CN106620879A - 机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料及其制备方法，包括如下具体步骤：步骤（一）：使用快速成型技术三维打印大孔径PCL支架，得到一级结构；步骤（二）：将一级结构PCL支架的表面活化；步骤（三）：采用胶原网络对一级结构PCL支架进行三维功能活化，得到二级结构Col-PCL支架；步骤（四）：采用纳米羟基磷灰石颗粒对二级结构Col-PCL支架进行仿生矿化，得到三级结构AP-Col-PCL支架；本发明产品结合了快速成型技术和生物材料三维修饰技术，构建出一种具有良好机械性能和生物活性的仿生骨修复材料AP-Col-PCL，运用于骨缺损的研究和临床治疗中。
Description
技术领域
本发明属于仿生复合材料技术领域，涉及一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料及其制备方法。
背景技术
骨是人体最易损伤和缺损的组织之一。目前对于大段骨缺损治疗的方法包括：自体骨移植，同种异体及异种骨移植，基于生物材料的骨缺损修材料等。自体骨移植，作为目前治疗骨缺损的金标准，从19世纪初至今一直被广泛运用于临床，然而自体骨移植存在供区二次手术创伤、骨量不足、疼痛等并发症。异体骨及异种骨移植，作为自体骨移植的常用替代方法，存在潜在免疫排斥反应、疾病传播以及骨移植材料来源有限等缺点。基于生物材料的骨缺损修材料，克服了自体骨移植及异体骨移植的缺点，同时具有可批量生产、成本相对较低、即拿即用等优点，具有很大潜能取代自体骨和异体骨移植材料作为骨缺损治疗的替代物。 理想的骨修复生物支架材料应具良好的生物相容性、生物降解性、骨传导性和骨诱导性，同时还应具有一定的机械稳定性，以及适当的结构和孔径，最大限度模拟自体骨的理化性质。
目前有天然或人工合成聚合物、生物陶瓷、以及他们的复合物等，作为一种骨替代材料运用于骨组织缺损的治疗和研究中。天然聚合物，包括：胶原、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸等从上世纪90年代起已被运用于骨缺损修复的研究中。天然聚合物具有良好的生物可降解性和生物相容性，但由于机械性能较差，仅限于皮肤、角膜以及腔隙性骨缺损或非承重部位骨缺等的修复治疗。胶原（Collagen，Col）作为作为骨组织中的最主要的有机成分，是组织中细胞外基质（Extracellular
matrix，ECM）的主要成分，由于具有良好的生物相容性和低免疫原型，且容易获得等优点，是目前运用最广泛的聚合物类骨移植材料。生物陶瓷材料，如：羟基磷灰石（hydroxyapatite，AP），β-磷酸三钙（β-tricalcium phospApte，β-TCP），由于具有与骨组织无机组分和结构相似的特点和较好的生物相容性而被广泛运用。生物陶瓷材料，大多呈细微颗粒状，不易成型，如需制备成为大段骨缺损移植材料，需要加入化学试剂制孔、经过高温烧结，制备过程较为复杂。同时烧结成型的生物陶瓷具有易脆、抗疲劳强度低、机械性能差、降解速度慢或降解速度不可调控等缺点。合成类聚合物，如：聚己内酯（poly(3-caprolactone，PCL），聚乳酸（polylactic acid，PLLA)，聚乙醇酸（polyglycolic
acid，PGA)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lacticco-glycolic) acid ，PLGA)等，由于具有可调控的机械性能和可调节生物降解速度，已被广泛用作骨缺损修复材料运用于基础研究中。其中PCL已被FDA批准作为骨缺损的修复材料运用于颅颌面骨组织缺损治疗。但先前的研究发现，单纯PCL具有较强的疏水性能，细胞接种和培养时，细胞不易粘附，从而影响细胞培养和增殖；同时，单纯三维PCL生物活性有限，体内植入后，容易引起机体的异物反应，导致纤维组织在PCL支架孔洞内部和支架周围增生与包绕，影响骨组织再生和修复效果。
因此探究一种简单有效的新方法，针对三维PCL支架进行改良，以提高其生物学活性，显得尤为必要。有研究者试图通过共混杂化的方法，将一定比例的无机材料（如：β-TCP）与PCL混合，后经三维打印（three
dimensional printing，3DP）成型，制备出有机—无机两相复合β-TCP-PCL支架材料，以提高PCL支架活性的目的。然而，该法制备的复合支架材料存在以下几个问题：（1）混料过程复杂，混料时纳米级的无机β-TCP颗粒在与有机大分子PCL在混合过程中容易发生团聚，导致分散不均；（2）FDM成型后的β-TCP-PCL复合支架中，绝大多数无机β-TCP颗粒被有机PCL包裹在内部，β-TCP不能均匀分布于支架材料内，对PCL支架生物活性提高有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料及其制备方法，本发明产品结合了快速成型技术和生物修饰技术，构建出一种具有良好机械性能和生物活性的仿生骨修复材料AP-Col-PCL，运用于骨缺损的研究和临床治疗中。
为了解决以上技术问题，本发明提供一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，包括如下具体步骤：
步骤（一）：使用快速成型技术三维打印大孔径PCL支架，得到一级结构；
步骤（二）：将一级结构PCL支架的表面活化；
步骤（三）：采用胶原网络对一级结构PCL支架进行三维功能活化，得到二级结构Col-PCL支架；
步骤（四）：采用纳米羟基磷灰石颗粒对二级结构Col-PCL支架进行仿生矿化，得到三级结构AP-Col-PCL支架。
PCL 具有熔点温度低（60℃）、室温下具有一定弹性、易于加工等特点，利用3DP技术构建出的个体化PCL骨组织工程支架具有可调控的孔洞结构和机械性能，适合于作为骨移植材料运用到骨组织缺损治疗，但单纯PCL三维支架具有较强的疏水性能，体外细胞接种和培养时，细胞不易粘附，从而影响细胞培养和增殖；同时，单纯三维PCL支架生物活性有限，体内植入后，容易引起机体的异物反应，导致纤维组织在PCL支架孔洞内部和支架周围增生与包绕，影响骨组织再生和修复效果。
