CN115845138A - 一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料制备方法和应用，具体涉及生物医学工程技术领域。以动物松质骨作为原料，去除软组织，经过切割、第一次清洗、脱蛋白、煅烧后，再经pH调节、第二次清洗、冷冻干燥，得到TBC；将TBC灭菌，后浸泡于3SrCl2·6H2O溶液中振荡后，清洗、烘干，得TBC&Sr；将TBC和TBC&Sr分别浸泡在VEGF溶液中，反应后冻干，得TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF；将TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料采用γ射线灭菌；即得骨修复材料。本发明是通过TBC、Sr及VEGF的联合使用，可以在极大程度上避免免疫源性反应发生，使得具有抗骨质疏松作用的Sr与具有强成血管活性的VEGF结合，分别从抑制破骨，促进成骨和增强局部血运并促进细胞成骨分化的不同方面对骨缺损区域进行快速修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料制备方法和应用。
背景技术
尽管骨骼的自我愈合能力很强，但大面积的骨缺损会阻碍骨折的愈合。创伤性损伤、骨肿瘤切除或先天性的缺陷都会导致骨不连或大面积骨缺损，且修复效果与创伤严重程度、高龄、糖尿病等因素高度相关。目前，骨不连的常见治疗方法包括自体骨移植和同种异体骨移植，然而这些治疗方法在骨的修复和再生中都存在不少局限。自体骨移植的骨组织具有良好的组织相容性和非免疫原性，同时自体移植物中含有生长因子、骨祖细胞和三维基质，它们是骨诱导、骨传导和骨整合的重要组成部分。然而，自体骨移植存在一定的缺点，比如出血、炎症、感染和慢性疼痛，以及供体部位损伤和畸形、过敏、瘢痕等；此外，自体骨移植的来源有限，不能处理大面积的骨缺损。异体骨移植是治疗骨不连的另一常见治疗选择，但也有缺乏供体、病毒性疾病传播、细菌感染或免疫排斥等风险。自体移植和同种异体移植的这些局限性和缺点推动了骨组织工程骨再生方法的发展。组织工程和再生医学为损伤骨组织再生和愈合提供了更为先进的方法，通过骨组织工程制备的人工骨组织材料在骨缺损与骨不连的修复中取得了很大的进展。
细胞、生物活性因子及支架这“三要素”的研究已在骨组织工程中取得了前所未有的进展。目前大量不同种类的生物活性因子已经与支架材料联合应用与骨组织工程支架，但不同工艺制备出的骨组织工程材料具有不同的特点，根据加入的因子不同，支架通常具有不同的作用。骨组织工程的研究正如火如荼地进行，不同种类的支架层出不穷。
TBC是一种天然衍生的骨材料，它的主要成分是羟基磷灰石，其无机成分和牙齿十分相近。TBC具有多孔性，可为成骨细胞和骨髓间充质干细胞的体内外生存提供微环境，将其植入骨缺损部位能形成很好的骨结合。这种材料生物相容性极佳，因此可以选择TBC作为骨髓间充质干细胞的支架材料。但TBC的力学强度低、脆性大、整体比较松散、不能承重、缺乏骨诱导性，故通常只能研磨成粉末，仅仅作为天然骨形成的支架。高温处理的TBC作为骨移植支架材料与其他支架材料相比具有明显的优点：①TBC具有原骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，保留了原有自然骨的连续多孔结构，有利于组织的长入，并且有一定的强度，能够起支撑作用。②TBC可逐渐降解，有利于新骨的改建。③经高温煅烧后，可以彻底消除其免疫原性，生物相容性好。异种骨的免疫原性和诱导活性具有共同的物质基础，在消除其抗原性的同时亦使成骨物质诱导过程遭到破坏。因此，采用上述方法进行制备处理的单纯异种骨无法解决消除抗原性和保持诱导活性之间的矛盾，临床效果并不理想。
Sr是人体中重要的微量元素，主要存在于骨骼与牙齿内，而其中的99％均蓄积在骨骼，其质量约占骨总质量的万分之一。Sr在体内可有效降低破骨细胞来源并抑制其活性，从而抑制骨吸收；同时还可促进成骨细胞增殖，加速其分化过程，从而促进成骨。但Sr的以上作用均与其浓度有关，应在局部达到有效浓度，Sr才能充分发挥加速成骨细胞增殖及抑制骨吸收的生物活性，从而加速受损骨组织的修复，有效提高骨骼的强度与韧性。同时，亦有研究表明Sr还具有抗骨质疏松的作用。
研究证实VEGF能够促进内皮细胞增殖及血管形成来促进骨的发育，亦能够作用于骨髓间充质干细胞、成骨细胞及破骨细胞来参与骨代谢过程，与骨质疏松的发生及发展关系紧密。VEGF作为强有力的血管生成因子及有丝分裂原，能够通过与VEGFR-2及VEGFR-1相互协同来发挥调节内皮细胞活动作用，进而能够促进骨组织内血管网的生成，显著缩短骨折与骨缺损的愈合时间。
