CN112076350B - 具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶及其制备方法与及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有纳米‑微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，由具有双交联高分子网络结构的水凝胶以及均匀分布在该水凝胶的双交联高分子网络上的类骨磷灰石组成；所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联以及具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应形成的；类骨磷灰石是以具有双交联高分子网络结构的水凝胶中的双交联高分子网络中的儿茶酚官能团与钙离子络合作为类骨磷灰石的成核位点生长形成的，类骨磷灰石是由纳米级类骨磷灰石聚集形成的微米级类骨磷灰石团聚体。本发明还提供了该仿生矿化水凝胶在颅骨修复领域中的应用。

Description

具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶 及其制备方法与及应用
技术领域
本发明属于骨修复材料领域，涉及具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
利用仿生矿化，生物有机体可在液体、环境温度下产生具有独特功能的层次结构化矿物。受有机-无机复合材料分层结构的骨骼成分的启发，有研究报道利用仿生矿化策略制备I型胶原(Col I)矿化支架并用于骨组织工程。作为结构模板，Col I可以促进无定形磷酸钙(ACP)前体离子渗透进入间隙空间并结晶成定向的羟基磷灰石纳米晶体。虽然胶原/磷灰石仿生矿化支架显示出增强的细胞活力和改善的成骨活性。然而，仿生具有分层交错纳米结构的骨支架仍然具有挑战性，因为它需要两个不同的有机相和无机纳米相高度相容。
基于模拟体液(SBF)的仿生矿化方法，已经开发了由可生物降解的聚合物和生物活性无机材料组成的有机-无机复合体，这种方法可增强材料机械稳定性，同时可赋予材料更优异的骨诱导和骨传导性能。SBF可提供接近人体体液的合适的离子浓度，pH和温度条件，促进类骨磷灰石的沉积。但是，SBF仿生矿化通常会导致类骨磷灰石在底物的表面上异质形核或松散地分布在支架中，无法形成高度相容的有机-无机复合体。而成熟的骨骼是由连续的有机相和无机相组成，良好的相结合与相容性才赋予了自然骨骼优异的力学性能。因此，如何通过SBF仿生矿化实现有机-无机相的高度整合，仍然是本领域的难点之一。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶及其制备方法，以实现有机-无机相的高度相容与整合，形成具有仿生骨基质成分与结构的水凝胶，并提高水凝胶的力学强度，本发明的目的之二是提供该仿生矿化水凝胶在骨修复领域，特别是颅骨修复领域中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，由具有双交联高分子网络结构的水凝胶以及均匀分布在该水凝胶的双交联高分子网络上的类骨磷灰石组成；
所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联以及具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应形成的；
类骨磷灰石是以具有双交联高分子网络结构的水凝胶中的双交联高分子网络中的儿茶酚官能团与钙离子络合作为类骨磷灰石的成核位点生长形成的，类骨磷灰石是由纳米级类骨磷灰石聚集形成的微米级类骨磷灰石团聚体。
上述仿生矿化水凝胶的技术方案中，该仿生矿化水凝胶在冷冻干燥后，其中的类骨磷灰石的含量为45wt.％～90wt.％，余量为双交联网高分子络结构；所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶中，双交联高分子网络的含量为5～50mg/mL。优选地，该仿生矿化水凝胶在冷冻干燥后，其中的类骨磷灰石的含量为45wt.％～68wt.％，余量为双交联高分子网络结构；所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶中，双交联高分子网络的含量为5～35mg/mL。
上述仿生矿化水凝胶的技术方案中，所述具有氨基及羧基的高分子材料优选为I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料优选为结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～50％，更优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～10％，进一步优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～10％；
Figure BDA0002688245610000021
所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶是在pH＝6.8～8.5的条件下，多巴胺改性的透明质酸溶液氧化自交联以及多巴胺改性的透明质酸溶液与I型胶原溶液通过迈克加成反应形成的。
上述仿生矿化水凝胶的技术方案中，具有双交联高分子网络结构的水凝胶是具有氨基及羧基的高分子材料的溶液与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液在pH＝6.8～8.5的条件下，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为(0.1～10):1反应形成的，优选地，是具有氨基及羧基的高分子材料的溶液与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液在pH＝6.8～8.5的条件下，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为
Figure BDA0002688245610000031
反应形成的，进一步优选地，是具有氨基及羧基的高分子材料的溶液与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液在pH＝6.8～8.5的条件下，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为1:1反应形成的。