本发明结合了快速成型技术和生物修饰技术，利用快速成型技术制备出个体化多孔PCL三维骨修复支架材料，该PCL支架材料具有良好的机械性能和良好的生物相容性，但生物活性有限；因此，我们利用具有较好生物活性的ECM——胶原（collagen，Col）对其进行三维活化，制备出仿生的复合Col-PCL支架，Col-PCL支架具备PCL机械性能和Col的生物活性；为了更进一步模拟自然骨组织中成分：无机-有机复合物，利用生物矿化的方法，对Col-PCL进行表面矿化，使得在温和的条件下，不影响Col-PCL各项性能的情况下，获得骨组织中的无机成分：羟基磷灰石（hydroxyapatite，AP）；从而构建出一种具有良好机械性能和生物活性的仿生骨修复材料AP-Col-PCL，运用于骨缺损的研究和临床治疗。
前述步骤（一）通过计算机辅助设计软件建立孔径大小为100～1500μm的三维PCL支架的CAD 模型，并将CAD模型转换为STL.格式文件，进行分层处理后输入熔融成型机数据处理软件中，利用3DP成型系统进行三维支架打印，三维支架打印时喷头走形方向按（0°，60°，120°）或者（0°，90°）逐层堆积。
优选地，三维PCL支架的孔径大小为1000μm。
前述三维支架打印的具体步骤包括：
A、将PCL颗粒原料放入快速成型机的熔化器中加热至50～180℃，使PCL材料成流动状态；
B、依据STL.格式的CAD图形，在计算的控制下，将流动状态的PCL材料由直径为
0.50mm的喷嘴沿X、Y轴在按照角度（0°，60°，120°）或者（0°，90°）挤出，降温至常态后凝固，然后沿Z轴下降一个高度再重复X、Y轴的运动，喷嘴中再挤出流动状态PCL材料，降温凝固时与上一层紧密粘结，如此一层一层堆积制作PCL支架；
C、根据需要，设计出不同形状的CAD模型，并将CAD模型以STL.格式文件导出，转移到成型系统中，按模式图成型模式制得不同形状的多孔三维PCL支架。
优选地，步骤A中，将PCL颗粒原料放入快速成型机的熔化器中加热至120℃。
前述步骤（二）通过采用碱处理法对PCL支架进行表面活化处理，表面活化处理的具体步骤包括：
D、将三维打印的PCL支架浸入3～7M的NaOH溶液中，40～120rpm处理12～48h，取出后三蒸水清洗至pH=6～8；
E、通过傅里叶变化红外光谱分析证实活化后PCL支架表面获得活化官能基团。
优选地，步骤D为：将三维打印的PCL支架浸入5M的NaOH溶液中，80rpm处理24h，取出后三蒸水清洗至pH=7.4。
三维打印的大孔径PCL支架，具有的生物活性有限，细胞粘附力差，植入体内后容易形成纤维包裹，为了提高三维大孔PCL支架的生物活性，若在PCL支架中混入磷酸钙类生物陶瓷颗粒，则会存在材料混合不均、成型后大部分无机材料颗粒被聚合物包裹而不能显露于材料表面的缺点；若利用静电丝仿、熔融成型以及在PCL支架表面进行Col涂层等方法制作PCL-COL复合支架，工艺复杂且费用高昂；利用碱处理法进行表面活化处理，既能最大程度活化PCL支架，又能简化制作流程，降低制作成本。
前述步骤（三）的三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到1～50mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到胶原凝胶中，抽真空20～60mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-50～-10℃冷冻12～48h；
H、在-80～-10℃条件下冷冻干燥上述PCL支架24～72h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用20～70mM 的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对复合支架材料进行交联，交联条件为1～10℃、10～72h，交联完成后，采用1～12%甘氨酸溶液清洗10～80min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=6～8后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，再次于-80～-10℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
前述步骤（四）中仿生矿化采用两步矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置100～250mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡，可加速生物矿化过程；
J、配置模拟体液，配置模拟体液，模拟体液各组分如下：
Na+：100～150mM, K+：3～6mM, Mg2+：1～2mM, Ca2+：1～3mM, Cl-：100～160mM, HCO3 -：20～30mM, HP04 2-：2～4mM, SO4 2-：0.1～0.6mM；
K、将复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入100～250mM 的CaCl2
溶液中10s～10min，然后取出，水洗1～5min，再浸入100～250mM 的K2HPO4溶液中，取出，水洗10s～10min，重复2～6遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为20～50℃，摇床30～80rpm，每1～24h更换新的矿化诱导液，持续矿化0.5～15天，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
本发明的有益效果是：
