间。CNF水凝胶中细胞的转移证明细胞确实在水凝胶内并保持于其中，因为附于平板的细胞不会被转移(没有胰蛋白酶消化)。这些实验显示细胞在转移中保持活力。
实施例3
干细胞
hES细胞来源的肝祖细胞的活/死细胞染色
人ES来源的肝祖细胞在天然CNF水凝胶中包埋(图15)并在含有或不含胶原IV情况下培养7天。没有检测到背景。人ES来源的肝祖细胞在透明CNF水凝胶中包埋并在含有或不含胶原IV情况下培养7天。没有检测到背景，这使得该材料在此方面使用极其容易。通常使用的其它材料例如MatriGel和MaxGel有明显的荧光背景，因此很难与这些基质一起应用。ES细胞能在CNF水凝胶中保持，其存活，因而该材料能够保持它们存活。另外，ES细胞也形成三维结构，这先前还没有在其它任何材料中观察到。
实施例4
葡聚糖通过CNF水凝胶的扩散
关于细胞培养材料的扩散性质的详细知识是很重要的。细胞培养材料应该足够多孔以使得营养和氧气能扩散到达培养的细胞，同样也能从细胞有效扩散代谢物。CNF水凝胶的扩散性质用不同分子量的葡聚糖以以下方式证实：
在TranswellTM过滤孔板的顶部隔室上植入400μl透明或不透明CNF(1％)/过滤器(过滤器孔径0.4μm)。将1ml的PBS加入基底侧并将100μl(25μg)的荧光标记葡聚糖(分子量20k、70k和250k)加入水凝胶的顶部。平板固定牢固并在平板摇晃器上保持原状。100μl样品从基底侧取出并且用PBS等量替代。第一批样品间隔15分钟取出，其它样品在从30分钟到2小时范围的不同时间点取出，最后的样品在24小时时取出。总共取出168个样品。目标平板(OptiPlateTM-96F)分别在490nm激发波长和520nm发射波长测量。
不同分子量的葡聚糖通过1％天然纤维素纳米纤维胶的扩散情况如图4所示。模型化合物以恒定速率扩散且高度依赖于化合物的分子量(尺寸)。显然分子在CNF水凝胶中能够有效扩散，尽管胶结构足够坚固以稳定细胞悬液。
观察到的扩散概况也能用于各种药物递送制剂和应用。药物的扩散能随着药物分子或蛋白(作为药物使用)的尺寸或CNF水凝胶浓度变化来控制。明显的缓释概况对于优选更长释放的某些治疗特别有益，尤其是在肽和蛋白药物的情况下。
实施例5
ARPE19细胞在CNF膜上的增殖
将天然CNF膜放置在96孔组织培养板的底部，溶于维持生长培养基的HepG2细胞悬液在膜顶部接种，所述悬液含有每孔25000-50000个细胞。膜的浓度范围为1.6％-0.01％。在37℃，5％CO2和95％相对湿度的培养箱中于天然CNF膜上培养细胞后，细胞活力和增殖作为天数的函数进行测量。
天然CNF膜上的ARPE-19细胞通过光学显微镜成像。CNF膜在图像(图5)的上部支持细胞的生长，表明ARPE-19细胞能够在CNF膜上二维生长并且该CNF膜用作二维生长基质。
ARPE-19细胞在水凝胶中增殖良好，与使用的细胞浓度无关。在水凝胶之间没有显著差异。水凝胶上培养时的细胞增殖相比没有水凝胶时培养的细胞增加约2倍。
实施例6
三维培养的HepG2细胞团形态
共聚焦激光显微镜
激光共聚焦显微镜用于活细胞成像。CNF水凝胶中已包封HepG2细胞的球形明显说明细胞陷在水凝胶内并三维生长(图6)。取自5天培养后的细胞图像如图6所示，表明细胞在两种水凝胶的三维球体内存活。细胞的活力与水凝胶中细胞的浓度无关并且在所有的培养中球体的尺寸随着时间变化而增加(图6)。
培养基在每48小时之后更新并且球体尺寸在培养中随着时间变化而增加。当纤连蛋白加入CNF水凝胶中时，三维球体内的细胞活力增加。活/死细胞染色共聚焦激光显微图像揭示细胞在5天培养段中保持活力。这些发现与阿拉马蓝细胞增殖试验结果(图2)相关。这个观察结果支持我们关于CNF水凝胶模仿人ECM组分的假设。其含有除了纤连蛋白以外的所有ECM关键组分。因此添加纤连蛋白促进了三维簇中细胞的活力。纤连蛋白促进HepG2细胞的附着和活力。先前显示纤连蛋白增加肝细胞存活并通过结合整联蛋白β1而减少凋亡。
通过这种方式，能够在仅有CNF水凝胶而没有其他任何支持材料或ECM组分下显示所得HepG2细胞的三维结构。这证明了使用CNF水凝胶作为三维细胞培养基质的有用性和简单性。
实施例7
凝胶强度
三维细胞培养基的一个重要功能是保持细胞在基质中均匀分布并防止沉淀。CNF通过其在极低浓度(0.5％)下形成凝胶网络的能力满足这个要求。CNF的胶样结构通过动态振荡流变测量检测其粘弹性来显示。频率扫描的结果显示典型的胶样性质。储能模量(G’)比损耗模量(G’)高出几个数量级并几乎与频率无关，其意味着弹性(固样)性质比黏性(液样)特性更加明显(图7)。G’和G”与频率相对无关也是胶的典型性质。CNF胶的粘弹性质在流变仪(AR-G2,TA仪器公司(TA Instruments))中以0.1％应变用振荡频率扫描测量测定。
实施例8
CNF水凝胶的流动性
CNF水凝胶的流变流动性质显示数对细胞培养应用有益的特性。水凝胶就最佳细胞悬浮能力而言具有低剪切率(或静止)下的高粘弹性，但也在较高剪切率显示剪切稀化性质以能简单分散和注射。CNF提供这些种类流变性质的能力在一个测试系列中证明，其中CNF分散体的粘度用转动流变仪(AR-G2,英国的TA仪器公司)在广泛剪切应力(比率)范围内测量。
CNF分散体显示比其他水溶聚合物高得多的零剪切粘度(在小剪切应力下恒定粘度的区域)，如图8所示。CNF的零剪切粘度通过对原料的事先化学预处理诱导的更小纳米纤维直径而大大增加。剪切稀化行为开始时的压力(“屈服应力”)就CNF分散体而言也很高。屈服应力越高，材料悬浮的能力越好。细胞通过高零剪切黏性和高屈服应力和高储能模量的组合效应能有效稳定防止沉淀。细胞施加的重力比屈服应力弱得多。因此，如果胶基质与CNF混合，悬浮的细胞在胶基质内部“冷冻”或如果沉积在胶的顶部，细胞在胶上“冷冻”。
在图9中，粘度表示为所测剪切率的函数。如图9所示，CNF分散体的粘度在相对较小剪切率下减少并达到与参比材料在剪切率约200s-1下所测相似的水平。
