CN112138215A - 基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用 - Google Patents

基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药材料技术领域，尤其是一种基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用，该方法包括以下步骤：(1)制备纸浆纤维；(2)将纸浆纤维进行清洗过滤；(3)采用清洗干净的纸浆纤维制取高纯纳米纤维素水凝胶；(4)用纳米纤维素水凝胶制得纳米纤维素薄膜；(5)将纳米纤维素薄膜浸入溶解有成纤细胞生长因子以及复合纤维素酶的溶液中，4℃原位吸附润胀，同步形成各向异性三维立体支架；(6)将制得的载有成纤细胞生长因子和复合纤维素酶的纳米纤维素水凝胶支架用无菌水冲洗，根据需要切割成不同形状尺寸，冷冻干燥，制得基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架。

Description

基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物医药材料技术领域，具体领域为一种细胞生长因子缓释支架。
背景技术
细胞生长因子是一类能刺激细胞增殖，促进细胞分化和成熟，调节细胞各类活动与功能的活性蛋白质或多肽类物质。例如，碱性成纤细胞生长因子(bFGFs)能促进成纤细胞增殖，修复受损细胞和组织；血小板衍生生长因子(PDGF)在血管新生中扮演重要角色；转化生长因子(TGF)具有促进胚胎发育、伤口愈合、趋化作用和细胞周期调控的生物效应。细胞生长因子在组织工程、创伤愈合、血管形成、神经系统等疾病的临床治疗中显示出巨大的潜力。然而，由于游离细胞生长因子在体内具有生物活性半衰期较短、代谢快、易被酶解的特点，体内注射或体外培养添加均存在生长因子利用率低下，需要多次施药和添加以达到预期目的，从而增加了病患的痛苦和经济负担。因此临床治疗和科学研究中均迫切需求开发具有能够维持生长因子活性并提供靶向和可控释放的产品。
细胞生长因子缓释是通过将具有生物活性的各类细胞生长因子与生物相容性材料或载体复合，制成具有保持细胞生长因子活力并调控其释放速率的产品，以用于科学研究和临床治疗。
例如，专利CN105288749A通过将生长因子与壳聚糖、聚乳酸、明胶等生物材料混合，冷冻干燥后制得一种释放生长因子的生物材料支架；专利CN102172418A将血管再生生长因子与无细胞基质，以及聚乙交酯丙交酯、聚己内酯等可降解疏水聚合物通过乳化冻干，制得可长期、平稳缓释生长因子的无细胞基质；再如，专利CN101279104B将表皮生长因子和碱性成纤细胞生长因子与源于动物皮或结缔组织的胶原蛋白复合，冷冻干燥后制得包含有生长因子的胶原蛋白海绵用于加速慢性难愈合创伤的愈合。
然而，现有的报道和相关发明制备的材料尚存在细胞因子与基质材料结合简单，基质材料难以降解或降解不可控，导致其释放速率无法精准调控，快速或过量释放导致活性丧失以及生物安全问题。
此外，动物来源的基质材料存在免疫反应以及批次差异等缺陷和不足，限制了细胞生长因子的应用范围和疗效发挥，在临床应用和科学研究中带来诸多不便。
纳米纤维素在制备过程中易于形成水凝胶，其高度水化的三维网络结构能够很好的模拟人体器官组织中的细胞外基质，从而为细胞黏附、生长、繁殖提供良好的三维微环境。由于其优异的生物相容性，理化性能可精确调控性，且无免疫过敏及排斥反应，目前国内外开发基于纳米纤维素的生物医用材料在人造器官、组织工程、伤口修复等临床治疗及科学研究中得到日趋广泛的应用。
