CN110898253B - 可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法。本发明中制备纤维内仿生矿化胶原膜具体是：配置胶原溶液；将胶原溶液倒入预制的模具中并放入密闭的含氨水的容器，中和后移出放入恒温箱继续培养，完成自组装并成为凝胶状；将所述的凝胶状进行交联，得到纯胶原凝胶；将纯胶原凝胶置于仿生矿化液中培养若干天，得到不同仿生矿化程度的胶原凝胶；将胶原凝胶进行降温，在冷冻干燥机中冻干得到最终的纤维内仿生矿化胶原膜。本发明的仿生矿化可以形成胶原纤维的纤维内矿化，在利用羟基磷灰石晶体的机械性能和生物性能的同时保留并利用了胶原膜的纤维网络结构。

Description

可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法

技术领域

本发明涉及一种胶原膜的制备方法，具体是一种可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化I型胶原膜的制备方法。

背景技术

口腔种植现在已经成为一个标准和常用的修复缺失牙的程序，但颌面部因创伤、肿瘤、牙周疾病等因素造成的骨量不足，一直是口腔种植和修复的挑战。因此也有很多方法试图解决这个问题，包括自体骨移植，牙槽嵴劈开和引导骨组织再生术(GBR)等等。其中，GBR是最常用的方法之一并且广泛应用于前牙区种植。GBR中需要骨替代材料联合屏障膜来阻挡快速增殖的上皮和结缔组织，以此保证成骨细胞生长和骨形成。目前，胶原膜因具有优越的生物相容性、可降解、不需二次手术取出而广泛应用。然而，胶原膜也有维持空间稳定性较差的不足，许多研究通过分子间和分子内的交联，静电纺丝制备聚合物膜和制备多层膜等试图改进，其中也包括在胶原中加入纳米钙磷材料。而羟基磷灰石(HAP)，是骨中发现的天然矿物，现在广泛应用于膜及支架类材料，胶原膜中加入矿物后可以提高其稳定性和骨诱导性能，HAP可以促进新骨形成和新形成骨的矿化。

膜中加入矿物的方法很多，包括将各种粒径的HAP纳米颗粒混合进入胶原基质溶液；混合HAP进入聚合物溶液后再进行静电纺丝；或者通过电镀沉积磷酸钙。然而，这些方法制备的胶原纤维形成的都是纤维外矿物。纤维外矿化可以对骨组织细胞外基质在化学组成和小部分结构上实现仿生，但是，这种方法制备的材料无法对骨组织基质在微观结构和形成过程以及微环境上获得真正的仿生。

生物矿化是矿物作为功能性和结构性部分整合进入有机体的现象，牙本质和骨组织是都是纳米磷灰石晶体组装在胶原上形成的混合系统，具有复杂和有序的多级有孔结构，目前认为在骨形成和牙本质发生过程中起调控作用的主要是非胶原蛋白(NCP)；生物矿化的另一个核心是纳米级无定形磷酸钙(ACP)，ACP是一种形成天然骨中矿物的含水的、非结构化的、不稳定的无定形前体，作为前驱体广泛存在于生物矿化过程中，通过矿化相关的蛋白可以调控ACP的尺寸以及相态，最后渗透到胶原纤维内部空间形成矿物。

因此，目前在体外模拟生物矿化的仿生矿化方式主要是利用非胶原蛋白的仿生物来调控合成并稳定ACP，从而使胶原纤维发生再矿化，其中，胶原纤维作为矿化的模板。通过对牙本质中的羟基磷灰石矿物研究发现，纤维内矿物是指沉积在胶原分子的空隙区域及其附近的羟基磷灰石，是ACP进入胶原后在胶原纤维内沿着胶原纤维长轴结晶及生长形成；而纤维外矿物是在胶原纤维表面以外，即胶原纤维之间的间隙内沉积的矿物。研究认为纤维外矿物的形成发生于纤维内矿化之后，纤维内矿物是维持胶原纤维机械强度和功能作用的基础，是判断胶原纤维矿化成功与否的标准。

发明内容

本发明的目的在于改进现有的材料，提供一种可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案是：

本发明首先合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液，利用该仿生矿化液进一步制备仿生矿化I型胶原膜。