本发明产品结合了快速成型技术和生物修饰技术，利用快速成型技术制备出个体化多孔PCL三维骨修复支架材料，该PCL支架材料具有良好的机械性能和良好的生物相容性，但生物活性有限；因此，利用具有较好生物活性的ECM——胶原（collagen，Col）对其进行三维活化，制备出仿生的复合Col-PCL材料支架，该支架材料具备PCL机械性能和Col的生物活性；为了更进一步模拟自然骨组织中成分：无机-有机复合物，利用生物矿化的方法，对Col-PCL进行表面矿化，使得在温和的条件下，不影响Col-PCL各项性能的情况下，获得骨组织中的无机成分：羟基磷灰石（hydroxyapatite，AP），以构建出一种具有良好机械性能和生物活性的仿生骨修复材料AP-Col-PCL，运用于骨缺损的研究和临床治疗中。
本发明公开的制备方法的优势在于：1、构建具有力学支撑的大孔PCL框架：利用三维打印技术构建一种具有多孔结构的具有适合力学稳定性的大孔PCL框架；2、PCL支架三维功能化：利用具有微米级多孔的胶原对大孔三维PCL框架进行三维修饰，实现支架材料的活化和功能化；3、利用仿生矿化技术进，模拟自然骨组织成分，进一步增强该支架生物活性；4、利用3DP技术，构建具出可定制化的、具有自由形状的骨组织缺损修复材料运用到骨缺损修复研究中。
本发明中采用3DP制备的多孔PCL骨修复支架材料，具有生物可降解性，具有良好的机械性能和完全的空隙连通率，有利于新生组织长入；利用胶原对PCL支架进行三维功能活化，不破坏PCL支架原来的机械性能和孔径结构，增加材料与组织的接触面积，能大大提高PCL支架的生物学活性，有利于为组织的再生提供更好的微环境；利用仿生矿化技术，在Col表面沉积出与骨组织中相似的纳米羟基磷灰石（AP），进一步提高支架材料的骨修复活性；本发明设计方案中的修饰方法均在温和反应条件下进行，操作简便，同时不破坏原来材料的性能，具有经济有效的优点。
附图说明
图1为三维大孔PLC支架的结构示意图；
图2为三维打印PLC支架的示意图；
图3为大孔径PCL支架的电镜图a1；
图4为大孔径PCL支架的电镜图a2；
图5为二级结构Col-PCL支架的电镜图b1；
图6为二级结构Col-PCL支架的电镜图b2；
图7为三级结构Ap-Col-PCL支架的电镜图c1；
图8为三级结构Ap-Col-PCL支架的电镜图c2；
图9为节段性骨缺损修复结果示意图。
具体实施方式
实施例
1
本实施例提供一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，包括如下具体步骤：
步骤（一）：使用快速成型技术三维打印大孔径PCL支架，得到一级结构，结构如图1，
通过计算机辅助设计软件建立孔径大小为100μm的三维PCL支架的CAD 模型，并将CAD模型转换为STL.格式文件，进行分层处理后输入熔融成型机数据处理软件中，利用3DP成型系统进行三维支架打印，三维支架打印时喷头走形方向按（0°，60°，120°）逐层堆积；
三维支架打印的具体步骤包括：
A、将PCL颗粒原料放入快速成型机的熔化器中加热至50℃，使PCL材料成流动状态；
B、如图2所示，依据STL.格式的CAD图形，在计算的控制下，将流动状态的PCL材料由直径为 0.50mm的喷嘴沿X、Y轴在按照角度（0°，60°，120°）挤出，降温至常态后凝固，然后沿Z轴下降一个高度再重复X、Y轴的运动，喷嘴中再挤出流动状态PCL材料，降温凝固时与上一层紧密粘结，如此一层一层堆积制作PCL支架；
C、根据需要，设计出不同形状的CAD模型，并将CAD模型以STL.格式文件导出，转移到成型系统中，按模式图成型模式制得不同形状的多孔三维PCL支架，如图3、图4所示。
步骤（二）：将一级结构PCL支架的表面活化；
采用碱处理法对PCL支架进行表面活化处理，表面活化处理的具体步骤包括：
D、将三维打印的PCL支架浸入3M的NaOH溶液中，120rpm处理12h，取出后三蒸水清洗至pH=6；
E、通过傅里叶变化红外光谱分析证实活化后PCL支架表面获得活化官能基团。
步骤（三）：采用胶原网络对一级结构PCL支架进行三维功能活化，得到二级结构Col-PCL支架；
三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到1mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到胶原凝胶中，抽真空60mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-10℃冷冻48h；
H、在-10℃条件下干燥上述PCL支架72h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用20mM的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对复合支架材料进行交联，交联条件为1℃、10h，交联完成后，采用12%甘氨酸溶液清洗10min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=6后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，如图5、图6所示，再次于-10℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
步骤（四）：采用纳米羟基磷灰石颗粒对二级结构Col-PCL支架进行仿生矿化，得到三级结构AP-Col-PCL支架；
其中仿生矿化采用两步矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置100mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡；
J、配置模拟体液，配置模拟体液，模拟体液各组分如下：
Na+：100mM, K+：3mM, Mg2+：1mM,
Ca2+：1mM, Cl-：100mM, HCO3 -：20mM, HP04 2- ：2mM, SO4 2- ：0.1mM；