生物活性因子的加入虽能提高材料在骨缺损区的成骨特性，但活性因子的浓度及释放方式的不同会带来不同的副作用。例如：骨形态发生蛋白2(BMP2)的应用最为广泛，也最成熟。重组BMP2在保留天然BMP2成骨活性的前提下大大降低了其生产成本，为BMP2的应用提供了有利条件。目前，BMP2的应用主要是将BMP2与支架材料通过吸附作用进行复合，但这种材料在植入初期BMP2会迅速溶解出现爆发性释放，过快的扩散进入周围组织和全身，而非定向的作用于骨缺损修复区域，从而引起异位骨化、急性水肿、神经软组织炎性损伤、椎体骨溶解等问题，并有增加全身性疾病发病率的潜在风险。
发明内容
为此，本发明提供一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料制备方法和应用，以解决局部骨缺损难以愈合、愈合缓慢等问题，利用VEGF的成血管特点促进缺损区域血管新生并提供血运，同时充分利用Sr元素促进骨形成和抑制骨吸收的作用加速骨形成。
本发明使用TBC、Sr及VEGF制备一种既能促进血管生成又能促进骨缺损修复的骨组织工程材料。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明第一方面提供的一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，包括：
步骤一，TBC的制备
以动物的松质骨作为原料，去除软组织，经过切割、第一次清洗、脱蛋白、煅烧后，再经pH调节、第二次清洗、冷冻干燥，得到TBC；
步骤二，TBC&Sr的制备
将TBC灭菌，后浸泡于3SrCl2·6H2O溶液中振荡后，清洗、烘干，得TBC&Sr；
步骤三，TBC&Sr&VEGF的制备
将TBC和TBC&Sr分别浸泡在VEGF溶液中，反应后冻干，得TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF；
步骤四，灭菌
将TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料采用γ射线灭菌；即得促进血管再生的高成骨活性骨修复材料。
所述动物的松质骨可以选择牛松质骨、羊松质骨、猪松质骨等，其中牛松质骨效果最佳，本发明后续选用牛松质骨进行实验。
进一步的，所述步骤一中，脱蛋白的条件为1％TrintonX-100、3％H2O2。
进一步的，所述步骤一中，煅烧温度为600-1000℃，煅烧时间为6h。
进一步的，所述步骤二中，3SrCl2·6H2O溶液浓度为600μg/ml。
进一步的，所述步骤三中，VEGF溶液浓度为600μg/ml。
进一步的，所述步骤三中，反应条件为4℃过夜。
进一步的，所述步骤三中，γ射线灭菌是采用60Coγ射线灭菌，辐照剂量25kGy。
根据本发明第二方面提供的一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料，所述材料为TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF或TBC&Sr&VEGF。
根据本发明第三方面提供的一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料在制备骨修复产品中的应用。
本发明具有如下优点：
本发明首先制备含Sr的锻烧骨支架TBC&Sr，再与高纯度的VEGF进行重组，最终形成TBC&Sr&VEGF支架。本发明整合了临床骨科医生，长期从事材料、细胞、动物实验研究的科研人员，以及组织病理学技师、实验员、研究生的工作团队，明确了Sr元素与VEGF对早期骨吸收的干预作用，并揭示其机制，这将显著提高骨修复材料在骨组织修复中的成骨效率。奔赴吗制备出一种可以具有高效成骨活性的理想支架材料，实现加速骨缺损区域愈合的目的，同时最大可能地发挥Sr元素在骨修复过程中促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，从而达到VEGF与Sr协同成骨的目的。
本发明是通过TBC、Sr及VEGF的联合使用，可以在极大程度上避免免疫源性反应发生，使得具有抗骨质疏松作用的Sr与具有强成血管活性的VEGF结合，分别从抑制破骨，促进成骨和增强局部血运并促进细胞成骨分化的不同方面对骨缺损区域进行快速修复。
本发明所用的细胞活性因子与微量元素均在合适且可控的浓度范围内，不会在成骨过程中对组织产生毒副作用及不良反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实验例1提供的一种复合材料TBC&Sr&VEGF的大体外观图；
图2为本发明实验例1提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGFs四组材料的SEM电镜；
图3为本发明实验例1提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料的红外测定图；
图4为本发明实验例2提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料与细胞共培养3d后相对增值率测定图；
