CN109821073B

CN109821073B - 一种原位实时立体交联的骨组织工程支架材料及制备方法

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Publication number: CN109821073B
Application number: CN201910237096.6A
Authority: CN
Inventors: 周长春; 梁洁; 孙桓; 樊渝江; 孙勇; 张勃庆; 胡诚; 张兴栋
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2039-03-27
Also published as: CN109821073A

Abstract

本发明公开了一种原位实时立体交联的骨组织工程支架材料及制备方法，该发明的生物活性骨组织工程支架是通过软件设计参数化模型获得具有一定宏观大孔的三维模型，再利用3D打印技术将一定配比的海藻酸钠和磷酸钙原料3D打印成型，通过在打印时与低浓度氯化钙溶液进行一次预交联反应，使支架能够原位实时固化交联，然后再通过将打印后支架浸泡于高浓度氯化钙溶液中进行二次交联反应，使其充分交联形成具有互穿网络结构的生物活性骨组织工程支架，最后通过冷冻干燥获得磷酸钙支架的内部毛细微纳孔结构。本发明调控支架中的二级微纳孔结构，赋予支架良好的生物活性，并可以根据患者个性化的医疗需求，设计定制出所需的骨组织修复支架材料。

Description

一种原位实时立体交联的骨组织工程支架材料及制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种3D打印材料，具体为一种原位实时立体交联的骨组织工程支架材料及制备方法。

背景技术

组织工程支架是组织工程重点研究的一部分，一般使用生物活性材料制作，它能够模仿人体组织的功能，适合种子细胞的生长和繁殖，同时也是影响组织重建成功的关健因素之一。人的骨骼是身体的支撑部分，在维护人体健康方面具有十分重要的作用。骨骼对于较小的局部损伤具有自愈能力，但是大多情况下，骨的病变、创伤，并不能自我修复，因此需要骨组织工程支架作为缺损骨的代替物。骨组织工程支架因为要保证氧气和营养液的输送、细胞代谢物的排除及附着的种子细胞生长繁殖，所以一般具有三维多孔结构。骨组织工程支架可以促进骨骼生长、修复骨缺损，并呈现生物活性,随着组织工程学技术的快速发展，骨组织工程支架也开始投入了临床应用。3D打印技术基于逐层累加原理，属于增材制造，依靠程序控制，可以制造结构复杂的各种结构件，而骨组织工程支架是三维多孔结构，特别适合使用3D打印技术制造。3D打印的骨组织工程支架，目前已经开始进入临床使用。3D打印制造在打印结构复杂的构件上具有巨大优势，因此也是国内外制造业研究的热点之一。但是由于受到打印方式的局限，3D打印支架存在成型困难，不易交联充分等困难。

羟基磷灰石是人体和动物骨骼中主要的无机组成部分，也是磷酸钙陶瓷中的一种，具有良好的机械性能和生物性能，在骨组织工程中有着非常广泛的应用。它能与机体组织在界面上实现化学键性结合，其在体内有一定的溶解度，代谢产物均是对机体无害的离子，能够参与人体的钙磷循环，促进骨组织缺损的修复，表现出良好的生物相容性、骨诱导性和骨传导性。

海藻酸钠是一种天然直线型阴离子多糖，由β-D-甘露糖醛酸(简称M单元)和α-L-古罗糖醛酸(简称G单元)通过糖苷键按照GG、MM或者GM交替连接顺序而形成的聚合物，其官能基尤其是GG结构很容易与二价离子Ca²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺等发生键合，键合有分子内交联和分子间交联两种形式，形成“egg-box”结构。海藻酸钠具有良好的生物相容性、非免疫性、无毒性以及生物降解性，使其成为医学领域的应用的热门材料。

发明内容

本发明目的是针对以上技术问题，提供一种用于硬组织修复的3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料及其制备方法。该材料伴随3D打印过程进行实时立体交联，利于3D打印技术调控支架的外形和宏观大孔结构，分两次使用钙离子溶液与支架中的海藻酸盐发生交联反应，使支架获得立体的互穿网络交联结构；再利用冷冻干燥技术调控支架中的二级微纳孔结构，赋予支架良好的生物活性。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料，它是由多孔磷酸钙材料与海藻酸钠原位实时立体交联而成，支架为具有宏观打印大孔以及内部毛细微纳孔结构，具有互穿网络交联结构特征的生物活性骨组织工程修复材料。

