CN111821507B - 一种具有缓释和促进成骨功能的3d打印骨组织工程支架及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有缓释和促进成骨功能的3d打印骨组织工程支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有缓释和促进成骨功能的3D打印骨组织工程支架及其制备方法，属于生物医学材料技术领域。所述支架由多孔磷酸钙材料与海藻酸钠原位交联而成，同时负载药物淫羊藿苷。本发明制备的骨组织工程支架具有良好的生物相容性和生物活性，同时通过在打印墨水中添加淫羊藿苷药物，进一步增强了支架的成骨性能，最终通过3D打印和后处理方式调控支架孔结构、通过改变氯化钙交联剂的浓度和交联时间调控支架交联度，进而调控材料体内降解速率。通过改变药物浓度调控支架载药量来实现该支架的药物缓释效果，本发明支架材料可用作人工骨以及骨组织工程重建修复，在临床上具有广阔的应用前景。

Description

一种具有缓释和促进成骨功能的3D打印骨组织工程支架及其 制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种3D打印载淫羊藿苷缓释促进骨诱导重建功能的骨组织工程支架及其制备方法。
技术背景
骨组织工程支架是组织工程中的重要组成部分，是将体外培养的种子细胞移植到支架材料上，然后将材料植入骨缺损处，辅以不同措施以促进细胞增殖分化,达到修复骨缺损目的。理想的骨支架材料应该能够模拟骨的成分、结构和力学特性等生物学功能，为细胞增殖分化提供暂时性场所，引导细胞、血管沿着支架的孔隙生长繁殖。传统骨支架材料强度高，但可塑性小，表面性能差，而3D打印技术基于逐层累加原理，依靠程序控制，在打印结构复杂的构件上具有巨大优势，因此用其成型骨组织工程支架具有先天技术优势。骨组织具有典型的三维多孔结构，特别适合使用3D打印技术制造，3D打印的骨组织工程支架已经应用于临床，但是仍然存在一些不足，如成骨性能不佳导致植入后骨组织愈合缓慢。
发明内容
本发明针对上述问题，开发了一种具有缓释和促进成骨功能的3D打印骨组织工程支架材料，所述支架由多孔磷酸钙材料与海藻酸钠原位交联而成，同时负载药物淫羊藿苷，具有缓释功能和促进骨组织修复重建的功效。
本发明包含以下技术方案：
一种3D打印墨水，包括磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷。磷酸钙具有良好的生物相容性，可控的生物可吸收性和与骨骼的成分相似性，其中的钙、磷成分在微环境中可以微溶解，溶解的钙、磷与周围骨组织的钙离子、磷离子结合使新生的骨晶体直接沉积于类骨磷灰石表面上，可促使骨细胞增殖分化，使骨组织与植入材料形成紧密、稳定的结合，并促进新骨形成，表现出良好的生物相容性、骨诱导性和骨传导性。所述海藻酸钠是一种天然直线型阴离子多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(简称M单元)和α-L-古罗糖醛酸(简称G单元)通过糖苷键按照GG、MM或者GM交替连接顺序而形成的聚合物，海藻酸钠的官能基尤其是GG结构很容易与某些二价阳离子(如Ca2+、Sr2+、Ba2+)键合，形成“egg-box”结构而成为水凝胶，具有良好的生物相容性、非免疫性、无毒性以及生物降解性。淫羊藿苷具有提高机体免疫力、抗氧化、改善心血管等生物学作用。本发明将三种组分混合配制出一种新型的3D打印墨水，采用该墨水打印而成的骨组织工程支架能够在植入体内后缓慢释放淫羊藿苷，并能显著增强支架的成骨性能，可用作人工骨以及骨组织工程重建修复，在临床上具有广阔的应用前景。
作为可选方式，在上述3D打印墨水中，磷酸钙、海藻酸钠和淫羊藿苷的质量比例为10～50︰6︰0.04～0.16。
作为可选方式，在上述3D打印墨水中，所述3D打印墨水是由磷酸钙粉体、海藻酸钠水溶液、淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液形成的混合浆料。
作为可选方式，在上述3D打印墨水中，所述海藻酸钠水溶液浓度为40-80mg/ml，所述淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液浓度为80-120mg/ml。
作为可选方式，在上述3D打印墨水中，所述磷酸钙为磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙、磷酸二氢钙中的一种或多种。
本发明还提供了一种上述的3D打印墨水的制备方法，具体包括以下步骤：
a)将海藻酸钠溶于去离子水中，配制海藻酸钠水溶液；
