CN113679888A - 光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架 - Google Patents

光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架。光固化成型复合水凝胶基质前驱体包括甲基丙烯酰化明胶；海藻酸钠；羧甲基纤维素钠；硫酸软骨素；其中，光引发剂：甲基丙烯酰化明胶：海藻酸钠：羧甲基纤维素钠：硫酸软骨素的质量比为0.2～0.3:8～10:1～3:0.6～0.8:0.05～0.07。采用所述光固化成型复合水凝胶基质前驱体挤出3D生物打印技术可以实现载细胞打印水凝胶支架，支架的形态可控、成型性好、精度高，具有较好的稳定性；具有较好的生物相容性和生物活性，能够为成纤维细胞提供生长的良好环境；制备过程简单，可以在短时间内完成，通过调整原料比例来调节3D打印水凝胶支架的孔隙率以及力学性能。

Description

光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的 支架
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着医疗手段的进步，器官移植和修复技术得到了极大的发展，器官移植也已成为终末期器官疾病的主要治疗手段。但目前供体器官极度短缺，器官移植很受限制，并且传统的仿生支架无生理活性，存在诸多不足。直至基于生物自组装原理提出了“细胞打印”的设想。细胞打印技术能够将细胞、生长因子和支架结合在一起形成一个完整的整体结构，从而行使正常的生物学功能，因此载细胞的生物3D打印应运而生。
传统的生物材料制造合成策略包括模塑、共混、微流控技术和磁力组装技术等。相比之下，生物3D打印技术以高通量的方式制造更精确的具有可控的多孔结构的组织构造和组织模型，与传统器官移植解决方案相比极大地减少了在组织和器官移植期间的治疗时间。此外，它允许多种细胞类型的活细胞的局部培养和各种生物制品的可自定义图案化定制，并促进药物、基因和生长因子的定点输送，以及组织工程生物组织内血管化的整合等。因此生物材料应当具有合适的理化性能，具有较好的生物相容性，在保证足够的力学性能下，需要具有剪切变稀下的可打印性以减少打印过程中对细胞的挤压损伤，并同时具有适合细胞粘附、迁移、增殖以及提供特定的微环境等特点。因此，制备一种综合性能良好的水凝胶材料仍是生物3D打印的难点。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架，所述光固化成型复合水凝胶基质前驱体可用于挤出式生物3D打印，本发明制备的光固化成型复合水凝胶具有生物相容性好、毒性低、力学性能可调、可挤出与可光固化双重性质下的成型性完整、可给细胞提供三维生存环境的优点，是能够促进细胞在三维支架上的粘附和增殖的生物3D打印的复合水凝胶材料。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种光固化成型复合水凝胶基质前驱体，其组分组成如下：
光引发剂；
甲基丙烯酰化明胶；
海藻酸钠；
羧甲基纤维素钠；
硫酸软骨素；
其中，光引发剂：甲基丙烯酰化明胶：海藻酸钠：羧甲基纤维素钠：硫酸软骨素的质量比为0.2～0.3:8～10:1～3:0.6～0.8:0.05～0.07。
在本发明的第二方面，提供一种上述光固化成型复合水凝胶基质前驱体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将光引发剂溶解在PBS溶液中，形成光引发剂溶液；
(2)制备混合溶液：将甲基丙烯酰化明胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠分别溶解在步骤(1)的光引发剂溶液中，分别形成甲基丙烯酰化明胶溶液、海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液，按一定体积比例混合得到混合溶液；
(3)制备复合溶液：向步骤(2)的混合溶液中加入硫酸软骨素搅拌溶解，得到复合溶液，即光固化成型复合水凝胶基质前驱体。
在本发明的第三方面，提供一种挤出式生物3D打印复合水凝胶支架，挤出式生物3D打印复合水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按照第二方面所述光固化成型复合水凝胶基质前驱体的制备方法制备光固化成型复合水凝胶基质前驱体；
(2)挤出3D打印步骤(1)中制备的基质前驱体，得到水凝胶支架：将基质前驱体与小鼠成纤维细胞均匀混合，利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架；将支架先用氯化钙溶液浸泡，使其离子交联，然后用紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
(1)采用挤出式3D生物打印技术可以实现载细胞打印水凝胶支架，支架的形态可控、成型性好、精度高，具有较好的稳定性；