所述的制备纤维内仿生矿化胶原膜具体是：

配置胶原溶液。

将胶原溶液倒入预制的模具中并放入密闭的含氨水的容器，中和后移出放入恒温箱继续培养，完成自组装并成为凝胶状。

将所述的凝胶状进行交联，得到纯胶原凝胶。

将纯胶原凝胶置于仿生矿化液中培养若干天，得到不同仿生矿化程度的胶原凝胶。

将胶原凝胶进行降温，在冷冻干燥机中冻干得到最终的纤维内仿生矿化胶原膜。

进一步说，所述的胶原溶液由小牛表皮冻干粉溶于乙酸溶液中配制而成。

进一步说，所述的乙酸溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为2.5。

进一步说，容器中氨水的质量浓度为1％，恒温箱温度为36～38℃。

进一步说，采用质量浓度为0.025％的戊二醛进行交联，交联时间为1小时。

进一步说，纯胶原凝胶置于仿生矿化液中于37℃培养若2天～4天。

进一步说，胶原凝胶按梯度进行降温，降温至-60℃。

本发明的有益效果：仿生矿化的胶原膜具有较好的生物相容性，具有良好的细胞黏附，仿生矿化可以形成胶原纤维的纤维内矿化，可以在利用羟基磷灰石晶体的机械性能和生物性能的同时保留并利用胶原膜的纤维网络结构。此外，仿生矿化的程度对胶原膜的性能有一定的影响，在维持胶原膜基本弹性的情况下，仿生矿化程度较高的膜，即具有较高结晶度和较高矿物含量的仿生矿化胶原膜，具有更好的机械强度和促进细胞成骨分化的作用，具有应用于引导骨组织再生中的潜力。

附图说明

图1A，图1E为纯胶原膜；

图1B，图1F为矿化2天的胶原膜；

图1C，图1G，图1H为矿化4天的胶原膜；

图1D为矿化4天胶原膜的实物照；

图2A为纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜的红外表征图；

图2B为纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜的热重分析图；

图3为纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜的应力-应变曲线；

图4为纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜上MC3T3-E1的增殖情况；

图5A为MC3T3-E1细胞在纯胶原膜初期黏附形态；

图5B为矿化2天胶原膜的初期黏附形态；

图5C为矿化4天胶原膜的初期黏附形态；

图6为MC3T3-E1在纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜上成骨诱导7天后的碱性磷酸酶活性图。

具体实施方式

本发明首先合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液，利用该仿生矿化液进一步制备仿生矿化I型胶原膜。

所述的合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液具体方法是：

用8～10g/L聚丙烯酸作为无定形磷酸钙的稳定剂，400mM谷氨酸溶液作为再矿化促进剂。在36～38℃下，使用0.1～0.2M、PH为9.5±0.1的磷酸氢二钠水溶液和0.2～0.3M氯化钙水溶液配成母液；采用50ml注射器在30～40分钟内将氯化钙水溶液按体积比1：1加入至磷酸氢二钠水溶液中，反应过程中采用磁力搅拌器搅拌，并使用0.1M氢氧化钠溶液调控PH保持在9.5±0.5区间；使得制备得的仿生矿化液中钙离子最终浓度为9.0～11.0mM，磷离子的最终浓度为5.0～7.0mM，谷氨酸的最终浓度为10～100mM。聚丙烯酸的最终浓度为300～400μg/mL。

所述的制备仿生矿化的I型胶原膜具体方法是：

将小牛表皮冻干粉溶于0.1mol/L乙酸溶液(pH＝2.5)中配制成3-5g/L的胶原溶液，于4℃储存24h备用且三月内有效。将胶原溶液倒入预制的模具中并放入密闭的含质量分数为1％氨水的容器，中和4h后移出放入36～38℃恒温箱继续培养20h，此过程中胶原完成自组装并成为凝胶状。为稳定胶原结构，用质量分数为0.025％戊二醛交联1h，至此，纯胶原凝胶制备完成。将纯胶原凝胶置于仿生矿化液中于37℃分别培养2天～4天，制备不同仿生矿化程度的胶原凝胶，将胶原凝胶梯度降温至-60℃，在冷冻干燥机中冻干48h，制备成膜。