K、将复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入100mM 的CaCl2 溶液中10min,
然后取出，水洗1min，再浸入100mM
的K2HPO4溶液中，取出，水洗10min，重复2遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为20℃，摇床80rpm，每1h更换新的矿化诱导液，持续矿化24h，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，如图7、图8所示，AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
实施例
2
本实施例提供一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，包括如下具体步骤：
步骤（一）：使用快速成型技术三维打印大孔径PCL支架，得到一级结构，结构如图1，
通过计算机辅助设计软件建立孔径大小为1500μm的三维PCL支架的CAD 模型，并将CAD模型转换为STL.格式文件，进行分层处理后输入熔融成型机数据处理软件中，利用3DP成型系统进行三维支架打印，三维支架打印时喷头走形方向按（0°，90°）逐层堆积；
三维支架打印的具体步骤包括：
A、将PCL颗粒原料放入快速成型机的熔化器中加热至180℃，使PCL材料成流动状态；
B、如图2所示，依据STL.格式的CAD图形，在计算的控制下，将流动状态的PCL材料由直径为 0.50mm的喷嘴沿X、Y轴在按照角度（0°，90°）挤出，降温至常态后凝固，然后沿Z轴下降一个高度再重复X、Y轴的运动，喷嘴中再挤出流动状态PCL材料，降温凝固时与上一层紧密粘结，如此一层一层堆积制作PCL支架；
C、根据需要，设计出不同形状的CAD模型，并将CAD模型以STL.格式文件导出，转移到成型系统中，按模式图成型模式制得不同形状的多孔三维PCL支架，如图3、图4所示。
步骤（二）：将一级结构PCL支架的表面活化；
采用碱处理法对PCL支架进行表面活化处理，表面活化处理的具体步骤包括：
D、将三维打印的PCL支架浸入7M的NaOH溶液中，40rpm处理48h，取出后三蒸水清洗至pH=8；
E、通过傅里叶变化红外光谱分析证实活化后PCL支架表面获得活化官能基团。
步骤（三）：采用胶原网络对一级结构PCL支架进行三维功能活化，得到二级结构Col-PCL支架；
三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到50mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到胶原凝胶中，抽真空20mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-50℃冷冻12h；
H、在-80℃条件下干燥上述PCL支架24h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用70mM的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对复合支架材料进行交联，交联条件为10℃、72h，交联完成后，采用1%甘氨酸溶液清洗80min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=8后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，如图5、图6所示，再次于-80℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
步骤（四）：采用纳米羟基磷灰石颗粒对二级结构Col-PCL支架进行仿生矿化，得到三级结构AP-Col-PCL支架；
其中仿生矿化采用两步矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置250mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡；
J、配置模拟体液，配置模拟体液，模拟体液各组分如下：
Na+：150mM, K+：6mM, Mg2+：2mM,
Ca2+：3mM, Cl-：160mM, HCO3 -：30mM, HP04 2-：4mM, SO4 2- ：0.6mM；
K、将复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入250mM 的CaCl2 溶液中10s,然后取出，水洗5min，再浸入250mM的K2HPO4溶液中，取出，水洗10s，重复6遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为50℃，摇床30rpm，每24h更换新的矿化诱导液，持续矿化7天，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，如图7、图8所示，AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
实施例
3
本实施例提供一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，包括如下具体步骤：
步骤（一）：使用快速成型技术三维打印大孔径PCL支架，得到一级结构，结构如图1，
通过计算机辅助设计软件建立孔径大小为1000μm的三维PCL支架的CAD 模型，并将CAD模型转换为STL.格式文件，进行分层处理后输入熔融成型机数据处理软件中，利用3DP成型系统进行三维支架打印，三维支架打印时喷头走形方向按（0°，60°，120°）逐层堆积；
三维支架打印的具体步骤包括：
A、将PCL颗粒原料放入快速成型机的熔化器中加热至120℃，使PCL材料成流动状态；