(2)加入的甲基丙烯酰化明胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和硫酸软骨素材料具有较好的生物相容性和生物活性，能够为成纤维细胞提供生长的良好环境，进而证明该水凝胶应用于组织工程上的可行性；
(3)制备过程简单，可以在短时间内完成，且反应要求简单，并且通过调整水凝胶体系中甲基丙烯酰化明胶和羧甲基纤维素钠的比例来调节3D打印水凝胶支架的孔隙率以及力学性能。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例3挤出3D打印支架图。
图2为本发明实施例1-5制备的水凝胶扫描电镜下微观形貌图。
图3为本发明实施例2-5制备的水凝胶压缩模量图。
图4为本发明实施例1-5制备的水凝胶流变性能图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种实施方式中，提供了一种光固化成型复合水凝胶基质前驱体，其组分组成如下：
光引发剂；
甲基丙烯酰化明胶；
海藻酸钠；
羧甲基纤维素钠；
硫酸软骨素；
其中，光引发剂：甲基丙烯酰化明胶：海藻酸钠：羧甲基纤维素钠：硫酸软骨素的质量比为0.2～0.3:8～10:1～3:0.6～0.8:0.05～0.07，优选0.25:10:2:0.7:0.06。
在本发明的一些实施方式中，所述光引发剂选择苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)；
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)，具有可挤出式打印能力、温敏性和可光固化性能，同时具有较好的生物相容性，良好的生物可降解性又能调节细胞黏附；海藻酸钠(Alg)，能够保持高分辨率，生物降解性较好，具有维持伤口愈合环境的特点；羧甲基纤维素钠(NaCMC)，是天然高分子材料的一种，能够在保证生物相容性的条件下，增加粘稠度，增加力学性能；硫酸软骨素(CS)，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表明，具有消炎灭菌的作用。
本发明的光固化成型复合水凝胶，在光引发剂产生的自由基存在下，自由基与甲基丙烯酰化明胶GelMA单体发生链式增长反应，即甲基丙烯酰化明胶分子间形成共价键产生聚合网络，从而使甲基丙烯酰化明胶分子形成具有良好的成型性；在氯化钙溶液的浸泡下，水凝胶支架内的海藻酸钠与钙离子进行离子交联而进一步固化成型；支架内的羧甲基纤维素和硫酸软骨素内的羟基、羧基、酯基可以形成氢键，帮助支架内的网络处于动态稳定，从而提高支架的结构稳定性。
并且在本发明的复合水凝胶中，羧甲基纤维素钠的含量会影响最终形成的复合水凝胶的性能，水凝胶随着羧甲基纤维素钠含量的增加，应力随着应变的变化更快，并且水凝胶的断裂应变值更小；在一定范围内羧甲基纤维素钠含量越高，水凝胶网络增强，从而导致机械强度增强，并且水凝胶的压缩模量越大；并且所述复合水凝胶对细胞无毒性，在一定程度上能够促进细胞增殖，生物相容性良好。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述光固化成型复合水凝胶基质前驱体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将光引发剂溶解在PBS溶液中，形成光引发剂溶液；
(2)制备混合溶液：将甲基丙烯酰化明胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠分别溶解在步骤(1)的光引发剂溶液中，分别形成甲基丙烯酰化明胶溶液、海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液，按一定体积比例混合得到混合溶液；
(3)制备复合溶液：向步骤(2)的混合溶液中加入硫酸软骨素搅拌溶解，得到复合溶液，即光固化成型复合水凝胶基质前驱体。
在本发明的一些实施方式中，在步骤(1)中：光引发剂溶解在PBS溶液中水浴加热至至60～65℃持续30～35min；
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)中：所述溶解在60～65℃下持续水浴加热的条件下进行；
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)中：混合溶液中的甲基丙烯酰化明胶溶液的体积分数为40～44％，优选42％(v/v)；
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)中：混合溶液中的海藻酸钠溶液的体积分数为14～18％，优选16％(v/v)；
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)中：混合溶液中的羧甲基纤维素钠溶液的体积分数为40～44％，优选42％(v/v)；