组织工程支架材料的网络结构及拓扑形貌，尤其微米至纳米级别各向异性排列的支架或基质结构会直接影响细胞形态及细胞行为，是维持细胞显性以及诱导细胞定向分化的强有力工具。然而，当前，包括常规纳米纤维素在内的绝大多数水凝胶，其三维网络骨架本质上还是各向同性的无序排列结构，缺乏像肌肉、软骨、心脏瓣膜等天然组织在微观尺度上的各向异性结构和优异的力学性能。虽然来源于动物基底膜的凝胶(Matrigel)网络结构也可以为组织工程培养研究提供良好的平台，但是其批次差异性导致力学性能和网络结构难以调控，而且潜在的携带病原体或抗原容易引发感染和触发免疫反应。现有的纳米纤维素支架，例如商业化产品UPM GrowDex水凝胶虽然能为细胞生长繁殖提供理想的三维网络环境，但是支架网络为杂乱无序的结构，缺乏天然组织在微观尺度上的各向异性结构，无法有效起到维持细胞显性以及诱导细胞定向分化。
因此，构建具有各向异性结构网络的细胞生长因子缓释支架材料，以满足组织工程支架材料在生物相容性上对结构和功能的双重要求，是生物医用材料研究和开发的关键内容，是目前迫切需要攻克的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于纳米纤维素的具有各向异性结构网络的细胞生长因子缓释支架及构建方法和应用，以解决目前细胞生长因子缓释材料存在的上述缺陷，同时构建各向异性支架从而动态的为细胞和组织提供结构和力学支持，实现开发具有能够维持生长因子活性并提供靶向和可控释放的产品的目标。
本发明先通过TEMPO催化氧化结合高压均质处理，制取超纯纳米纤维素及其薄膜；然后纳米纤维素薄膜原位吸附细胞生长因子以及纤维素降解酶，同步形成三维立体支架材料，最后冷冻干燥制得基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架。
具体的，本发明提供如下技术方案：
一种基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，包括以下步骤：
(1)制备纸浆纤维：将云杉溶解浆纤维1千克分散于30升无菌水中搅拌分散均匀，加入50-100克氢氧化钠，20-40毫升30％过氧化氢，搅拌均匀，120℃高压灭菌60分钟。
(2)将纸浆纤维进行清洗过滤：将步骤(1)中的纸浆纤维用无菌水过滤清洗至滤液pH中性。
(3)制取高纯纳米纤维素水凝胶：将清洗干净的纸浆纤维分散在50升无菌水中搅拌，加入10-15克2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基、50-100克溴化钠、3-5L 10％次氯酸钠，调节并保持pH至10.5，室温下搅拌反应3-6小时，1.0M HCl调节体系pH至7.0；300目尼龙网过滤，使用无菌水清洗直至滤液电导率低于5μS/cm；将清洗干净的纸浆纤维分散在30-50升无菌水中搅拌均匀，分别以300bar和1000bar的压力通过高压均质机，制得高纯纳米纤维素水凝胶。
(4)将制得的纳米纤维素水凝胶，使用无菌水稀释至浓度为0.1％，倒入装载有PVDF滤膜的真空抽滤器，真空抽滤，收集滤饼；转移至热压干燥机，在80℃，2.3bar压力下，热压干燥20分钟，紫外照射30分钟，制得纳米纤维素薄膜；
(5)将纳米纤维素薄膜浸入溶解有成纤细胞生长因子以及复合纤维素酶的溶液中，4℃原位吸附润胀，同步形成各向异性形成三维立体支架；
(6)将制得的载有成纤细胞生长因子和复合纤维素酶的纳米纤维素水凝胶支架用无菌水冲洗移除表面残余的成纤细胞生长因子和复合纤维素酶，根据需要切割成不同形状尺寸，冷冻干燥，制得基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架。
其中，所述步骤(4)中，PVDF滤膜的孔径为0.22微米，真空抽滤的时间为8-12小时。
其中，所述步骤(4)中，滤饼上表面覆盖PVDF滤膜，双面垫衬3层吸水滤纸后，再转移至热压干燥机。
其中，所述步骤(5)中，成纤细胞生长因子的浓度为500-1000ng/ml，复合纤维素酶的浓度为20-100U/ml。
其中，所述步骤(6)中，冷冻干燥的条件为-50℃，0.1mbar真空度下，冷冻干燥时间为72小时。
