CN111729129B - 光控杂化交联可降解支架的精细化制造及其骨组织工程应用 - Google Patents

光控杂化交联可降解支架的精细化制造及其骨组织工程应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体为光控杂化交联可降解支架的精细化制造及其骨组织工程应用。光控杂化交联可降解支架的制备方法为：1)制备改羟基磷灰石；2)制备了粘结剂GelMA；3)与蓝光引发剂、增稠剂共混成浆料，通过3D打印技术成型，在特定波长的光照条件下，GelMA中的双键与经硅烷偶联剂改性接枝羟基磷灰石的双键在自由基的作用下发生相互作用M*→R·+R′·，进而引发单体聚合，成键形成固相杂化可降解支架。本发明涉及的促进成骨修复光交联复合3D打印杂化可降解支架可作为药物载体、或/和生物支架材料的应用。本发明设计科学，操作简便，精细化可控加工特性和可生物降解特性，可以应用于骨缺损再生修复或各类生物活性物质的载体支架材料。

Description

光控杂化交联可降解支架的精细化制造及其骨组织工程应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体为光控杂化交联可降解支架的精细化制造及其骨组织工程应用。
背景技术
组织工程是生物医学工程领域一个重要的新兴课题，其三要素为种子细胞，支架和生长因子。作为组织工程三要素之一，支架在其中发挥着重要作用。一般而言，支架本身及其降解产物都要具有良好的生物相容性。而且支架需具有合适的机械性能以为新生组织提供良好的应力环境。此外，支架应具备贯通的多孔结构和可渗透性以允许细胞和营养物质的进入以及代谢废物的排出。最后，支架需具有合适的表面结构和性能以利于细胞的粘附。除此之外，针对不同的组织工程支架还有相应的其他要求，如骨组织工程支架一般需具有良好的骨修复性能。
HAP作为人骨的主要无机矿物成分，具有良好的生物活性和生物相容性，此外，HAP还有良好的骨传导作用并且可以诱导新骨生成，是良好的骨修复和骨替代材料。但是，传统的HAP生物陶瓷难以形成贯通的多孔结构，而利用3D打印技术可以构建复杂的连通多孔结构。3D打印技术适合处理多种材料，尤其是处理一些对加工温度敏感的生物材料。在骨组织缺损修复生物材料的研究中，因3D打印技术能够根据不同患者需要，快速精确制备适合不同患者的骨修复材料，并能同时对材料的微观结构进行精确控制而受到广泛关注和深入研究。利用3D打印技术打印HAP需要使用交联剂，物理交联的交联度和交联效率往往较低。相反，化学交联的交联度和交联效率都比较高，但交联剂如醛、异氰酸酯等的残留可能对细胞产生毒性作用，使用化学交联后要去除交联剂残留。
因此，选择毒性低、生物相容性高，可生物降解的交联剂，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种光控杂化交联可降解支架。该光控杂化交联可降解支架(3D打印支架)，解决现有技术中HAP与交联剂仅仅为物理交联作用，常用的化学交联剂毒性高、使用化学交联后要烧结去除交联剂残留的问题。本发明将HAP改性接枝双键，与同样带有双键的甲基丙烯酸酐明胶在光引发剂作用下发生化学交联，解决了传统的3D打印甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)力学性能差，降解速率快的问题。
本发明的另外一个发明目的是提供以上所述促进成骨修复光交联复合3D打印支架的制备方法，该制备方法操作简便，有良好的可加工性、生物相容性，可生物降解，可快速光交联成型，能任意裁剪。
本发明还提供了该促进成骨修复光交联复合3D打印支架的应用。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案为：
一种可用于促进成骨修复光交联复合3D打印支架的改性羟基磷灰石，其结构如式Ⅰ所示，
Figure GDA0002595764780000021
式Ⅰ
其中
Figure GDA0002595764780000022