在本发明的一些实施方式中，在步骤(3)中：加入硫酸软骨素搅拌溶解后用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。
在本发明的一些实施方式中，复合溶液中甲基丙烯酰化明胶溶液的溶度为10％(w/v)；复合溶液中海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)；复合溶液中甲基丙烯酰化明胶与羧甲基纤维素钠的质量比100:7；复合溶液中硫酸软骨素的浓度为0.006％(w/v)。
本发明的一种实施方式中，提供了一种挤出式生物3D打印复合水凝胶支架，挤出式生物3D打印复合水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按照第二方面所述光固化成型复合水凝胶基质前驱体的制备方法制备光固化成型复合水凝胶基质前驱体；
(2)挤出3D打印步骤(1)中制备的基质前驱体，得到水凝胶支架：将基质前驱体与小鼠成纤维细胞均匀混合，利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架；将支架先用氯化钙溶液浸泡，使其离子交联，然后用紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)中：打印速度380～400mm/min，移动速度850～900mm/min，层高0.25mm，层数3层，间距1.5mm*1.5mm，长宽12mm*12mm，边界长度为1mm，边界打印速度为300mm/min，喷头型号25G，喷头温度23℃，平台温度5℃，精密气压27.4KPa。
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)在无菌环境下进行；
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)中氯化钙溶液的质量分数为4％；紫外光的波长为405nm；
在本发明的一些实施方式中，在步骤(2)中：复合溶液与小鼠成纤维细胞的用量比为1mL：1×106～1.5×106个。
本发明中，在波长为405nm的紫外光照射下，光引发剂吸收光能产生自由基，自由基与甲基丙烯酰化明胶单体发生链式增长反应，即甲基丙烯酰化明胶分子间形成共价键产生聚合网络，从而使甲基丙烯酰化明胶分子形成具有良好的成型性；在氯化钙溶液的浸泡下，水凝胶支架内的海藻酸钠与钙离子进行离子交联而进一步固化成型；支架内的羧甲基纤维素和硫酸软骨素内的羟基、羧基、酯基可以形成氢键，帮助支架内的网络处于动态稳定，从而提高支架的结构稳定性。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1
(1)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml PBS溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)；
(2)制备混合溶液：先分别制备甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液、海藻酸钠溶液(Alg)、羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶液，即将1g甲基丙烯酰化明胶溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶溶液的溶度为10％(w/v)；将0.2g海藻酸钠溶解在10ml PBS溶液中，即海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)；不将羧甲基纤维素钠溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶(GelMA)与羧甲基纤维素钠(NaCMC)的质量比100：0；以上溶液分别在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解。然后分别取4.2ml甲基丙烯酰化明胶溶液，1.6ml海藻酸钠溶液，4.2ml羧甲基纤维素钠溶液放置容器中搅拌均匀，期间60℃下持续水浴加热并震荡3次，形成10ml混合溶液；
(3)制备复合溶液：向10ml混合溶液中加入0.006g硫酸软骨素(CS)搅拌溶解，并用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，最终得到复合溶液；
(4)挤出3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠成纤维细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠成纤维细胞的用量比为1mL：1×106个；利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架，其中打印参数为打印速度400mm/min，移动速度900mm/min，层高0.25mm，层数3层，间距1.5mm*1.5mm，长宽12mm*12mm，边界长度为1mm，边界打印速度为300mm/min，喷头型号25G，喷头温度23℃，平台温度5℃，精密气压27.4KPa；