CNF的网络结构在剪切后破裂(图7)。应用某一压力后，系统的黏性大幅下降且发生从固样向液样的转变。这种性质是有益的，因为其能通过温和机械剪切而在CNF悬液中均匀混合细胞。当两相液体如絮凝的CNF分散体被剪切时(例如，在流变仪或在试管中)，分散相倾向于离开固体边界，这导致在容器壁产生较低粘度液层(图10)。这种现象意味着流动阻力，例如边界处的粘度比大量分散体内低(Barnes,1995)。相对而言，用注射器和针头或移液器注射CNF水凝胶甚至在高浓度下(1-4％)容易。所述现象也能简单分散细胞悬液而对细胞扰动最小，例如大多数细胞位于针头中间并且实际上静止(图10)。
当考虑注射制剂时，CNF水凝胶的简单可注射性也是重要的特征。如实施例6所述，CNF水凝胶有能用于持续和可控药物释放应用的释放概况。这两个关于CNF水凝胶的发现能用于多种潜在的药物治疗应用，如眼内、肌肉内、皮下治疗或例如粘弹性滴眼液制剂。
实施例9
在剪切停止后的结构恢复
另一个CNF水凝胶的重要流变性质是在剪切(例如注射或混合)停止后的高粘度水平。CNF分散体的结构恢复在一个测试系列中证明，其中材料首先在流变仪(StressTech,Reologica仪器公司(Reologica Instruments Ab))中以高剪切率剪切，并在停止剪切后通过振荡时间扫描测量监控凝胶强度(G’)。剪切循环在同心圆筒几何结构中以40Pa恒定压力进行61秒。此测试中剪切率和粘度的演变如图10所示。材料在相对较高剪切率(1000s-1)下剪切至少40秒时间，期间材料的粘度下降到低于40mPa·秒。
在停止剪切后，通过恒定频率(1赫兹)和小压力(0.5帕)下的振荡测量跟踪G’(凝胶强度的量度)的变化。测量在剪切停止后10秒精确开始。如图11所示，显然当CNF分散体在高剪切率下剪切后能静止时，极迅速形成凝胶网络。在剪切停止(等于图11中的时间零点)后10秒已经观察到大量结构恢复。恒定的储能模量(G’)水平在CNF分散体静止不到10分钟后达到。经充分剪切的CNF分散体所发展出的G’水平与结构恢复测试之前用玻璃棒仅仅温和混合的CNF分散体相当。
当0.7％天然CNF分散体在同心圆筒几何结构的流变仪中以40帕的恒定压力剪切时，剪切率和粘度的变化如图11所示。
与用玻璃棒温和混合相比，0.7％的天然CNF分散体在高剪切率剪切下的结构恢复如图12所示。
就两个原因而言快速结构恢复对于水凝胶细胞培养材料重要。第一，其使得细胞能够在与水凝胶混合后均匀分布于CNF水凝胶中。第二，如果CNF水凝胶用于转运培养的细胞，快速恢复的胶结构有效地抓住细胞至需要的位置，所述迁移极小，例如当考虑细胞移植时。快速恢复对注射药物释放制剂也是必要的。
实施例10
稳定性
如实施例1所示，即使非常稀的CNF在低的剪切比率下有很高的粘度。水凝胶结构在剪切、如注射停止时也能够恢复。在静态条件下，CNF形成有高弹性模量和出乎意料的高屈服应力的水凝胶网络。因为这些性质，CNF甚至在非常低的浓度下有非常高的固体颗粒悬浮能量。
在静态条件下的悬浮能力用砂砾悬浮证实。0.5％分散物的天然CNF和透明CNF能够很长时间内甚至稳定2-3mm尺寸的砂砾颗粒，见图13。应注意，透明CNF能够在比天然CNF更低的浓度下稳定颗粒悬浮物。
实施例11
酶促水解
通常已知某些酶纤维素酶能够水解纤维素中的β-(1-4)-键。例如内-1,4-β-葡聚糖酶(EG)靶向纤维素链中除了链末端以外的随机位置；外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶(CBH)在链的两个末端同时分裂分子而产生纤维二糖二聚体；和β-葡糖苷酶(BGL)水解纤维二糖单位(在EG和CBH攻击期间形成)到葡萄糖。纤维素纳米纤维能在纤维素酶的帮助下酶促水解为葡萄糖(Ahola,S.,Turon,X.,M.,Laine,J.,Rojas,O.J.,Langmuir,2008,24,11592-11599)。
纤维素的酶促水解能出于多种原因而用于含有纤维素纳米纤维的细胞培养系统。CNF水凝胶水解后，培养基的粘度大幅降低并且培养的细胞结构易可及，例如用于染色。在水解之后，细胞结构能够在没有含纤维素材料的情况下转移或移植。降解产物即葡萄糖，通常对细胞没有毒性并能够用作细胞培养的营养物。
纤维素纳米纤维的酶促水解能在不同纤维素酶帮助下于不同环境中进行。图14中，证明市售Celluclast酶对胶悬浮力的效果。天然和透明CNF水凝胶由于胶结构的酶促水解而释放悬浮力。培养的细胞系也可遗传工程改造成在培养系统中产生所需的酶蛋白。

Claims (19)

1.一种细胞培养或细胞递送组合物，其特征是所述组合物包含水凝胶或湿膜形式的植物来源的、机械崩解的纤维素纳米纤维和/或其衍生物。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征是所述纤维素纳米纤维和/或其衍生物中的纤维素纳米纤维或纳米纤维束的直径小于1μm，优选小于200nm，更优选小于100nm。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征是所述纤维素纳米纤维和/或其衍生物包括化学或物理修饰的纤维素纳米纤维或纳米纤维束的衍生物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其特征是所述机械崩解的纤维素纳米纤维经过酸-碱预处理。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征是所述组合物还包括选自下组的添加剂：胞外基质组分、血清、生长因子和蛋白质。
6.一种细胞培养或细胞递送基质，其特征是所述基质包括活细胞以及如权利要求1-5中任一项所述的组合物，形成水凝胶，所述细胞在所述基质中以三维或二维排列存在。
7.如权利要求6所述的基质，其特征是所述细胞是真核细胞或原核细胞。