b)将淫羊藿苷溶于二甲基亚砜中制得淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液；
c)将步骤b)所得淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液滴加到步骤a)所得的海藻酸钠水溶液中，使二者混合均匀，得到混合溶液；
d)将磷酸钙缓缓加入保温后的海藻酸钠和淫羊藿苷混合溶液中，分散均匀，制得混合浆料。
作为可选方式，在上述3D打印墨水的制备方法中，所述海藻酸钠水溶液浓度为60mg/ml。进一步的，在所述步骤a)中，将海藻酸钠溶于去离子水中，用磁力搅拌器搅拌并水浴30～35℃加速溶解，溶解12～24h后制得浓度为60mg/ml的海藻酸钠溶液。
作为可选方式，在上述3D打印墨水的制备方法中，所述淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液浓度为100mg/ml。进一步的，在所述步骤b)中，将粉末状淫羊藿苷药物溶于二甲基亚砜中制得100mg/ml的淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液，使用超声波震荡1～2h加速溶解。
作为可选方式，在上述3D打印墨水的制备方法中，在所述步骤c)中，按照淫羊藿苷与海藻酸钠质量比0.04～0.16：6的比例，将步骤b)所得淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液滴加到步骤a)所得的海藻酸钠水溶液中，水浴30～35℃下搅拌30～60min至二者混合均匀。
作为可选方式，在上述3D打印墨水的制备方法中，所述保温具体为：将步骤c)所得的混合溶液置于50～60℃下保温30～60min。
作为可选方式，在上述3D打印墨水的制备方法中，在所述步骤d)的混合过程中先使用混合脱泡仪以500rpm预混0.5min，再以2000rpm正式混合6min，接着以2200rpm脱泡0.5min，多次预混和混合，可以充分保证打印墨水各组分的均匀性，脱泡处理利于去除墨水组分中的气体，利于后续打印的进行。
作为可选方式，在上述3D打印墨水的制备方法中，所述步骤d)具体为：将步骤c)所得的混合溶液置于50～60℃下保温30～60min，使海藻酸钠溶液黏度降低后，按照磷酸钙和海藻酸钠为25：6的质量比，将磷酸钙粉末缓缓加入保温后的海藻酸钠和淫羊藿苷混合溶液中，先使用混合脱泡仪以500rpm预混0.5min，再以2000rpm正式混合6min，接着以2200rpm脱泡0.5min，最终制得混合均匀的磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的比例为25︰6︰0.04～0.16︰100的混合浆料。
本发明还提供了一种上述的3D打印墨水的应用，其特征在于，将其用于制备骨组织工程支架材料。进一步的，采用所述的3D打印墨水通过3D喷墨打印技术制得的具有缓释和促进成骨功能的3D打印骨组织工程支架材料。
本发明还提供了一种采用上述的3D打印墨水通过3D喷墨打印技术制得的具有缓释和促进成骨功能的3D打印骨组织工程支架材料。
作为可选方式，所述3D打印骨组织工程支架由多孔磷酸钙材料与海藻酸钠原位交联而成，同时负载淫羊藿苷。所述骨组织工程支架具有良好的生物相容性和生物活性，同时通过在打印墨水中添加淫羊藿苷药物，进一步增强了支架的成骨性能，最终通过3D打印和后处理方式调控支架孔结构、通过改变氯化钙交联剂的浓度和交联时间调控支架交联度，进而调控材料体内降解速率。通过改变药物浓度调控支架载药量来实现该支架的药物缓释效果。
作为可选方式，在所述3D打印骨组织工程支架材料中，包括一级三维宏观孔结构和二级微纳毛细孔隙。
作为可选方式，所述3D打印骨组织工程支架材料具有孔径为200-800μm的宏观大孔，且彼此交互贯通。
作为可选方式，在所述3D打印骨组织工程支架材料中，所述一级三维宏观孔结构通过3D打印软件设计参数化模型和调节打印墨水中各原料的比例来获得，所述二级微纳毛细孔隙通过控制交联程度和冷冻干燥后处理来获得，冻干过程中由于大量水相挥发自发形成支撑材料内部和表面的微纳毛细微孔，进一步增强3D打印缓释促进成果功能骨组织工程支架材料的生物活性。
作为可选方式，所述组织工程支架材料成型后经氯化钙溶液浸泡，使得海藻酸钠与多孔磷酸钙原位交联。
本发明还提供了一种上述的组织工程支架材料的制备方法，包括以下步骤：
1)通过3D建模软件设计出所需支架的三维模型；
2)根据步骤1)中所述的三维模型，采用权利要求1所述的3D打印墨水通过3D喷墨打印技术打印出多孔磷酸钙支架；
3)将步骤2)所得多孔磷酸钙支架浸入交联剂中，交联形成具有一级稳定宏观结构的多孔生物活性支架材料；
4)将步骤3)所得支架进行冷冻干燥处理。
在上述方法中，通过3D打印和后处理方式调控支架孔结构、通过改变氯化钙交联剂的浓度和交联时间调控支架交联度，以及通过改变药物浓度调控支架载药量来实现该支架的药物缓释效果。
作为可选方式，在上述组织工程支架材料的制备方法中，所述交联剂为氯化钙溶液，进一步的，所述氯化钙溶液的质量分数为2.5％～30％。交联处理的具体方法为：将打印出的多孔磷酸钙支架浸入交联剂中，室温静置1～12小时，形成具有一级稳定宏观结构的多孔生物活性支架材料。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
(1)本发明所采用的初始材料为磷酸钙陶瓷、海藻酸盐和淫羊藿苷，生物相容性好，具有良好的骨修复效果。
(2)使用3D打印技术制备多孔支架，一级可调控设计宏观大孔结构，利于细胞的长入和营养物质的交换，并且能够根据患者骨缺损定制个性化外形尺寸。
(3)使用冷冻干燥技术处理一级宏观结构大孔磷酸钙支架，可进一步设计调控磷酸钙支架的二级微纳孔结构，赋予支架良好的生物活性，形成具有一级宏观大孔和二级微纳孔相间分布的多层级生物活性骨组织工程支架材料。
(4)该骨组织工程支架材料通过在打印墨水中掺加淫羊藿苷药物，使得支架具有促进成骨的功能，最终通过3D打印和后处理方式调控支架孔结构、通过改变氯化钙交联剂的浓度和交联时间调控支架交联度，以及通过改变药物浓度调控支架载药量来实现该支架的药物缓释效果。
(5)通过使用氯化钙溶液做为交联剂，使支架中的海藻酸盐遇到钙离子发生螯合反应，能够在原位固化交联，改善了支架的打印成型能力和力学稳定性。
附图说明：
图1为本发明实施例1制得的组织工程支架材料照片。
图2为实施例1样品与对比例1样品经比格犬颅骨缺损模型种植3个月后的新生骨组织重建能力对比Micro-CT结果图。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)制备3D打印墨水
在30℃水浴条件下，将海藻酸钠粉末材料加入去离子水中配制获得6％的海藻酸钠溶液，加入1ml浓度为0.1g/ml的淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液，用磁力搅拌器使其充分混合至均匀。在50℃预热30～60min后，使海藻酸钠溶液黏度降低，再将磷酸钙粉末固体缓缓加入到预热后的溶液中，用均质搅拌器使浆料混合均匀直至观察不到磷酸钙出现团聚现象，在最终浆料中磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比为25︰6︰0.08︰100，将此混合浆料作为3D打印墨水。
(2)打印支架
通过3D建模软件设计出支架的三维模型，采用3D喷墨打印技术将混合墨水打印成具有一级宏观多孔结构的磷酸钙支架。
(3)交联
将打印所得的多孔磷酸钙支架30％的氯化钙溶液进行交联反应，室温静置12小时使其充分固化交联，形成具有一级稳定宏观结构的多孔生物活性支架材料。
(4)后处理
将交联后的多孔支架做冷冻干燥处理，冻干过程使得支架中大量水相挥发，导致打印丝的内部和表面出现了许多空间空位，即形成二级微观孔结构，最终获得一种3D打印具有缓释促进成骨功能的骨组织工程支架材料。
(5)释放效果实验
将所得支架样品置于2ml PBS溶液中，室温静置，在24小时内每2小时测试一次，一天之后，后续每天测试一次，连续测试21天，直至药物释放曲线变平缓。每次测试时从实验浸泡液中提取0.25ml PBS溶液，用酶标仪测定吸光度值(吸光度越高，对应的药物浓度越高，说明从支架上释放到溶液中的药物越多)，同时向实验浸泡液中加入0.25ml新鲜的PBS溶液。
(6)体内促进成骨实验
选取健康雄性比格犬，在颅骨顶部钻取2个直径为12mm的圆形缺损区域，不能伤及脑膜层。然后骨科植入含有药物的圆形打印样品以及未含有药物的圆形打印样品。在植入后1个月及3个月，进行CT活体检测和牺牲动物取样进行组织学切片分析，观察植入才新生骨组织区域体积(成骨量)，可得到其促进成果的效果评价数值。
对比例1
参照实施例1所述方法制备不含淫羊藿苷的支架材料，其与实施例1不同之处在于：步骤(1)中，在30℃水浴条件下，将海藻酸钠粉末材料加入去离子水中配制获得60mg/ml的海藻酸钠溶液，用磁力搅拌器使其充分混合至均匀，不再加入淫羊藿苷。在50℃预热30～60min后，使海藻酸钠溶液黏度降低，再将磷酸钙粉末缓缓加入到预热后的溶液中，用混合脱泡仪使浆料混合均匀直至观察不到磷酸钙出现团聚现象，在最终浆料中磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比为25︰6︰0︰100，将此混合浆料做为3D打印墨水。其余处理方式与实施例1完全相同。结果表明：实施例1中所得支架中的淫羊藿苷能够缓慢释放，具有明显的缓释效果，而对比例1所得支架中由于不含有淫羊藿苷不具备缓释效果。体内促进成骨实验结果如图2所示：实施例1经过加载缓释淫羊藿药物支架，新生骨组织体积与缺损体积比例(修复率)为：BV/TV＝91.56％；其表现出具有良好的成骨活性，能有效促进骨缺损的修复愈合，对比例1样品缺损修复率比例为BV/TV＝43.54％，说明该材料的骨诱导修复功能不如实施例1好
实施例2
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其与实施例1不同之处在于：将磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比调整为25︰6︰0.04︰100，其余处理方式与实施例1所述相同。实验结果显示，所得支架具备缓释功能和促进成骨效果，但与实施例1相比，由于打印浆料中淫羊藿苷的固含量较少，造成具有缓释促进成骨功能的骨组织工程支架的载药总量较少，本实施利所得支架对骨缺损的促进成骨功能优于对比例1，但较实施例1略差。
实施例3
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其与实施例1不同之处在于：将磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比调整为25︰6︰0.16︰100，其余处理方式与实施例1所述相同。实验结果显示，所得支架具备缓释功能和促进成骨效果，由于打印浆料中淫羊藿苷的固含量较实施例1、2多，造成具有缓释促进成骨功能的骨组织工程支架的载药总量较多，本实施利所得支架对骨缺损的促进成骨功能较实施例1、2更好。
实施例4
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其与实施例1不同之处在于：使用质量分数为5％的氯化钙溶液作为交联剂，交联反应1小时，其余处理方式与实施例1所述相同。实验结果显示，所得支架具备一定的缓释功能和促进成骨效果，但由于此时钙离子浓度较低，交联时间短，与海藻酸钠的螯合反应不能充分进行，形成交联网络结构数量少，支架的结构稳定性、力学性能和缓释促进成骨效果较实施例1差。
实施例5
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其与实施例1不同之处在于：使用质量分数为5％的氯化钙溶液作为交联剂，交联反应12小时，其余处理方式与实施例1所述相同。实验结果显示，所得支架具备缓释功能和促进成骨效果，由于钙离子浓度较低，能够形成的交联网络结构总量较少，支架的结构稳定性、力学性能较实施例1差，但与实施例4相比已得到明显改善；不过由于经历较长的交联时间，钙离子溶液能够均匀渗透进入支架内部，使得打印丝的表面和内部获得同等的交联程度，这就使得支架也能具备一定的缓释促进成骨效果，较实施例1稍差。
实施例6
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其与实施例1不同之处在于：使用质量分数为30％的氯化钙溶液作为交联剂，交联反应1小时，其余处理方式与实施例1所述相同。实验结果显示，所得支架具备缓释功能和促进成骨效果，由于钙离子浓度虽高，但是经历较短的交联时间，打印丝本身具有一定得尺寸厚度，富含钙离子的溶液不能完全渗透进入打印丝的内部，因此虽然支架表层得到充分交联，但是支架打印丝的芯部材料仍然处于未交联状态，因此该支架的药物释放速度不能得到很好的控制。而实施例1中的交联方式可以完美地解决这个问题，用30％的近饱和钙离子溶液交联12小时，充分渗透进入打印丝的内部，使得支架的打印丝表面和内部均能进行完全交联，也使得支架具备了结构稳定性和力学稳定性，也有利于具有缓释促进成骨功能的骨组织工程支架的药物缓释效果。
实施例7
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，按照实施例1所述，磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比为25︰6︰0.08︰100，配成浆料做为3D打印墨水；30％氯化钙溶液做为交联剂。通过3D建模软件设计支架模型宏观大孔为300μm的正交方孔，再按照实施例1的方法，首先制备3D打印墨水，进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备支架，然后浸入氯化钙溶液中交联，其它交联参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，样品进一步经过冷冻干燥处理后，支架体收缩率约为30％，形成一种宏观大孔为200μm，同时具有二级毛细微孔约为1～10μm的缓释促进成骨功能的骨组织工程支架。实验结果显示，所得支架具备缓释功能和促进成骨效果。
实施例8
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，按照实施例1所述，磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比为25︰6︰0.08︰100，配成浆料做为3D打印墨水；30％氯化钙溶液做为交联剂。其它参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，通过3D建模软件设计的支架模型宏观大孔为600μm的正交方孔，经3D打印成形一级宏观尺度大孔，然后浸入氯化钙溶液中交联，最终得到的支架经过冷冻干燥处理后，体收缩率约为30％，形成了一种宏观大孔为400μm，同时具有二级毛细微孔约为1～10μm的缓释促进成骨功能的骨组织工程支架。实验结果显示，所得支架具备缓释功能和促进成骨效果。
实施例9
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，按照实施例1所述，磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比为25︰6︰0.08︰100，配成浆料做为3D打印墨水；30％氯化钙溶液做为交联剂。其它参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，通过3D建模软件设计支架模型宏观大孔为900μm的正交方孔，再按照实施例1的方法，首先制备3D打印墨水，进行一级宏观尺度大孔设计3D打印制备支架，然后浸入氯化钙溶液中交联，其交联参数选择及制备过程与实施例1相同，最终得到的宏观大孔尺寸经过冷冻干燥处理后，体收缩率约为30％，形成了一种宏观大孔为600μm，同时具有二级毛细微孔约为1～10μm的缓释促进成骨功能的骨组织工程支架。实验结果显示，所得支架具备缓释功能和促进成骨效果。
通过实施例7-9对比发现，各实施例中，每一根打印丝的宽度相同，随着打印丝间距越大，支架孔隙率就越高，单位体积支架中淫羊藿苷的载药总量更少，支架周围液体的连通性也越好，药物释放速度更快，因此此技术能够通过调节支架孔径大小来控制淫羊藿苷的缓释促进成骨效果。实施例7、实施例8和实施例9制备的三种不同大孔尺寸的3D打印具有缓释促进成骨功能的骨组织工程支架材料，200μm孔径支架的缓释促进成骨效果最优，400μm孔径支架次之，600μm孔径支架最差。
实施例10
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，在30℃水浴条件下，将海藻酸钠粉末材料加入去离子水中配制获得6％的海藻酸钠溶液，加入1ml浓度为0.1g/ml的淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液，用磁力搅拌器使其充分混合至均匀。在50℃预热30～60min后，使海藻酸钠溶液黏度降低，再将磷酸钙粉末固体缓缓加入到预热后的溶液中，用混合脱泡仪使浆料混合均匀直至观察不到磷酸钙出现团聚现象，其它参数选择及制备过程与实施例1相同。不同之处在于，在最终浆料中磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比为50︰6︰0.08︰100，将此混合浆料作为3D打印墨水材料，配制30％的氯化钙溶液做为交联剂使用。与实施例1相比，本实施例中磷酸钙固含量较高，浆料流动性降低，黏度增大，在打印过程中容易导致喷头堵塞，影响材料打印成型，因此本实施例获得的支架对骨缺损的促进成骨功能较实施例1稍差。
实施例11：
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其它参数选择及制备过程与实施例1相同，不同之处在于，磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比为10︰6︰0.08︰100，配成浆料做为3D打印墨水；与实施例1相比，本实施例中磷酸钙固含量低，浆料流动性大，黏度降低，打印过程中易挤出，打印后纤维强度不足，出现支架坍塌现象。因此本实施例获得的支架对骨缺损的促进成骨功能较实施例1稍差。
实施例12：
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其与实施例1不同之处在于：将磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比调整为25︰6︰0.02︰100，其余处理方式与实施例1所述相同。实验结果显示，本实施例由于打印浆料中淫羊藿苷含量太少，支架总载药量低，释放速度慢，对骨缺损的促进成骨功能较实施例1差。
实施例13：
参照实施例1所述方法制备3D打印骨组织工程支架材料，其与实施例1不同之处在于：将磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的质量比调整为25︰6︰0.32︰100，其余处理方式与实施例1所述相同。实验结果显示，本实施例由于打印浆料中淫羊藿苷含量过高，支架总载药量过高，导致药物释放速度快，虽然表现出良好的促进成骨功能，但过高的淫羊藿苷释放对成骨相关细胞具有一定的毒副作用，不利于骨组织的修复重建，本支架整体应用效果较实施例1差。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种具有缓释和促进成骨功能的3D打印骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）通过3D建模软件设计出所需支架的三维模型；
2）配制3D打印墨水，具体包括：
a）将海藻酸钠溶于去离子水中，用磁力搅拌器搅拌并水浴30~35℃加速溶解，溶解12~24h后制得浓度为40-80mg/ml的海藻酸钠溶液；
b）将粉末状淫羊藿苷药物溶于二甲基亚砜中制得80-120mg/ml的淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液，使用超声波震荡1~2h加速溶解；
c）按照淫羊藿苷与海藻酸钠质量比0.04~0.16：6的比例，将步骤b)所得淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液滴加到步骤a)所得的海藻酸钠水溶液中，水浴30~35℃下搅拌30~60min至二者混合均匀；
d）将步骤c)所得的混合溶液置于50~60℃下保温30~60min，使海藻酸钠溶液黏度降低后，按照磷酸钙和海藻酸钠为10~50︰6的质量比，将磷酸钙粉末缓缓加入保温后的海藻酸钠和淫羊藿苷混合溶液中，先使用混合脱泡仪以500rpm预混0.5min，再以2000rpm正式混合6min，接着以2200rpm脱泡0.5min，最终制得混合均匀的磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷质量比例为10~50︰6︰0.04~0.16的混合浆料；
3）根据步骤1）中所述的三维模型，采用步骤2）中制备的3D打印墨水通过3D喷墨打印技术打印出多孔磷酸钙支架；
4）将步骤3）打印出的多孔磷酸钙支架浸入交联剂中，室温静置1~12小时，形成具有一级稳定宏观结构的多孔生物活性支架材料；
5）将步骤4）所得支架进行冷冻干燥处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钙为磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙、磷酸二氢钙中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤a）中，配制浓度为60mg/ml的海藻酸钠溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤b）中，制得100mg/ml的淫羊藿苷-二甲基亚砜溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤d）中，按照磷酸钙和海藻酸钠为25：6的质量比，将磷酸钙粉末缓缓加入保温后的海藻酸钠和淫羊藿苷混合溶液中，先使用混合脱泡仪以500rpm预混0.5min，再以2000rpm正式混合6min，接着以2200rpm脱泡0.5min，最终制得混合均匀的磷酸钙、海藻酸钠、淫羊藿苷和去离子水的比例为25︰6︰0.04~0.16︰100的混合浆料。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述3D打印骨组织工程支架由多孔磷酸钙材料与海藻酸钠原位交联而成，同时负载淫羊藿苷。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过3D打印和后处理方式调控支架孔结构、通过改变氯化钙交联剂的浓度和交联时间调控支架交联度，以及通过改变药物浓度调控支架载药量来实现该支架的药物缓释效果。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述3D打印骨组织工程支架材料具有孔径为200-800μm的宏观大孔，且彼此交互贯通。
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