最后将水凝胶支架用无菌4％氯化钙溶液浸泡3min，使其离子交联，然后用405nm紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
实施例2
(1)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml PBS溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)；
(2)制备混合溶液：先分别制备甲基丙烯酰化明胶溶液、海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液，即将1g甲基丙烯酰化明胶溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶溶液的溶度为10％(w/v)；将0.2g海藻酸钠溶解在10ml PBS溶液中，即海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)；将0.04g羧甲基纤维素钠溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶(GelMA)与羧甲基纤维素钠(NaCMC)的质量比100：4；以上溶液分别在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解。然后分别取4.2ml甲基丙烯酰化明胶溶液，1.6ml海藻酸钠溶液，4.2ml羧甲基纤维素钠溶液放置容器中搅拌均匀，期间60℃下持续水浴加热并震荡3次，形成10ml混合溶液；
(3)制备复合溶液：向10ml混合溶液中加入0.006g硫酸软骨素搅拌溶解，并用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，最终得到复合溶液；
(4)挤出3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠成纤维细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠成纤维细胞的用量比为1mL：1×106个；利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架，其中打印参数为打印速度400mm/min，移动速度900mm/min，层高0.25mm，层数3层，间距1.5mm*1.5mm，长宽12mm*12mm，边界长度为1mm，边界打印速度为300mm/min，喷头型号25G，喷头温度23℃，平台温度5℃，精密气压27.4KPa；
最后将水凝胶支架用无菌4％氯化钙溶液浸泡3min，使其离子交联，然后用405nm紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
实施例3
(1)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml PBS溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)；
(2)制备混合溶液：先分别制备甲基丙烯酰化明胶溶液、海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液，即将1g甲基丙烯酰化明胶溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶溶液的溶度为10％(w/v)；将0.2g海藻酸钠溶解在10ml PBS溶液中，即海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)；将0.07g羧甲基纤维素钠溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶(GelMA)与羧甲基纤维素钠(NaCMC)的质量比100：7；以上溶液分别在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解。然后分别取4.2ml甲基丙烯酰化明胶溶液，1.6ml海藻酸钠溶液，4.2ml羧甲基纤维素钠溶液放置容器中搅拌均匀，期间60℃下持续水浴加热并震荡3次，形成10ml混合溶液；
(3)制备复合溶液：向10ml混合溶液中加入0.006g硫酸软骨素搅拌溶解，并用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，最终得到复合溶液；