8.一种制备如权利要求1-5中任一项所述的组合物的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：
-提供植物来源的、机械崩解的纤维素纳米纤维和/或其衍生物，
-将所述纤维素纳米纤维和/或其衍生物与水混合。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是方法还包括将所述混合物与合适的药物组合。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征是所述机械崩解的纤维素纳米纤维经过酸-碱预处理。
11.一种从细胞培养材料中去除基于植物的纤维素纳米纤维和/或其衍生物的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：
-提供包括细胞培养基和细胞的材料；
-用水性或非水性液体稀释所述材料；
-任选地离心材料以沉淀细胞和细胞聚集物；
-倾倒去除纤维素纳米纤维。
12.一种从细胞培养材料中去除基于植物的纤维素纳米纤维和/或其衍生物的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：
-提供包括细胞培养基和细胞的材料；
-使所述细胞培养材料与降解酶接触；
-任选地离心材料以沉淀细胞和细胞聚集物；
-倾倒去除纤维素纳米纤维。
13.植物来源的、机械崩解的纤维素纳米纤维和/或其衍生物或如权利要求1-5中任一项所述的组合物作为培养基或体外维持细胞的培养基的化合物用于实验室和/或工业目的的微生物应用。
14.用如权利要求1-5中任一项所述的组合物用于固定细胞或酶的应用。
15.一种培养细胞的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：
-提供细胞；
-使所述细胞与如权利要求1-5中任一项所述的组合物接触以形成基质；
-在所述基质内以三维或二维排列培养细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征是在培养之前，所述基质转移或放置到用于细胞培养或细胞递送的环境中。
17.如前述权利要求中任一项或多项所述的组合物、方法或应用，其特征是所述细胞是真核细胞。
18.如前述权利要求中任一项或多项所述的组合物、方法或应用，其特征是所述细胞是原核细胞。
19.如前述权利要求中任一项或多项所述的组合物、方法或应用，其特征是所述细胞是干细胞。
CN201710872909.XA 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料 Active CN107557330B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20106121 2010-10-27
FI20106121A FI123988B (fi) 2010-10-27 2010-10-27 Soluviljelymateriaali
PCT/FI2011/050939 WO2012056109A2 (en) 2010-10-27 2011-10-26 Plant derived cell culture material
CN2011800627192A CN103354834A (zh) 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800627192A Division CN103354834A (zh) 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107557330A true CN107557330A (zh) 2018-01-09
CN107557330B CN107557330B (zh) 2022-09-13

Family

ID=43064279

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800627192A Pending CN103354834A (zh) 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料
CN201710872909.XA Active CN107557330B (zh) 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800627192A Pending CN103354834A (zh) 2010-10-27 2011-10-26 植物来源细胞培养材料

Country Status (16)

Country Link
US (3) US20140010790A1 (zh)
EP (4) EP2632493B1 (zh)
JP (3) JP6321961B2 (zh)
CN (2) CN103354834A (zh)
AU (1) AU2011322363B2 (zh)
BR (1) BR112013010377B1 (zh)
CA (1) CA2815276C (zh)
DK (3) DK2632493T3 (zh)
ES (3) ES2537268T3 (zh)
FI (1) FI123988B (zh)
HK (1) HK1188466A1 (zh)
IL (1) IL225923B (zh)
PL (2) PL2975115T3 (zh)
RU (1) RU2597978C2 (zh)
SG (1) SG189966A1 (zh)
WO (3) WO2012056111A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112138215A (zh) * 2020-09-26 2020-12-29 江苏大学 基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用
