CN108404223B - 可分步降解的多功能高分子复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可分步降解的多功能高分子复合支架及其制备方法，以掺杂改性mHA晶体粉末、PLGA和PCL作为原料组成三元复合体系，将三元复合体系通过3D打印或溶剂发泡方式得到多孔支架，进一步在多孔支架上接枝促红细胞生长素EPO和RGD多肽得到高分子复合支架。本发明制备方法得到的多功能高分子复合支架，具有优异的抗菌性能、荧光示踪性能、生物相容性和成骨性能，可促进新骨生长的血管化和骨组织再生修复，并可实现对支架降解时间的调控，因此在生物医学基础研究、高性能骨修复材料研制、促进成骨即生物材料体内示踪研究等方面具有广阔的应用前景。

Description

可分步降解的多功能高分子复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料和生物医学工程技术领域，涉及一种由多功能纳米HA晶体与两种高分子材料复合得到的可分步降解支架及其制备方法。
背景技术
炎症、骨肿瘤和创伤等造成的人体骨组织(包括口腔颌骨)缺损现象日益增加，借助人工合成的生物材料来促进骨组织再生修复已成为一种重要的治疗手段。
以颌骨缺损为例，对于小尺寸的颌骨缺损，可以采用自愈合方式或者采用羟基磷灰石颗粒予以填充；对于尺寸较大的颌骨缺损的修复，一般采用多孔骨支架。公开的多孔骨支架有磷酸钙陶瓷多孔支架、聚乳酸类高分子支架，然而磷酸钙陶瓷多孔支架存在强度低、脆性大、体内降解缓慢和新骨血管化不足的等缺陷，聚乳酸类高分子支架虽然具有强度适中、韧性好、来源充足、易于加工和可降解等优点，但现有聚乳酸类高分子支架【如，聚乳酸(Polyactic acid，PLA)，聚乳酸-羟基乙酸(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)】，尽管在体内可以降解，仍存在降解速率不可控、支架易在体内瞬间崩塌、所产生的酸性降解产物易引起刺激和炎症反应以及自身缺乏成骨生物活性等不足【Rezwan,K.；Chen,Q.Z.；Blaker,J.J.；Boccaccini,A.R.,Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering.Biomaterials 2006,27(18),3413-3431.】，因而，对尺寸较大颌骨缺损的修复依然是目前国内外有待解决的临床难题。
发明内容
本发明的目的旨在针对上述现有技术中的不足，提供一种可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，本发明的另一目的旨在提供由上述制备方法制备的可分步降解的多功能高分子复合支架，不仅可以解决现有高分子支架降解速率不可控，支架易瞬间崩塌的问题，还具有抗菌性能、荧光示踪性能以及良好的生物相容性和促成骨性能。
本发明的基本发明思路为：首先通过水热法制备锌离子、氟离子和稀土离子共掺杂的mHA晶体粉末，然后将得到的mHA晶体粉末添加到聚乳酸-羟基乙酸共聚物【Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA】和聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)混合溶液中，配制成三元复合体系，再通过3D打印技术或溶剂发泡技术得到多孔支架，最后在得到的多孔支架上接枝促红细胞生长素EPO(Erythropoietin)和RGD多肽【RGD(Arg-Gly-Asp)，RGD由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成】得到高分子复合支架。由于PLGA体内降解一般可在6个月内完成，而PCL体内降解时间相对较长，其完全降解时间以及强度保持时间均大于12个月，非常适于作为长期植入的骨再生支架材料。由这两种基质构建的支架可有效调控支架在体内的降解速率，达到新生组织生长与高分子支架降解速率平衡，从而解决PLGA支架在体内瞬间崩塌的缺点。同时，在这种复合支架中引入锌离子(Zn2+)、氟离子(F-)和稀土离子(Ln3+)共掺杂的羟基磷灰石晶体粉末(mHA)，通过Zn2+和F-提供长效抗菌性，通过HA晶体提供成骨生物活性位点，并借助Ln3+提供成骨荧光示踪性能。HA的羟基(-OH)碱性基团也有助于中和PLGA降解产物造成的酸性。本发明在支架组分中或其表面引入具有促进血管化和成骨细胞粘附的促红细胞生长素EPO和RGD多肽，以刺激造血干细胞增生，促进成骨细胞在多孔支架表面和孔内的粘附，实现促进新骨血管化和骨组织再生修复。
