CN213130115U

CN213130115U - 骨软骨支架

Info

Publication number: CN213130115U
Application number: CN202021620326.1U
Authority: CN
Inventors: 陈慧敏; 朱海林; 汪争光; 华宇杰; 程文红
Original assignee: Huaxia Siyin Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huaxia Siyin Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2030-08-06

Abstract

本实用新型公开了一种骨软骨支架。该骨软骨支架包括软骨层、黏连层和骨层，所述黏连层的两侧分别与所述软骨层和所述骨层连接；所述软骨层和/或所述骨层为多孔结构。该骨软骨支架可以用于修复骨软骨缺损中，能够充分地捕获细胞，骨软骨损伤修复功能强，且操作简便。

Description

骨软骨支架

技术领域

本实用新型涉及一种骨软骨支架。

背景技术

关节软骨病变作为一个基本的病理过程，几乎参与了所有临床常见的关节疾病病理变化早期阶段。由于软骨组织内缺乏血管和淋巴分布，软骨细胞含量少，缺少细胞分化所必须的祖母细胞且包埋于稠厚的细胞外基质中，迁徙难度大，无法有效移动到损伤部位参与修复，因此其自我修复能力非常差，即使是微小的软骨缺损也难以自然修复。组织工程技术的出现为关节软骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。

目前组织工程骨软骨支架设计主要分为以下几类：1)骨采用支架而软骨不采用支架，即在骨支架上方直接种植上高密度的软骨细胞；2)采用适合骨、软骨构建的两种支架材料，分别在体外培养形成组织工程骨和软骨，然后粘合、或手术缝合、或顺序植入等方法将组织工程骨和软骨部分组装成组织工程骨软骨复合体；3)骨和软骨皆采用相同的支架材料的一体化单层支架；4)骨软骨部分分别采用两种不同的支架材料构建的一体化的双层支架。

双层骨软骨支架，由于其分层结构是根据骨和软骨生长的需要而设计的，因此具有更优良的特性。然而目前这种骨软骨双相支架也存在以下问题：1) 上层软骨材料力学性能差，植入体内后吸水变形，降解速率快；2)修复后的软骨是纤维软骨而不是透明软骨；3)新生软骨与周边软骨组织整合不良。已有的临床产品，通过灌注来修复骨软骨缺损，没有通孔结构，细胞无法进入支架内部，只在表面停留，修复效果不好；另外，还可能长成瘢痕组织或者骨化成骨。

实用新型内容

本实用新型为了解决现有技术中存在的骨软骨支架捕获细胞不足、损伤修复功能差的缺陷，从而提供了一种骨软骨支架。本实用新型的骨软骨支架能够充分地捕获细胞，骨软骨损伤修复功能强，且操作简便。

为了实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案：

本实用新型提供一种骨软骨支架，其包括软骨层、黏连层和骨层，所述黏连层的两侧分别与所述软骨层和所述骨层连接；所述软骨层和/或所述骨层为多孔结构。

本实用新型中，较佳地，所述软骨层和所述骨层均为多孔结构；更佳地，所述软骨层的孔与所述骨层的孔连通。所述骨层的孔与所述软骨层的孔可完全对齐或不完全对齐，较佳地为完全对齐。

本实用新型中，较佳地，所述黏连层不覆盖或部分覆盖所述骨层和/或所述软骨层的孔。也就是说，所述黏连层仅覆盖所述骨层和所述软骨层的非孔区域的部分或全部，以保证黏连层不堵塞骨层和软骨层的孔。

本实用新型中，所述软骨层和/或所述骨层的孔的孔径为50～350μm，较佳地为200～280μm，例如250μm；较佳地，所述骨层的孔的孔径与所述软骨层的孔的孔径相等。

本实用新型中，所述软骨层和/或所述骨层的孔的分布方式较佳地为垂直交叉排列。

本实用新型中，所述软骨层和/或所述骨层的孔隙率为40％-60％，例如 50％。

本实用新型中，所述骨软骨支架的孔隙率可为20％-60％，较佳地为40％- 60％。

本实用新型中，所述软骨层和所述骨层的孔径的选择均是为了适合捕获细胞和细胞生长。

本实用新型中，较佳地，所述骨软骨支架为圆柱体。所述圆柱体的直径可为2～20mm，较佳地为3～10mm；所述圆柱体的高度可为2～10mm，较佳地为3～6mm。

本实用新型中，所述骨层和所述软骨层的高度比可为1：(0.1～1)，较佳地为1：(0.2～0.5)。

本实用新型中，所述黏连层的高度较佳地为5～100μm。

本实用新型中，所述软骨层的材料可为本领域常规的软骨层材料，较佳地为水凝胶材料。

其中，所述水凝胶材料可为单网络水凝胶材料、互穿网络水凝胶材料和复合交联水凝胶材料中的一种或多种。由单一交联方式形成的水凝胶材料，称为单网络水凝胶材料。由两种或两种以上交联方式形成的水凝胶材料，称为互穿网络水凝胶材料，或双网络水凝胶材料。由同一交联方式的多种可凝胶成分复合交联而成，称为复合交联水凝胶材料。所述水凝胶材料较佳地为光交联水凝胶材料，更佳地为复合光交联水凝胶材料。

本实用新型中，所述软骨层较佳地还负载软骨促进成分。其中，所述软骨促进成分可包括生物活性因子和/或细胞。其中，所述生物活性因子较佳地包括转化生长因子TGFα或TGFβ。所述细胞可包括自体或异体软骨细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞或iPS细胞。

本实用新型中，所述骨层的材料可为本领域常规的医用高分子材料，较佳地为聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚己内酯(PCL)。

本实用新型中，所述骨层较佳地还负载骨促进成分。其中，所述骨促进成分可包括生物活性的无机材料、生物活性因子和细胞中的一种或多种。

其中，所述生物活性的无机材料较佳地包括羟基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙和生物玻璃中的一种或多种。所述生物活性的无机材料在所述骨层中的质量百分比可为0.1wt％～50wt％，较佳地为1wt％-20wt％。

所述生物活性因子较佳地包括转化生长因子TGFα、TGFβ，骨形态发生蛋白BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP- 9中的一种或多种。所述生物活性因子在所述骨层中的质量百分比可为 0.01wt％～10wt％，较佳地为0.1wt％-1wt％。

所述细胞可包括自体或异体骨细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞或iPS 细胞。

本实用新型中，所述黏连层可由本领域常规的医用胶水形成。所述医用胶水例如可选自康派特、绿海(greensea)、金象、海氏海诺、双一、吗丁啉、 3M、七乐康、福爱乐、爱达宝(IDEALPLAST)、开颜或奥非特。

本实用新型所述的骨软骨支架的制备方法，可包括以下步骤：将骨层和软骨层连接，连接处形成黏连层；所述软骨层和/或所述骨层为多孔结构。

本实用新型中，所述软骨层的制备方法可为本领域常规，一般为以水凝胶组合物为原料经交联固化制备。

本实用新型中，所述水凝胶组合物是指形成水凝胶的原料组合物，至少包括可凝胶成分和凝胶介质。其中，所述可凝胶成分可为本领域常规的可以形成凝胶的成分，一般包括天然可凝胶成分和/或合成可凝胶成分。

所述天然可凝胶成分可为本领域常规，较佳地包括天然蛋白、天然蛋白修饰物、天然蛋白降解物、天然蛋白降解物的修饰物、天然多糖、天然多糖修饰物、天然多糖降解物和天然多糖降解物的修饰物中的一种或多种。

所述天然蛋白包括各种亲水动植物蛋白、水溶性动植物蛋白、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白和弹性蛋白中的一种或多种。所述天然蛋白降解物较佳地包括明胶(Gel)或多肽。所述天然蛋白降解物的修饰物较佳地为甲基丙烯酰化天然蛋白降解物，更佳地为甲基丙烯酰化明胶 (GelMA)。

所述天然多糖包括透明质酸(HA)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素(CS)、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖和壳聚糖季铵盐中的一种或多种，较佳地为透明质酸(HA)和/或硫酸软骨素(CS)。所述天然多糖修饰物较佳地为甲基丙烯酰化天然多糖，例如甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)或甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)。

其中，所述合成可凝胶成分可为本领域常规，较佳地包括两臂或多臂聚乙二醇双丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、合成多肽、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。

本实用新型中，所述可凝胶成分较佳地包括甲基丙烯酰化明胶(GelMA) 和甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)；更佳地包括甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)和甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)。

其中，所述凝胶介质可为本领域常规，较佳地为生理盐水、细胞培养基和磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中的一种或多种。其中，所述生理盐水即为 0.9％NaCl水溶液。所述细胞培养基可为本领域常规的细胞培养基，例如 DMEM、DMEM/F12、RPMI 1640等常用培养基。所述磷酸盐缓冲溶液可为本领域常规，所述磷酸盐缓冲溶液的pH较佳地为7.4。

在本实用新型一较佳的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶1～20份，甲基丙烯酰化透明质酸0.1～3份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素0.1～5份，光引发剂0.01～1份和凝胶介质。

其中，所述甲基丙烯酰化明胶的用量较佳地为5～15份，例如8份、10 份或12份。

所述甲基丙烯酰化明胶可为本领域常规，可商购，也可采用本领域常规的方法对明胶(Gel)进行甲基丙烯酰化得到。

所述甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化程度较佳地为40％～80％。其中，所述甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化程度利用核磁共振氢谱(1H NMR) 来计算，具体为：选取苯丙氨酸标准峰(7.1～7.4ppm)的积分面积作为1，计算明胶改性前后赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积下降的百分比，即：

GelMA的甲基丙烯酰化程度＝(Gel的赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积-GelMA的赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积)/Gel的赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积*100％。

其中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的用量较佳地为0.5～2份，例如0.5 份、1份、1.5份。

所述甲基丙烯酰化透明质酸可为本领域常规，可商购，也可采用本领域常规的方法对透明质酸(HA)进行甲基丙烯酰化得到。所述甲基丙烯酰化透明质酸的分子量较佳地为890～950kDa。

所述甲基丙烯酰化透明质酸的甲基丙烯酰化程度较佳地为30％～50％。其中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的甲基丙烯酰化程度利用核磁共振氢谱 (1H NMR)来计算，具体为：

HAMA的甲基丙烯酰化程度＝甲基丙烯酰胺-乙烯基在5.6ppm处的峰面积/N-乙酰基葡萄糖在1.9ppm处的峰面积*100％。

其中，所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的用量较佳地为0.5～3份，例如1 份、2份或2.5份。

所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素可为本领域常规，可商购，也可采用本领域常规的方法对硫酸软骨素(CS)进行甲基丙烯酰化得到。所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的分子量较佳地为30～50kDa。

所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的甲基丙烯酰化程度较佳地为30％～50％。其中，所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的甲基丙烯酰化程度利用核磁共振氢谱 (1H NMR)来计算，具体为：

CSMA的甲基丙烯酰化程度＝甲基丙烯酰胺-乙烯基在5.6ppm处的峰面积/N-乙酰基葡萄糖在1.9ppm处的峰面积*100％。

其中，所述甲基丙烯酰化明胶、所述甲基丙烯酰化透明质酸和所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的质量比较佳地为(2-15)：1：(1-3)，例如10:1:3，5:2:2， 15:1:1或8:1:3。

其中，所述光引发剂可为本领域常规的光引发剂，较佳地为蓝光引发剂、紫外光引发剂或绿光引发剂；所述蓝光引发剂较佳地为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)、核黄素、黄素单核苷酸或曙红Y；所述紫外光引发剂较佳地为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(I2959)；所述绿光引发剂较佳地为三联吡啶氯化钌/过硫酸钠(Ru/SPS(1/10))。

其中，所述凝胶介质的用量可为本领域常规，较佳地使得所述水凝胶组合物中：甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5％-20％，甲基丙烯酰化透明质酸 (HAMA)0.1％～3％，甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)0.1％～5％，光引发剂0.01％～1％；其中所述百分比为每100mL凝胶介质含有的组分质量(g)。

其中，所述水凝胶组合物还可包括增稠剂，所述增稠剂的用量较佳地为 0.1～25份。所述增稠剂可为本领域常规，较佳地为聚环氧乙烷(PEO)、聚乙二醇(PEG)、海藻酸钠、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、结冷胶和黄原胶中的一种或多种。

当所述增稠剂包括海藻酸钠时，所述海藻酸钠的用量较佳地为1～2份。当所述增稠剂包括透明质酸时，所述透明质酸的用量较佳地为0.5～2份。当所述增稠剂包括聚乙烯吡咯烷酮时，所述聚乙烯吡咯烷酮的用量较佳地为 2～10份。当所述增稠剂包括阿拉伯树胶时，所述阿拉伯树胶的用量较佳地为 0.1～25份。当所述增稠剂包括结冷胶时，所述结冷胶的用量较佳地为0.1～2 份。当所述增稠剂包括黄原胶时，所述黄原胶的用量较佳地为0.1～1份。

其中，所述水凝胶组合物还可包括合成类光敏材料。所述合成类光敏材料的用量较佳地为5～30份。所述合成类光敏材料可为本领域常规，较佳地包括聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺中的一种或多种。所述合成类光敏材料较佳地为聚乙二醇丙烯酸酯。

本实用新型中，较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5～15份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)0.5～2份，

甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)0.5～3份，

和光引发剂0.1～0.5份。

在本实用新型一具体的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)2份，

甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)2份，

和光引发剂0.25份。

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)10份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，

甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，

和光引发剂0.25份。

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)15份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，

甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)1份，

和光引发剂0.25份。

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)8份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，

甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，

和光引发剂0.25份。

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)8份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，

甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，

海藻酸钠2份，

和光引发剂0.25份。

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)8份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，

甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，

PEGDA 10份，

和光引发剂1份。

在本实用新型一具体的实施方式中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5份，

甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)2份，

和光引发剂0.5份。

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5份，

海藻酸钠2份，

和光引发剂0.5份。

本实用新型中，所述交联固化的方式可包括物理交联、化学交联和光交联中的一种或多种；较佳地包括光交联。所述光交联可采用本领域常规的方法在光照射下进行；较佳地，所述光交联在波长365～405nm、强度5～50 mW/cm²的光照射下进行；更佳地，所述光交联在波长405nm、强度10mW/cm²的光照射下进行。

本实用新型中，所述软骨层的制备方法可为灌注法，其包括以下步骤：将所述水凝胶组合物的各组分混合，然后将混合物灌注于软骨模具中进行光交联，得到固化水凝胶；将所述固化水凝胶冷冻干燥即得。

其中，所述软骨模具可采用本领域常规的方法根据所需软骨的形状和大小设计而成。

本实用新型中，所述软骨层的制备方法可为直接3D打印法，其包括以下步骤：将所述水凝胶组合物的各组分混合，对混合物进行3D打印同时进行光交联，得固化水凝胶；将所述固化水凝胶冷冻干燥即得。

在一较佳的实施方式中，所述软骨层的制备方法包括：将水凝胶采用挤出式3D打印机打印，蓝光固化成型，其中，保温温度为30～37℃，打印环境温度为22～25℃，打印压力为20～40PSI，打印速度为4～8mm/s，填充率为 40％～60％，光照强度为5～20mW/cm²。

本实用新型中，所述软骨层的制备方法可为间接3D打印法，又称为3D 工程法，其包括以下步骤：

S1、将牺牲材料进行3D打印，得到阴模；其中，所述牺牲材料为可溶于有机溶剂的硬质高分子材料；

S2、将所述水凝胶组合物的各组分混合，将混合物灌注于阴模中进行光交联，得到固化水凝胶-阴模复合体；

S3、用有机溶剂溶解所述阴模以脱除阴模，将所得固化水凝胶冷冻干燥即得。

其中，所述硬质高分子材料的定义为：以形成尺寸为10*10*10mm的立方体支架为目标对高分子材料进行3D打印，实际形成的支架的尺寸误差在 10％以内，该高分子材料即可称为硬质高分子材料。此处所述立方体支架为判断高分子材料是否为硬质高分子材料的标准，并不对材料可形成的形状产生限制。采用硬质高分子材料进行3D打印，形态维持良好，可实现高精度打印。目前行业内通常使用的常规牺牲材料，例如普朗尼克、卡波姆、明胶颗粒、蔗糖等，在3D打印过程中无法维持形态，不能实现精细打印。

其中，所述牺牲材料较佳地为生物相容的。所述“生物相容的”标准为：采用本领域常规的方法进行生物相容性测试，细胞存活率在75％以上。所述牺牲材料较佳地为透明的。

其中，所述牺牲材料较佳地为聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚对苯二甲酸乙二醇酯-1,4-环己烷二甲醇酯(PETG)或合成类光敏树脂。所述合成类光敏树脂较佳地为聚丙烯酸酯类光敏树脂。

步骤S1中，较佳地，先将颜料混于所述牺牲材料中，然后将带颜色的牺牲材料进行3D打印，得到带颜色的阴模。这样做的作用为，在步骤S3脱除阴模时，颜色消失可以作为阴模脱除成功的监控指标。

步骤S1中，所述3D打印的方式可为本领域常规的可以实现精确细微结构的打印方式，较佳地为挤出方式(即熔融堆积方式)或光固化方式。所述光固化方式可为立体光固化成型技术(SLA)、数字光投影技术(DLP)或液晶显示技术(LCD)。

步骤S1中，所述阴模的形状、大小和结构可根据所需的软骨层按照本领域常规的方法设计。

其中，所述有机溶剂，可根据形成阴模的牺牲材料的特性进行选择，可溶解所述阴模即可。所述有机溶剂较佳地为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或1,4-二氧六环。

在上述软骨层的制备方法中，所述冷冻干燥的时间较佳地为8～24h；所述冷冻干燥前较佳地进行预冷步骤；所述预冷的温度较佳地为-20℃，所述预冷的时间较佳地为1～3h。

本实用新型中，所述软骨层的制备方法较佳地还包括负载软骨促进成分的步骤。所述负载软骨促进成分的方法可为本领域常规。所述软骨促进成分如前所述。

本实用新型中，所述骨层的制备方法可为本领域常规，较佳地为对所述骨层的材料进行3D打印。其中，所述骨层的材料如前所述。所述3D打印的参数可根据所述骨层的结构和材料采用本领域常规的方法进行选择。所述 3D打印较佳地采用熔融沉积式3D打印机进行。

本实用新型中，较佳地，所述骨层的制备方法还包括负载骨促进成分的步骤。所述负载骨促进成分的方法可为本领域常规，例如：将所述骨层的材料磨成粉末后掺入所述骨促进成分；或者，将所述骨层的材料溶于有机溶剂后掺入所述骨促进成分，然后使所述有机溶剂挥发即可。所述骨促进成分如前所述。

在一较佳的实施方式中，所述骨层通过采用熔融沉积式3D打印机对负载羟基磷灰石的PLA进行3D打印来提供，其中，打印头温度为210℃，平台温度为50～60℃，打印速度为50～60mm/s，填充率为40％～60％。

在一较佳的实施方式中，所述骨层通过采用熔融沉积式3D打印机对负载有磷酸三钙的PCL进行3D打印来提供，其中，打印温度为140～150℃，打印速度为50～60mm/s，填充率为40％～60％。

在一较佳的实施方式中，所述骨层通过采用挤出式光固化3D打印机对负载有磷酸三钙的GelMA进行3D打印来提供，其中，保温温度为30-35℃，打印环境温度为22～25℃，打印压力为20～40PSI，打印速度为4-8mm/s，填充率为40-60％，光照强度为5～50mW/cm²。

本实用新型中，所述连接一般地为通过医用胶水将所述骨层和所述软骨连接。所述连接的操作条件可根据所用医用胶水的使用方法确定即可。所述医用胶水如前所述。

本实用新型所述的骨软骨支架可应用于修复软骨缺损。所述软骨缺损可为单纯软骨缺损或骨软骨复合缺损。所述软骨缺损可位于膝关节、髋关节或肩关节。

在修复骨软骨复合缺损中，所述骨软骨支架的使用方式可为：在骨软骨复合缺损处向下钻孔至骨层，达到骨髓腔后，去除多余的骨层基质，将骨软骨支架材料放入骨软骨复合缺损处。此时，骨层冒出的骨髓血液中富含大量的间充质干细胞，在流经所述骨软骨支架材料时，骨髓源间充质干细胞被捕获于孔中。手术完成后，缝合伤口，即完成了骨软骨复合缺损的修复。

在修复单纯软骨缺损中，所述骨软骨支架材料的使用方式可为：在软骨缺损处进行微骨裂处理，至骨髓流出，放所述骨软骨支架于缺损处。此时，骨层冒出的骨髓中富含大量的间充质干细胞，在流经所述骨软骨支架时，细胞被捕获于孔中。手术完成后，缝合伤口，即完成了单纯软骨缺损的修复。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本实用新型各较佳实例。

本实用新型的积极进步效果在于：

1、本实用新型的骨软骨支架具有精细化的通孔结构，从底层的骨层一直贯通到顶层的软骨层，且周边也存在通孔结构，有利于支架材料在填充骨软骨缺损时充分地捕获细胞，还有利于营养物质和代谢废物的运输，从而有利于缺损修复。进一步地，通过选用合适的软骨层材料可以诱导干细胞分化生长成为软骨细胞。

2、本实用新型的骨软骨支架具有优异的黏连层结构，能够牢固连接软骨层和骨层，达到一体化整合的目的。本实用新型的骨软骨支架可以实现骨软骨全层修复。

3、本实用新型的骨软骨支架具备简便的临床操作方式和实用性，为临床上软骨缺损及骨软骨复合缺损的修复提供了一种全新的、有效的解决方案。

附图说明

图1为本实用新型实施例1～4中骨软骨支架的结构示意图。

具体实施方式

下面举个较佳实施例，并结合附图来更清楚完整地说明本实用新型。

实施例1

1、软骨层的制备

(1)甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的合成：将明胶(1g)溶于10mL PBS (pH＝7.4)中，加热至50℃搅拌至完全溶解，加入0.5mL甲基丙烯酸酐，反应2-3h，反应后用40mL PBS稀释反应液，然后倒入透析袋(MWCO 7000) 中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酰酯化明胶(0.9g)。根据核磁共振氢谱(1H NMR)，选取苯丙氨酸标准峰(7.1～7.4ppm)的积分面积作为1，计算明胶改性前后赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积下降的百分比，即得甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化程度为65％。

(2)甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)的合成：将透明质酸(1g，900kDa) 溶于100mL去离子水，冷却至0-4℃，加入5mL甲基丙烯酸酐，再缓慢滴加5mL 5M NaOH水溶液，反应24h，然后将反应液倒入透析袋(MWCO 7000) 中，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥即可得到甲基丙烯酰化透明质酸(0.9g)。根据核磁共振氢谱(1H NMR)，计算HAMA的甲基丙烯酰化程度为40％ (HAMA的甲基丙烯酰化程度＝甲基丙烯酰胺-乙烯基在5.6ppm处的峰面积 /N-乙酰基葡萄糖在1.9ppm处的峰面积*100％)。

(3)配制5％GelMA/2％HAMA/0.5％LAP的水凝胶：称取0.05g GelMA， 0.02g HAMA和5mg LAP溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，在37℃下配制5％GelMA/2％HAMA/0.5％LAP。

(4)灌注法制备GelMA/HAMA软骨层：

将水凝胶灌注于预制的圆柱体模具(直径5mm，高度3mm)中，在405nm 波长、强度10mW/cm²的光源照射下实现光交联，即可获得GelMA/HAMA 光交联水凝胶；将制备的GelMA/HAMA光交联水凝胶放置于-20℃冰箱中冷冻2h，再用冻干机冻干，即得GelMA/HAMA软骨层。

(5)TGFβ的负载：将上述GelMA/HAMA软骨层浸泡于5mg/mL TGFβ溶液中，待充分吸附12h后，放置于-20℃冰箱中冷冻2h，再用冻干机冻干，即可获得负载TGFβ的软骨层，记为TGFβ-GelMA/HAMA软骨层。

2、骨层的制备

(1)负载羟基磷灰石的聚乳酸高分子材料(HAP/PLA)的制备

称取5g聚乳酸(PLA)溶于20mL二氯甲烷后至完全溶解，加入1g羟基磷灰石(HAP)，搅拌至均匀溶液，然后置于通风橱待二氯甲烷挥发后，放入真空干燥箱烘干24h，用粉碎机粉碎制成粉末，经拉丝机制成1.75mm线材，即可制成为HAP/PLA高分子材料。

(2)3D打印HAP/PLA高分子材料

将HAP/PLA高分子材料采用熔融沉积式3D打印机打印成型(打印温度：210℃；平台温度为50℃；打印速度：60mm/s；填充率：50％，层高为 0.1mm)，得到HAP/PLA骨层。所得HAP/PLA骨层为圆柱体(直径5mm，高度为3mm)，孔隙率50％，孔径为250μm。

3、骨软骨支架的制备

用医用胶水金象将上述TGFβ-GelMA/HAMA软骨层和HAP/PLA骨层连接，连接处形成黏连层，黏连层的厚度约为100μm，即得TGFβ- GelMA/HAMA-HAP/PLA骨软骨支架，其结构示意图见图1，从上至下一次为软骨层1、黏连层2和骨层3。

本实施例中，如果不进行TGFβ的负载，即得GelMA/HAMA-HAP/PLA 骨软骨支架。

实施例2

1、软骨层的制备

(1)甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的合成：同实施例1。

(2)甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)的合成：同实施例1。

(3)配制5％GelMA/2％HAMA/0.5％LAP的水凝胶：同实施例1。

(4)直接3D打印法制备软骨层：

将上述水凝胶采用挤出式3D打印机打印，蓝光固化成型(保温温度： 37℃；平台温度：22℃；打印压力：20PSI；打印速度：5mm/s；填充率：50％)；将制备的GelMA/HAMA光交联水凝胶放置于-20℃冰箱中冷冻2h，再用冻干机冻干，即得GelMA/HAMA软骨层。所得GelMA/HAMA软骨层为圆柱体(直径为5mm，高度为1mm)，孔隙率为50％，孔径为300μm。

(5)TGFβ的负载：同实施例1。

2、骨层的制备：同实施例1。

3、骨软骨支架的制备

用医用胶水金象将上述TGFβ-GelMA/HAMA软骨层和HAP/PLA骨层连接，连接处形成黏连层，黏连层的厚度约为100μm，即得TGFβ- GelMA/HAMA-HAP/PLA骨软骨支架，其结构示意图见图1。

实施例3

1、软骨层的制备

(1)负载软骨细胞的海藻酸/明胶复合交联水凝胶(Alg/GelMA)的制备

(1)甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的合成：同实施例1。

(2)海藻酸/明胶复合交联水凝胶的制备：称取0.02g海藻酸(Alg)， 0.05g GelMA和5mg LAP溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，在37℃下配成2％Alg/5％GelMA/0.5％LAP的水凝胶。

(3)将水凝胶灌注于预制的模具中，在405nm波长、强度10mW/cm²的光源照射下实现光交联；将成型的水凝胶从模具中取出，于0.1M CaCl₂中浸泡2h，实现物理交联，即可获得复合光交联水凝胶；然后，将制备的复合光交联水凝胶放置于-20℃冰箱中冷冻2h，再用冻干机冻干，即得Alg/GelMA 软骨层。

(4)间接3D打印法制备Alg/GelMA软骨层：

首先，根据软骨层设计合适的阴模，并用聚丙烯酸酯类打印成型；然后，在阴模中灌注Alg/GelMA水凝胶，在405nm波长、强度10mW/cm²的光源照射下实现原位光交联；再于0.1M CaCl₂中浸泡2h，实现物理交联；用二氯甲烷溶解脱模后，即可获得Alg/GelMA复合光交联水凝胶。将制备的 Alg/GelMA复合光交联水凝胶放置于-20℃冰箱中冷冻2h，再用冻干机冻干，即得Alg/GelMA软骨层。所得Alg/GelMA软骨层为圆柱体(直径为5mm，高度为1mm)，孔隙率为50％，孔径为250μm。

(5)间充质干细胞(MSC)的负载：将MSC用胰酶消化，离心收集细胞，然后将细胞悬液滴加于上述Alg/GelMA软骨层上，孵育1h后，加入培养基，在37℃/5％CO₂条件的细胞培养箱中培养7d，即可获得MSC- Alg/GelMA软骨层。

2、骨层的制备

(1)负载磷酸三钙(TCP)的聚己内酯高分子材料(TCP/PCL)的制备

称取5g聚己内酯(PCL)溶于20mL二氯甲烷后至完全溶解，加入1g 磷酸三钙(TCP)，搅拌至均匀溶液，然后置于通风橱待二氯甲烷挥发后，放入真空干燥箱烘干24h，用粉碎机粉碎制成粉末，即可制成为TCP/PCL高分子材料。

(2)3D打印TCP/PCL高分子材料：将TCP/PCL高分子材料采用熔融沉积式3D打印机打印成型(打印温度：140℃；打印压力：40PSI；打印速度：50mm/s；填充率：50％)，得到TCP/PCL骨层。所得TCP/PCL骨层为圆柱体(直径5mm，高度为3mm)，孔隙率50％，孔径为300μm。

3、骨软骨支架的制备

用医用胶水金象将上述MSC-Alg/GelMA软骨层和TCP/PCL骨层连接，连接处形成黏连层，黏连层的厚度约为100μm，即得MSC-Alg/GelMA- TCP/PCL骨软骨支架，其结构示意图见图1。

本实施例中，如果不进行MSC的负载，即得Alg/GelMA-TCP/PCL骨软骨支架。

效果实施例1：骨软骨支架的细胞相容性测试

以实施例1制备的GelMA/HAMA-HAP/PLA骨软骨支架、实施例4制备的Alg/GelMA-TCP/PCL骨软骨支架为例。

将间充质干细胞(MSC)用胰酶消化，离心收集细胞，然后将细胞悬液滴加于上述骨软骨支架上，孵育1h后，加入培养基，在37℃/5％CO₂条件的细胞培养箱中培养24h。测试前，先将细胞培养液吸出，并用PBS多次洗涤，接着加入l mL细胞活/死双染试剂(10μM的钙黄绿素和15μM的二聚乙啡啶溶于5mL PBS中)，在37℃下与细胞共同孵育30min。

利用共聚焦荧光显微镜观察骨软骨支架内部细胞的粘附及存活情况。活细胞呈现钙黄素染色活性，433nm下发射绿色荧光；死细胞被溴化乙啶染色， 543nm激发下发射红色荧光。本实用新型的骨软骨支架具有较好的细胞相容性，且能够长入支架材料的通孔结构中。

效果实施例2：骨软骨支架在兔子骨软骨复合缺损修复中的应用

以实施例1制备的GelMA/HAMA-HAP/PLA骨软骨支架为例。

采用新西兰雄性大白兔，每只兔子均建立骨软骨复合缺损模型。实验前按体重随机分组(每组3只)：a：空白对照组；b：骨层支架(HAP/PLA) 阴性对照组；c：骨软骨支架(GelMA/HAMA-HAP/PLA)组。在手术中，将支架填充于兔子关节骨软骨复合缺损处。在手术12周后，通过静脉注射空气的方法处死实验中的兔子，并提取损伤关节对实验修复效果进行评价。空白对照组，由于没有放置支架，几乎看不到新生组织。仅有骨层支架的阴性对照组，因为软骨层缺失，完全没有长出新生软骨，仅看到尚未降解的骨层支架。骨软骨支架组，可以看出植入骨软骨支架处形成了新的组织，且与周围正常组织有类似的外观，有较好的修复效果。

Claims

1.一种骨软骨支架，其包括软骨层、黏连层和骨层，所述黏连层的两侧分别与所述软骨层和所述骨层连接；其特征在于，所述软骨层和所述骨层均为多孔结构；所述软骨层的孔与所述骨层的孔连通；所述软骨层的孔与所述骨层的孔完全对齐或不完全对齐；所述黏连层不覆盖或部分覆盖所述软骨层和/或所述骨层的孔。

2.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述骨层的孔的孔径与所述软骨层的孔的孔径相等。

3.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述软骨层和/或所述骨层的孔的孔径为50～350μm。

4.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述软骨层和/或所述骨层的孔的分布方式为垂直交叉排列。

5.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述软骨层和/或所述骨层的孔隙率为40％-60％；所述骨软骨支架的孔隙率为20％-60％。

6.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述骨软骨支架为圆柱体，所述圆柱体的直径为2～20mm，所述圆柱体的高度为2～10mm；

所述骨层和所述软骨层的高度比为1：(0.1～1)；

所述黏连层的高度为5～100μm。

7.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述软骨层的材料为水凝胶。

8.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述骨层的材料为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚己内酯。

9.如权利要求1所述的骨软骨支架，其特征在于，所述黏连层由医用胶水形成。