为羟基磷灰石。
该可用于促进成骨修复光交联复合3D打印支架的改性羟基磷灰石的制备方法，包括以下步骤：将正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷在乙醇-水的环境中，在pH＝3.5～4.5条件下室温水解1h～3h后，加入羟基磷灰石浆料，通过正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷的水解产物与羟基磷灰石表面-OH发生缩合反应，形成化学交联，使得羟基磷灰石表面负载双键，制得所述可用于3D打印的改性羟基磷灰石；其反应式为：
Figure GDA0002595764780000031
正硅酸乙酯的水解反应
Figure GDA0002595764780000032
乙烯基三乙氧基硅烷的水解反应
Figure GDA0002595764780000041
正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷水解产物与羟基磷灰石表面-OH缩合反应。
所述改性羟基磷灰石的制备方法，包括以下步骤：
步骤1.配液：配制乙醇与水的体积比为1:1～9:1的溶液50ml～100ml，用冰乙酸调其pH值为3.5～5.5。
步骤2.水解反应：取步骤1配制的乙醇-水溶液，用磁力搅拌器搅拌，分别缓慢滴加1ml～10ml正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷的混合溶液并在室温搅拌反应1h～10h，正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷的体积比为1:1～10:1；
步骤3.缩合反应：向步骤2制得的混合溶液中缓慢滴加羟基磷灰石浆料20ml～100ml，室温搅拌反应1h～10h；
步骤4.向步骤3制得的混合溶液中滴加10％的NaOH溶液或氨水，调节其pH＝8～12，使步骤2、步骤3中的副产物二氧化硅生成硅酸盐；
步骤5.将步骤4制得的溶液室温静置2h～24h；
步骤6.将步骤5制得的产物分别用无水乙醇和去离子水各洗3遍，以去除未完全反应的正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷；
步骤7.将步骤6所得产物放入真空干燥箱干燥12h～48h。
所述步骤2、步骤3、步骤4、步骤5，均在室温条件下进行反应。
甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)，其结构如式Ⅱ所示，
Figure GDA0002595764780000051
式Ⅱ
其中
Figure GDA0002595764780000052
为明胶。
甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的制备方法为：将明胶与甲基丙烯酸酐在30℃～90℃水浴搅拌反应后，调pH＝7.0～10.0，其反应式为：
Figure GDA0002595764780000053
甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的制备方法，包括以下具体制备方法步骤：
步骤1.配液：将明胶以10％(w/v)的浓度溶于PBS缓冲液中，于30℃～90℃下充分搅拌至明胶完全溶解；
步骤2.将甲基丙烯酸酐MA(每克明胶加入1mLMA)以每分钟0.5ml的速率滴加到步骤1制得的明胶溶液中，维持30℃～90℃条件下，充分搅拌反应1h～10h；
步骤3.反应完成后，将步骤2所得产物转移至离心管中，在1000rpm～3000rpm下离心5min～30min，取上清液，装入10～12kDa透析袋中；
步骤4.透析：将步骤3所得产物在30℃～90℃的纯水中透析3～7天，每天换水3次，去除残留杂质；
步骤5.用1mol/L NaOH调整步骤4所得产物pH为7.0～10.0；