B、如图2所示，依据STL.格式的CAD图形，在计算的控制下，将流动状态的PCL材料由直径为 0.50mm的喷嘴沿X、Y轴在按照角度（0°，60°，120°）挤出，降温至常态后凝固，然后沿Z轴下降一个高度再重复X、Y轴的运动，喷嘴中再挤出流动状态PCL材料，降温凝固时与上一层紧密粘结，如此一层一层堆积制作PCL支架；
C、根据需要，设计出不同形状的CAD模型，并将CAD模型以STL.格式文件导出，转移到成型系统中，按模式图成型模式制得不同形状的多孔三维PCL支架，如图3、图4所示。
步骤（二）：将一级结构PCL支架的表面活化；
采用碱处理法对PCL支架进行表面活化处理，表面活化处理的具体步骤包括：
D、将三维打印的PCL支架浸入5M的NaOH溶液中，80rpm处理24h，取出后三蒸水清洗至pH=7.4；
E、通过傅里叶变化红外光谱分析证实活化后PCL支架表面获得活化官能基团。
步骤（三）：采用胶原网络对一级结构PCL支架进行三维功能活化，得到二级结构Col-PCL支架；
三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到20mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到胶原凝胶中，抽真空30mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-20℃冷冻24h；
H、在-50℃条件下冷冻干燥上述PCL支架48h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用50mM的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对复合支架材料进行交联，交联条件为4℃、24h，交联完成后，采用5%甘氨酸溶液清洗30min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=7.4后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，如图5、图6所示，再次于-50℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
步骤（四）：采用纳米羟基磷灰石颗粒对二级结构Col-PCL支架进行仿生矿化，得到三级结构AP-Col-PCL支架；
其中仿生矿化采用两步矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置200mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡；
J、配置模拟体液，配置模拟体液，模拟体液各组分如下：
Na+：142mM, K+：5mM, Mg2+：1.5mM,
Ca2+：2.5mM, Cl-：120mM, HCO3 -：27mM, HP04 2-：2.27mM, SO4 2-：0.5mM；
K、将复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入200mM 的CaCl2 溶液中3min,
然后取出，水洗1min，再浸入200mM的K2HPO4溶液中，取出，水洗1min，重复3遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为37℃，摇床60rpm，每12h更换新的矿化诱导液，持续矿化72h，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，如图7、图8所示，AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
对实施例1、2和3得到的AP-Col-PCL支架进行性能检测，如图9所示，得到以下实验数据：
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。
Claims (15)
1.一种机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
步骤（一）：使用快速成型技术三维打印大孔径PCL支架，得到一级结构；
步骤（二）：将一级结构PCL支架的表面活化；
步骤（三）：采用胶原网络对一级结构PCL支架进行三维功能活化，得到二级结构Col-PCL支架；
步骤（四）：采用纳米羟基磷灰石颗粒对二级结构Col-PCL支架进行仿生矿化，得到三级结构AP-Col-PCL支架。
2.根据权利要求1所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（一）通过计算机辅助设计软件建立孔径大小为100～1500μm的三维PCL支架的CAD 模型，并将所述CAD模型转换为STL.格式文件，进行分层处理后输入熔融成型机数据处理软件中，利用3DP成型系统进行三维支架打印，所述三维支架打印时喷头走形方向按（0°，60°，120°）或者（0°，90°）逐层堆积。
3.根据权利要求2所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述三维PCL支架的孔径大小为1000μm。
4.根据权利要求2所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述三维支架打印的具体步骤包括：
A、将PCL颗粒原料放入快速成型机的熔化器中加热至50～180℃，使PCL材料成流动状态；
B、依据所述STL.格式的CAD图形，在计算的控制下，将流动状态的PCL材料由直径为 0.50mm的喷嘴沿X、Y轴在按照角度（0°，60°，120°）或者（0°，90°）挤出，降温至常态后凝固，然后沿Z轴下降一个高度再重复X、Y轴的运动，喷嘴中再挤出流动状态PCL材料，降温凝固时与上一层紧密粘结，如此一层一层堆积制作PCL支架；
C、根据需要，设计出不同形状的CAD模型，并将CAD模型以STL.格式文件导出，转移到成型系统中，按模式图成型模式制得不同形状的多孔三维PCL支架。