上述仿生矿化水凝胶的技术方案中，类骨磷灰石遵循逐层生长模式并在具有双交联高分子网络结构的水凝胶中嵌入式生长，形成由纳米级类骨磷灰石聚集形成的板条状结构的微米级类骨磷灰石团聚体，我们将该结构称之为纳米-微米复合板条状结构的类骨磷灰石团聚体，微米级类骨磷灰石团聚体的粒径为1.2～200μm，该粒径进一步优选为1.2～7.2μm。同时，所述类骨磷灰石的Ca/P比为1.64～1.83，优选地，类骨磷灰石的Ca/P比为1.67±0.03，与天然骨组织的Ca/P比非常接近。
上述仿生矿化水凝胶的技术方案中，该生物矿化水凝胶的压缩模量至少为100kPa，进一步可达到116～128kPa，有利于骨髓间充质干细胞向成骨分化。
上述仿生矿化水凝胶的技术方案中，I型胶原是以动物皮、肌腱、尾腱为原料制备的I型胶原。
上述仿生矿化水凝胶的技术方案中，结构式如式(Ⅰ)所示多巴胺改性的透明质酸中是以透明质酸钠为基础改性得到的，作为改性基础的透明质酸钠的分子量为8.9w～200w，优选为34w～100w。
本发明提供的仿生矿化水凝胶由天然聚合物的水凝胶和类骨磷灰石构成，具有良好生物相容性，体内降解产物可吸收，原料来源广泛。我们对该仿生矿化水凝胶的体外细胞生物学、体内募集干细胞能力及原位骨再生能力及其他相关的性能进行了评估，结果表明：
(1)在体外细胞-仿生矿化水凝胶DCLHBM二维培养模型中，仿生矿化水凝胶DCLHBM没有细胞毒性并促进了细胞增殖，表现出良好的生物相容性。同时，在体外共培养21天后，DCLHBM5:5和DCLHBM3:7组的仿生矿化水凝胶未出现明显的收缩及溶胀现象，保持了相对稳定的结构，并且细胞呈现高密度均匀分布。相比于其他实验组，仿生矿化水凝胶DCLHBM5:5能更显著地促进干细胞的保留、粘附、增殖及成骨分化。所用细胞浓度范围1-10万个/mL，优选为5-10万个/mL。所述的细胞可以是骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等祖细胞。
(2)在兔子临界颅骨缺损模型中对仿生矿化水凝胶在体内募集内源干细胞能力进行了评估，结果表明：仿生矿化水凝胶DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，特别是DCLHBM5:5能有效地募集内源干细胞，且干细胞有明显的粘附生长。仿生矿化水凝胶DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，尤其是DCLHBM5:5，能增强兔子颅骨缺损再生，不仅在缺损处形成大量的新生骨组织，还使新生骨组织具有类自然骨的骨结构。仿生矿化水凝胶DCLHBM5:5和DCLHBM5:5，特别是DCLHBM5:5在植入体内12周后促进了兔子颅骨缺损的完美再生重塑。
现有技术中，在骨组织工程上支架外加细胞或生长因子促成骨研究很多，但是外源性干细胞和生长因子因其潜在的不可控临床风险和严格的审批程序阻碍了其进一步临床应用，单一支架材料募集内源性干细胞到骨缺损部位一直是学者研究的重点。相比于支架复合外源细胞及生长因子的现有技术，本发明提供的仿生矿化水凝胶采用了单一的支架材料，其中无外源细胞及生长因子，这既降低了临床风险，又简化操作方法，提升了产品进一步走向临床转化的可能。
(4)本发明提供的仿生矿化水凝胶，具有柔性自适应特性，植入后可与缺损周围的骨组织紧密贴合，而无需其他移植材料和固定销的辅助，简化了手术操作。在整个骨愈合过程中，植入材料均保留在原位，并在大体观标本检查中保持其结构完整性。实验中所有动物均保持健康，并且在整个实验周期内未出现任何伤口并发症。
基于以上实验结果，本发明还提供了一种上述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶在颅骨修复领域中的应用。该仿生矿化水凝胶能在体内将内源性干细胞募集到缺损部位，在无外源细胞或生长因子的情况下，实现颅骨缺损血管与骨再生。
本发明还提供了上述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料溶解，将具有氨基及羧基的高分子材料溶液溶解，将所得具有氨基及羧基的高分子材料的溶液滴加至具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液中，在冰浴条件下充分混合，然后调节所得混合溶液的pH值至6.8～8.5，再立即转移至模具中静置至各组分充分交联，得到具有双交联高分子网络结构的水凝胶；
(2)将具有双交联高分子网络结构的水凝胶用去离子水清洗，干燥去除表面的水分，然后浸没在pH＝6.8～8.5的模拟体液中在无菌条件下于37℃孵育10～50天，将所得产物用水洗涤，得到具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶；在孵育期间，每间隔12～24h更换一次模拟体液，所述模拟体液为1×SBF～20×SBF。
上述仿生矿化水凝胶的制备方法的技术方案的步骤(1)中，所述具有氨基及羧基的高分子材料优选为I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料优选为结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～50％，更优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～10％，进一步优选地，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为5％～10％；
Figure BDA0002688245610000051
上述仿生矿化水凝胶的制备方法的技术方案的步骤(1)中，将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5～50mg/mL、优选浓度为5～40mg/mL的具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将具有氨基及羧基的高分子材料用醋酸溶液溶解形成浓度为5～50mg/mL、优选浓度为5～35mg/mL的具有氨基及羧基的高分子材料的溶液。
上述仿生矿化水凝胶的制备方法的技术方案的步骤(1)中，优选采用浓度为0.01～1mol/L的醋酸溶液溶解具有氨基及羧基的高分子材料。