基于上述发明思路，本发明提供的可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，步骤如下：
(1)配制前驱液
配制前驱液A：将含Ln3+的溶液、含Zn2+的溶液与含Ca2+的溶液混合均匀得到前驱液A；所述前驱液A中，Ln3+、Zn2+、Ca2+的摩尔比为(1～20):(1～15):100；
配制前驱液B：将含F-的溶液与含PO4 3-的溶液混合均匀得到前驱液B；所述前驱液B中，F-与PO4 3-的摩尔比为(1.67～8.33):100；
(2)制备mHA晶体粉末
在搅拌条件下，将前驱液B滴加到25～70℃的前驱液A中形成反应体系，滴加过程中通过添加氨水或氢氧化钠溶液维持反应体系的pH值为9～11，滴加结束后于120～180℃反应6～10h，然后将反应所得产物进行固液分离，分离出的固体产物经洗涤、冷冻干燥得到mHA晶体粉末；所述反应体系中，Ca2+与PO4 3-的摩尔比为1.67；
(3)配制mHA/PLGA-PCL三元复合体系
将聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯溶解到有机溶剂中，形成复合高分子基质体系，所述复合高分子基质体系中，聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯的质量比为(1～2)：(2～1)；将mHA晶体粉末添加到所得复合高分子基质体系中并搅拌均匀得到mHA/PLGA-PCL三元复合体系，所述mHA/PLGA-PCL三元复合体系中mHA晶体粉末的质量分数为20～70％；
(4)制备多孔支架
将mHA/PLGA-PCL三元复合体系通过3D打印或溶剂发泡方式得到多孔支架；
(5)在多孔支架上接枝促红细胞生长素EPO和RGD多肽得到高分子复合支架。
上述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，首先配制前驱液A和前驱液B，然后将前驱液A和前驱液B混合后通过水热法制备mHA晶体粉末。用于配制前驱液A的Ln3+为Tb3+、Eu3+、Er3+、Dy3+、Yb3+和Ho3+中的一种或两种，含Ln3+的溶液为相应的硝酸盐、盐酸盐或硫酸盐水溶液，溶液中水的用量为将Ln3+相应的硝酸盐、盐酸盐或硫酸盐溶解完全；含Zn2+的溶液为硝酸锌、氯化锌或硫酸锌水溶液，溶液中水的用量为将硝酸锌、氯化锌或硫酸锌溶解完全；含Ca2+的溶液为硝酸钙或氯化钙水溶液，溶液中Ca2+浓度为0.2～2mol/L。用于配制前驱液B的含PO4 3-的溶液为磷酸钠或磷酸氢二铵水溶液，溶液中PO4 3-浓度为0.12～1.2mol/L，含F-的溶液为氟化钠或氟化铵水溶液，溶液中水的用量为将氟化钠或氟化铵溶解完全。
上述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，所述步骤(2)中，对分离出的固体产物进行洗涤的目的在于去除附着在所得产物表面的未反应的原料及反应所生成的可溶性盐等杂质，一般采用去离子水和乙醇对分离出的固体产物进行充分清洗即可。
上述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，将聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯将聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯的质量比控制在(1～2)：(2～1)，以此通过调配PLGA和PCL比例来控制支架的降解时间，以适应新生骨组织的生长和再生重建。而mHA/PLGA-PCL三元复合体系中mHA晶体粉末的质量分数为20～70％，优选范围为20～40％，mHA晶体粉末太多会导致复合支架力学性能下降，太少则对成骨不利。
上述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，用于溶解聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或三氟乙醇，有机溶剂将聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯溶解得到均质的溶液(将其作为复合高分子基质体系)，有机溶剂用量大于将聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯刚好完全溶解时有机溶剂的使用量，以避免得到的溶液过于黏稠。