5.根据权利要求4所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，将PCL颗粒原料放入快速成型机的熔化器中加热至120℃。
6.根据权利要求1所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（二）通过采用碱处理法对所述PCL支架进行表面活化处理，所述表面活化处理的具体步骤包括：
D、将三维打印的PCL支架浸入3～7M的NaOH溶液中，40～120rpm处理12～48h，取出后三蒸水清洗至pH=6～8；
E、通过傅里叶变化红外光谱分析证实活化后PCL支架表面获得活化官能基团。
7.根据权利要求6所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤D为：将三维打印的PCL支架浸入5M的NaOH溶液中，80rpm处理24h，取出后三蒸水清洗至pH=7.4。
8.根据权利要求1所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（三）的三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到1～50mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到所述胶原凝胶中，抽真空20～60mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-50～-10℃冷冻12～48h；
H、在-80～-10℃条件下冷冻干燥上述PCL支架24～72h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用20～70mM 的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对所述复合支架材料进行交联，交联条件为1～10℃、10～72h，交联完成后，采用1～12%甘氨酸溶液清洗10～80min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=6～8后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，再次于-80～-10℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
9.根据权利要求8所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（三）的三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到1mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到所述胶原凝胶中，抽真空60mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-10℃冷冻48h；
H、在-10℃条件下干燥上述PCL支架72h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用20mM的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对所述复合支架材料进行交联，交联条件为1℃、10h，交联完成后，采用12%甘氨酸溶液清洗10min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=6后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，再次于-10℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
10.根据权利要求8所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（三）的三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到50mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到所述胶原凝胶中，抽真空20mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-50℃冷冻12h；
H、在-80℃条件下干燥上述PCL支架24h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用70mM的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对所述复合支架材料进行交联，交联条件为10℃、72h，交联完成后，采用1%甘氨酸溶液清洗80min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=8后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，再次于-80℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
11.根据权利要求8所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（三）的三维功能活化步骤具体包括：
F、将 I型胶原溶解到乙酸溶液中，制备得到20mg/ml的胶原凝胶；
G、将PCL支架浸没到所述胶原凝胶中，抽真空30mim，缓慢释放空气，得到胶原凝胶充满的PCL支架，并将上述PCL支架-20℃冷冻24h；
H、在-50℃条件下冷冻干燥上述PCL支架48h，得到海绵状胶原充满PCL支架的复合支架材料，采用50mM的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物对所述复合支架材料进行交联，交联条件为4℃、24h，交联完成后，采用5%甘氨酸溶液清洗30min，并采用大量去离子水清洗，调节至pH=7.4后，得到功能活化后的PCL胶原复合支架，即Col-PCL支架，再次于-50℃条件冻干后，可长期保存于4℃。