CN112334492A (zh) * 2018-06-13 2021-02-05 芬欧汇川集团 纳米原纤纤维素产品及其制造方法
CN112755240A (zh) * 2019-07-29 2021-05-07 芬欧汇川集团 包含纳米原纤纤维素的医用水凝胶，定制伤口敷料及其制备方法

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI123988B (fi) 2010-10-27 2014-01-31 Upm Kymmene Corp Soluviljelymateriaali
FI130619B (en) 2011-11-15 2023-12-15 Upm Kymmene Corp Matrix for controlled release of bioactive substances
FI123694B (en) * 2011-12-22 2013-09-30 Upm Kymmene Corp Matrix and composition for microbial culture of gram-positive bacteria
FI123715B (en) * 2011-12-22 2013-09-30 Upm Kymmene Corp Composition for embedded microbial culture
FI126055B (en) * 2012-05-14 2016-06-15 Upm Kymmene Corp A method of making a film from fibril pulp and a fibril pulp film
FI125965B (en) * 2012-09-25 2016-04-29 Upm Kymmene Corp Three-dimensional cell culture
JP5846449B2 (ja) * 2012-11-12 2016-01-20 北越紀州製紙株式会社 電池用セパレータの製造方法及び電池用セパレータ
CN102978256B (zh) * 2012-12-26 2013-11-20 东华大学 一种连续生产细菌纤维素的方法
FI126109B (en) 2013-02-22 2016-06-30 Upm Kymmene Corp Nanofibril polysaccharide for use in the control and prevention of constriction and scarring
JP2016533498A (ja) 2013-07-18 2016-10-27 ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ 溶剤反発材料を使用したパターン紙上でのパラレル有機合成
CN103422379B (zh) * 2013-08-19 2016-03-30 南京林业大学 一种甘蔗渣纤维素纳米纤维膜的制备方法
FI126854B (en) * 2013-12-30 2017-06-30 Upm Kymmene Corp The membrane, its use and the method for making the membrane
KR102232289B1 (ko) * 2014-01-23 2021-03-26 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 배양 배지 조성물
KR102368213B1 (ko) * 2014-01-23 2022-02-28 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 미분화성 유지 배양재료
JP6369044B2 (ja) * 2014-02-19 2018-08-08 凸版印刷株式会社 培養装置およびその製造方法
JP2015159778A (ja) * 2014-02-28 2015-09-07 日本バイリーン株式会社 光学的測定用細胞培養担体、光学的測定用ウェルプレート、及び細胞の光学的測定方法
JP6684719B2 (ja) * 2014-03-10 2020-04-22 株式会社スリー・ディー・マトリックス ペプチド組成物の滅菌および濾過
JP6681872B2 (ja) * 2014-03-21 2020-04-15 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ −オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 細胞外マトリクス由来最終滅菌ヒドロゲルの調製方法
JP5727657B1 (ja) * 2014-09-22 2015-06-03 第一工業製薬株式会社 セルロースナノファイバー分散体の製造方法。
EP3011952A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-27 Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs- Time-controlled glucose releasing hydrogels and applications thereof
EP3912652B1 (en) 2014-12-18 2023-11-15 CELLINK Bioprinting AB Bacterial cellulose nanofibrillar bioink for 3d bioprinting for cell culturing, tissue engineering and regenerative medicine applications