上述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，将步骤(3)配制得到的mHA/PLGA-PCL三元复合体系可以通过3D打印方式得到多孔支架，也可以通过溶剂发泡方式得到多孔支架。通过溶剂发泡方式得到多孔支架的具体实现方式为：向mHA/PLGA-PCL三元复合体系中加入三元复合体系1～3倍重量的NaCl颗粒并搅拌均匀，之后于30～50℃进行真空干燥使用于溶解聚乳酸-羧基乙酸共聚物和聚己内酯的有机溶剂挥发产生丰富的微孔(<100μm)，再对干燥所得固体利用去离子水洗涤去除NaCl颗粒即得到含有大孔和微孔的多孔支架。得到的多孔支架的大孔孔径为100～600μm，孔隙率大于70％，以满足骨再生重建的需要。
上述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，为了解决多孔支架中新骨生长血管化的不足，进一步促进复合支架的成骨性能，可以在多孔支架上接枝促红细胞生长素EPO和RGD多肽。将多孔支架放置于促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液中静置至少12h得到接枝了促红细胞生长素EPO和RGD多肽的高分子复合支架。促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液由促红细胞生长素EPO和RGD多肽粉末溶解到去离子水或PBS缓冲液中得到。为了确保促红细胞生长激素EPO和RGD多肽均匀接枝到多孔支架上，在优选的实施方式中，溶液的使用量至少将多孔支架覆盖，溶液中的促红细胞生长素EPO和RGD多肽的质量分别是置于溶液中多孔支架质量的1～5％。
本发明进一步提供了上述制备方法得到的可分步降解的多功能高分子复合支架，为Zn离子、F离子和Ln离子掺杂改性的mHA晶体，与PLGA/PCL混合构建的可分步降解的新型骨再生支架，该支架一方面能促进新骨血管化和成骨，另一方面具有抗菌性和荧光示踪性能，在骨组织再生修复领域将具有广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明制备方法得到的可分步降解的多功能高分子复合支架，以mHA晶体粉末、PLGA和PCL作为原料组成三元复合体系，将三元复合体系通过3D打印或溶剂发泡方式得到多孔支架，由于mHA晶体粉末富含多种离子(锌离子、氟离子和稀土离子)，从而使得到的多孔支架具有抗菌性能、荧光示踪性能以及良好的生物相容性和成骨性能；同时PLGA和PCL为具有不同降解速率的两种高分子材料，以这两种材料为支架基质，可以实现对支架降解时间的调控，从而避免支架在体内瞬间崩塌的缺点；
2、本发明制备方法得到的可分步降解的多功能高分子复合支架，在由mHA/PLGA-PCL三元复合体系得到的多孔支架上进一步接枝两种生物因子促红细胞生成素(EPO)和RGD多肽，可促进复合支架中新骨生长的血管化以及缺损骨组织再生修复；
3、本发明制备方法得到的可分步降解的多功能高分子复合支架，不仅具有优异的抗菌性能、荧光示踪性能、生物相容性和成骨性能，可促进新骨生长的血管化和骨组织再生修复，并可实现对支架降解时间的调控，因此在生物医学基础研究、高性能骨修复材料研制、促进成骨即生物材料体内示踪研究等方面具有广阔的应用前景；
4、本发明制备方法，基于水热工艺、3D打印技术/溶剂发泡技术等，操作简单，成本较低，易于在本领域内推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1所得mHA晶体粉末的XRD图谱。
图2为本发明实施例1所得mHA晶体粉末的TEM形貌图谱。
图3为本发明实施例1所得mHA晶体粉末的EDS能谱图。
图4为本发明实施例1所得mHA晶体粉末的荧光发射谱图。
图5为本发明实施例2-4所得掺杂不同浓度Zn所得mHA晶体粉末对金黄色葡萄球菌抑菌效果示意图，其中空白组表示未添加mHA晶体粉末和纯HA晶体粉末的葡萄球菌，HA组表示将对比例制备的纯HA晶体粉末料灭菌后置入平板固体培养基的金黄色葡萄球菌抑菌试验组，mHA-5％Zn～mHA-15％Zn组表示将实施例2-4中制备的掺杂不同浓度Zn的mHA晶体粉末材料灭菌后置入平板固体培养基的金黄色葡萄球菌抑菌试验组；#VS空白，代表相对于空白组具有显著性差异，P＜0.05；*VS HA，代表相对于HA组具有显著性差异，P＜0.05。