上述仿生矿化水凝胶的制备方法的技术方案的步骤(1)中，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为(0.1～10):1的比例将具有氨基及羧基的高分子材料的溶液滴加至具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的液中；优选地，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为
Figure BDA0002688245610000052
的比例将具有氨基及羧基的高分子材料的溶液滴加至具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的液中；进一步优选地，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为1:1的比例将具有氨基及羧基的高分子材料的溶液滴加至具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的液中。
上述仿生矿化水凝胶的制备方法的技术方案的步骤(2)中，所述模拟体液优选为1.5×SBF～5×SBF，更具体地，所述模拟液体中：NaCl含量为5～30g/L，优选为7～20g/L；NaHCO3含量为0.1～2g/L，优选为0.3～1.2g/L；KCl含量为0.05～1.5g/L，优选为0.2～1.2g/L；K2HPO4·3H2O含量为0.05～1g/L，优选为0.15～0.8g/L；MgCl2·6H2O含量为0.11～1.4g/L，优选为0.2～0.9g/L；CaCl2含量为0.1～2g/L，优选为0.24～1g/L；Na2SO4含量为0.01～1g/L，优选为0.04～0.5g/L。
上述仿生矿化水凝胶的制备方法的技术方案中，一种可行的多巴胺改性的透明质酸的制备方法如下：
将透明质酸钠溶解在事先脱气完全的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，随后将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在水中，将N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液滴加至透明质酸钠溶液中，搅拌反应1～3h，向所得混合液中加入盐酸多巴胺(DA)水溶液，搅拌反应5～24h、优选12～24h，在两次搅拌反应过程中，控制pH值在4.5～6.0范围内，优选在5.1～5.5范围内，该步骤的所有操作均在氮气保护下进行。将所得反应液通过透析纯化3天，冷冻干燥，得到多巴胺改性的透明质酸粉末。
作为可选方案，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为(1～6):(1～4):(1～3):1，优选为(4～6):(2～4):(2～3):1，盐酸多巴胺水溶液的浓度为0.5～3mmol/L，优选为2～3mmol/L，透明质酸钠水溶液的浓度为5～25mg/mL，优选为10～15mg/mL。作为改性基础的透明质酸钠的分子量为8.9w～200w，优选为34w～100w。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，由具有双交联高分子网络结构的水凝胶以及均匀分布在该水凝胶的双交联高分子网络结构上的类骨磷灰石组成。具有双交联高分子网络结构的水凝胶的双交联高分子网络结构中丰富的儿茶酚官能团不仅可以与胶原分子发生迈克加成反应，而且作为钙离子络合剂，为类骨磷灰石的成核和生长提供位点，使钙磷生物矿物遵循逐层生长的模式，得到了具有纳米-微米复合结构、不同层次均匀分布的类骨磷灰石，实现了有机-无机相的高度整合；同时，仿生矿化形成的类骨磷灰石无机相，能有效增强有机相的力学性能，提高仿生矿化水凝胶的力学强度；再者，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料(比如多巴胺改性的透明质酸)能促进磷酸钙无定形相渗入具有氨基及羧基的高分子材料(I型胶原纤维)中，提高具有氨基及羧基的高分子材料的生物矿化效率，更有利于形成有仿生骨基质成分与结构的仿生矿化水凝胶。以上特点均有利于实现有机-无机相的高度相容与整合，改善仿生矿化水凝胶的综合性能，促进其在实践中更好地应用。
2.本发明提供的仿生矿化水凝胶中，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料(比如多巴胺改性的透明质酸)的大量的羧基(-COOH)和酚羟基(-OH)增加了其与模拟体液中的钙、磷离子相互作用的能力，有效提高了生物矿化效率。同时，具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料通过自交联并与具有氨基及羧基的高分子材料(I型胶原纤维)发生迈克加成反应形成双交联高分子网络结构，充当有效的增强填充相来提高水凝胶的网络结构稳定性。此外，通过引入具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料过多的官能团来更紧密地模仿天然骨骼的特性并协调离子的矿化作用，从而成为具有氨基及羧基的高分子材料的生物活化剂。这些因素的综合作用使得本发明提供的仿生矿化水凝胶中类骨磷灰石具有更加均匀的分布。
3.本发明通过实验证实，在仿生矿化后，水凝胶的压缩力学模量得到了有效提升，在模拟体液中仿生矿化14天后得到的仿生矿化后水凝胶DCLHBM5:5和DCLHBM3:7的压缩力学模量达到了128±7.6kPa和116±6.8kPa，压缩力学模量均高于100kPa，十分有利于骨髓间充质干细胞向成骨分化。
4.本发明通过实验证实，本发明提供的仿生矿化水凝胶中的类骨磷灰石的含量达到了45wt.％～68wt.％，仿生矿化水凝胶中类骨磷灰石的体积占比达到了12.5±0.89％～18±1.1％，矿物质密度高；同时，类骨磷灰石的Ca/P比达到了1.64～1.83，特别是仿生矿化水凝胶DCLHBM5:5中沉积的类骨磷灰石的钙磷比与天然骨组织的Ca/P比非常接近，这些都有利于仿生矿化水凝胶在骨修复领域实现更好的应用。
5.本发明提供的仿生矿化水凝胶具有仿生骨基质成分与结构，体外细胞二维共培养实验表明干细胞在仿生矿化水凝胶中表现出明显的黏附生长和增殖行为，该仿生矿化水凝胶能够募集干细胞在3D环境中迁移，浸润和增殖，并促进干细胞成骨分化。