(4)挤出3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠成纤维细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠成纤维细胞的用量比为1mL：1×106个；利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架，其中打印参数为打印速度400mm/min，移动速度900mm/min，层高0.25mm，层数3层，间距1.5mm*1.5mm，长宽12mm*12mm，边界长度为1mm，边界打印速度为300mm/min，喷头型号25G，喷头温度23℃，平台温度5℃，精密气压27.4KPa；
最后将水凝胶支架用无菌4％氯化钙溶液浸泡3min，使其离子交联，然后用405nm紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
实施例4
(1)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml PBS溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)；
(2)制备混合溶液：先分别制备甲基丙烯酰化明胶溶液、海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液，即将1g甲基丙烯酰化明胶溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶溶液的溶度为10％(w/v)；将0.2g海藻酸钠溶解在10ml PBS溶液中，即海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)；将0.1g羧甲基纤维素钠溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶(GelMA)与羧甲基纤维素钠(NaCMC)的质量比10：1；以上溶液分别在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解。然后分别取4.2ml甲基丙烯酰化明胶溶液，1.6ml海藻酸钠溶液，4.2ml羧甲基纤维素钠溶液放置容器中搅拌均匀，期间60℃下持续水浴加热并震荡3次，形成10ml混合溶液；
(3)制备复合溶液：向10ml混合溶液中加入0.006g硫酸软骨素搅拌溶解，并用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，最终得到复合溶液；
(4)挤出3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠成纤维细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠成纤维细胞的用量比为1mL：1×106个；利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架，其中打印参数为打印速度400mm/min，移动速度900mm/min，层高0.25mm，层数3层，间距1.5mm*1.5mm，长宽12mm*12mm，边界长度为1mm，边界打印速度为300mm/min，喷头型号25G，喷头温度23℃，平台温度5℃，精密气压27.4KPa；
最后将水凝胶支架用无菌4％氯化钙溶液浸泡3min，使其离子交联，然后用405nm紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
实施例5
(1)制备LAP溶液：将0.1g光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)溶解在40ml PBS溶液中，对溶液水浴加热至60℃持续30min，期间震荡3次，形成LAP溶液，即LAP溶液浓度为0.25％(w/v)；
(2)制备混合溶液：先分别制备甲基丙烯酰化明胶溶液、海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液，即将1g甲基丙烯酰化明胶溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶溶液的溶度为10％(w/v)；将0.2g海藻酸钠溶解在10ml PBS溶液中，即海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)；将0.3g羧甲基纤维素钠溶解在10ml PBS溶液中，即甲基丙烯酰化明胶(GelMA)与羧甲基纤维素钠(NaCMC)的质量比10：3；以上溶液分别在60℃下持续水浴加热，期间震荡3次，等待完全溶解。然后分别取4.2ml甲基丙烯酰化明胶溶液，1.6ml海藻酸钠溶液，4.2ml羧甲基纤维素钠溶液放置容器中搅拌均匀，期间60℃下持续水浴加热并震荡3次，形成10ml混合溶液；