图6为本发明实施例1所得3D打印多孔支架形貌图；其中，(a)为立体图，(b)为俯视图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例制备可分步降解的多功能高分子复合支架的步骤如下：
(1)配制前驱液
配制前驱液A：将10mL Tb(NO3)3水溶液【含Tb3+40mmol】和10mL Zn(NO3)2水溶液【含Zn2+2mmol】添加到100mL浓度为2mol/L的Ca(NO3)2水溶液中，混合均匀得到前驱液A；
配制前驱液B：将10mL NaF水溶液【含F-2mmol】添加到100mL浓度为1.2mol/L的Na3PO4水溶液中，混合均匀得到前驱液B；
(2)制备含1％Zn和20％Tb的mHA晶体粉末
在搅拌条件下，将前驱液B滴加到25℃的前驱液A中，滴加过程中通过添加氨水维持反应体系pH值为9，滴加结束后将所得悬浮液装入水热反应釜中，于180℃反应6h，然后将反应所得产物离心，离心所得沉淀用去离子水和乙醇依次充分清洗后，再将洗涤所得产物经冷冻干燥得到含Zn2+和Tb3+离子的mHA晶体粉末，其中Zn2+和Tb3+的物质的量分别是Ca2+物质的量的1％和20％；
(3)配制mHA/PLGA-PCL三元复合体系
将4g聚乳酸-羧基乙酸共聚物与4g聚己内酯溶解到20mL二氯甲烷中，形成复合高分子基质体系；然后将2g mHA晶体粉末添加到所得复合高分子基质体系中并搅拌均匀，得到mHA含量为20wt％的mHA/PLGA-PCL三元复合体系；
(4)制备多孔支架
本实施例采用的3D打印机为(型号3D Bioprinter V2.0,杭州Regenovo生物技术公司制造)。依据设计的模型尺寸设定3D打印机参数(喷嘴直径为0.22mm,打印单层厚度为0.1mm，层与层间采用45°交替打印，喷丝间距为0.5mm，喷头速度为5mm/s)，在室温下将配制好的mHA/PLGA-PCL三元复合体系装入打印机的料筒中，之后通过3D打印得到孔径为300～500μm、孔隙率＞70％的多孔支架；
(5)将得到的多孔支架淹没在促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液中(溶液中的促红细胞生长素EPO和RGD多肽的质量分别是多孔支架质量的1％)静置24h，获得接枝了促红细胞生长素EPO和RGD多肽的高分子复合支架。
对本实施例步骤(2)得到的mHA晶体粉末进行XRD分析，分析结果如图1所示，上方为分析所得mHA晶体粉末的XRD图谱，下方为对应HA标准卡片ICDD 09-0432的标准峰位，从图中可以看出mHA晶体粉末XRD图谱上的特征峰与HA ICDD 09-0432的标准峰相对应，说明掺杂并未破坏HA的晶体结构。
对本实施例步骤(2)得到的mHA晶体粉末利用透射电子显微镜进行TEM形貌分析和EDS能谱分析，分析结果如图2和图3所示。从图2中可以看出mHA晶体粉末呈颗粒状，其尺度分布在200-300nm。从mHA晶体粉末的EDS能谱图(见图3)上可以看到Ca、P、O、Zn、Tb的特征峰，说明Zn2+、Tb3+离子已经成功掺杂到羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)晶体内。
对本实施例步骤(2)得到的mHA晶体粉末采用波长为232nm的紫外光进行激发，所得样品的荧光发射谱图如图4所示。从图中可以看出，mHA晶体粉末能发出497nm和552nm波长的绿色荧光，证明mHA晶体具有良好的荧光性能，可用于植入材料的示踪。
本实施例步骤(4)得到的多孔支架如图6所示，从图中可以看出3D打印支架孔径为300～500μm、孔隙率＞70％。
实施例2
本实施例制备可分步降解的多功能高分子复合支架的步骤如下：
(1)配制前驱液
配制前驱液A：将20mL EuCl3水溶液【含Eu3+30mmol】和20mL ZnCl2水溶液【含Zn2+10mmol】添加到200mL浓度为1mol/L的CaCl2水溶液中，混合均匀得到前驱液A；
配制前驱液B：将20mL NH4F水溶液【含F-4mmol】添加到200mL浓度为0.6mol/L的(NH4)2HPO4水溶液中，混合均匀得到前驱液B；