FI126398B (en) 2014-12-18 2016-11-15 Upm Kymmene Corp Procedure for testing chemicals
FI125884B2 (en) 2014-12-22 2019-03-29 Upm Kymmene Corp Treatment of a high temperature nanofibrillar cellulose hydrogel
FI125883B (en) 2014-12-22 2016-03-31 Upm Kymmene Corp Treatment of Catalytically Oxidized Nanofibril Cellulose Hydrogel
FI126120B (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Upm Kymmene Corp Process for preparation of oxidized hydrogel of nanofibrillar cellulose
FI125758B (en) 2014-12-22 2016-02-15 Upm Kymmene Corp A method for reducing the viscosity of nanofibrillar cellulose hydrogel
WO2016146616A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Ventana Medical Systems, Inc. Control slides for immunohistochemistry generated from three-dimensional cell line cultures
US11390835B2 (en) * 2015-05-08 2022-07-19 University Of Florida Research Foundation, Inc. Growth media for three-dimensional cell culture
FI127834B (en) 2015-06-04 2019-03-29 Upm Kymmene Corp Process for the production of nanofibril cellulose hydrogel
AU2016315779B2 (en) * 2015-08-31 2022-04-21 Cormedix Inc. Delivery of active agents using nanofiber webs
WO2017114856A1 (de) * 2015-12-30 2017-07-06 Empa Eidgenössische Materialprüfungs- Und Forschungsanstalt Verfahren zur verbesserung der akustischen eigenschaften von fichten-klangholz
EP3232432A1 (de) * 2016-04-11 2017-10-18 EMPA Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt Verfahren zur verbesserung der akustischen eigenschaften von fichten-klangholz
JP2017127264A (ja) * 2016-01-21 2017-07-27 株式会社スギノマシン アスペルギルス・オリゼ由来のホルムアルデヒド分解酵素およびホルムアルデヒド分解酵素を用いたホルムアルデヒドの分解方法
JP2017189164A (ja) * 2016-04-08 2017-10-19 三菱ケミカル株式会社 細胞及び／又は細胞外マトリックス成分を含む組成物
WO2017199737A1 (ja) * 2016-05-16 2017-11-23 富士フイルム株式会社 培養細胞の回収方法および培養細胞分散液
WO2017214592A1 (en) * 2016-06-09 2017-12-14 Paul Gatenholm Preparation of modified cellulose nanofibrils with extracellular matrix components as 3d bioprinting bioinks
JP6758621B2 (ja) * 2016-10-17 2020-09-23 株式会社日本触媒 細胞培養用基材およびその製造方法、ならびにこれを利用した細胞培養容器および細胞培養方法
JP6874329B2 (ja) * 2016-11-01 2021-05-19 凸版印刷株式会社 ホルムアルデヒド除去組成物およびその製造方法、ホルムアルデヒド除去シート
CN106544281B (zh) * 2016-12-07 2019-07-02 哈尔滨工业大学 一种基于蛋白质和多糖构筑生物体保护层的制备方法
EP3335740A1 (en) * 2016-12-15 2018-06-20 UPM-Kymmene Corporation Medical hydrogel
DE102017000368A1 (de) 2017-01-16 2018-07-19 Gabriele Blume Einbringen von schwer und/oder nicht wasserlöslichen Wirkstoffen mittels auf Lipiden basierenden Nanopartikeln/Vesikeln in ein hydrophiles aus Cellulose bestehendes dreidimensionales Netzwerk.