步骤6.将步骤5所得产物于-20℃冷冻12h～48h，再放入冻干机冷冻干燥后，得到白色多孔泡沫状产物，即GelMA。
所述步骤1、步骤2、步骤4，均在30℃～90℃条件下进行反应，避免成胶。
一种促进成骨修复光交联复合3D打印支架，是指将前述方法制备得到的改性羟基磷灰石及甲基丙烯酸酐改性后的明胶，在光引发剂存在下，通过蓝光引发自由基聚合形成网状结构。
具体原理如下：光引发剂在蓝光照射下，形成自由基；然后自由基开始进攻改性羟基磷灰石及甲基丙烯酸酐改性明胶的双键，形成带有自由基的明胶分子，随后发生自由位点转移，再继续进攻其他游离的双键，进而形成共聚物分子链；最后，可能以两种方式结束反应，一是带有自由位点的共聚物分子链与游离自由基相遇终止反应，二是带有自由位点共聚物与其他带有自由位点共聚物分子链共聚终止反应。其反应式为：
Figure GDA0002595764780000061
其中
Figure GDA0002595764780000062
为羟基磷灰石。
本发明将羟基磷灰石表面接枝双键，并制备了粘结剂GelMA，与蓝光引发剂、增稠剂共混成浆料，通过3D打印技术成型，在特定波长的光照条件下，光引发剂单体经光照后，吸收光子形成激发态M*：M+hv→M*，激发了的活性分子经均裂产生自由基。GelMA中的双键与经硅烷偶联剂改性接枝羟基磷灰石的双键在自由基的作用下发生相互作用M*→R·+R′·，进而引发单体聚合，成键形成固相凝胶。
作为优选，所述的光引发剂选自酰基磷氧化物，具体为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)(Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate)。
一种促进成骨修复光交联复合3D打印支架，该支架固含量可达50wt％～85wt％。打印采用三维气动式打印系统。该系统主要由3D打印机、气压挤出机以及蓝光光源三部分组成。其中3D打印机由计算机控制XYZ三轴精确定位，且料筒处安装温度控制器以保证打印材料时具有合适的温度；温控打印平台下安装了冷却系统，保证改性HAP/GelMA水凝胶挤出后能维持稳定的结构。气压挤出机具有可控制的气压范围(0～1MPa)，便于挤出不同粘度的材料。蓝光光源(波长405nm)稳定连续，保证水凝胶的光交联。打印时，根据不同的固含量调整打印参数。温控打印平台温度控制在15℃～25℃，喷头温度控制在25℃～35℃，挤出气压控制在0.20MPa～0.55MPa，打印速度控制在5mm/s～15mm/s。
前述所述促进成骨修复光交联复合3D打印支架的应用方法为：
步骤A.将GelMA以5％～15％(w/v)的浓度、光引发剂以3mg/mL～10mg/mL的浓度溶于PBS缓冲液中；
步骤B.将50wt％～85wt％的改性HAP、1-10％wt％的羧甲基纤维素钠与步骤A制得溶液混合，置匀浆机中充分混合均匀；
步骤C.将步骤B制得的浆料装入料筒，按需要调整参数进行打印。
打印得到的3D打印支架的结构式如式Ⅲ所示，
Figure GDA0002595764780000071
式Ⅲ
其中
Figure GDA0002595764780000081
为羟基磷灰石。
其中，所述改性羟基磷灰石双键接枝率为4.3×10-3mol/g～8.3×10-3mol/g；所述甲基丙烯酸酐明胶接枝率为45％～100％。
该3D打印支架可作为药物载体、或/和生物支架材料的应用，可用于促进成骨修复。
与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：
(一)、本发明设计科学，操作简便，有良好的可加工性、生物相容性，可生物降解，可快速光交联成型，能任意裁剪。可用于骨再生修复，如原位骨再生或组织工程领域。
(二)、本发明促进成骨修复光交联复合3D打印支架，以羟基磷灰石浆料及明胶为原材料，进行功能化改性，再通过3D打印、光催化化学交联而成。羟基磷灰石作为人骨的主要无机矿物成分，具有良好的生物活性和生物相容性，此外，羟基磷灰石还有良好的骨传导作用并且可以诱导新骨生成，是良好的骨修复和骨替代材料。明胶是胶原变性所得的产物，属蛋白质大分子范畴，它具有与蛋白质大分子相类似的特性，其生物相容性好，但由于分子结构的特殊性，决定了其理化性质又有独特之处。