(2)制备含5％Zn和15％Eu的mHA晶体粉末
在搅拌条件下，将前驱液B滴加到50℃的前驱液A中，滴加过程中通过添加NaOH溶液维持反应体系pH值为10，滴加结束后将所得悬浮液装入水热反应釜中，于160℃反应8h，然后将反应所得产物离心，离心所得沉淀用去离子水和乙醇依次充分清洗后，再将洗涤所得产物经冷冻干燥得到含Zn2+和Eu3+离子的mHA晶体粉末，其中Zn2+和Eu3+的物质的量分别是Ca2+物质的量的5％和15％；
(3)配制mHA/PLGA-PCL三元复合体系
将2g聚乳酸-羧基乙酸共聚物与4g聚己内酯溶解到20mL二氯甲烷中，形成复合高分子基质体系；将2.6g mHA晶体粉末添加到所得复合高分子基质体系中并搅拌均匀得到mHA含量为30％的mHA/PLGA-PCL三元复合体系；
(4)制备多孔支架
本实施例采用的3D打印机为(型号3D Bioprinter V2.0,杭州Regenovo生物技术公司制造)。依据设计的模型尺寸设定3D打印机参数(喷嘴直径为0.22mm,打印单层厚度为0.1mm，层与层间采用45°交替打印，喷丝间距为0.5mm，喷头速度为5mm/s)，在室温下将配制好的mHA/PLGA-PCL三元复合体系装入打印机的料筒中，之后通过3D打印得到孔径为300～500μm、孔隙率＞70％的多孔支架；
(5)将得到的多孔支架淹没在促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液(溶液中的促红细胞生长素EPO和RGD多肽的质量分别是多孔支架质量的2％)静置24h，获得接枝了促红细胞生长素EPO和RGD多肽的高分子复合支架。
实施例3
本实施例制备可分步降解的多功能高分子复合支架的步骤如下：
(1)配制前驱液
配制前驱液A：将10mL Tb(NO3)3水溶液【含Tb3+20mmol】和10mL Zn(NO3)2水溶液【含Zn2+20mmol】添加到100mL浓度为2mol/L的Ca(NO3)2水溶液中，混合均匀得到前驱液A；
配制前驱液B：将10mL NaF水溶液【含F-6mmol】添加到100mL浓度为1.2mol/L的Na3PO4水溶液中，混合均匀得到前驱液B；
(2)制备含10％Zn和10％Tb的mHA晶体粉末
在搅拌条件下，将前驱液B滴加到70℃的前驱液A中，滴加过程中通过添加氨水维持反应体系pH值为11，滴加结束后将所得悬浮液装入水热反应釜中，于140℃反应9h，然后将反应所得产物离心，离心所得沉淀用去离子水和乙醇依次充分清洗后，再将洗涤所得产物经冷冻干燥得到含Zn2+和Tb3+离子的mHA晶体粉末，其中Zn2+和Tb3+的物质的量分别是Ca2+物质的量的10％和10％；
(3)配制mHA/PLGA-PCL三元复合体系
将2g聚乳酸-羧基乙酸共聚物与3g聚己内酯溶解到20mL二氯甲烷中，形成复合高分子基质体系；然后将5g mHA晶体粉末添加到所得复合高分子基质体系中并搅拌均匀，得到mHA含量为50wt％的mHA/PLGA-PCL三元复合体系；
(4)制备多孔支架
本实施例采用的3D打印机为(型号3D Bioprinter V2.0,杭州Regenovo生物技术公司制造)。依据设计的模型尺寸设定3D打印机参数(喷嘴直径为0.22mm,打印单层厚度为0.1mm，层与层间采用45°交替打印，喷丝间距为0.5mm，喷头速度为5mm/s)，在室温下将配制好的mHA/PLGA-PCL三元复合体系装入打印机的料筒中，之后通过3D打印得到孔径为300～500μm、孔隙率＞70％的多孔支架；
(5)将得到的多孔支架淹没在促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液(溶液中的促红细胞生长素EPO和RGD多肽的质量分别是多孔支架质量的3％和1％)静置24h，，获得接枝了促红细胞生长素EPO和RGD多肽的高分子复合支架。
实施例4
本实施例制备可分步降解的多功能高分子复合支架的步骤如下：
(1)配制前驱液
配制前驱液A：将100mL Er2(SO4)3水溶液【含Er3+2mmol】和100mL ZnSO4水溶液【含Zn2+30mmol】添加到1000mL浓度为0.2mol/L的Ca(NO3)2水溶液中，混合均匀得到前驱液A；
配制前驱液B：将100mL NaF水溶液【含F-10mmol】添加到1000mL浓度为0.12mol/L的Na3PO4水溶液中，混合均匀得到前驱液B；
(2)制备含15％Zn和1％Er的mHA晶体粉末