WO2018182016A1 (ja) * 2017-03-30 2018-10-04 日産化学株式会社 ナノファイバーを用いた細胞培養
WO2018191244A1 (en) * 2017-04-10 2018-10-18 TheWell Bioscience Hydrogel for cell culture and biomedical applications
EP3418377B1 (en) * 2017-06-22 2024-04-17 UPM-Kymmene Corporation Supportive nanofibrillar cellulose scaffold for expanding cells
JP7132566B2 (ja) * 2017-09-04 2022-09-07 学校法人早稲田大学 チキソトロピー性を有するゲルを用いる多層３次元細胞培養足場システム
JP7349156B2 (ja) * 2017-12-21 2023-09-22 エイチ アンド エー ファーマケム カンパニー，リミテッド 金属有機構造体及びナノセルロースを用いた経皮送達用複合体
CN108300713A (zh) * 2017-12-31 2018-07-20 宁波大学 固定细胞的方法及装置
WO2019145795A2 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Cellink Ab Systems and methods for optical assessments of bioink printability
SI3533458T1 (sl) * 2018-03-02 2023-09-29 Upm-Kymmene Corporation Medicinski izdelek, ki vsebuje bioaktivno molekulo, ki je imobilizirana na nanofibrilarno celulozo in postopek za njegovo pripravo
WO2019181294A1 (ja) * 2018-03-23 2019-09-26 国立研究開発法人物質・材料研究機構 スルホン化セルロースナノファイバーを含むハイドロゲル
EP3616730A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-04 UPM-Kymmene Corporation Composition or matrix for storage of bacteriophages comprising nanofibrillar cellulose
US11186736B2 (en) 2018-10-10 2021-11-30 Cellink Ab Double network bioinks
BR112021021158A2 (pt) * 2019-04-22 2021-12-28 Elc Man Llc Sistema de aplicação tópica contendo nanofibras de celulose
EP3750982A1 (en) * 2019-06-10 2020-12-16 UPM-Kymmene Corporation Cell culture plate, method for preparing thereof and method for detecting a substance
HUP1900226A1 (hu) * 2019-06-21 2020-12-28 Hummel Zoltan Dr Hidrofil mikrobiális cellulóz nanorostokat tartalmazó hordozóanyag (gél) a bélnyálkahártya állapotának javítására
CN114026223A (zh) * 2019-06-24 2022-02-08 芬欧汇川集团 包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞的可移植细胞组合物、其制备方法和纳米原纤纤维素的用途
CN110387060B (zh) * 2019-07-15 2021-10-29 陕西科技大学 一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用
US11826951B2 (en) 2019-09-06 2023-11-28 Cellink Ab Temperature-controlled multi-material overprinting
EP3791858A1 (en) * 2019-09-13 2021-03-17 UPM-Kymmene Corporation Injectable pharmaceutical formulation
EP3791864A1 (en) 2019-09-13 2021-03-17 UPM-Kymmene Corporation Method for preparing pharmaceutical composition and pharmaceutical composition
US11131059B2 (en) * 2019-11-15 2021-09-28 Innovatech Engineering Llc Nanocellulose composite sheet for use as dermatological treatment or medical device
US11793230B2 (en) 2019-12-09 2023-10-24 Nicoventures Trading Limited Oral products with improved binding of active ingredients
US11969502B2 (en) 2019-12-09 2024-04-30 Nicoventures Trading Limited Oral products
US20220295861A1 (en) * 2019-12-09 2022-09-22 Nicoventures Trading Limited Oral composition with nanocrystalline cellulose
US11826462B2 (en) 2019-12-09 2023-11-28 Nicoventures Trading Limited Oral product with sustained flavor release
US11872231B2 (en) 2019-12-09 2024-01-16 Nicoventures Trading Limited Moist oral product comprising an active ingredient
US20210170031A1 (en) * 2019-12-09 2021-06-10 Nicoventures Trading Limited Oral composition with nanocrystalline cellulose
GB2592240B (en) 2020-02-21 2022-03-23 Advanced Biofuel Solutions Ltd Waste processing system
JP2021136912A (ja) * 2020-03-04 2021-09-16 国立大学法人東海国立大学機構 細胞の機能を変化させる方法
US20230301906A1 (en) * 2020-07-31 2023-09-28 Ocean Tunicell As Biocompatible, injectable and in situ gelling hydrogels and preparation and applications of biocompatible, injectable and in situ gelling hydrogels based on cellulose nanofibrils for tissue and organ repair
CN118076394A (zh) * 2021-09-02 2024-05-24 昆士兰大学 可注射组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1718172A (zh) * 2005-07-20 2006-01-11 同济大学 一种组织工程血管及其体外构建方法