(三)、本发明制备了促进成骨修复光交联复合3D打印支架，通过改性羟基磷灰石浆料使其接枝双键，并制得甲基丙烯酸酐化明胶，调整两者的比例及3D打印的参数，制得不同固含量的支架材料。本发明选择了GelMA水凝胶，不仅保持了明胶的生物活性功能，同时利用光敏交联实现与其他功能性物质界面的稳定连接；选择双键修饰的HAP，则充分利用了HAP良好的骨传导性的同时，实现了固体表面官能化，利于增强固体界面与生物高分子的紧密连接和整合；通过3D打印的方式使两者按照不同的比例在引发剂条件下光控交联制备成精细化结构的骨修复体，满足临床修复中精细化，个性化需求；其生物相容性好，可控生物全降解，可控光交联成型，可切割加工实现任意形状和尺寸的需求。
附图说明
图1为为实施例1中制得的编号为改性HAP-①～④实验组及羟基磷灰石浆料的傅里叶红外光谱(FTIR)图。
图2为实施例1中制得的编号为改性HAP-①～④实验组及羟基磷灰石浆料的热重(TGA)图。
图3为实施例1中制得的编号为改性HAP-④实验组及羟基磷灰石浆料的X射线光电子能谱(XPS)图。
图4为实施例1中制得的编号为改性HAP-①～④实验组的扫描电镜(SEM)图。
图5为实施例2制得的编号为GELMA-C实验组与GEL的核磁图谱。
图6为实施例2制得的实验组C的水凝胶力学性能曲线。
图7为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架扫描电镜图。
图8为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架在Tris-HCl缓冲液中降解曲线。
图9为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架在Tris-HCl缓冲液中浸出液pH变化曲线。
图10为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架压缩试验示意图。
图11为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架压缩试验结果。
图12为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架三点弯曲试验示意图。
图13为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架三点弯曲试验结果。
图14为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架负载细胞培养不同时间得到的三维细胞支架的激光共聚焦扫描显微镜图。
图15为实施例2制得的实验组C与实施例1制得的实验组④打印交联而成的支架动物试验示意图。
图16为实施例4中制备得到GelMA/HAP支架的成品图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的促进成骨修复光交联复合3D打印支架的制备及其应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
本发明实施例中透析所用的透析袋的规格为10～12kDa。
以下实施例中采用的三维气动式打印系统为现有技术。该系统主要由3D打印机、气压挤出机以及蓝光光源三部分组成。其中3D打印机由计算机控制XYZ三轴精确定位，且料筒处安装温度控制器以保证打印材料时具有合适的温度；温控打印平台下安装了冷却系统，保证改性HAP/GelMA水凝胶挤出后能维持稳定的结构。
以下实施例中所采用的光引发剂均为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)(Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate)。