12.根据权利要求1所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（四）中仿生矿化采用两步矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置100～250mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡；
J、配置模拟体液，所述模拟体液各组分如下：
Na+：100～150mM, K+：3～6mM, Mg2+：1～2mM, Ca2+：1～3mM, Cl-：100～160mM, HCO3 -：20～30mM, HP04 2-：2～4mM, SO4 2-：0.1～0.6mM；
K、将所述复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入100～250mM
的CaCl2 溶液中10s～10min，然后取出，水洗1～5min，再浸入100～250mM 的K2HPO4溶液中，取出，水洗10s～10min，重复2～6遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为20～50℃，摇床30～80rpm，每1～24h更换新的矿化诱导液，持续矿化0.5～15天，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，所述AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
13.根据权利要求12所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（四）中仿生矿化采用两步矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置100mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡；
J、配置模拟体液，配置模拟体液，所述模拟体液各组分如下：
Na+：100mM, K+：3mM,
Mg2+：1mM, Ca2+：1mM, Cl-：100mM,
HCO3 -：20mM, HP04 2-
：2mM, SO4 2- ：0.1mM；
K、将所述复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入100mM 的CaCl2
溶液中10min, 然后取出，水洗1min，再浸入100mM 的K2HPO4溶液中，取出，水洗10min，重复2遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为20℃，摇床80rpm，每1h更换新的矿化诱导液，持续矿化24h，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，所述AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
14.根据权利要求12所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（四）中仿生矿化采用两步矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置250mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡；
J、配置模拟体液， 所述模拟体液各组分如下：
Na+：150mM, K+：6mM,
Mg2+：2mM, Ca2+：3mM, Cl-：160mM,
HCO3 -：30mM, HP04 2-：4mM, SO4 2- ：0.6mM；
K、将所述复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入250mM 的CaCl2
溶液中10s,然后取出，水洗5min，再浸入250mM的K2HPO4溶液中，取出，水洗10s，重复6遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为50℃，摇床30rpm，每24h更换新的矿化诱导液，持续矿化7天，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，所述AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
15.根据权利要求12所述的机械性能和生物活性良好的仿生骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（四）中仿生矿化采用两部矿化法，具体步骤包括：
I、首先配置200mM的CaCl2溶液和K2HPO4溶液，用于生物矿化前的交替浸泡；
J、配置模拟体液， 所述模拟体液各组分如下：
Na+：142mM, K+：5mM,
Mg2+：1.5mM, Ca2+：2.5mM, Cl-：120mM, HCO3 -：27mM, HP04 2-：2.27mM, SO4 2-：0.5mM；
K、将所述复合支架材料浸入交替矿化液，首先浸入200mM 的CaCl2
溶液中3min, 然后取出，水洗1min，再浸入200mM的K2HPO4溶液中，取出，水洗1min，重复3遍；
L、将上述经交替浸泡后的复合支架材料，置入SBF液中进行生物矿化，矿化条件为37℃，摇床60rpm，每12h更换新的矿化诱导液，持续矿化72h，生物矿化结束后，清洗、冻干后得到最终的仿生骨修复材料AP-Col-PCL支架，所述AP-Col-PCL支架可于4℃长期保存。
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