图5为本发明实验例2提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF与细胞共培养3d细胞活死图；
图6为本发明实验例2提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF与细胞共培养3d细胞SEM图；
其中，A-TBC；B-TBC&Sr；C-TBC&VEGF；D-TBC&Sr&VEGF；
图7为本发明实验例2提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料对细胞共培养7d碱性磷酸酶活性测定图；
图8为本发明实验例2提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料对细胞共培养7、14d碱性磷酸酶活性定量测定；
图9为本发明实验例3提供的8w的动物骨缺损修复模型Micro-CT；
其中，A-TBC；B-TBC&Sr；C-TBC&VEGF；D-TBC&Sr&VEGF；
图10为本发明实验例3提供的Micro-CT参数分析图：骨体积分数(BV/TV)；
图11为本发明实验例3提供的Micro-CT参数分析图：与骨小梁离散度(Tb.Sp)；
图12为本发明实验例3提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF的Masson染色；
图13为本发明实验例3提供的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF的荧光双标图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
TBC--锻烧骨：经高温锻烧处理动物骨所获得的无机材料，主要成分是羟基磷灰石，钙磷比接近于人骨，与人工合成羟基磷灰石相比，煅烧骨保留了天然骨的孔隙率、孔径大小、孔隙贯通等结构特点，而且制作成本低、方法简单。然而，锻烧骨由于高温处理使其失去了有机相的胶原，其力学强度下降，脆性增加，多数情况下只能作为充填材料
Sr--锶：具有促进骨形成和抑制骨吸收双重作用的元素，Sr是与钙元素同族的碱土金属元素，是人体骨中必需元素之一。
VEGF--血管内皮生长因子：又称血管通透因子(VPF)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
TBC&Sr—锻烧骨附载锶：经高温煅烧处理的锻烧骨保留了天然骨的孔隙率、孔径大小、孔隙贯通等结构特点，在锻烧骨作为填充材料的基础上，加入了具有促进骨形成和抑制骨吸收双重作用的锶元素。
TBC&VEGF--锻烧骨附载血管内皮生长因子：经高温煅烧处理的锻烧骨保留了天然骨的孔隙率、孔径大小、孔隙贯通等结构特点，在锻烧骨作为填充材料的基础上，加入了具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用的血管内皮生长因子。
TBC&Sr&VEGF--锻烧骨附载锶及血管内皮生长因子：经高温煅烧处理的锻烧骨保留了天然骨的孔隙率、孔径大小、孔隙贯通等结构特点，在锻烧骨作为填充材料的基础上，加入了具有促进骨形成和抑制骨吸收双重作用的锶元素，同时加入具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用的血管内皮生长因子，在发挥促成骨与抑制破骨的基础上，加速血管生成，促进骨愈合。
实施例1
本实施例提供一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备：
1.TBC的制备：
取新鲜的牛松质骨作为原料，去除软组织，加工成大小为5mm×5mm×2mm的松质骨块和直径7.5mm、长10mm的松质骨柱。经高压水枪和超声清洗，1％Trinton X-100、3％H2O2脱蛋白处理，重复清洗、干燥；置于马弗炉内程序高温煅烧6h，煅烧温度为600-1000℃，自然冷却至室温，调节pH为7.0-7.5，纯化水清洗，冷冻干燥，制备得TBC。
2.TBC&Sr的制备：
将灭菌后的TBC浸泡在无菌的浓度为600μg/ml的3SrCl2·6H2O溶液中振荡14d，纯化水清洗、烘干，获得TBC&Sr。
3.TBC&Sr&VEGF的制备：
将TBC和TBC&Sr浸泡在浓度为600μg/ml VEGF溶液中，4℃过夜，冻干，获得TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF。
4.制备材料的灭菌：
所得TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料采用60Coγ射线灭菌，辐照剂量25kGy，即得促进血管再生的高成骨活性骨修复材料TBC&Sr&VEGF材料。
实验例1