本申请中改性羟基磷灰石，其结构如式Ⅰ所示，
Figure GDA0002595764780000101
式Ⅰ
其中
Figure GDA0002595764780000102
为羟基磷灰石。
甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)，其结构如式Ⅱ所示，
Figure GDA0002595764780000111
式Ⅱ
其中
Figure GDA0002595764780000112
为明胶。
实施例1
本实施例公开了双键改性羟基磷灰石浆料的制备方法，具体步骤如下：
(1)配液：将乙醇与水按体积比为6:1，7:1，8:1，9:1的比例分别配置得到溶液，用冰乙酸调其pH值为4.0；
该步骤中，乙醇：水体积比为6:1，7:1，8:1，9:1，其分别记为实验组①、②、③、④。
(2)水解反应：取步骤(1)配制的乙醇-水溶液，用磁力搅拌器搅拌，分别缓慢滴加5ml正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷按体积比为1:1配置的溶液，室温搅拌反应1h；
(3)缩合反应：向步骤(2)制得的混合溶液中缓慢滴加羟基磷灰石浆料20ml，室温搅拌反应1.5h，得混合溶液；
(4)向步骤(3)制得的混合溶液中滴加10wt％的NaOH溶液，调节其pH＝10，使步骤步骤(3)中的副产物二氧化硅生成硅酸盐；
(5)将步骤(4)制得的溶液室温静置陈化24h；
(6)将步骤(5)制得的产物分别用无水乙醇和去离子水各洗3遍，以去除未反应完全的正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷；
(7)将步骤(6)所得产物放入真空干燥箱干燥48h。
图1为实验组①、②、③、④的红外光谱图，由图1可知，本实施例制得的改性羟基磷灰石的特征吸收峰在1610cm-1处，为C＝C的伸缩振动峰，及1416cm-1、1276cm-1、768cm-1处，为C-H的弯曲振动峰，而纯的羟基磷灰石无这些特征峰出现。
图2为实验组①、②、③、④的热重图，由图2可知，本实施例制得的改性羟基磷灰石热重损失与未改性的羟基磷灰石相比，最大可达约6％，说明有机基团被接枝到了无机羟基磷灰石上。
图3为实验组④的X射线光电子能谱(XPS)图，实施例制得的改性羟基磷灰石出现了硅元素，且C元素的CPS较未改性的羟基磷灰石有所增强。
将步骤(7)所得产物用碘量法滴定双键值，该改性羟基磷灰石中双键含量如表1所示：
表1
Figure GDA0002595764780000121
实施例2
本实施例公开了甲基丙烯酸酐明胶的制备方法，具体步骤如下：
(1)配液：将明胶以10％(w/v)的浓度溶于PBS缓冲液中，于50℃下充分搅拌至明胶完全溶解；
(2)将甲基丙烯酸酐MA(每克明胶加入0.8ml～1.2mLMA)以每分钟0.5ml的速率滴加到步骤(1)制得的明胶溶液中，维持50℃条件下，充分搅拌反应3h；
该步骤中，甲基丙烯酸酐与明胶之比(v/w)为：0.6:1，0.8:1，1:1，1.2:1。分别记为实验组A、B、C、D；
(3)反应完成后，将步骤2所得产物转移至离心管中，在1500rpm下离心5min，取上清液，装入透析袋中；
(4)透析：将步骤3所得产物在50℃的纯水中透析至少3天，每天换水3次，去除残留杂质；
(5)用1mol/L NaOH调整步骤4所得产物pH为7.5；
(6)将步骤(5)所得产物于-20℃冷冻24h，再放入冻干机冷冻干燥后，得到白色多孔泡沫状产物，即GelMA。
本实施例中A-D组所得产物的接枝率为45％～100％。
具体如表2所示：
表2
组别 GELMA编号 MA:GEL(v/w) 透析时间(天) GELMA接枝率(％)
A GELMA-A 0.6:1 4 45
B GELMA-B 0.8:1 4 58
C GELMA-C 1:1 4 75