本发明的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架在人造器官、组织工程、伤口修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明从结构仿生和功能仿生的角度，解决了其他细胞生长因子缓释材料基质与生长因子结合简单，导致其释放速率无法精准调控，快速或过量释放导致活性丧失以及生物安全的难题；解决了动物来源的基质材料存在免疫反应以及批次差异等缺陷和不足；原位吸附生长因子，同步形成具有各向异性结构网络的细胞生长因子缓释支架材料，满足组织工程支架材料在生物相容性上对结构和功能的双重要求。
本发明制得的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架材料，具有优良的生物相容性，无细胞毒性，可生物降解性，模拟天然组织细胞外基质中细胞生长因子与肝素等阴离子多糖的紧密结合，所得支架材料具有生长因子活性稳定储存，生长因子按需释放，支架基质材料可控降解等优点，其高度水化的三维立体网络结构，能够最大程度上模拟还原真实的细胞外基质微环境及结构，为细胞黏附、生长、繁殖、分化提供理想的微环境。
附图说明
图1为实施例3中碱性成纤细胞缓释曲线；
图2为实施例3中碱性成纤细胞缓释促进细胞增殖情况；
图3为实施例3中成纤细胞在生长因子缓释各向异性支架材料中的分布；
图4为实施例1中制得的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架冻干产品照片；
图5为实施例2中原位吸附生长因子，同步形成具有各向异性结构网络的支架显微镜图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，包括以下步骤：
(1)将云杉溶解浆纤维1千克分散于30升无菌水中搅拌分散均匀，加入50-100克氢氧化钠，20-40毫升30％过氧化氢，搅拌均匀，120℃高压灭菌60分钟。
(2)将步骤(1)中的纸浆纤维用无菌水过滤清洗至滤液pH中性。
(3)将步骤(2)中清洗干净的纸浆纤维分散在50升无菌水中搅拌，加入10-15克TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基)、50-100克溴化钠、3-5L 10％次氯酸钠，调节并保持pH至10.5，室温下搅拌反应3-6小时，1.0M HCl调节体系pH至7.0。300目尼龙网过滤，使用无菌水清洗直至滤液电导率低于5μS/cm。将清洗干净的纸浆纤维分散在30-50升无菌水中搅拌均匀，分别以300bar和1000bar的压力通过高压均质机，制取高纯纳米纤维素水凝胶。
(4)取适量步骤(4)制得的纳米纤维素，使用无菌水稀释至浓度为0.1％，倒入装载有0.22微米孔径PVDF滤膜的真空抽滤器。真空抽滤8-12小时，收集滤饼，上层覆盖PVDF滤膜，双面垫衬3层吸水滤纸。转移至热压干燥机，在80℃，2.3bar压力下，热压干燥20分钟，紫外照射30分钟，制得纳米纤维素薄膜。
(5)将步骤(4)中制得纳米纤维素薄膜浸入溶解有500-1000ng/ml成纤细胞生长因子以及20-100U/ml复合纤维素酶的溶液1-5ml中，4℃原位吸附润胀，同步形成具有各向异性结构的三维立体支架。
(6)将步骤(5)中制得载有细胞生长因子和纤维素酶的纳米纤维素水凝胶支架用无菌水冲洗移除表面残余生长因子和纤维素酶，根据需要切割成不同形状尺寸，-50℃，0.1mbar真空度下，冷冻干燥72小时，制得基于低电荷密度纳米纤维素的细胞生长因子缓释支架，产品照片如图4所示。
实施例2
一种基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，包括以下步骤：
(1)将云杉溶解浆纤维1千克分散于30升无菌水中搅拌分散均匀，加入50-100克氢氧化钠，20-40毫升30％过氧化氢，搅拌均匀，120℃高压灭菌60分钟。
(2)将步骤(1)中的纸浆纤维用无菌水过滤清洗至滤液pH中性。