6.本发明提供的仿生矿化水凝胶具有安全无毒、体内可降解吸收、生物相容性好等特点。本发明通过实验证实，本发明提供的仿生矿化水凝胶在植入体内12周后，在兔子临界颅骨缺损模型上取得了良好的修复效果，相比现有的颅骨修复材料，本发明提供的仿生矿化水凝胶可诱导再生高密度血管的新生骨，及时供应血液和营养，维持骨骼完整性。同时，该仿生矿化水凝胶的降解速率与组织再生速度相匹配，植入兔子颅骨12周后，实现了颅骨缺损部位的完美重塑。
7.本发明提供的仿生矿化水凝胶，在不加外源细胞及生长因子条件下，能够在兔子颅骨缺损处募集内源干细胞，同时诱导内源干细胞向成骨及成血管分化，降低了外源性干细胞和生长因子潜在的不可控临床风险，操作简单，有望实现临床应用转化。
附图说明
图1是本发明所述仿生矿化水凝胶的合成过程示意图(以多巴胺改性的透明质酸及I型胶原为例)。
图2是透明质酸钠(HA)、多巴胺改性的透明质酸(HAD)、I型胶原(Col I)、冷冻干燥后的透明质酸-I型胶原水凝胶(HA-Col I)，冷冻干燥后的多巴胺改性的透明质酸-I型胶原水凝胶(HAD-Col I)的差热分析谱图。
图3是实施例2制备的水凝胶在仿生矿化前后的大体观(A图)、尺寸变化率(B图)及质量增加量(C图)。
图4是实施例3在模拟体液中浸泡孵育不同时间后得到的矿化水凝胶的压缩力学模量测试结果。
图5是实施例3在模拟体液中浸泡孵育14天后得到的矿化水凝胶在冷冻干燥后的SEM图像，其中的第一排和第二排是不同放大倍数下的SEM图像。
图6是实施例3在模拟体液中浸泡孵育14天后得到的仿生矿化水凝胶在冷冻干燥后的成分表征结果，其中，A图是电子能谱分析，B图是XRD衍射谱图，C图是红外谱图，D图是热重分析谱图。
图7是实施例3在模拟体液中浸泡孵育14天后得到的仿生矿化水凝胶的Micro-CT分析结果，其中，C1图是冷冻干燥后的仿生矿化水凝胶的三维重建以及冠状截面图像，C2图是冷冻干燥后的仿生矿化水凝胶中磷灰石体积与总体积比，C3图是冷冻干燥后的仿生矿化水凝胶中磷灰石体积。
图8是实施例9中将仿生矿化水凝胶与干细胞体外共培养21天后的增殖情况，其中，A1图是CCK-8细胞增殖测试结果，A2、B1图是体外共培养21天后的细胞活死染色(FDA和PI染色)结果，B2图是细胞数目。
图9是实施例9中将仿生矿化水凝胶与干细胞体外共培养21天的细胞接种成功率(B3图)、细胞骨架染色图像(B4、B5图)、细胞接种率(B6图)、SEM图像(C图)、茜素红染色及半定量分析(D1、D2图)、碱性磷酸酶染色以及半定量分析(E1、E2图)。
图10是实施例10中仿生矿化水凝胶DCLHBM5:5和DCLHBM3:7在体内募集内源干细胞SEM图像。
图11是实施例11中仿生矿化水凝胶DCLHBM5:5和DCLHBM3:7在植入兔子颅骨缺损模型4周和12周后的颅骨缺损修复情况，其中，A图是大体观，B图是X光图像。
图12是实施例11中仿生矿化水凝胶DCLHBM5:5和DCLHBM3:7在植入兔子颅骨缺损模型4周和12周后的颅骨缺损修复情况，其中，C1图是Micro-CT三维重建图像，C2-C4图是成骨参数定量分析结果。
图13是实施例12中仿生矿化水凝胶DCLHBM5:5和DCLHBM3:7在植入兔子颅骨缺损模型4周和12周后修复颅骨缺损的切片H&E及Masson染色结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶及其制备方法与及应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
下述各实施例中，动物实验操作均在无菌环境下进行且已经通过四川大学伦理委员会批准，兔子临界颅骨缺损模型构建及手术植入方法如下：用戊巴比妥钠通过耳静脉注射方法对兔子进行麻醉。用手持牙科电钻在颅骨两侧钻取直径约9mm孔洞，钻取过程不断用生理盐水冲洗以去除渣滓和渗出血液同时降温，切忌钻孔过程伤及硬脑膜。用医用纱布初步止血，滴加生理盐水使其处于湿润状态。用一次性无菌弯镊将仿生矿化水凝胶植入颅骨缺损处，手术线缝合，伤口擦拭碘伏，注射硫酸庆大霉素，放回笼内观察。
实施例1
本实施例中，制备多巴胺改性透明质酸(HAD)，步骤如下：
(1)向浓度为11.5mg/mL的透明质酸钠(Mw＝340kDa)水溶液中滴加浓度为46mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，然后滴加浓度为150mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)溶液，搅拌反应2h，滴加浓度为2mmol/L的盐酸多巴胺水溶液，搅拌反应12h，两次搅拌反应过程中均控制pH值在5.0，该步骤的操作均在氮气保护下进行，EDCI、NHS、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比为6:4:3:1；
(2)将步骤(1)所得反应液用透析膜(MW＝3.5-8kDa)在pH值为3.5的超纯水中透析48h，真空冷冻干燥，即得多巴胺接枝率为8％的HAD粉体，将样品保存在干燥器中。
通过调整EDCI、NHS、盐酸多巴胺与透明质酸钠上的羧基的摩尔比，透明质酸钠的分子量，可以改变HAD中多巴胺的接枝率，在本发明限定的比例关系范围内，可以调整HAD中多巴胺的接枝率在1％～10％范围内。
实施例2
本实施例中，制备具有双交联高分子网络结构的水凝胶(DCLH水凝胶)，Col I水凝胶和HAD水凝胶，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HAD粉体溶解在去离子水中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，将I型胶原(Col I)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的Col I溶液。将Col I溶液缓慢滴加到上述混合溶液中，在冰浴条件下涡旋振荡使二者充分混合，然后用1mol/L的NaOH溶液将所得混合溶液的pH值调节至7.5，迅速转移至硅胶模具中(直径8mm，高度2mm)静置24h，使各组分充分交联，得到DCLH水凝胶。
本实施例中，通过控制Col I与HAD的质量比，共制备三组DCLH水凝胶：
第一组：控制Col I与HAD的质量比为7:3，将制备得到的DCLH水凝胶记作DCLH7:3
第二组：控制Col I与HAD的质量比为5:5，将制备得到的DCLH水凝胶记作DCLH5:5
第三组：控制Col I与HAD的质量比为3:7，将制备得到的DCLH水凝胶记作DCLH3:7