D GELMA-D 1.2:1 4 100
实施例3
将实验组C的GELMA配置成15％(w/v)浓度的水凝胶置于动态力学分析仪(TAInstruments Q800，USA)上，在多频模式(0.1～100rad/s)下测量水凝胶的弹性模量(G′)和黏性模量(G″)的变化曲线，结果如附图6所示。在振幅固定为0.5％的测试条件下，频率在0.1～100rad/s的范围内，弹性模量G′大于黏性模量G″，材料表现出明显的水凝胶特性，并且弹性模量G′和黏性模量G″都表现出较强的频率相关性，随着频率的增加而增大，数值分别为0.01Pa～139Pa和0.01Pa～72Pa。
实施例4
(1)将式Ⅱ所示接枝率为75％GelMA(实施例2中实验组C)溶于PBS缓冲液中，配置成15％(w/v)的浓度，将光引发剂以5mg/ml的浓度、多巴胺以1mg/ml的浓度溶于该GelMA溶液中；
(2)将式Ⅰ所示的改性羟基磷灰石(实施例1中实验组④)、1wt％的羧甲基纤维素钠与步骤A制得溶液混合，置匀浆脱泡仪器中充分混合均匀；
(3)将步骤(2)制得的浆料装入料筒，将料筒装入打印系统。采用低温-光照两步交联法制得GelMA/HAP支架。该支架的成品图如图16所示。低温-光照两步交联法的具体操作为：温控打印平台温度控制在20℃，喷头温度控制在25℃，挤出气压控制在0.20MPa，打印速度控制在10mm/s；光照采用蓝光打印，光源的波长405nm。
将实验组C与实验组④打印交联而成的支架置于扫面电镜及体视显微镜下扫描，结果如附图7所示。从图7中发现，该支架具有相互贯通的孔，有大孔套小孔的结构，小孔孔径的大小为1μm～5μm，大孔孔径的大小为1500μm。这种结构保证了营养物质的输送，同时三维网络结构更有利于细胞的生长和增殖。
实施例5
将实施例4中用实验组C与实验组④打印交联而成的支架样品用直径为8mm的环形裁刀裁成圆片状，将其置于无水乙醇中超声清洗，在60℃烘干24h并称重，记作Wo。然后，配制37℃下pH为7.4的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液。按Tris-HCl体积与支架质量的比率约为200mL/g。将支架浸入Tris-HCl缓冲液中，将样品置于37℃恒温水浴中，降解性能测定组设定1、3、5、7、14、21天五个时间点，每个时间点自成一组，每组三个平行样，到达预设时间后，取出支架，用去离子水洗涤后在60℃烘箱中烘干24h称取浸泡后的质量Wt。
支架的降解行为表示为质量损失百分数，按以下公式计算：
质量损失百分数＝(Wo-Wt)/Wo×100％
根据不同时间段的质量损失百分数，绘制降解曲线。实验组C与实验组④打印交联而成的支架的降解曲线如附图8所示，结果显示该支架在刚开始时降解速率增加，达到平衡后，维持在8％左右稳定的降解速率。说明该骨修复支架具有生物可降解性，降解速率适宜。
实施例6
将前述实施例4中用实验组C与实验组④打印交联而成的支架样品用直径为8mm的环形裁刀裁成圆片状，按照实施例5中方法处理支架样品，分别于1、3、5、7、14、21天五个时间点将浸泡液取出测pH，每个时间点自成一组，每组三个平行样。浸泡液pH变化曲线见附图9。由图9可知，该浸泡液pH稳定，基本维持在7.7～7.8左右，适宜细胞生长。
实施例7
将前述实施例4中用实验组C与实验组④打印交联而成的支架打印成直径为6mm，高为8mm的圆柱状样品，置岛津电子万能试验机(AGS-X 10KN)，如附图10所示，以3mm/min的试验速度进行压缩试验，所得结果如附图11。由图11可知，该支架具有较高的抗压强度，较好的力学性能使其适合作为成骨修复材料。
实施例8
将前述实施例4中用实验组C与实验组④打印交联而成的支架打印成3mm厚，10mm宽，30mm长的样品，置岛津电子万能试验机(AGS-X 10KN)，如附图12所示，以5mm/min的试验速度进行三点弯曲试验，所得结果如附图13。由图13可知，该支架具有较高的抗弯强度，较好的力学性能使其适合作为成骨修复材料。