实施例1：

(1)合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液具体方法是：

用8g/L聚丙烯酸作为无定形磷酸钙的稳定剂，400mM谷氨酸溶液作为再矿化促进剂。在36℃下，使用0.1M、PH为9.5±0.1的磷酸氢二钠水溶液和0.2M氯化钙水溶液配成母液；采用50ml注射器在30分钟内将氯化钙水溶液按体积比1：1加入至磷酸氢二钠水溶液中，反应过程中采用磁力搅拌器搅拌，并使用0.1M氢氧化钠溶液调控pH保持在9.5±0.5区间；使得制备得的仿生矿化液中钙离子最终浓度为9.0mM，磷离子的最终浓度为5.0mM，谷氨酸的最终浓度为10mM。聚丙烯酸的最终浓度为300μg/mL。

(2)制备仿生矿化的I型胶原膜具体是：

将小牛表皮冻干粉溶于0.1mol/L乙酸溶液(pH＝2.5)中配制成3-5g/L的胶原溶液，于4℃储存24h备用且三月内有效。将胶原溶液倒入预制的模具中并放入密闭的含质量分数为1％氨水的容器，中和4h后移出放入36℃恒温箱继续培养20h，此过程中胶原完成自组装并成为凝胶状。为稳定胶原结构，用质量分数为0.025％戊二醛交联1h，至此，纯胶原凝胶制备完成。将纯胶原凝胶置于仿生矿化液中于37℃分别培养2天，制备不同仿生矿化程度的胶原凝胶，将胶原凝胶梯度降温至-60℃，在冷冻干燥机中冻干48h，制备成膜。

实施例2：

(1)合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液具体方法是：

用9g/L聚丙烯酸作为无定形磷酸钙的稳定剂，400mM谷氨酸溶液作为再矿化促进剂。在37.5℃下，使用0.17M、PH为9.5±0.1的磷酸氢二钠水溶液和0.28M氯化钙水溶液配成母液；采用50ml注射器在37分钟内将氯化钙水溶液按体积比1：1加入至磷酸氢二钠水溶液中，反应过程中采用磁力搅拌器搅拌，并使用0.1M氢氧化钠溶液调控pH保持在9.5±0.5区间；使得制备得的仿生矿化液中钙离子最终浓度为10.0mM，磷离子的最终浓度为6.3mM，谷氨酸的最终浓度为75mM。聚丙烯酸的最终浓度为360μg/mL。

(2)制备仿生矿化的I型胶原膜具体是：

将小牛表皮冻干粉溶于0.1mol/L乙酸溶液(pH＝2.5)中配制成4.3g/L的胶原溶液，于4℃储存24h备用且三月内有效。将胶原溶液倒入预制的模具中并放入密闭的含质量分数为1％氨水的容器，中和4h后移出放入37.5℃恒温箱继续培养20h，此过程中胶原完成自组装并成为凝胶状。为稳定胶原结构，用质量分数为0.025％戊二醛交联1h，至此，纯胶原凝胶制备完成。将纯胶原凝胶置于仿生矿化液中于37℃分别培养3天，制备不同仿生矿化程度的胶原凝胶，将胶原凝胶梯度降温至-60℃，在冷冻干燥机中冻干48h，制备成膜。

实施例3：

(1)合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液具体方法是：

用10g/L聚丙烯酸作为无定形磷酸钙的稳定剂，400mM谷氨酸溶液作为再矿化促进剂。在38℃下，使用0.2M、PH为9.5±0.1的磷酸氢二钠水溶液和0.3M氯化钙水溶液配成母液；采用50ml注射器在40分钟内将氯化钙水溶液按体积比1：1加入至磷酸氢二钠水溶液中，反应过程中采用磁力搅拌器搅拌，并使用0.1M氢氧化钠溶液调控pH保持在9.5±0.5区间；使得制备得的仿生矿化液中钙离子最终浓度为11.0mM，磷离子的最终浓度为7.0mM，谷氨酸的最终浓度为100mM。聚丙烯酸的最终浓度为400μg/mL。