CN1730734A (zh) * 2005-08-19 2006-02-08 清华大学 一种天然纳米纤维的制备方法

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0243151B1 (en) 1986-04-22 1992-12-16 Ajinomoto Co., Inc. Modified microbially-produced cellulose gel and complex thereof with animal cell
US5254471A (en) 1986-10-06 1993-10-19 Toray Industries, Inc. Carrier for cell culture
US5405953A (en) * 1993-08-03 1995-04-11 Biocontrol Incorporated Microfibrillated oxycellulose
US6602994B1 (en) 1999-02-10 2003-08-05 Hercules Incorporated Derivatized microfibrillar polysaccharide
US7449180B2 (en) 2001-02-06 2008-11-11 John Kisiday Macroscopic scaffold containing amphiphilic peptides encapsulating cells
WO2004007683A2 (en) 2002-07-15 2004-01-22 Massachusetts Institute Of Technology Cellular reprogramming in peptide hydrogel and uses thereof
US20050037082A1 (en) 2003-08-13 2005-02-17 Wan-Kei Wan Poly(vinyl alcohol)-bacterial cellulose nanocomposite
US20080146701A1 (en) 2003-10-22 2008-06-19 Sain Mohini M Manufacturing process of cellulose nanofibers from renewable feed stocks
US7704740B2 (en) 2003-11-05 2010-04-27 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
CA2615717A1 (en) 2005-07-20 2007-01-25 Surmodics, Inc. Polymer coated nanofibrillar structures and methods for cell maintenance and differentiation
US8951551B2 (en) 2005-08-31 2015-02-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiribbon nanocellulose as a matrix for wound healing
US20090317437A1 (en) 2005-12-06 2009-12-24 Albert Mihranyan Cellulose gel formulations
US20070275458A1 (en) 2005-12-09 2007-11-29 The Research Foundation Of State University Of New York Three dimensional-BIO-mimicking active scaffolds
WO2007129991A1 (en) 2006-05-04 2007-11-15 Agency For Science Technology And Research Mechanically reversible gel
JP4998981B2 (ja) 2006-06-20 2012-08-15 国立大学法人 東京大学 微細セルロース繊維
US20080193536A1 (en) * 2006-08-14 2008-08-14 Alireza Khademhosseini Cell-Laden Hydrogels
JP5030667B2 (ja) 2007-05-29 2012-09-19 国立大学法人京都大学 ミクロフィブリル化セルロース複合樹脂及びその製造方法
JP2008308802A (ja) 2007-06-18 2008-12-25 Univ Of Tokyo セルロースナノファイバーの製造方法
US8834917B2 (en) * 2007-11-13 2014-09-16 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research Nanoparticle composition and process thereof
WO2009095562A2 (fr) 2007-11-14 2009-08-06 Ma.I.A Woundcare Biomateriau permettant la delivrance controlee d'actifs
JP5260033B2 (ja) 2007-11-27 2013-08-14 花王株式会社 食後ｇｉｐ及び／又は食後インスリン分泌抑制剤
DE102008014735A1 (de) 2008-03-18 2009-09-24 Studiengesellschaft Kohle Mbh Verfahren zur Depolymerisation von Zellulose
SE0800807L (sv) * 2008-04-10 2009-10-11 Stfi Packforsk Ab Nytt förfarande
AT506657A1 (de) 2008-04-14 2009-10-15 Chemiefaser Lenzing Ag Cellulosebasiertes hydrogel und verfahren zu seiner herstellung
JP5386866B2 (ja) 2008-06-30 2014-01-15 国立大学法人京都大学 ナノファイバーシート
JP2010013604A (ja) * 2008-07-07 2010-01-21 Toray Ind Inc セルロース分散体
US20100065236A1 (en) * 2008-09-17 2010-03-18 Marielle Henriksson Method of producing and the use of microfibrillated paper
US9861096B2 (en) 2008-10-01 2018-01-09 Cornell University Biodegradable chemical delivery system
CN102481527B (zh) 2008-10-07 2015-04-01 纽约州立大学研究基金会 高通量高效率纳米纤维膜及其制备方法
CN101392246A (zh) 2008-10-29 2009-03-25 东北电力大学 一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法
US20100172889A1 (en) 2008-12-05 2010-07-08 Catchmark Jeffrey M Degradable biomolecule compositions
FI124724B (fi) 2009-02-13 2014-12-31 Upm Kymmene Oyj Menetelmä muokatun selluloosan valmistamiseksi
US9192655B2 (en) 2009-03-12 2015-11-24 New Jersey Institute Of Technology System and method for a hydrogel and hydrogel composite for cartilage repair applications