在搅拌条件下，将前驱液B滴加到25℃的前驱液A中，滴加过程中通过添加NaOH溶液维持反应体系pH值为11，滴加结束后将所得悬浮液装入水热反应釜中，于120℃反应10h，然后将反应所得产物离心，离心所得沉淀用去离子水和乙醇依次充分清洗后，再将洗涤所得产物经冷冻干燥得到含Zn2+和Er3+离子的mHA晶体粉末，其中Zn2+和Er3+的物质的量分别是Ca2+物质的量的15％和1％；
(3)配制mHA/PLGA-PCL三元复合体系
将2g聚乳酸-羧基乙酸共聚物与1g聚己内酯溶解到20mL三氯甲烷中，形成复合高分子基质体系；将7g mHA晶体粉末添加到所得复合高分子基质体系中并搅拌均匀得到mHA含量为70wt％的mHA/PLGA-PCL三元复合体系；
(4)制备多孔支架
向mHA/PLGA-PCL三元复合体系中加入三元复合体系3倍重量的NaCl颗粒并搅拌均匀，之后于30℃进行真空干燥去除三氯甲烷，再对干燥所得固体利用去离子水进行洗涤去除NaCl颗粒即得到孔径为100～600μm，孔隙率大于70％的多孔支架；
(5)将得到的多孔支架淹没在促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液(溶液中的促红细胞生长素EPO和RGD多肽的质量分别是多孔支架质量的1％)静置24h，获得接枝了促红细胞生长素EPO和RGD多肽的高分子复合支架。
对比例
本对比例制备纯HA晶体粉末的过程为：在搅拌条件下，将100mL浓度为1.2mol/L的Na3PO4水溶液滴加到25℃的100mL浓度为2mol/L的Ca(NO3)2水溶液中，滴加过程中通过添加氨水维持反应体系pH值为9，滴加结束后将所得悬浮液装入水热反应釜中，于180℃反应6h，然后将反应所得产物离心，离心所得沉淀用去离子水和乙醇依次充分清洗后，再将洗涤所得产物经冷冻干燥得到纯HA晶体粉末。
将对比例制备的纯HA晶体粉末和实施例2-4中制备的掺杂不同浓度Zn的mHA晶体粉末材料灭菌后置入平板固体培养基中进行金黄色葡萄球菌抑菌试验，得到的结果如图5所示。从图中可以看出，mHA晶体粉末相对空白组(未添加mHA晶体粉末和纯HA晶体粉末的葡萄球菌)和纯HA组有明显抑菌作用(P<0.05，表示mHA晶体粉末相对空白组和纯HA组具有显著性差异)，且抑菌效果随Zn含量升高而增大。
实施例5
本实施例制备可分步降解的多功能高分子复合支架的步骤如下：
(1)配制前驱液
配制前驱液A：将100mL Yb(NO3)3水溶液【含Yb3+36mmol】，100mL Ho(NO3)3水溶液【含Ho3+4mmol】和100mL ZnSO4水溶液【含Zn2+4mmol】添加到1000mL浓度为0.2mol/L的Ca(NO3)2水溶液中，混合均匀得到前驱液A；
配制前驱液B：将100mL NaF水溶液【含F-4mmol】添加到1000mL浓度为0.12mol/L的Na3PO4水溶液中，混合均匀得到前驱液B；
(2)制备含2％Zn，18％Yb和2％Ho的mHA晶体粉末
在搅拌条件下，将前驱液B滴加到25℃的前驱液A中，滴加过程中通过添加NaOH溶液维持反应体系pH值为11，滴加结束后将所得悬浮液装入水热反应釜中，于120℃反应10h，然后将反应所得产物离心，离心所得沉淀用去离子水和乙醇依次充分清洗后，再将洗涤所得产物经冷冻干燥得到含Zn2+、Yb3+和Ho3+离子的mHA晶体粉末，其中Zn2+、Yb3+和Ho3+的物质的量分别是Ca2+物质的量的2％、18％和2％；
(3)配制mHA/PLGA-PCL三元复合体系
将2g聚乳酸-羧基乙酸共聚物与2g聚己内酯溶解到20mL三氟乙醇中，形成复合高分子基质体系；将6g mHA晶体粉末添加到所得复合高分子基质体系中并搅拌均匀得到mHA含量为60wt％的mHA/PLGA-PCL三元复合体系；
(4)制备多孔支架
本实施例采用的3D打印机为(型号3D Bioprinter V2.0,杭州Regenovo生物技术公司制造)。依据设计的模型尺寸设定3D打印机参数(喷嘴直径为0.22mm,打印单层厚度为0.1mm，层与层间采用45°交替打印，喷丝间距为0.5mm，喷头速度为5mm/s)，在室温下将配制好的mHA/PLGA-PCL三元复合体系装入打印机的料筒中，之后通过3D打印得到孔径为300～500μm、孔隙率＞70％的多孔支架；
(5)将得到的多孔支架淹没在促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液(溶液中的促红细胞生长素EPO和RGD多肽的质量分别是多孔支架质量的5％)静置12h，获得接枝了促红细胞生长素EPO和RGD多肽的高分子复合支架。