一种3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料的制备方法，其主要包括以下步骤：a)在30℃水浴条件下，将海藻酸钠粉末加入去离子水中用磁力搅拌器使其充分混合至均匀，配制获得4％～8％的海藻酸钠溶液；

b)将步骤a)制得的4％～8％海藻酸钠溶液在50℃预热30-60min后，使海藻酸钠溶液黏度降低，再将磷酸钙粉末材料缓缓加入到预热后的溶液中，用均质搅拌器使浆料混合均匀直至观察不到磷酸钙出现团聚现象，在最终浆料中磷酸钙、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：4～8：100；此浆料为A通道材料；

c)配制5％的氯化钙溶液做为B通道材料；

d)结合AB双通道打印喷头装置的使用，采用3D喷墨打印技术，分别从A通道中挤出磷酸钙、海藻酸钠和去离子水的混合浆料，从B通道中挤出5％氯化钙溶液，A、B通道材料在打印喷头处接触，伴随着打印的进行发生了第一次预交联反应，A通道材料中的海藻酸钠遇到B通道材料中的钙离子发生螯合反应，迅速在原位实时固化交联，得到具有一级宏观尺度的大孔磷酸钙支架；

e)将步骤d)所得的3D打印的多孔磷酸钙支架浸入30％的近饱和氯化钙溶液中进行第二次交联反应，室温静置4-8小时，此时充足的钙离子进一步浸润与海藻酸钠发生螯合反应，使得支架材料中的海藻酸钠完全反应，形成具有互穿网络交联结构的多孔生物活性支架材料；

f)打印后处理：将步骤e)所得的二次交联后多孔支架进行冷冻干燥处理，在冷冻干燥过程中由于大量的水相挥发导致多孔支架的支撑材料内部出现许多空间空位，即形成微纳毛细孔隙，进一步增强原位实时立体交联的骨组织工程支架材料的生物活性。

进一步地，所述的磷酸钙材料为磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙、磷酸二氢钙中一种或多种混合物。

进一步地，所述多孔陶瓷支架的三维宏观大孔尺度通过3D建模软件设计，通过3D打印工艺成型，支架最终宏观大孔为：200-800μm，彼此交互贯通。

进一步地，该骨组织工程支架材料通过二步法进行原位实时立体交联成型，打印支架第一步首先通过A、B通道材料在打印喷头处接触，伴随着打印的进行发生了第一次预交联反应，待支架全部打印完成后，再第二次通过近饱和氯化钙溶液与支架中的海藻酸钠发生第二次交联反应，使支架形成立体互穿网络交联结构。

进一步地，该骨组织工程支架材料具有多层级孔隙结构特征，其一级三维宏观孔结构可通过建模软件和调节原料中的磷酸钙和海藻酸钠的比例，设计定制支架的宏观大孔，其二级微纳毛细孔隙通过冷冻干燥后处理形成，干燥过程中由于大量水相挥发自发形成支撑材料内部的微纳毛细微孔，进一步增强原位实时立体交联的骨组织工程支架材料的生物活性。

本发明采用上述技术方案所获得的积极效果为：

(一)、本发明所采用的初始材料为磷酸钙陶瓷和海藻酸盐，生物相容性好，具有良好的骨修复效果。

(二)、使用3D打印技术制备多孔支架，一级可调控设计宏观大孔结构，利于细胞的长入和营养物质的交换，并且能够根据患者骨缺损定制个性化外形尺寸。

(三)、使用冷冻干燥技术处理一级宏观结构大孔磷酸钙支架，可进一步设计调控磷酸钙支架的二级微纳孔结构，赋予支架良好的生物活性，形成具有一级宏观大孔和二级微纳孔相间分布的多层级生物活性骨组织工程支架材料。

(四)、通过一次预交联反应，使支架能够原位实时固化交联，再通过二次交联反应，使支架充分交联形成具有互穿网络结构的生物活性骨组织工程支架。这种分两次使用钙离子溶液与支架中的海藻酸盐发生交联反应的方式，改善了支架的打印成型能力和力学稳定性。