(2)制备仿生矿化的I型胶原膜具体是：

将小牛表皮冻干粉溶于0.1mol/L乙酸溶液(pH＝2.5)中配制成5g/L的胶原溶液，于4℃储存24h备用且三月内有效。将胶原溶液倒入预制的模具中并放入密闭的含质量分数为1％氨水的容器，中和4h后移出放入38℃恒温箱继续培养20h，此过程中胶原完成自组装并成为凝胶状。为稳定胶原结构，用质量分数为0.025％戊二醛交联1h，至此，纯胶原凝胶制备完成。将纯胶原凝胶置于仿生矿化液中于37℃分别培养4天，制备不同仿生矿化程度的胶原凝胶，将胶原凝胶梯度降温至-60℃，在冷冻干燥机中冻干48h，制备成膜。

申请人之前已经通过聚丙烯酸(PAA)成功合成并利用ACP使牙本质胶原纤维发生再矿化，后续也加入L-谷氨酸来调控ACP的尺寸以及促进纤维内矿化进程。在体外实验的细胞系选择上，目前，应用于骨组织工程研究中的细胞主要有骨髓间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞。其中破骨细胞多用于疾病及机制研究，较少应用于骨缺损修复。骨髓间充质干细胞是由骨髓和躯体组织前体细胞共同组成的具有多向分化潜能的细胞群，增殖能力强，加入诱导液后可定向分化为成骨细胞，但其在骨髓组织中含量较低，分离纯化技术存在很多不足，经大量传代以后，分化潜能大大降低，而成骨细胞取材容易，具有良好的增殖、分化及分泌能力，在体外持续传代20代以上仍可以保持良好的增殖分化能力，其分化产物及生化标志易于鉴定，某些分泌物已被作为骨代谢的标志物，与骨生长、塑性及骨吸收密切相关。

MC3T3-E1是C57BL6乳鼠源性的成骨细胞系，在某些物质的诱导下可分化为成骨细胞，是研究成骨细胞的良好模型。作为目前较公认的组织工程学中的种子细胞，已被广泛应用于体外成骨实验中。综上，本发明将较成熟的仿生矿化体系应用于矿化胶原膜的制备，并且评估不同矿化程度的胶原膜的性能，获得可体外促进MC3T3-E1细胞成骨分化的仿生矿化胶原膜材料，具有应用于引导骨组织再生和组织工程的潜力，为仿生矿化在骨组织修复中的应用提供了新的参考。

为了验证本发明所制备的纤维内仿生矿化胶原膜，本发明给出如下验证例：

图1A、图1E所示为纯胶原膜，图1B、图1F所示为矿化2天的胶原膜，图1C,图1G，图1H所示为矿化4天的胶原膜的超微结构；其中A,B,C,H为扫描电镜图，E,F,G为透射电镜图。图1D为矿化4天胶原膜的实物照，图1H为图1D纵截面图。

扫描图中可以看到三种膜都有致密的网状结构，纤维互相重叠和交织，并且仿生矿化膜保留了这种结构。在图1A的纯胶原膜组中可以看到胶原纤维典型的D周期，宽度为66±1.3nm。但在图1B和图1C的矿化胶原膜上因为纳米矿物复合体的结合导致这种条带结构消失了，这一现象与TEM观察结果是一致的。同样只在图1E中可以看到条带结构。另外，在图1F中展示的仿生矿化2天的胶原膜中，矿物沿胶原纤维的长轴生长；图1G展示的仿生矿化4天的胶原膜组中，胶原纤维的直径相较于纯胶原纤维的100nm增加到了200nm，这些都符合经典的仿生纤维内矿化特征。

FT-IR图谱如图2A所示，纯胶原膜在1650cm-1处，1550cm-1和1235cm-1处分别展现出了典型的酰胺I带，酰胺II带和酰胺III带。对于矿化胶原膜而言，除了上述典型的胶原峰值外，矿化2天胶原膜组在600cm-1处出现了一个肩形的峰，并且随着矿化程度的提高，在矿化4天胶原膜组中的600cm-1和560cm-1处劈裂为两个峰，这两个峰是PO₄ ^3-基团反对称弯曲振动产生的峰，是HAP的特征峰，图2A中由虚线框所示。这两个峰劈裂程度的加强表明了HAP结晶程度的提高。从图2B中可以看出，各组胶原膜在从室温到100℃时的重量下降是由于膜中物理结合的水的蒸发造成的。随后，在到600℃时，出现了较大的重量减轻，对应了膜中有机物的重量，即矿化2天胶原膜中的无机物含量为16.5％，而矿化4天胶原膜则为31.7％。