(2)将I型胶原(Col I)溶解在0.5mol/L的酸溶液中得到浓度为25mg/mL的Col I溶液，在冰浴条件下涡旋振荡，然后用1mol/L的NaOH溶液将Col I溶液的pH值调节至7.5，迅速转移至硅胶模具中(直径8mm，高度2mm)静置24h，得到Col I水凝胶。
(3)将实施例1制备的HAD粉体溶解在去离子水中，涡旋振荡至透明澄清，得到浓度为25mg/mL的HAD溶液，在冰浴条件下涡旋振荡，然后用1mol/L的NaOH溶液将HAD溶液的pH值调节至7.5，迅速转移至硅胶模具中(直径8mm，高度2mm)静置24h，得到HAD水凝胶。
本实施例中，对透明质酸钠(HA)、多巴胺改性的透明质酸(HAD)、I型胶原(Col I)、冷冻干燥后的透明质酸-I型胶原水凝胶(HA-Col I，HA与Col I按照5:5的质量比制备得到)，冷冻干燥后的多巴胺改性的透明质酸-I型胶原水凝胶(HAD-Col I，即冷冻干燥后的DCLH5:5)进行差热分析(DSC)测试。结果如图2所示，图2的DSC曲线中的吸热峰温度代表胶原分子内氢键被破坏，导致三股螺旋结构解散为无规卷曲结构的温度，即热变性温度。相比于HA-Col I，HAD-Col I的变性温度大幅提升，从纯Col I膜的84.6℃提高到111.7℃。DSC测试结果表明HAD与Col I之间发生了迈克加成反应，形成具有双交联高分子网络结构的HAD-Col I水凝胶。HAD-Col I湿热稳定性得到提高，有助于改善Col I的降解速率。
实施例3
本实施例中，制备仿生矿化水凝胶，步骤如下：
(1)配制模拟体液，模拟体液为1.5×SBF。
用酸缸浸泡玻璃烧杯，塑料烧杯及实验中用到的其他容器。量取700mL去离子水，依次按顺序将0.1mmolNaCl，0.02mmolNaHCO3，0.05mmolKCl，0.01mmolK2HPO4·3H2O，0.025mmolMgCl2·6H2O，0.01mmolCaCl2和1mmolNa2SO4溶解在去离子水中并在36.5℃用三(羟甲基)氨基甲烷和1mol/L的HCl水溶液将pH调至7.40，定容至1L，制备得到模拟体液，将配制的模拟体液用0.22μm滤头过滤。
(2)将实施例2制备的三组DCLH水凝胶用去离子水充分漂洗，并用氮气流干燥去除水凝胶表面的水分，然后浸没在用0.22μm滤头过滤后的模拟体液中，在无菌条件下于37℃孵育14天，将所得产物用去离子水洗涤，得到仿生矿化水凝胶DCLHBM，将由DCLH7:3、DCLH5:5、DCLH3:7仿生矿化制备的仿生矿化水凝胶分别记作DCLHBM7:3、DCLHBM5:5、DCLHBM3:7。
在孵育期间，每间隔24h更换一次模拟体液，以确保在实验过程中具有基本一致的离子强度，分别在孵育的第3、7、14天从模拟体液中取出材料，用去离子水漂洗。
(3)将实施例2制备的Col I水凝胶用去离子水充分漂洗，并用氮气流干燥去除水凝胶表面的水分，然后浸没在用0.22μm滤头过滤后的模拟体液中，在无菌条件下于37℃孵育14天，将所得产物用去离子水洗涤，得到Col I仿生矿化水凝胶。
在孵育期间，每间隔24h更换一次模拟体液，以确保在实验过程中具有基本一致的离子强度，分别在孵育的第3、7、14天从模拟体液中取出材料，用去离子水漂洗。
(4)将实施例2制备的HAD水凝胶用去离子水充分漂洗，并用氮气流干燥去除表面的水分，然后浸没在用0.22μm滤头过滤后的模拟体液中，在无菌条件下于37℃孵育14天，将所得产物用去离子水洗涤，得到HAD仿生矿化水凝胶。
在孵育期间，每间隔24h更换一次模拟体液，以确保在实验过程中具有基本一致的离子强度，分别在孵育的第3、7、14天从模拟体液中取出材料，用去离子水漂洗。
实施例4
本实施例中，观察和测试实施例2制备的五组水凝胶在仿生矿化前后的大体观、尺寸变化率和质量增加率。
将实施例2制备的未仿生矿化的五组水凝胶冷冻干燥，将实施例3制备的仿生矿化后五组仿生矿化水凝胶冷冻干燥。用体视显微镜拍摄冷冻干燥后的各组水凝胶样品在仿生矿化前后的大体观，如图3的A图所示，图3A中，仿生矿化前的样品是指实施例2制备的水凝胶经冷冻干燥后得到的样品，仿生矿化后的样品是指实施例3中在模拟体液中浸泡孵育14天后得到的仿生矿化水凝胶经冷冻干燥后得到的样品。拍摄时将各样品面正对镜头，拍摄倍数设为7.5倍。随后在冷冻干燥后的样品表面量取十个不同位置的直径，取平均值，计算仿生矿化前后的样品尺寸变化率。使用电子分析天平(精确至10-5g)测量仿生矿化后样品的质量增量(MK)，质量增量MK表示为M2(仿生矿化后样品冷冻干燥后的质量)与M1(仿生矿化之前样品冷冻干燥后的质量)之间的差，质量增加率表示为MK(％)，MK(％)＝(M2-M1)/M2×100％。
由图3的A图可知，在仿生矿化之前，冷冻干燥后的Col I水凝胶和冷冻干燥后的DCLH水凝胶的颜色分别为白色和棕色，且DCLH水凝胶的棕色随着HAD浓度的增加而增加。在模拟体液中浸泡孵育14天后，白色晶体沉积在水凝胶中，材料颜色变为浅棕色。
在模拟体液中浸泡孵育14天后，五组水凝胶都出现不同程度的尺寸变化，Col I，DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD组的尺寸变化率分别为0.68±0.04、1.26±0.08、1.07±0.06、1.15±0.07和1.78±0.09。图3的B图展示了五组水凝胶在经过不同的浸泡孵育时间后的尺寸变化率。
在模拟体液中浸泡孵育14天后，五组水凝胶都出现不同程度的质量变化，Col I，DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD组的质量增加率分别为110±4.8％、115±5.4％、192±11.1％、166±7.5％和138±6.9％。相比其他四组样品，DCLHBM5:5组具有最小的尺寸变化率和最大的质量增加率，其次是DCLHBM3:7组，由此我们推测这两组在模拟体液中浸泡孵育14天后产生了更明显的矿化现象。
实施例5
本实施例中，测试实施例3中将五组水凝胶在模拟体液中浸泡孵育3、7和14天后得到的仿生矿化水凝胶的机械性能。
对实施例3中将五组水凝胶在模拟体液中浸泡孵育3、7和14天后得到的仿生矿化水凝胶进行压缩测试以评估它们的机械性能，结果如图4所示。由图4可知，五组矿化水凝胶的压缩模量随着仿生矿化时间的延长都呈现上升趋势，在模拟体液中浸泡孵育14天后，DCLHBM5:5组的压缩模量(128±7.6kPa)显著高于其他组别的压缩模量(Col I组，14.7±0.9kPa；DCLHBM7:3组，45±1.9kPa；DCLHBM3:7组，116±6.8kPa；HAD组，27±1.2kPa)。