实施例9
本实施例公开了组织工程无菌三维支架的制备方法，具体为：
步骤A.将实施例2制得的编号为C的GELMA-C以15％(w/v)的浓度溶于PBS缓冲液中；
步骤B.将光引发剂以5mg/ml的浓度、多巴胺以1mg/ml的浓度、羧甲基纤维素钠以1wt％的浓度溶于步骤A制得的GELMA溶液中，再加入实施例1中制得的编号为④的改性HAP-4的羟基磷灰石粉末，使其固含量为82％，置匀浆机中充分混合均匀；
步骤C.将步骤B制得的浆料装入料筒，将料筒装入打印系统。采用低温-光两步交联法用于3D生物打印GelMA/HAP支架。
步骤D.将透明质酸(HA,400mg,MW＝340kDa)溶于35mLPBS缓冲液中。缓慢加入盐酸二氯乙烷(EDC，766mg)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS，230mg)，直到HA/EDC/NHS的最终摩尔比设定为1:4:2。搅拌30min后，加入1mmol多巴胺(Dopa)。连续监测溶液pH值为5，维持12h。整个反应是在无氧条件下进行的。反应结束后，透析3d进行纯化，然后进行冻干，得到白色粉末(HA-Dopa)。
步骤E.将步骤D制得的HA-Dopa，紫外辐照4h以上，并用无菌水配置成浓度为20mg/ml的溶液，另取Ⅰ型胶原，用醋酸泡3天以上，配置成浓度为20mg/ml的溶液。
步骤F.取无菌培养皿，每皿加800μl步骤E配置的HA-Dopa溶液，及800μl步骤E配置的Ⅰ型胶原溶液，另加400μl灭菌水，混匀，再使用不同浓度的酸碱调节pH至7.5左右。将步骤C打印的支架用75％乙醇灭菌，并用紫外光照射灭菌，放入该培养皿中，将材料裹上水凝胶，皿口用无菌滤膜包好，再盖上皿盖，用封口胶封口，保证皿内保持无菌状态。
步骤G.将装有支架的皿放入4℃冰箱冷藏过夜，再放入-20℃冰箱冷冻过夜，取出后放入冻干机中冷冻干燥48h，得到所需支架。
步骤H.将支架上滴上细胞悬液，其滴加量为：2×106cells/个支架，置于培养箱中，在34～40℃、3％～5％的CO2的条件下培养至少1天，得到组织工程三维细胞支架，培养期间定期更换培养基。
所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液以及胎牛血清得到，α-MEM培养基中青霉素和链霉素混合液的浓度为0.8％～1.2％，胎牛血清的浓度为8％～12％。
分别于培养1天、3天、7天、14天、21天后取出三维细胞支架，使用PBS缓冲液清洗2遍，将清洗后的三维细胞支架浸没于含有FDA和PI的染液中染色1min，然后用PBS缓冲液清洗1次，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察三维支架中的细胞的生长状态和分布情况，如附图14所示，随着时间的增加，细胞增殖情况明显，并且在后期出现成团生长，结果表明，该3D打印支架有利于细胞的黏附与生长。
实施例10
将实施例9制得的组织工程无菌三维支架用直径为10mm的环形裁刀裁成圆片状，在兔颅骨处用环钻造缺损，并将支架植入缺损处，如附图15所示。
综上所述，本发明促进成骨修复光交联复合3D打印支架有良好的可加工性、生物相容性，可生物降解，可快速光交联成型，能任意裁剪。可用于骨再生修复，如原位骨再生或组织工程领域。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (2)

1.一种促进成骨修复光交联复合3D打印支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤A. 将GELMA-C以15%w/v的浓度溶于PBS缓冲液中；
步骤B.将光引发剂以5mg/mL的浓度、多巴胺以1mg/mL的浓度、羧甲基纤维素钠以1wt%的浓度溶于步骤A制得的GELMA-C溶液中，再加入改性HAP-4的羟基磷灰石粉末，使其固含量为82wt%，置匀浆机中充分混合均匀；