ES2524090T3 (es) * 2009-03-30 2014-12-03 Omya Development Ag Proceso para la producción de geles de celulosa nanofibrilar
JP5243371B2 (ja) 2009-09-07 2013-07-24 第一工業製薬株式会社 ゲル状組成物
WO2011079380A1 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Axcelon Biopolymers Corporation Transparent bacterial cellulose nanocomposite hydrogels
FI123988B (fi) 2010-10-27 2014-01-31 Upm Kymmene Corp Soluviljelymateriaali

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1718172A (zh) * 2005-07-20 2006-01-11 同济大学 一种组织工程血管及其体外构建方法
CN1730734A (zh) * 2005-08-19 2006-02-08 清华大学 一种天然纳米纤维的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何小维主编: "《碳水化合物功能材料》", 31 January 2007, 中国轻工业出版社 *
化学工业出版社组织编写: "《中国化工产品大全 第三版 上卷》", 31 January 2005, 化学工业出版社 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112334492A (zh) * 2018-06-13 2021-02-05 芬欧汇川集团 纳米原纤纤维素产品及其制造方法
CN112334492B (zh) * 2018-06-13 2023-02-28 芬欧汇川集团 纳米原纤纤维素产品及其制造方法
CN112755240A (zh) * 2019-07-29 2021-05-07 芬欧汇川集团 包含纳米原纤纤维素的医用水凝胶，定制伤口敷料及其制备方法
CN112755240B (zh) * 2019-07-29 2023-02-17 芬欧汇川集团 包含纳米原纤纤维素的医用水凝胶，定制伤口敷料及其制备方法
CN112138215A (zh) * 2020-09-26 2020-12-29 江苏大学 基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用
CN112138215B (zh) * 2020-09-26 2021-11-05 江苏大学 基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用
WO2022062282A1 (zh) * 2020-09-26 2022-03-31 江苏大学 基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011322363B2 (en) 2015-07-09
IL225923B (en) 2018-01-31
WO2012056110A3 (en) 2012-06-14
EP2633032A2 (en) 2013-09-04
WO2012056111A2 (en) 2012-05-03
RU2013122757A (ru) 2014-12-10
US10612003B2 (en) 2020-04-07
DK2975115T3 (da) 2019-11-04
US20140010790A1 (en) 2014-01-09
EP2632493A2 (en) 2013-09-04
CN107557330B (zh) 2022-09-13
FI20106121L (fi) 2012-04-28
US20130344036A1 (en) 2013-12-26
EP2632493B1 (en) 2015-12-30
DK2633032T3 (en) 2015-05-04
EP2633033B1 (en) 2016-04-06
FI20106121A0 (fi) 2010-10-27
DK2632493T3 (da) 2016-03-14
CA2815276A1 (en) 2012-05-03
JP2013541956A (ja) 2013-11-21
JP2013540804A (ja) 2013-11-07
WO2012056110A2 (en) 2012-05-03
JP6448755B2 (ja) 2019-01-09
SG189966A1 (en) 2013-06-28
US20130330379A1 (en) 2013-12-12
ES2759257T3 (es) 2020-05-08
ES2565958T3 (es) 2016-04-07
RU2597978C2 (ru) 2016-09-20
EP2633033A2 (en) 2013-09-04
BR112013010377A2 (pt) 2016-07-05
PL2633032T3 (pl) 2015-08-31
JP2018102291A (ja) 2018-07-05
ES2537268T3 (es) 2015-06-05
IL225923A0 (en) 2013-06-27
EP2633032B1 (en) 2015-02-25
WO2012056111A3 (en) 2012-06-14
BR112013010377B1 (pt) 2021-01-19
HK1188466A1 (zh) 2014-05-02
JP6321961B2 (ja) 2018-05-09
PL2975115T3 (pl) 2020-05-18
WO2012056109A2 (en) 2012-05-03
FI123988B (fi) 2014-01-31
EP2975115B1 (en) 2019-09-11
WO2012056109A3 (en) 2012-06-28
FI20106121A (fi) 2012-04-28
CA2815276C (en) 2019-09-10
CN103354834A (zh) 2013-10-16
EP2975115A1 (en) 2016-01-20
US9631177B2 (en) 2017-04-25
AU2011322363A1 (en) 2013-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107557330A (zh) 植物来源细胞培养材料
Curvello et al. Engineering nanocellulose hydrogels for biomedical applications
CN108025110A (zh) 可注射大孔水凝胶
JP6441680B2 (ja) グラム陽性菌の微生物培養のためのマトリックス及び組成物
EP3418377B1 (en) Supportive nanofibrillar cellulose scaffold for expanding cells
Zhang et al. Recent advances of cellulose nanofiber-based materials in cell culture: From population to single-cell
CN114026223A (zh) 包含位于纳米原纤纤维素水凝胶中的真核细胞的可移植细胞组合物、其制备方法和纳米原纤纤维素的用途
Kim et al. Recent advances and biomedical application of 3D printed nanocellulose-based adhesive hydrogels: A review
RU2772470C2 (ru) Поддерживающий каркас на основе нанофибриллярной целлюлозы для растущих клеток

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant