CN103990182A - 一种用于骨组织修复的三维支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于骨组织修复的三维支架材料及其制备方法，其由具有相互贯通的大孔结构的三维打印聚合物骨架和作为填充材料且具有微孔结构的蛋白质材料组成。制备步骤为：1)用三维打印机制作聚合物三维骨架；2)配置蛋白质的水溶液；3)冷冻干燥；4)加入交联剂，水洗，再次冷冻干燥，即得到产品。本发明操作简单，稳定性高，全程不涉及有机溶剂，绿色安全，制备的骨组织支架力学性能良好，该支架中聚合物与蛋白紧密结合，其中聚合物骨架可以提供足够的强力，而蛋白质部分则可以提供更多的细胞粘附位点，有利于细胞的渗透长入，进而促进组织再生。

Description

一种用于骨组织修复的三维支架材料及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程和生物制造领域，特别涉及一种用于骨组织修复的三维支架材料及其制备方法。

背景技术

目前，由于创伤、肿瘤切除、感染、发育异常等原因造成的骨缺损的发病率较高，对患者日常生活产生了严重影响。现有的方法主要是自体骨和异体骨移植，自体骨的来源较少，且会给病人带来一定的痛苦；异体骨移植容易引发排斥反应，其应用受到限制。近年来，以生物材料为基础的骨组织工程的发展为治疗骨缺损提供了新的途径。骨组织工程包括种子细胞、生长因子和支架三个要素。其中三维空间支架可以为细胞的生长提供粘附位点、营养输送和代谢废物的排放场所。骨组织工程改变了骨缺损修复的传统模式，以少量细胞修复大块组织缺损，同时可以根据实际需要进行塑造达到理想状态。

目前，快速成型技术三维打印被广泛应用于个性化骨修复支架材料的制备，是生物医学、材料科学和现代制造技术等多学科交叉发展的产物，能够满足临床治疗的迫切需求。三维打印骨组织工程支架的强力较大，更接近于天然骨的力学性能。该方法有效地缩短了开发周期，降低了研发费用，其精确定制可以满足不同部位不同形状的骨缺损修复，在复杂性状的骨支架制备方面具有独特的优势。可以根据病人个性化的要求快速制备出任意形状大小的骨组织工程支架。然而现有的三维打印骨组织工程支架由于打印技术的限制，其结构无法再更精细的尺度上模仿天然骨的结构，孔径尺寸过大无法提供所必需的粘附位点使得组织难以长入支架内部(Roosa，Kemppainen et al.2010)。而且可以通过此方法加工的材料比较有限，多为高聚物合成材料，其生物相容性受到了限制。

此外，冷冻干燥技术也被应用于制备三维多孔骨组织工程支架材料，利用冷冻过程中冰晶的生长在支架内部形成比较均匀的分布，冷冻干燥后，冰晶被去除，冰晶所在的位置形成大小均匀且相互贯通的孔洞。利用此方法可以将多种水溶性蛋白质或其它生物材料制备成多孔结构的支架。利用该种方所制备的支架，其孔洞大小可控、取向排列可控(Wu，Liu et al.2010)，具有良好的生物相容性，研究表明其能够促进细胞的增殖与渗透(Mandal and Kundu2009)，并被应用于组织工程支架和医用敷料的制备。然而该种微孔支架的力学性能较差，尤其是湿态下容易变形，限制了其在骨组织工程中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于骨组织修复的三维支架材料及其制备方法，该支架的聚合物骨架能够为骨组织再生提供必需的力学支撑，而蛋白质材料形成的微孔结构能够为骨组织细胞提供有利的生长环境，有效的促进骨组织的再生。

本发明的一种用于骨组织修复的三维支架材料，由具有相互贯通的大孔结构的三维打印聚合物骨架和作为填充材料且具有微孔结构的蛋白质材料组成。

所述大孔结构孔径为0.1-20毫米；所述微孔结构孔径为0.05-0.6毫米。

所述聚合物是聚己内酯、聚乳酸、聚氨酯中的一种或几种；所述蛋白质是明胶、再生丝素、胶原等水溶性蛋白中的一种或几种。

所述聚合物骨架与纳米羟基磷灰石形成聚合物/纳米羟基磷灰石骨架，纳米羟基磷灰石的质量百分比为10％-60％。

所述蛋白质中包含活性物质；其中，活性物质为药物、生长因子、无机纳米颗粒中的一种或几种。

所述药物是庆大霉素、四环素等抗菌类药物、抗炎症类药物、紫杉醇等抗癌症类药物中的一种或几种；生长因子是骨形态发生蛋白或者转化生长因子，骨形态发生蛋白为BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-7或BMP-14；转化生长因子为TGF-α或TGF-β；无机纳米颗粒为纳米羟基磷灰石或纳米生物玻璃颗粒，无机纳米颗粒直径为30-200纳米，无机纳米颗粒与蛋白质的质量比为1∶0.5-10。

所述聚合物骨架外观形状为立方体、圆柱体、长方体、截面为异形多边形或圆环的柱体中的一种。

本发明的一种用于骨组织修复的三维支架材料的制备方法，其包括下述步骤：

(1)三维打印：将聚合物加热使其熔融，利用三维打印机挤出，挤出的聚合物流体冷却凝固，形成聚合物三维骨架；

(2)蛋白质水溶液的配制：将蛋白质固体溶于去离子水中，经过搅拌至完全溶解，得到蛋白质水溶液；

(3)冷冻干燥：将打印成型的聚合物骨架放置于模具中，将蛋白质水溶液注入模具，将聚合物骨架完全浸没，然后将模具置于-80℃冷冻，进行冷冻干燥处理；

(4)交联：利用交联剂交联蛋白质使其不溶于水，交联之后用去离子水洗涤去除交联剂，再次冷冻干燥，即得。

所述步骤(1)中的针头内径为0.3-1.0毫米，聚合物挤出速率为0.02-0.10毫米/秒，接受平板移动速率为0.01-0.1毫米/秒，聚合物流体的直径为0.3-0.6毫米，聚合物流体间距为0.1-20毫米，聚合物三维骨架的层高为0.2-0.5毫米，聚合物三维骨架高度≥0.3毫米。

所述步骤(2)中的蛋白质水溶液的浓度为0.5-20毫克/毫升。

所述步骤(4)中的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS、京尼平、乙醇中的一种或几种。

所述步骤(1)中的聚合物中可以选择性的加入纳米羟基磷灰石。具体操作步骤为：将聚合物溶于有机溶剂形成溶液，加入羟基磷灰石颗粒搅拌均匀，加热使有机溶剂蒸发，冷却后利用三维打印机制备聚合物/纳米羟基磷灰石骨架。

有益效果

采用上述技术方案后，本发明至少有以下有益效果：

(1)本发明通过将三维打印技术与冷冻干燥技术结合在一起该支架的聚合物骨架能够为骨组织再生提供必需的力学支撑，而蛋白质材料形成的微孔结构能够为骨组织细胞提供有利的生长环境，有利于骨组织的修复和再生；

(2)三维打印技术可以依照骨缺损部位的形状定制相应的聚合物骨架，聚合物骨架具有优良的机械性能，蛋白质水溶液注入聚合物骨架经冷冻干燥可以形成填充聚合物骨架大孔的微孔结构，能够在成分上仿生天然骨。

(3)蛋白质微孔大小可控、取向可控，且微孔相互连通能够促进细胞的增殖与迁移，有利于营养物质的输送和代谢废物的移除。

(4)本发明还引入无机纳米颗粒、药物、生长因子等生物活性材料，可进一步改善三维支架材料的生物相容性，促进骨组织的再生。

附图说明

图1是一种用于骨组织修复的三维支架材料的制备流程图；

图2是实施例1中PCL骨架的照片；

图3是实施例1中PCL骨架的SEM图像；

图4是实施例1中PCL/再生丝素复合三维支架材料的照片；

图5是实施例1中PCL/再生丝素复合三维支架材料的SEM图片；

图6是实施例1中PCL/再生丝素复合三维支架材料上细胞形态(PCL部分)。

图7是实施例1中PCL/再生丝素复合三维支架材料上细胞形态(丝素部分)。

图8是实施例1中PCL/再生丝素复合三维支架与纯丝素冻干支架的力学性能对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(a)聚己内酯(PCL，分子量65，000)加热到60摄氏度，由内径为0.4毫米针头挤出，形成0.4毫米PCL流体，接受平板移动速度为0.05毫米/秒，聚合物挤出速率为0.05毫米/秒，流体间距为0.5毫米，层与层之间垂直排列，层高0.3毫米，层数为7层，形成圆柱体PCL骨架，直径为20毫米(图2，图3)。

(b)将1克桑蚕丝再生丝素固体溶于50毫升去离子水中，搅拌使其完全溶解，得到质量体积百分比为2％的丝素溶液。

(c)将PCL骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的丝素溶液，使其完全浸润并没过PCL骨架。将模具置于-80摄氏度冰箱中冷冻12小时，随后于冷冻干燥机中(-60摄氏度)冻干处理2天，得到孔径为100-150μm的多孔结构。

(d)配制95％的乙醇水溶液，将冻干好的样品浸入乙醇水溶液中，交联处理4小时。其后，用去离子水洗涤支架三遍，并再次冷冻干燥，得到用于骨组织修复的PCL/再生丝素复合支架材料(图4，图5)。

在此支架上培养成纤维细胞，三天后可观测到细胞在支架上呈现出良好的细胞形态。如图6、图7所示。

实施例2

(a)PCL加热到60摄氏度，由内径为0.4毫米的针头挤出，形成0.4毫米PCL流体，接受平板移动速度为0.05毫米/秒，聚合物挤出速率为0.05毫米/秒，流体间距为0.5毫米，层与层之间垂直排列，层高0.3毫米，层数为7层，得到圆柱体PCL骨架，直径为14毫米。

(b)将1克明胶(A型猪皮明胶)与1克桑蚕丝再生丝素溶于50毫升去离子水中，加热至60摄氏度搅拌使明胶与丝素完全溶解，得到质量体积百分比为4％的明胶/丝素(1∶1)水溶液。

(c)将PCL骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的丝素溶液，使其完全浸润并没过PCL骨架。将模具置于-80摄氏度冰箱中冷冻12小时，随后于冷冻干燥机中(-60摄氏度)冻干处理2天。

(d)配制95％的乙醇水溶液，加入EDC和NHS使得两者的浓度皆为0.15摩尔/升。将冻干好的样品浸入含EDC/NHS的乙醇水溶液中，随后放置于4摄氏度冰箱冷藏交联，交联时间为18小时。用去离子水洗涤支架三遍，并再次冷冻干燥，得到用于骨组织修复的明胶/再生丝素和PCL复合支架材料。

实施例3

(a)将3克PCL加入到30毫升三氟乙醇中，搅拌使其溶解，溶解完全后加入1.5克纳米羟基磷灰石颗粒，继续搅拌并超声使羟基磷灰石均匀分散。配好的PCL/纳米羟基磷灰石溶液倒入金属容器中，加热使三氟乙醇迅速挥发并全部去除，得到PCL和纳米羟基磷灰石质量比例为2/1的混合物。将此混合物加热到60摄氏度，有内径为0.5毫米的针头挤出，形成0.5毫米PCL流体，接受平板移动速度为0.05毫米/秒，聚合物挤出速率为0.05毫米/秒，流体间距为0.5毫米，层与层之间60度排列，层高0.4毫米，层数为9层，得到圆柱体PCL骨架，直径为20毫米。

(b)将0.4克胶原(I型猪皮胶原)加入到20毫升去离子水中，搅拌使其完全溶解，得到质量体积百分比为2％的胶原水溶液。再加入0.4克纳米羟基磷灰石颗粒，搅拌并超声，使纳米羟基磷灰石颗粒均匀分散，得到胶原/纳米羟基磷灰石质量比为1∶1的均匀水溶液。

(c)将PCL/纳米羟基磷灰石骨架放置于塑料模具中，并注入配置好的胶原/纳米羟基磷灰石溶液，使其完全浸润并没过骨架。将模具置于-80摄氏度冰箱中冷冻12小时，随后于冷冻干燥机中(-60摄氏度)冻干处理2天。

(d)配制95％的乙醇水溶液，加入EDC和NHS使得两者的最终浓度皆为0.15摩尔/升。将冻干好的样品浸入含EDC/NHS的乙醇水溶液中，随后放置于4摄氏度冰箱冷藏交联，交联时间为12小时。用去离子水洗涤支架三遍，并再次冷冻干燥，得到用于骨组织修复的胶原/纳米羟基磷灰石和PCL复合支架材料。

Claims (11)

1.一种用于骨组织修复的三维支架材料，其特征在于：由具有相互贯通的大孔结构的三维打印聚合物骨架和作为填充材料且具有微孔结构的蛋白质材料组成。

2.根据权利要求1所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料，其特征在于：所述大孔结构孔径为0.1-20毫米；所述微孔结构孔径为0.05-0.6毫米。

3.根据权利要求1所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料，其特征在于：所述聚合物是聚己内酯、聚乳酸、聚氨酯中的一种或几种；所述蛋白质是明胶、再生丝素、胶原中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料，其特征在于：所述聚合物骨架与纳米羟基磷灰石形成聚合物/纳米羟基磷灰石骨架，纳米羟基磷灰石的质量百分比为10％-60％。

5.根据权利要求1所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料，其特征在于：所述蛋白质中包含活性物质；其中，活性物质为药物、生长因子、无机纳米颗粒中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料，其特征在于：所述药物是抗菌类药物、抗炎症类药物、抗癌症类药物中的一种或几种；生长因子是骨形态发生蛋白或者转化生长因子；无机纳米颗粒为纳米羟基磷灰石或纳米生物玻璃颗粒，无机纳米颗粒直径为30-200纳米，无机纳米颗粒与蛋白质的质量比为1∶0.5-10。

7.根据权利要求1所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料，其特征在于：所述聚合物骨架外观形状为立方体、圆柱体、长方体、截面为异形多边形或圆环的柱体中的一种。

8.一种用于骨组织修复的三维支架材料的制备方法，其包括下述步骤：

(1)将聚合物加热使其熔融，利用三维打印机挤出，挤出的聚合物流体冷却凝固，形成聚合物三维骨架；

(2)将蛋白质固体溶于去离子水中，经过搅拌至完全溶解，得到蛋白质水溶液；

(3)将打印成型的聚合物骨架放置于模具中，将蛋白质水溶液注入模具，将聚合物骨架完全浸没，然后将模具置于-80℃冷冻，进行冷冻干燥处理；

(4)利用交联剂交联蛋白质使其不溶于水，交联之后用去离子水洗涤去除交联剂，再次冷冻干燥，即得。

9.根据权利要求8所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的针头内径为0.3-1.0毫米，聚合物挤出速率为0.02-0.10毫米/秒，接受平板移动速率为0.01-0.1毫米/秒，聚合物流体的直径为0.3-0.6毫米，聚合物流体间距为0.1-20毫米，聚合物三维骨架的层高为0.2-0.5毫米，聚合物三维骨架高度≥0.3毫米。

10.根据权利要求8所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的蛋白质水溶液的浓度为0.5-20毫克/毫升。

11.根据权利要求8所述的一种用于骨组织修复的三维支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的交联剂为EDC/NHS、京尼平、乙醇中的一种或几种。