步骤C. 将步骤B制得的浆料装入料筒，将料筒装入打印系统，采用低温-光两步交联法用于3D生物打印GELMA-C/ HAP-4支架；
步骤D. 将400mg、MW=340kDa的透明质酸（HA）溶于35mLPBS缓冲液中，缓慢加入盐酸二氯乙烷（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS），直到HA/EDC/NHS的最终摩尔比设定为1:4:2，搅拌30min后，加入1mmol多巴胺，连续监测溶液pH值为5，维持12h，整个反应是在无氧条件下进行的，反应结束后，透析3天进行纯化，然后进行冻干，得到白色粉末HA-Dopa；
步骤E. 将步骤D制得的HA-Dopa，紫外辐照4h以上，并用无菌水配置成浓度为20mg/mL的溶液，另取Ⅰ型胶原，用醋酸泡3天以上，配置成浓度为20mg/mL的溶液；
步骤F. 取无菌培养皿，每皿加800μL步骤E配置的HA-Dopa溶液，及800μL步骤E配置的Ⅰ型胶原溶液，另加400μL灭菌水，混匀，再使用不同浓度的酸碱调节pH至7.5，将步骤C打印的支架用75%乙醇灭菌，并用紫外光照射灭菌，放入该培养皿中，将材料裹上水凝胶，皿口用无菌滤膜包好，再盖上皿盖，用封口胶封口，保证皿内保持无菌状态；
步骤G. 将装有支架的皿放入4℃冰箱冷藏过夜，再放入-20℃冰箱冷冻过夜，取出后放入冻干机中冷冻干燥48 h，得到所需支架；
所述GELMA-C制备方法包括以下步骤：（1）配液：将明胶以10%w/v的浓度溶于PBS缓冲液中，于50℃下充分搅拌至明胶完全溶解；
（2）将甲基丙烯酸酐MA，以每分钟 0.5mL的速率滴加到步骤（1）制得的明胶溶液中，维持 50℃条件下，充分搅拌反应3h；
该步骤中，甲基丙烯酸酐与明胶之比v/w为：1:1；
（3）反应完成后，将步骤（2）所得产物转移至离心管中，在1500rpm下离心5min，取上清液，装入透析袋中；
（4）透析：将步骤（3）所得产物在50℃的纯水中透析至少3天，每天换水3次，去除残留杂质；
（5）用1mol/L NaOH调整步骤（4）所得产物pH为7.5；
（6）将步骤（5）所得产物于-20℃冷冻24h，再放入冻干机冷冻干燥后，得到白色多孔泡沫状产物，即GELMA-C；
改性HAP-4的羟基磷灰石制备方法包括以下步骤：（1）配液：将乙醇与水按体积比为9:1的比例配置得到溶液，用冰乙酸调其pH值为4.0；
（2）水解反应：取步骤（1）配制的乙醇-水溶液，用磁力搅拌器搅拌，缓慢滴加5 mL正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷按体积比为1:1配置的溶液，室温搅拌反应1 h；
（3）缩合反应：向步骤（2）制得的混合溶液中缓慢滴加羟基磷灰石浆料20 mL，室温搅拌反应1.5h，得混合溶液；
（4）向步骤（3）制得的混合溶液中滴加10wt%的NaOH溶液，调节其pH=10，使步骤（3）中的副产物二氧化硅生成硅酸盐；
（5）将步骤（4）制得的溶液室温静置陈化24h；
（6）将步骤（5）制得的产物分别用无水乙醇和去离子水各洗3遍，以去除未反应完全的正硅酸乙酯与乙烯基三乙氧基硅烷；
（7）将步骤（6）所得产物放入真空干燥箱干燥48h，得到改性HAP-4的羟基磷灰石。
2.根据权利要求1所述一种促进成骨修复光交联复合3D打印支架的制备方法制得的支架，其特征在于，打印采用三维气动式打印系统；该系统主要由3D打印机、气压挤出机以及蓝光光源三部分组成；其中3D打印机由计算机控制 XYZ 三轴精确定位，且料筒处安装温度控制器以保证打印材料时具有合适的温度；温控打印平台下安装了冷却系统，保证改性HAP-4/GELMA-C水凝胶挤出后能维持稳定的结构；打印时，根据不同的固含量调整打印参数，温控打印平台温度控制在15 ℃～25 ℃，喷头温度控制在25 ℃～35 ℃，挤出气压控制在0.20 MPa～0.55 MPa，打印速度控制在5 mm/s～15 mm/s。
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