图3中所示为纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜的应力-应变曲线。相较于纯胶原膜，矿化胶原膜的弹性模量随着矿化程度的提高而提高，在最终的拉伸强度上，纯胶原膜组是3.84Mpa，矿化2天胶原膜组为3.14Mpa，而矿化4天胶原膜组表现出了最高的6.84Mpa。

图4中所示为纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜上MC3T3-E1的增殖情况，如图4所示，细胞在所有胶原膜上的7天培养中均表现出良好的活性，表明材料没有细胞毒性。

图5A、图5B、图5C中所示为MC3T3-E1细胞在纯胶原膜(A),矿化2天胶原膜(B)和矿化4天胶原膜(C)上的初期黏附形态。可看出在细胞黏附的第一天，三种膜上的细胞都表现出了良好的贴附形态，细胞形态伸展，有囊泡分泌，细胞中有伪足伸出。

图6中所示为MC3T3-E1在纯胶原膜，矿化2天胶原膜和矿化4天胶原膜上成骨诱导7天后的碱性磷酸酶活性。如图所示，矿化2天胶原膜组的ALP活性明显高于纯胶原组，而矿化4天胶原膜组的ALP活性最高，且两两之间的差异均具有统计学意义。因此，矿化的胶原膜可以促进细胞的成骨。

综上，本发明将较成熟的仿生矿化体系应用于矿化胶原膜的制备，并且评估不同矿化程度的胶原膜的性能，获得可体外促进MC3T3-E1细胞成骨分化的仿生矿化胶原膜材料，具有应用于引导骨组织再生和组织工程的潜力，为仿生矿化在骨组织修复中的应用提供了新的参考。

本说明书实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于上述实施方式所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。

Claims (7)

1.可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法，首先合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液，利用该仿生矿化液进一步制备纤维内仿生矿化胶原膜；

其特征在于：

所述的合成含无定形磷酸钙的仿生矿化液具体是：

用8～10 g/L聚丙烯酸作为无定形磷酸钙的稳定剂，400 mM谷氨酸溶液作为再矿化促进剂；在36～38℃下，使用0.1～0.2 M、PH为9.5±0.1的磷酸氢二钠水溶液和0.2～0.3 M氯化钙水溶液配成母液；采用50 ml注射器在30～40分钟内将氯化钙水溶液按体积比1：1加入至磷酸氢二钠水溶液中，反应过程中采用磁力搅拌器搅拌，并使用0.1 M 氢氧化钠溶液调控PH保持在 9.5±0.5 区间；使得制备得的仿生矿化液中钙离子最终浓度为9.0～11.0mM，磷离子的最终浓度为5.0～7.0 mM，谷氨酸的最终浓度为10～100 mM，聚丙烯酸的最终浓度为300～400 µg/mL；

所述的制备纤维内仿生矿化胶原膜具体是：

配置胶原溶液；

将胶原溶液倒入预制的模具中并放入密闭的含氨水的容器，中和后移出放入恒温箱继续培养，完成自组装并成为凝胶状；

将所述的凝胶状进行交联，得到纯胶原凝胶；

将纯胶原凝胶置于仿生矿化液中培养若干天，得到不同仿生矿化程度的胶原凝胶；

将胶原凝胶进行降温，在冷冻干燥机中冻干得到最终的纤维内仿生矿化胶原膜。

2.根据权利要求1所述的可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法，所述的胶原溶液由小牛表皮冻干粉溶于乙酸溶液中配制而成。

3.根据权利要求2所述的可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法，所述的乙酸溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为2.5。

4.根据权利要求1所述的可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法，容器中氨水的质量浓度为1%，恒温箱温度为36～38℃。

5.根据权利要求1所述的可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法，采用质量浓度为0.025%的戊二醛进行交联，交联时间为1小时。

6.根据权利要求1所述的可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法，纯胶原凝胶置于仿生矿化液中于37℃培养若2天～4天。

7.根据权利要求1所述的可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法，胶原凝胶按梯度进行降温，降温至-60℃。

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