(3)制备复合溶液：向10ml混合溶液中加入0.006g硫酸软骨素搅拌溶解，并用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，最终得到复合溶液；
(4)挤出3D打印制备的复合溶液，得到水凝胶支架：在无菌环境下，将复合溶液与小鼠成纤维细胞均匀混合，其中复合溶液与小鼠成纤维细胞的用量比为1mL：1×106个；利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架，其中打印参数为打印速度400mm/min，移动速度900mm/min，层高0.25mm，层数3层，间距1.5mm*1.5mm，长宽12mm*12mm，边界长度为1mm，边界打印速度为300mm/min，喷头型号25G，喷头温度23℃，平台温度5℃，精密气压27.4KPa；
最后将水凝胶支架用无菌4％氯化钙溶液浸泡3min，使其离子交联，然后用405nm紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
通过以下几项测试说明实施例中的水凝胶材料在组织工程支架或载细胞打印组织应用中的优势。
成形性表征：实施例3水凝胶材料3D打印3层多孔支架如图1所示，其中图1(a)为刚打印后交联完成的水凝胶支架，可以表现出多孔的形态且没有溶胀和塌陷，图1(b)则为用PBS溶液浸泡5天后的水凝胶支架，可以发现内孔基本保持原形态，并未出现堵塞和坍塌，结构较为稳定。
水凝胶微观形貌表征：将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5水凝胶材料分别经固化、冷冻干燥、喷金后用场发射扫描电镜(JEOL，JSM-7610F)在5kv交流加速电压下研究了水凝胶的内部聚合物网络，如图2所示。观察电镜图可以看出，所有水凝胶组分内部均为多孔结构，通过对比可以发现，随着羧甲基纤维素钠的含量增多，内部微孔的结构尺寸减小，孔密度增大。这些现象表明不同浓度的水凝胶成功交联后，改变了其交联形貌结构，浓度越大，对交联结构影响越大，结构越加致密化。
力学性能表征：利用万能试验机(ZLC-2D，济南XLC试验机有限公司)在空气中以1mm/min的加载速率和100n的称重传感器对水凝胶的力学性能进行了表征，如图3所示。在图3a中，水凝胶随着NaCMC含量的增加，应力随着应变的变化更快，并且水凝胶的断裂应变值更小。如图3b所示，NaCMC含量越高，水凝胶网络增强，从而导致机械强度增强，并且水凝胶的压缩模量越大(GelMA:NaCMC＝100：4为1.25KPa，GelMA：NaCMC＝100：7为2.51KPa，GelMA：NaCMC＝10：1为2.91KPa，GelMA：NaCMC＝10:3为4.14KPa)。对于生物体的软组织，如脑组织，较软的部分(100-500Pa)极有利于神经元生长，而较硬的部分(1000-10000Pa)有利于促进胶质细胞培养。因此，通过压缩试验，得到的水凝胶压缩模量小于10kpa，具有神经细胞培养在脑组织领域的应用前景。
流变性表征：在室温下使用Anton Paar MCr 302和1°锥板对水凝胶进行流变学分析，如图4所示。在实验过程中，为了防止失水，采用硅油对平板边缘进行密封。图4中可以发现，储能模量G'随着应变的增加而不断减小，并逐渐接近损耗模量G"，表明固化后的水凝胶网络随着应变的增加开始破裂。然后储能模量G'曲线在某一临界应变处与损耗模量G"曲线相交，出现一个交点。当应变大于该临界值时，G'小于G"，表明聚合物网络的崩溃导致凝胶从固体转变为流体。此外，凝胶中GelMA:NaCMC的质量比越大，形成交点前的G'值越大，而在交点处的应变值越小(GelMA:NaCMC＝100：0时为98％，GelMA：NaCMC＝100：4时为67％，GelMA：NaCMC＝100：7时为39％，GelMA：NaCMC＝10:1时为37％，GelMA：NaCMC＝10:3时为17％)。这表明凝胶与NaCMC的质量比越大，固化后的凝胶越硬，但其脆性要小得多，更容易断裂。
细胞毒性表征：通过细胞增殖实验验证材料的生物相容性，使用CCK-8试剂评估细胞在材料浸提液中的活性。首先将L-929小鼠成纤维细胞以每孔3000个细胞的密度接种到96孔板中，用完全培养基(100μl/孔)培养24小时，然后设计4组实验(阳性对照组、空白对照组、阴性对照组和实验组)。其中，空白对照组继续用完全培养基培养，阳性对照组用0.65％苯酚溶液孵育，阴性对照组用质量比为GelMA：NaCMC＝100：7的水凝胶浸提液孵育。此外，实验组由两种提取物组成：一种是不添加NaCMC和CS的水凝胶提取物，另一种为添加NaCMC但不添加CS的水凝胶提取物。以上4组同时培养1、3、5、7天。用CCK-8原液和对应培养基配置体积比为1：10的工作液并注意避光保存备用。检测流程为:先取出孔板中的原始培养基，然后向孔板中加入110μl/孔的CCK-8工作液，置于培养箱中2小时，过程避免气泡的产生。最后用多功能酶标仪(ReadMax 1900，上海闪光光谱生物技术有限公司)测定其在450nm波长下的吸光度，读取OD值，样品个数大于5个，重复实验n＝3。然后，使用Dixon检验消除异常值，并将这些数据表示为平均标准差(SD)。最后，使用以下等式以百分比表示生存能力。Viability＝OD450e/OD450b×100％