TBC&Sr&VEGF支架材料的性能表征：
1.TBC&Sr&VEGF材料理化特征的测定
1.1孔隙率测定
取已制备好的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料，计算体积(V＝a×b×c，式中，a表示长，b表示宽，c表示高)，将其放入有一定刻度的容器内(容器事先盛有一定体积的甘油)，这样可以得到前后变化的体积V1。孔隙率＝(1－V1/V)×100％，测量10例，取平均值，结果见表1。
表1
| TBC | TBC&Sr | TBC&VEGF | TBC&Sr&VEGF | |
| 平均值 | 64.2％±2.8％ | 62.2％±3.2％ | 62.1％±3.5％ | 61.9％±3.8％ |
结果表明，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料的孔隙率几乎相近，多元素材料孔隙率略小于单一元素孔隙率，孔隙率依次为：64.2％±2.8％，62.2％±3.2％，62.1％±3.5％，61.9％±3.8％。按程序制备的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF骨修复材料孔隙率类似天然骨组织，可进行下一步实验。
1.2孔径测定
已制备好的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料，材料表面喷金后，通过扫描电镜测量孔径大小。
结果如图1所示，为最终复合材料TBC&Sr&VEGF的大体外观观察，复合材料TBC&Sr&VEGF的大体外观呈现多孔结构，且孔径大小不均一；
图2为TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGFs四组材料的SEM电镜图；TBC组无离子与蛋白吸附，TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF组均可见离子或蛋白的吸附。
在定量实验中，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料的孔径几乎相近，孔径大小依次分别为：402.56±45.05μm，395.25±43.97μm，387.44±82.57μm，377.15±79.63μm。多元素材料孔径略小于单一元素孔径，孔径大小顺序依次为：TBC>TBC&Sr>TBC&VEGF>TBC&Sr&VEGF。
1.3材料的成分测定
已制备好的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料进行傅里叶红外分析。
结果如图3所示，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料的红外在2500cm-1处四条曲线有明显的波峰变化，该结果表明，所加元素已均匀分布且牢固连接在材料的相应位置。
1.4材料的骨块密度及抗压强度
已制备好的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料：
①脊骨两端部位骨块沿骨小梁方向加力与垂直骨小梁方向加力各10例。
②脊骨中间部位骨块沿骨小梁方向加力与垂直骨小梁方向加力各10例。
方法：用钢锉把骨块磨成规则的5mm×5mm×7mm长方体，测量质量，并在万能电子试验机上测定抗压强度，以2×102N/s的速度均匀加载，准确读取试样一次性破坏时的压力值，各测10例。
结果表明，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料的抗压程度不一，增加了Sr离子后，材料的抗压能力稍微增强，其抗压能力依次为：2.38±0.23MPa、2.65±0.33MPa、2.64±0.29MPa、2.71±0.34MPa。材料的抗压强度依次为：TBC&Sr&VEGF>TBC&Sr>TBC&VEGF>TBC。
1.5材料的因子释放速率测定
已制备好的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料放置在SBF模拟体液中进行孵育，在1，3，5，7，9，11，15d分别使用VEGF与Sr离子Elisa试剂盒进行浓度测定，判断离子的释放程度见表2。
表2
结果表明TBC&Sr&VEGF材料在模拟体液中确实存在缓慢释放现象，与以往材料的暴释情况相比，该种复合材料多样结合已明显减慢了因子的释放速率。同时Sr离子也在随时间推移缓慢释放，但前期TBC支架上的Sr离子保证在220ng/L的浓度，即不会影响支架在成骨中的协同作用。
实验例2
本试验例提供一种TBC&Sr&VEGF材料体外细胞实验：
2.1细胞相容性检测