由于骨移植替代物的机械性能在决定细胞命运方面起着至关重要的作用，较软的基质更适合于软骨形成分化，而较硬的基质更适合于成骨分化，在仿生矿化后，DCLHBM5:5组和DCLHBM3:7组的压缩模量均大于100kPa，因此适合干细胞成骨分化。
实施例6
本实施例中，对实施例3制备的五组仿生矿化水凝胶进行SEM测试。
将实施例3中经过14天的模拟体液浸泡孵育制备的五组仿生矿化水凝胶置于2.5％的戊二醛中固定24h，PBS清洗，随后进行冷冻干燥。将冷冻干燥后的样品放置入液氮中迅速冷冻10分钟后脆断，粘附在导电胶上，并进行表面喷金处理拍摄SEM照片。结果如图5所示，图5的第一排和第二排是不同放大倍数下的SEM照片。在经过14天的模拟体液浸泡孵育后，在五组水凝胶中都形成了类骨磷灰石，在DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD这四组中形成了类骨磷灰石团聚体，类骨磷灰石团聚体覆盖了四组支架的大部分表面，且在DCLHBM5:5组中分布密度最大。同时，在DCLHBM7:3，DCLHBM5:5和DCLHBM3:7组中，类骨磷灰石团聚体的分布均匀，而HAD组中的类骨磷灰石团聚体的分布均匀性相对较差。在DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD组中，类骨磷灰石团聚体的尺寸分别为6.4±0.35μm、7.2±0.40μm、6.7±0.37μm、和6.5±0.38μm，高倍下可以看到致密的纳米尺度的类骨磷灰石典型花瓣状结构。
实施例7
本实施例中，将实施例3在模拟体液中浸泡孵育14天后得到的五组仿生矿化水凝胶冷冻干燥，并进行电子能谱、XRD、红外和热重分析。
使用电子能谱对矿化晶体成分进行半定量分析。使用X射线衍射仪(Cu Kλ＝1.540598nm)对结晶相进行测定，2θ扫描范围5°-80°，扫描步长0.02°/s。采用红外光谱仪(Nicolet 6700，Germany)在500-4000cm-1波长范围内对矿化后官能团进行表征。使用热重分析仪对支架中磷灰石含量进行分析，温度范围为25-1000℃，升温速率为10℃/min，结果如图6所示。图6的A图是实施例3制备的生矿化水凝胶在冷冻干燥之后的电子能谱分析结果，B图是XRD衍射谱图，C图是红外谱图，D图是热重分析谱图。
由图6的A图可知，仿生矿化水凝胶中的类骨磷灰石团聚体主要由Ca元素和P元素组成，经计算得出Col I，DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD组的Ca/P比分别为2.21、1.95、1.64、1.83和2.87。在DCLHBM5:5组中观察到Ca/P比为1.67±0.03，最接近天然骨组织的Ca/P比1.67。钙元素和磷酸盐元素分布的EDS谱图证实了DCLHBM5:5组的仿生矿化水凝胶相比于其他四组的仿生矿化水凝胶，具有更均匀的磷灰石沉积。
进一步用X射线衍射分析冷冻干燥后的仿生矿化水凝胶中的晶体成分，结果如图6的B图所示，Col I，DCLHBM7:3，DCLHBM5:5和DCLHBM3:7组在大约20°处观察到胶原蛋白的宽扩散峰。在DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD组中检测到26.1°和31.8°的峰，分别对应于羟基磷灰石的(002)和(300)衍射峰。DCLHBM5:5组在31.8°处的峰强度明显强于其他组别，表明DCLHBM5:5组的仿生矿化水凝胶中的羟基磷灰石晶相含量最多。
从图6的C图所示的红外光谱分析结果可以看到，在1023、961、601和561cm-1处的峰对应于DCLHBM仿生矿化水凝胶中磷灰石PO43-基团的振动峰。在1547cm-1处观察到酰胺II谱带中N-H振动峰，而1200-1300cm-1附近的峰对应于酰胺III谱带的N-H振动峰。
从图6的D图所示的热重分析结果可以看到，实施例3在模拟体液中经过14天的浸泡孵育完成仿生矿化后，Col I，DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD组的剩余重量分别为23.9％，34.2％，67.7％，45.2％和44.6％，表明DCLHBM5:5和DCLHBM3:7组中沉积了更多的磷灰石。
实施例8
本实施例中，将实施例3制备的五组仿生矿化水凝胶冷冻干燥，进行Micro-CT分析。
将实施例3经过14天的仿生矿化制备的仿生矿化水凝胶冷冻干燥，固定在样品管的海绵中，在Micro-CT机中进行扫描成像，体积像素设为10μm。将扫描得到的dicom格式数据用mimics 17.0软件进行处理，重建对应的样品3D图像，Micro-CT分析结果如图7所示，其中，C1图是冷冻干燥后的仿生矿化水凝胶的三维重建以及冠状截面图像，C2图是冷冻干燥后的仿生矿化水凝胶中磷灰石体积与总体积比，C3图是冷冻干燥后的仿生矿化水凝胶中磷灰石体积。
C1图中的三维成像中的绿色块体代表磷灰石，在Micro-CT三维重建图像中观察到圆柱状和磷灰石层的均匀分布。横断面冠状截面图像显示，许多磷灰石附着在仿生矿化水凝胶的表面和内部。磷灰石体积(AV)和磷灰石体积占总体积百分比(AV/TV)的定量分析证实，在DCLHBM5:5和DCLHBM3:7组中沉积了更多的磷灰石，羟基磷灰石的体积以及仿生矿化水凝胶中磷灰石体积与总体积比分别为46.5±2.8mm3、18±1.1％，32.6±1.9mm3、12.5±0.89％。
实施例9
本实施例中，按以下步骤构建细胞-DCLHBM的二维共培养模型：
将实施例3制备的仿生矿化水凝胶置于超低粘附24孔板中，吸取20μL 2.5×105/mL兔子骨髓间充质干细胞(MSCs)悬浮液(调节pH至7.4)滴加到仿生矿化水凝胶表面，在细胞培养箱中孵育30min后，向仿生矿化水凝胶的另外一面滴加20μL 2.5×105/mLMSCs细胞悬浮液(调节pH至7.4)，随后转移至细胞培养箱中孵育3h后，将1.5mL的培养基滴加到每个孔中，然后置于细胞培养箱中进行培养，每2天更换一次新的培养基，培养21天后，将细胞-仿生矿化水凝胶复合物取出，用PBS清洗去表面未粘附的细胞。此处使用的培养基为补充有10％血清和1％双抗的α-MEM或高糖DMEM培养基。
图8是仿生矿化水凝胶与干细胞体外共培养21天后的增殖情况，其中，A1图是CCK-8细胞增殖测试结果，A2、B1图是体外共培养21天后的细胞活死染色(FDA和PI染色)结果，B2图是细胞数目。CCK-8细胞增殖测试结果表明仿生矿化水凝胶DCLHBM没有细胞毒性并促进了细胞增殖。细胞活死染色(FDA和PI染色)结果进一步证明仿生矿化水凝胶DCLHBM与细胞体外共培养21天时，未观察到死细胞的存在，表现出良好的生物相容性。