其中，OD450e是样品浸提液测量的光密度的平均值；OD450b是空白组的平均光密度。其中存活率值越低，测试样品的细胞毒性潜力越高，其结果如表1所示。
由表1可以发现，在第7天，空白组中苯酚浸提液的细胞存活率为25％以下，细胞等级为4，表明样品是有毒的。而阴性对照组的细胞存活率从第五天开始超过100％，细胞毒性等级为0，表明由上述材料制备的水凝胶样品对细胞无毒性。同样在实验组中，不含NaCMC和CS的水凝胶提取物的细胞存活率超过70％，第7天达到75.3％，细胞毒性等级为1。含有NaCMC但是不含CS的水凝胶提取物的细胞存活率超过80％，第7天达到85.4％，并且细胞毒性等级为1。因此说明在水凝胶制备过程中添加的成分不具有细胞毒性，并且制备的GelMA基水凝胶在一定程度上促进了细胞增殖，生物相容性良好。
表1水凝胶材料细胞毒性测试结果
Figure BDA0003231544330000111
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光固化成型复合水凝胶基质前驱体，其特征在于，其组分组成如下：
光引发剂；
甲基丙烯酰化明胶；
海藻酸钠；
羧甲基纤维素钠；
硫酸软骨素；
其中，光引发剂：甲基丙烯酰化明胶：海藻酸钠：羧甲基纤维素钠：硫酸软骨素的质量比为0.2～0.3:8～10:1～3:0.6～0.8:0.05～0.07。
2.如权利要求1所述的光固化成型复合水凝胶基质前驱体，其特征在于，所述光引发剂选择苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂。
3.一种权利要求1或2所述光固化成型复合水凝胶基质前驱体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将光引发剂溶解在PBS溶液中，形成光引发剂溶液；
(2)制备混合溶液：将甲基丙烯酰化明胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠分别溶解在步骤(1)的光引发剂溶液中，分别形成甲基丙烯酰化明胶溶液、海藻酸钠溶液、羧甲基纤维素钠溶液，按一定体积比例混合得到混合溶液；
(3)制备复合溶液：向步骤(2)的混合溶液中加入硫酸软骨素搅拌溶解，得到复合溶液，即光固化成型复合水凝胶基质前驱体。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：光引发剂溶解在PBS溶液中水浴加热至至60～65℃持续30～35min；
或者，步骤(2)中：所述溶解在60～65℃下持续水浴加热的条件下进行。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：混合溶液中的甲基丙烯酰化明胶溶液的体积分数为40～44％，优选42％；
或者，步骤(2)中：混合溶液中的海藻酸钠溶液的体积分数为14～18％，优选16％；
或者，步骤(2)中：混合溶液中的羧甲基纤维素钠溶液的体积分数为40～44％，优选42％。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中：加入硫酸软骨素搅拌溶解后用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。
7.一种挤出式生物3D打印复合水凝胶支架，其特征在于，挤出式生物3D打印复合水凝胶支架的制备方法包括以下步骤：
(1)按照权利要求3所述光固化成型复合水凝胶基质前驱体的制备方法制备光固化成型复合水凝胶基质前驱体；
(2)挤出3D打印步骤(1)中制备的基质前驱体，得到水凝胶支架：将基质前驱体与小鼠成纤维细胞均匀混合，利用3D生物打印机进行挤出式打印形成支架；将支架先用氯化钙溶液浸泡，使其离子交联，然后用紫外光照射使其光交联得到挤出式生物3D打印复合水凝胶支架。
8.如权利要求7所述的挤出式生物3D打印复合水凝胶支架，其特征在于，步骤(2)中：打印速度380～400mm/min，移动速度850～900mm/min，层高0.25mm，层数3层，间距1.5mm*1.5mm，长宽12mm*12mm，边界长度为1mm，边界打印速度为300mm/min，喷头型号25G，喷头温度23℃，平台温度5℃，精密气压27.4KPa。
9.如权利要求7所述的挤出式生物3D打印复合水凝胶支架，其特征在于，步骤(2)中氯化钙溶液的质量分数为4％；紫外光的波长为405nm；步骤(2)在无菌环境下进行。
10.如权利要求7所述的挤出式生物3D打印复合水凝胶支架，其特征在于，步骤(2)中：复合溶液与小鼠成纤维细胞的用量比为1mL：1×106～1.5×106个。
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