Claims (10)

1.一种可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)配制前驱液
配制前驱液A：将含Ln3+的溶液、含Zn2+的溶液与含Ca2+的溶液混合均匀得到前驱液A；所述前驱液A中，Ln3+、Zn2+、Ca2+的摩尔比为(1～20):(1～15):100；
配制前驱液B：将含F-的溶液与含PO4 3-的溶液混合均匀得到前驱液B；所述前驱液B中，F-与PO4 3-的摩尔比为(1.67～8.33):100；
(2)制备mHA晶体粉末
在搅拌条件下，将前驱液B滴加到25～70℃的前驱液A中形成反应体系，滴加过程中通过添加氨水或氢氧化钠溶液维持反应体系的pH值为9～11，滴加结束后于120～180℃反应6～10h，然后将反应所得产物进行固液分离，分离出的固体产物经洗涤、冷冻干燥得到mHA晶体粉末；所述反应体系中，Ca2+与PO4 3-的摩尔比为1.67；
(3)配制mHA/PLGA-PCL三元复合体系
将聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯溶解到有机溶剂中，形成复合高分子基质体系，所述复合高分子基质体系中，聚乳酸-羧基乙酸共聚物与聚己内酯的质量比为(1～2)：(2～1)；将mHA晶体粉末添加到所得复合高分子基质体系中并搅拌均匀得到mHA/PLGA-PCL三元复合体系，所述mHA/PLGA-PCL三元复合体系中mHA晶体粉末的质量分数为20～70％；
(4)制备多孔支架
将mHA/PLGA-PCL三元复合体系通过3D打印或溶剂发泡方式得到多孔支架；
(5)在多孔支架上接枝促红细胞生长素EPO和RGD多肽得到高分子复合支架。
2.根据权利要求1所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于所述Ln3+为Tb3+、Eu3+、Er3+、Dy3+、Yb3+和Ho3+中的一种或两种，所述含Ln3+的溶液为相应的硝酸盐、盐酸盐或硫酸盐水溶液。
3.根据权利要求1所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于所述含Zn2+的溶液为硝酸锌、氯化锌或硫酸锌水溶液。
4.根据权利要求1所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于所述含Ca2+的溶液为硝酸钙或氯化钙水溶液，溶液中Ca2+浓度为0.2～2mol/L。
5.根据权利要求1所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于所述含PO4 3-的溶液为磷酸钠或磷酸氢二铵水溶液，溶液中PO4 3-浓度为0.12～1.2mol/L，含F-的溶液为氟化钠或氟化铵水溶液。
6.根据权利1至5任一权利要求所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或三氟乙醇。
7.根据权利要求6所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于通过溶剂发泡方式得到多孔支架的实现方式为：向mHA/PLGA-PCL三元复合体系中加入NaCl颗粒并搅拌均匀，之后于30～50℃进行真空干燥使有机溶剂挥发，再对干燥所得固体利用去离子水洗涤去除NaCl颗粒即得到多孔支架。
8.根据权利要求6所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于步骤(5)是将步骤(4)得到的多孔支架放置于促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液中静置至少12h获得接枝了促红细胞生长素EPO和RGD多肽的高分子复合支架。
9.根据权利要求8所述可分步降解的多功能高分子复合支架的制备方法，其特征在于所述促红细胞生长素EPO和RGD多肽溶液中的促红细胞生长素EPO和RGD多肽的质量分别是置于溶液中多孔支架质量的1～5％。
10.权利要求1至9中任一权利要求所述方法制备得到的可分步降解的多功能高分子复合支架。
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