(3)将步骤(2)中清洗干净的纸浆纤维分散在50升无菌水中搅拌，加入10-15克TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基)、50-100克溴化钠、5-10L 10％次氯酸钠，调节并保持pH至10.5，室温下搅拌反应12-24小时，1.0M HCl调节体系pH至7.0。300目尼龙网过滤，使用无菌水清洗直至滤液电导率低于5μS/cm。将清洗干净的纸浆纤维分散在30-50升无菌水中搅拌均匀，分别以500bar和1500bar的压力通过高压均质机，制取高纯纳米纤维素水凝胶。
(4)取适量步骤(4)制得的纳米纤维素，使用无菌水稀释至浓度为0.1％，倒入装载有0.22微米孔径PVDF滤膜的真空抽滤器。真空抽滤12-24小时，收集滤饼，上层覆盖PVDF滤膜，双面垫衬3层吸水滤纸。转移至热压干燥机，在80℃，2.3bar压力下，热压干燥20分钟，紫外照射30分钟，制得纳米纤维素薄膜。
(5)将步骤(4)中制得纳米纤维素薄膜浸入溶解有500-1000ng/ml成纤细胞生长因子以及20-100U/ml复合纤维素酶的溶液5-10ml中，4℃原位吸附润胀，同步形成具有各向异性结构的三维立体支架。
(6)将步骤(5)中制得载有细胞生长因子和纤维素酶的纳米纤维素水凝胶支架用无菌水冲洗移除表面残余生长因子和纤维素酶，根据需要切割成不同形状尺寸，-50℃，0.1mbar真空度下，冷冻干燥72小时，制得基于高电荷密度纳米纤维素的细胞生长因子缓释支架。
实施例3基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的性能验证
(1)为验证实施例1和2中制得生长因子缓释支架控释细胞生长因子，采用小鼠b-FGF/FGF-2ABC-ELISA酶联免疫试剂盒检测支架材料在DMEM细胞培养基中释放细胞生长因子情况。
取一片实施例1和2中生长因子缓释支架(3mm×3mm×50μm)，加入1ml DMDM完全培养基，分别在0.5h,1.0h,3.0h,6.0h,12.0h,1day,3days,7days，取上清液测定生长因子浓度，绘制释放曲线。结果如图1所示，细胞生长因子能够不断从支架材料中缓慢释放，释放时间长达7天，且缓释过程中支架材料在纤维素酶水解作用下逐步降解，进一步提高生长因子生物利用度，为细胞生长并分泌自身细胞外基质提供空间。
此外，纳米纤维素表面电荷密度较低的支架材料能更快，并释放更多生长因子。而高电荷密度纳米纤维素支架材料，由于细胞生长因子与支架网络结合紧密，能够更缓和的释放生长因子，从而有效避免生长因子的过快过量释放以及活性丧失，因此通过控制纳米纤维素表面电荷密度可对细胞生长因子释放速率进行调控。
(2)为验证实施例1和2中制得生长因子缓释支架控释细胞生长因子促进细胞生长繁殖，采用3D细胞培养并检测细胞增殖情况。
取一片实施例1和2中生长因子缓释支架(3mm×3mm×50μm)置于24孔板，种入3×105个小鼠胚胎成纤细胞，加入1ml DMEM完全培养基(含有200mM L-谷酰胺，1000IU/mL青霉素和链霉素，10％灭活胎牛血清)，在37℃，5％CO2，95％湿度下培养3天。同时，在24孔板中进行常规平面培养细胞，以及在24孔板平面培养细胞中添加游离细胞生长因子分别作为对照。使用MTT细胞增殖和毒性检测试剂盒分析细胞增殖情况。使用活细胞/死细胞荧光染色试剂盒对细胞进行染色并拍摄荧光照片。结果分别如图2-3所示。成纤细胞在细胞生长因子缓释支架上增殖速率显著高于常规培养细胞(高电荷密度支架***,p<0.01；低电荷密度支架*,p<0.05)。且低电荷密度支架对细胞增殖促进效果更明显。而添加游离细胞生长因子进行培养的细胞增殖速率与常规培养对照无明显差异。
由此证明，本发明的细胞生长因子缓释支架具有显著促进细胞生长增殖的能力，且有效避免游离生长因子的变性与失活。荧光显微镜照片显示密集的活细胞分布在支架内部，且可见明显的细胞团簇，再次证明本发明制备的支架材料能有效提升细胞生长繁殖速率，且伴随支架基质逐步降解，能促进细胞团簇生产，进而逐步分泌生成自身细胞外基质。