使用双转盘共聚焦扫描成像(DTCS)对整个仿生矿化水凝胶表面的细胞生长情况进行定量分析，发现在五组仿生矿化水凝胶样品中都没有观察到死细胞的存在，说明仿生矿化水凝胶具有良好的生物相容性。定量分析得到Col I，DCLHBM7:3，DCLHBM5:5，DCLHBM3:7和HAD组表面的活细胞数分别为980±37、4233±210、12890±754、3465±176和1069±55。说明DCLHBM5:5组相比于其他四组更能促进MSCs增殖。
测试仿生矿化水凝胶与干细胞体外共培养21天的细胞接种成功率、细胞骨架染色图像、细胞接种率、SEM图像、茜素红染色及半定量分析、碱性磷酸酶染色以及半定量分析，结果如图9所示。
使用DTCS对整个仿生矿化水凝胶表面的F-actin细胞骨架染色进行分析，结果如图9的B4、B5图所示，B4、B5图中，蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表肌动蛋白。Col I组在体外共培养21天后，Col I仿生矿化水凝胶出现了明显的收缩现象，细胞多集中在边缘，中心出现空洞。HAD组在体外共培养21天后，HAD仿生矿化水凝胶出现了明显的溶胀现象，且细胞分布不均匀。DCLHBM5:5和DCLHBM3:7组的仿生矿化水凝胶在体外共培养21天后，DCLHBM5:5和DCLHBM3:7组的仿生矿化水凝胶保持了相对稳定的结构，细胞呈现高密度均匀分布。
细胞接种成功率的定量分析结果如图9的B3图所示，DCLHBM3:7和DCLHBM5:5组的细胞接种成功率分别为68±3.4％和85±5.3％，说明DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，特别是DCLHBM5:5具有作为骨组织工程支架修复骨缺损的巨大潜力。
仿生矿化水凝胶与细胞体外共培养21天后的SEM照片如图9的C图所示，由该图可知，DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，特别是DCLHBM5:5组在体外共培养21天后，细胞呈现出明显的梭形铺展形态，表现出明显的黏附材料生长的形貌特征。通过茜素红染色表明粘附到水凝胶上的细胞在体外共培养21天时向成骨分化，形成钙结节细胞外基质，见图9的D1、D2图。在体外共培养的21天后，在DCLHBM5:5组中看到了细胞核周围大量的ALP阳性表达，见图9的E1、E2图。
以上体外二维培养模型证实，DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，特别是DCLHBM5:5能更好地促进干细胞增殖、粘附并向成骨分化。
实施例10
本实施例中，将实施例3中经过14天的模拟体液浸泡孵育制备的仿生矿化水凝胶DCLHBM3:7和DCLHBM5:5植入兔子临界颅骨缺损模型(Diameter＝9mm)。植入1周后，取出仿生矿化水凝胶DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，脱水干燥，拍摄SEM照片，结果如图10所示。由图10中的SEM图像可知，DCLHBM3:7组的细胞呈圆球形，DCLHBM5:5组中有大量呈铺展状态的细胞粘附在DCLHBM5:5的表面，具有与干细胞相似的形态，表明DCLHBM5:5组具有更明显的细胞粘附生长行为。以上实验结果表面DCLHBM5:5能更好地募集内源干细胞，且干细胞有明显的粘附生长。
实施例11
将实施例3中经过14天模拟体液浸泡孵育制备的仿生矿化水凝胶DCLHBM3:7和DCLHBM5:5植入兔子临界颅骨缺损模型(Diameter＝9mm)。分别在植入4周和12周后取出仿生矿化水凝胶DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，进行相应的表征。
植入4周和12周后缺损处再生骨组织的大体观如图11的A图所示。在植入后第4周，DCLHBM3:7和DCLHBM5:5组可以看到缺损边缘处有新生骨组织且缺损面积减小，在DCLHBM5:5组的缺损处有丰富的血管分布。而在空白组(空白组中未植入任何材料)中未观察到新生骨组织，仍存在大面积的缺损，据此我们推测对缺损不做处理，无法形成有效的修复组织。在植入后第12周，从DCLHBM5:5组中可以看到不规则的新骨从缺损的边缘向中心生长，形成了一些网状结构，表明缺损已被新骨部分填充。
X光射线图证实在植入后第4周，可以看到缺损处存在大量的材料且材料与缺损组织边缘结合紧密，在植入后第12周时，缺损被白色组织部分填充，如图11的B图所示。
由图12的C1图所示的Micro-CT三维重建图像可知，在植入后第4周，DCLHBM3:7和DCLHBM5:5组的缺损边缘处有部分新生骨，空白组中则保留了较大的缺损面积。在植入后第12周，DCLHBM3:7和DCLHBM5:5组的新生骨组织厚度和骨量进一步增加，只是DCLHBM3:7组的新生骨量变化相对较小，而空白组的新生骨量变化则更小。从缺损断面成像图可以看出，DCLHBM5:5组的新生骨组织在植入后第4周时具有类自然骨的骨结构，在植入后第12周时DCLHBM3:7组的新生骨组织覆盖了大部分缺损区域并形成更完整的骨结构。
从图12的C2-C4图是成骨参数定量分析结果可以看到，在植入后第4周，空白组、DCLHBM3:7和DCLHBM5:5组的新生骨体积在缺损部位总体积的占比(BV/TV)分别为11.3±1.3％、29.4±2.6％和40.3±4.1％。在植入后第12周，空白组、DCLHBM3:7和DCLHBM5:5组的新生骨体积在缺损部位总体积的占比分别为18.4±2.3％、35.7±5.1％和53.5±6.1％。在植入后第4周和第12周，DCLHBM5:5组和DCLHBM3:7组的新生骨体积和新生骨面积比相比于空白组都显示出更高的值，同时，DCLHBM5:5组的新生骨体积和新生骨面积比也高于DCLHBM3:7组。在植入后第12周，DCLHBM5:5组的新生骨体积和新生骨面积占比分别为62.9±5.7mm3、84.1±9.4％，而DCLHBM3:7组和空白处理组分别为41.9±4.4mm3、39.7±6.8％和21.7±3.4mm3、22.9±3.3％。
由本实施例的实验结果可知，DCLHBM3:7和DCLHBM5:5，尤其是DCLHBM5:5，能增强兔子颅骨缺损再生，不仅在缺损处形成大量的新生骨组织，还使新生骨组织具有类自然骨的骨结构。