附图说明

图1为3D打印AB双通道结构示意图；

图2为3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料结构示意图；

图3为实施例1中获得的具有多层级微纳结构的多孔生物活性陶瓷支架材料SEM图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。

c)配制5％的氯化钙溶液做为B通道材料；

实施例1：

在30℃水浴条件下，将海藻酸钠粉末材料加入去离子水中用磁力搅拌器使其充分混合至均匀，配制获得6％的海藻酸钠溶液，在50℃预热30～60min后，使海藻酸钠溶液黏度降低，再将羟基磷灰石粉末固体缓缓加入到预热后的溶液中，用均质搅拌器使浆料混合均匀直至观察不到羟基磷灰石出现团聚现象，在最终浆料中羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，将此浆料做为A通道材料；配制5％的氯化钙溶液做为B通道材料，伴随着打印过程同时与A通道中的海藻酸钠发生了第一次预交联反应，使得混合浆料中的海藻酸钠遇到钙离子立刻发生螯合反应，迅速在原位实时固化交联，最终得到具有一级宏观尺度大孔的多孔磷酸钙支架；将一次预交联后的3D打印多孔磷酸钙支架浸入30％的近饱和氯化钙溶液中进行第二次交联反应4小时，此时由于具有充足的钙离子与海藻酸钠发生螯合反应，使得海藻酸钠完全反应，形成互穿网络交联结构的多孔生物活性陶瓷支架。将二次交联后的多孔支架做冷冻干燥处理，在冷冻干燥过程中，由于大量的水相挥发导致多孔支架的支撑材料内部形成现许多空间空位，即形成微纳毛细孔隙，最终获得一种3D打印原位实时立体交联的具有多层级微孔结构的骨组织工程支架材料。

实施例2：

选用β相磷酸三钙(β-TCP)作为A通道打印墨水配料，按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其余参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，本实施例调节了原材料的成分配比，即改用β相磷酸三钙(β-TCP)作为A通道打印墨水配料，最终A通道打印墨水配料中β相磷酸三钙、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，5％氯化钙溶液做为B通道材料。其余处理方式与实施例1所述相同。本实施例最终得到的多孔支架材料为β相磷酸三钙为主体的生物活性陶瓷，该骨组织支架在组织重建中具有更快的生物降解速度，适用于非承力部位骨组织填充修复。

实施例3：

选用双相磷酸钙(BCP，其质量百分比HA:β-TCP＝50：50)作为A通道打印墨水配料，按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其余参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，本实施例调节了原材料的成分配比，即改用双相磷酸钙(BCP，其质量百分比HA：β-TCP＝50：50)作为A通道打印墨水配料，最终A通道打印墨水配料中BCP、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，5％氯化钙溶液做为B通道材料。其余处理方式与实施例1所述相同。本实施例最终得到的多孔支架材料为双相磷酸钙为主体的生物活性陶瓷，该骨组织支架在组织重建中具有适中的生物降解速度，适用于骨组织填充修复。

实施例4：

在30℃水浴条件下，将海藻酸钠粉末材料加入去离子水中用磁力搅拌器使其充分混合至均匀，配制获得6％的海藻酸钠溶液，在50℃预热30～60min后，使海藻酸钠溶液黏度降低，再将羟基磷灰石粉末固体缓缓加入到预热后的溶液中，用均质搅拌器使浆料混合均匀直至观察不到羟基磷灰石出现团聚现象，在最终浆料中羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，将此浆料做为A通道材料；配制5％的氯化钙溶液做为B通道材料，伴随着打印过程同时与A通道中的海藻酸钠发生了第一次预交联反应，使得混合浆料中的海藻酸钠遇到钙离子立刻发生螯合反应，迅速在原位实时固化交联，最终得到具有一级宏观尺度大孔的多孔磷酸钙支架；将一次预交联后的3D打印多孔磷酸钙支架浸入5％的氯化钙溶液中进行第二次交联反应4小时，本实施例其余参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，本实施例调节了第二次交联反应过程中的氯化钙溶液浓度，即改用5％的氯化钙溶液进行第二次交联反应，与实施例1相比，此时由于钙离子浓度较低，与海藻酸钠的螯合反应不能充分进行，形成互穿网络交联结构数量少，多孔生物活性陶瓷支架力学性能较实施例1差。

实施例5：

按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其余参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，本实施例将实施例1中所用的B通道材料，5％的氯化钙溶液换成30％的近饱和氯化钙溶液；按照羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，配成浆料做为A通道材料。其余参数与实施例1相同。与实施例1相比，本实施例由于钙离子浓度较高，第一次预交联反应过于剧烈，导致打印过程中打印喷头处易发生堵塞，不利于打印成型。