利用骨髓间充质干细胞(BMSCs)评价材料的细胞相容性。BMSCs用含10％胎牛血清的α-MEM培养基常规培养。细胞80％融合时，加入0.25％胰酶进行消化，离心后用含10％胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为2×104/ml，分别接种到含TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料的12孔细胞培养板中，每孔接种2ml。
细胞和TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料分别联合培养1、3、5d后，弃去原培养基后，用PBS洗涤细胞1次，加入含10％CCK-8的α-MEM培养基。37℃孵育2h，将孵育液体转移至96孔板中，每孔100μl，450nm波长检测吸光度。
结果如图4所示，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料的相对增值率无论在1，3，5d，与空白板组相比，增值率均大于0.75，其中3天时，四组相对增值率依次为0.78、0.81、0.93和1.02，其促进细胞生长的趋势为TBC&Sr&VEGF>TBC&VEGF>TBC&Sr>TBC；加入了Sr及VEGF的材料组对细胞增殖的促进作用明显优于其他组。
2.2细胞活死染色实验:
将BMSCs细胞和TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料分别联合培养3d后，弃去原培养基后，用PBS洗涤细胞1次，使用细胞活死染色试剂对共培养支架进行染色，然后在荧光显微镜下观察。
结果如图5所示，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF与细胞共培养3d细胞活死拍照观察可见细胞数量TBC&Sr&VEGF>TBC&VEGF>TBC&Sr>TBC，证明VEGF和Sr离子有促进细胞增殖的作用，并且细胞形态均正常，无特异性改变。
2.3SEM观察：将BMSCs细胞和TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料分别联合培养3d，弃去原培养基后，用PBS洗涤细胞1次，2.5％戊二醛固定4h，冻干，喷金，SEM观察材料上细胞的黏附状态。
结果如图6表明，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF与细胞共培养3d细胞SEM拍照观察均可见细胞在支架上正常生长、黏附，且细胞形态无变化，且稳定附着；加入了VEGF组表现出细胞增殖生长的效益明显提高。
2.4细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性
将BMSCs细胞和TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料分别联合培养7、14d后，弃原培养基，PBS冲洗细胞1次，裂解细胞，用ALP试剂盒进行染色，并对ALP进行定量检测。
结果如图7所示，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料对碱性磷酸酶活性在7d的表达有促进作用，其中促进作用的强度依次为：TBC&Sr&VEGF>TBC&VEGF>TBC&Sr>TBC；
结果如图8所示，TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料对碱性磷酸酶活性在7、14d的定量表达均有促进作用。同时在加入了VEGF的材料组，即TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF组，碱性磷酸酶活性尤为明显，说明本发明所述的材料前期确实可通过碱性磷酸酶的作用来促进成骨。
实验例3
本试验例提供TBC&Sr&VEGF材料体内动物实验：
3.1兔股骨缺损修复评价
按程序制备TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF骨修复材料。分别进行兔双侧股骨髁缺损修复实验。新西兰大耳兔麻醉成功后，仰卧固定于手术台上，常规备皮、消毒、铺无菌洞巾。选取后肢股骨髁外侧纵行切口，分离软组织，用骨膜剥离器尽量剥离骨膜，显露股骨髁，以微型钻于股骨髁中部钻出直径5mm的圆孔，深度10mm。冲洗手术区域，制成骨缺损模型。将复合材料用生理盐水混合后植入实验兔的骨缺损处，庆大霉素注射液8万单位冲洗切口，逐层缝合，覆盖材料和伤口。同时还需保留骨缺损模型空白实验组作为对照。术后连续注射青霉素5天。术后4、8周分别取材观察。
观察指标：
大体观察：观察术后动物伤口有无肿胀、发红及分泌物，处死动物后观察植骨区有无炎性反应。
微观形态学观察：取材后材料用4％多聚甲醛固定，使用microCT对材料进行扫描，建模，进行定量分析。
结果如图9所示，在8w的动物骨缺损修复模型中，负载了Sr离子与VEGF的TBC材料均可对骨修复进展产生促进作用。