实施例12
将实施例11中植入兔子临界颅骨缺损模型4周和12周后的仿生矿化水凝胶DCLHBM3:7和DCLHBM5:5取出，依次进行脱钙、石蜡包埋和切片。随后进行H&E和Masson’strichrome组织化学染色，同时也对空白组进行相同的染色，结果如图13所示，图13的A1、B1图分别为植入4周和12周后的HE染色结果，图13的A2、B2图分别为植入4周和12周后的MT染色结果。
由图13可知，在植入12周后，DCLHBM3:7组和DCLHBM5:5组，特别是DCLHBM5:5组中有大量新生骨组织且几乎长满整个缺损区域，新生骨组织逐渐扩展到了缺损的中心区域，颅骨缺损充分愈合。局部放大可以看到新生骨组织具有接近自然骨的结构特征且大量的新生血管分布在缺损处。Masson染色通过不同分子量的染料在不同致密度的胶原纤维的渗透性能差异来判断骨的成熟度，致密的胶原、肌肉纤维和红细胞会被染为红色，而疏松的胶原和纤维素则会被染为蓝色。通过Masson染色进一步证实缺损处新生骨组织的主要成分为胶原，新生骨组织处于早期发育阶段。
本实施例的实验结果表明DCLHBM5:5和DCLHBM5:5，特别是DCLHBM5:5在植入体内12周后促进了兔子颅骨缺损的完美再生重塑。

Claims (7)

1.具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，其特征在于，该仿生矿化水凝胶由具有双交联高分子网络结构的水凝胶以及均匀分布在该水凝胶的双交联高分子网络上的类骨磷灰石组成，类骨磷灰石的Ca/P比为1.64～1.83；
所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶是具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料氧化自交联以及具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料与具有氨基及羧基的高分子材料通过迈克加成反应形成的；
类骨磷灰石是以具有双交联高分子网络结构的水凝胶中的双交联高分子网络中的儿茶酚官能团与钙离子络合作为类骨磷灰石的成核位点生长形成的，类骨磷灰石是由纳米级类骨磷灰石聚集形成的微米级类骨磷灰石团聚体；
所述具有氨基及羧基的高分子材料是I型胶原，所述具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料是结构式如式(Ⅰ)所示的多巴胺改性的透明质酸，多巴胺改性的透明质酸中多巴胺的接枝率为1％～50％，
Figure FDA0003240501440000011
所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶是具有氨基及羧基的高分子材料的溶液与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液在pH＝6.8～8.5的条件下，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为
Figure FDA0003240501440000012
的比例，多巴胺改性的透明质酸溶液氧化自交联以及多巴胺改性的透明质酸溶液与I型胶原溶液通过迈克加成反应形成的反应形成的；
该仿生矿化水凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料溶解，将具有氨基及羧基的高分子材料溶液溶解，将所得具有氨基及羧基的高分子材料的溶液滴加至具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液中，在冰浴条件下充分混合，然后调节所得混合溶液的pH值至6.8～8.5，再立即转移至模具中静置至各组分充分交联，得到具有双交联高分子网络结构的水凝胶；
(2)将具有双交联高分子网络结构的水凝胶用去离子水清洗，干燥去除表面的水分，然后浸没在pH＝6.8～8.5的模拟体液中在无菌条件下于37℃孵育10～50天，将所得产物用水洗涤，得到具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶；在孵育期间，每间隔12～24h更换一次模拟体液，所述模拟体液为1×SBF～20×SBF。
2.根据权利要求1所述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，其特征在于，该仿生矿化水凝胶在冷冻干燥后，其中的类骨磷灰石的含量为45wt.％～90wt.％，余量为双交联网高分子络结构；所述具有双交联高分子网络结构的水凝胶中，双交联高分子网络的含量为5～50mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，其特征在于，微米级类骨磷灰石团聚体的粒径为1.2～200μm。
4.根据权利要求1或2所述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，其特征在于，该仿生矿化水凝胶的压缩模量至少为100kPa。
5.根据权利要求1所述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，其特征在于，步骤(1)中，将具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料用水溶解形成浓度为5～50mg/mL的具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的溶液，将具有氨基及羧基的高分子材料用醋酸溶液溶解形成浓度为5～50mg/mL具有氨基及羧基的高分子材料的溶液。
6.根据权利要求1所述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶，其特征在于，步骤(1)中，按照具有氨基及羧基的高分子材料与具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的质量比为
Figure FDA0003240501440000021
的比例将具有氨基及羧基的高分子材料的溶液滴加至具有羧基及儿茶酚官能团的高分子材料的液中。
7.权利要求1至6中任一权利要求所述具有纳米-微米复合结构和高矿物质密度的仿生矿化水凝胶在制备颅骨修复材料中的应用。
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