(3)为验证实施例2中制得基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释支架的各向异性结构，对实施例2中制得支架材料横截面进行扫描电子显微镜拍照观察。由图5可以看出，支架材料具有规整的孔隙结构和取向排列结构，可为维持细胞显性以及诱导细胞定向分化的提供强有力的支持。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备纸浆纤维；
(2)将纸浆纤维进行清洗过滤；
(3)采用清洗干净的纸浆纤维制取高纯纳米纤维素水凝胶；
(4)将制得的纳米纤维素水凝胶，使用无菌水稀释至浓度为0.1％wt.，倒入装载有PVDF滤膜的真空抽滤器，真空抽滤，收集滤饼；转移至热压干燥机，在80℃，2.3bar压力下，热压干燥20分钟，紫外照射30分钟，制得纳米纤维素薄膜；
(5)将纳米纤维素薄膜浸入一定体积的溶解有成纤细胞生长因子以及复合纤维素酶的溶液中，4℃原位吸附润胀，同步形成具有各向异性结构三维立体支架；
(6)将制得的载有成纤细胞生长因子和复合纤维素酶的纳米纤维素水凝胶支架用无菌水冲洗移除表面残余的成纤细胞生长因子和复合纤维素酶，根据需要切割成不同形状尺寸，冷冻干燥，制得基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释支架。
2.根据权利要求1所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，PVDF滤膜的孔径为0.22微米；真空抽滤的时间为8-12小时。
3.根据权利要求2所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，滤饼上表面覆盖PVDF滤膜，双面垫衬3层吸水滤纸后，再转移至热压干燥机。
4.根据权利要求3所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于：所述步骤(5)中，成纤细胞生长因子的浓度为500-1000ng/ml，复合纤维素酶的浓度为20-100U/ml。
5.根据权利要求4所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于：所述步骤(6)中，冷冻干燥的条件为-50℃，0.1mbar真空度下；冷冻干燥时间为72小时。
6.根据权利要求5所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，将云杉溶解浆纤维1千克分散于30升无菌水中搅拌分散均匀，加入50-100克氢氧化钠，20-40毫升30％过氧化氢，搅拌均匀，120℃高压灭菌60分钟。
7.根据权利要求6所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，将步骤(1)中的纸浆纤维用无菌水过滤清洗至滤液pH中性。
8.根据权利要求7所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，将清洗干净的纸浆纤维分散在50升无菌水中搅拌，加入10-15克2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基、50-100克溴化钠、3-5L 10％次氯酸钠，调节并保持pH至10.5，室温下搅拌反应3-6小时，1.0M HCl调节体系pH至7.0；300目尼龙网过滤，使用无菌水清洗直至滤液电导率低于5μS/cm；将清洗干净的纸浆纤维分散在30-50升无菌水中搅拌均匀，分别以300bar和1000bar的压力通过高压均质机，制得高纯纳米纤维素水凝胶。
9.权利要求1-8任一所述构建方法制得的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架。
10.权利要求9所述的基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架在人造器官、组织工程、伤口修复材料中的应用。
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