如图10、图11，即为骨体积分数(BV/TV)与骨小梁离散度(Tb.Sp)定量分析，该结果表明Sr与VEGF在成骨过程中确实产生了协同作用。四种材料的骨修复促进作用效益TBC&Sr&VEGF>TBC&VEGF>TBC&Sr>TBC。
组织形态学观察：部分骨组织不进行脱钙处理，用硬组织切片机切片，予以Masson染色进行组织形态学观察。部分骨组织进行脱钙处理，选用石蜡切片，Masson染色观察。显微镜下观察植入材料区域胶原与新骨生成情况。结果如图12所示，按程序制备的TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF骨修复材料在植入兔股骨缺损模型8w后，Masson染色上均可见稳定的修复。且就修复厚度与修复区域大小而言，修复效果HA&Cu&BMP2>HA&BMP2>HA&Cu>HA。
动物在取材前7天分别行皮下注射钙黄绿素荧光标记液，4天后再次标记，每次注射量为10mg/kg。矿化沉积率，即每天骨矿化再生的速率，为两条钙黄绿素标记线之间的平均距离除以间隔天数。
图13为各组对应的荧光双标图，在荧光显微镜下各标本中均可见黄绿色标记。所有材料组均出现了不同程度的颜色弥散，但弥散程度趋势为：TBC&Sr&VEGF>TBC&VEGF>TBC&Sr>TBC，该结果表明我们研制的复合材料组，即TBC&Sr&VEGF组的每日骨矿化再生速率最佳。
本发明首先制备含Sr的锻烧骨支架TBC&Sr，再与高纯度的VEGF进行重组，最终形成TBC&Sr&VEGF支架。经过体外材料学实验检验活性因子和Sr元素的缓释曲线，模拟体液中的矿化，用细胞实验评价不同含Sr浓度材料对成骨细胞和破骨细胞的作用效果和机制，通过裸鼠体内的骨诱导活性实验评价该材料骨诱导活性的干预效果及规律，最终选用新西兰兔进行体内骨缺损修复的效果评估。本发明整合了临床骨科医生，长期从事材料、细胞、动物实验研究的科研人员，以及组织病理学技师、实验员、研究生的工作团队，有望明确Sr元素与VEGF对早期骨吸收的干预作用，并揭示其机制，这将有望显著提高骨修复材料在骨组织修复中的成骨效率。最重要的是制备出一种可以具有高效成骨活性的理想支架材料，实现加速骨缺损区域愈合的目的，同时最大可能地发挥Sr元素在骨修复过程中促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，从而达到VEGF与Sr协同成骨的目的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一，TBC的制备
以动物的松质骨作为原料，去除软组织，经过切割、第一次清洗、脱蛋白、煅烧后，再经pH调节、第二次清洗、冷冻干燥，得到TBC；
步骤二，TBC&Sr的制备
将TBC灭菌，后浸泡于3SrCl2·6H2O溶液中振荡后，清洗、烘干，得TBC&Sr；
步骤三，TBC&Sr&VEGF的制备
将TBC和TBC&Sr分别浸泡在VEGF溶液中，反应后冻干，得TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF；
步骤四，灭菌
将TBC、TBC&Sr、TBC&VEGF和TBC&Sr&VEGF材料采用γ射线灭菌；即得促进血管再生的高成骨活性骨修复材料。
2.根据权利要求1所述一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，脱蛋白的条件为1％TrintonX-100、3％H2O2。
3.根据权利要求1所述一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，煅烧温度为600-1000℃，煅烧时间为6h。
4.根据权利要求1所述一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，3SrCl2·6H2O溶液浓度为600μg/ml。
5.根据权利要求1所述一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，VEGF溶液浓度为600μg/ml。
6.根据权利要求1所述一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，反应条件为4℃过夜。
7.根据权利要求1所述一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，γ射线灭菌是采用60Coγ射线灭菌，辐照剂量25kGy。
8.一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料，其特征在于，所述材料为TBC&Sr&VEGF。
9.一种促进血管再生的高成骨活性骨修复材料在制备骨修复产品中的应用。
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