实施例6：

按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其余参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，本实施例将实施例1中所用的A通道材料，羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比调整为50：6：100，配成浆料做为A通道材料；5％氯化钙溶液做为B通道材料。其余处理方式与实施例1所述相同。与实施例1相比，本实施例由于打印浆料中羟基磷灰石的固含量较多，此时浆料黏度较大，在打印过程中不易挤出，不利于打印成型。

实施例7：

按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其余参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，本实施例将实施例1中所用的A通道材料，羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比调整为10：6：100，配成浆料做为A通道材料；5％氯化钙溶液做为B通道材料。其余处理方式与实施例1所述相同。与实施例1相比，本实施例由于打印浆料中羟基磷灰石的固含量较少，此时浆料黏度较小，在打印过程中易挤出，但是挤出后纤维强度不足，出现支架塌陷现象。

实施例8：

按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其余参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，本实施例将实施例1中所用的A通道材料，羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比调整为20：4：100，配成浆料做为A通道材料；5％氯化钙溶液做为B通道材料。其余处理方式与实施例1所述相同。海藻酸钠主要有两个作用，一是增加浆料黏度，提升打印流畅性；二是打印后通过与钙离子反应生成互穿交联网络，为支架提供力学强度支撑。与实施例1相比，浓度为4％的海藻酸钠配成的打印浆料黏度下降，打印后支架易塌陷；与钙离子交联后支架强度下降。

实施例9：

按照实施例1所述，羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，配成浆料做为A通道材料；5％氯化钙溶液做为B通道材料。通过3D建模软件设计支架模型宏观大孔为300μm的正交方孔，再按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其交联参数选择及制备过程与实施例1相同，最终得到的宏观大孔尺寸经过二次交联后，体收缩率约为30％，形成了一种宏观大孔为200μm的3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料。

实施例10：

按照实施例1所述，羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，配成浆料做为A通道材料；5％氯化钙溶液做为B通道材料。通过3D建模软件设计支架模型宏观大孔为600μm的正交方孔，再按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其交联参数选择及制备过程与实施例1相同，最终得到的宏观大孔尺寸经过二次交联后，体收缩率约为30％，形成了一种宏观大孔为400μm的3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料。

实施例11：

按照实施例1所述，羟基磷灰石、海藻酸钠和去离子水的质量比为20：6：100，配成浆料做为A通道材料；5％氯化钙溶液做为B通道材料。通过3D建模软件设计支架模型宏观大孔为900μm的正交方孔，再按照实施例1的方法，首先进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备，打印过程中随之进行第一次原位实时预交联，待打印完成后再进行第二步近饱和钙离子螯合反应交联，其交联参数选择及制备过程与实施例1相同，最终得到的宏观大孔尺寸经过二次交联后，体收缩率约为30％，形成了一种宏观大孔为600μm的3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料，其特征在于，所述骨组织工程支架材料为具有互穿网络交联结构特征的生物活性骨组织工程修复材料，是由多孔磷酸钙材料与海藻酸钠原位实时立体交联而成的具有一级三维宏观打印大孔以及二级微纳毛细孔结构，其一级三维宏观打印大孔结构可通过3D喷墨打印技术结合AB双通道打印喷头装置分别调节原料中的磷酸钙和海藻酸钠的比例实现原位实时固化交联，其二级微纳毛细孔结构通过二次交联反应形成具有互穿网络结构的生物活性骨组织工程支架并冷冻干燥后处理形成。

2.一种3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料的制备方法，其主要包括以下步骤：a)在30℃水浴条件下，将海藻酸钠粉末加入去离子水中用磁力搅拌器使其充分混合至均匀，配制获得4％～8％的海藻酸钠溶液；

c)配制5％的氯化钙溶液做为B通道材料；

3.根据权利要求2所述的3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，所述的磷酸钙材料为磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙、磷酸二氢钙中一种或多种混合物。

4.根据权利要求2所述的3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，所述多孔陶瓷支架的三维宏观大孔尺度通过3D建模软件设计，通过3D打印工艺成型，支架最终宏观大孔为：200-800μm，彼此交互贯通。

5.根据权利要求2所述的3D打印原位实时立体交联的骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，该骨组织工程支架材料通过二步法进行原位实时立体交联成型，打印支架第一步首先通过A、B通道材料在打印喷头处接触，伴随着打印的进行发生了第一次预交联反应，待支架全部打印完成后，再第二次通过近饱和氯化钙溶液与支架中的海藻酸钠发生第二次交联反应，使支架形成立体互穿网络交联结构。