CN111574816A - 高强度生物医用水凝胶材料及浴支撑水凝胶3d打印方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高强度生物医用水凝胶材料，是由以下重量份的组分制成：FDA15～40份，功能化生物医用大分子0～15份，引发剂0.05～0.3份，水20～200份。本发明还公开了采用所述高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法，本发明中水凝胶组分和打印方法具有良好的生物相容性，可作为支架材料用于细胞的培养，在药物缓释、组织修复等领域具有重大潜在应用。

Description

高强度生物医用水凝胶材料及浴支撑水凝胶3D打印方法
技术领域
本发明属于生物医用水凝胶及3D打印技术领域，具体地说，涉及一种高强度生物医用水凝胶材料及浴支撑水凝胶3D打印方法。
背景技术
水凝胶由于生物物理性质接近人体的软组织、具有优异的生物相容性及可加工性在生物医药、组织工程及再生医学领域有着广阔的应用前景。虽然截止目前相关科研论文不断增多，但是能实现真正实际应用的却寥寥无几。究其原因，相比人体组织，天然和人工的水凝胶在机械强度、生物相容性及加工精度等方面存在诸多不尽人意的地方，从而极大地限制了其实际应用。
PluonicF127是一种温敏性三嵌段聚合物，在一定温度下分子可以通过亲疏水相互作用自组装形成胶束，其可逆的自组装性能可以为外力作用下的水凝胶提供能量耗散，从而增强水凝胶的机械性能。比如：Okay等人提出在物理缠绕的Pluonic网络中添加一重由丙烯酸酯单体引发聚合而成的互穿网络来提高水凝胶的韧性(Polymer,2013,54(12)，2979-2987)。付俊等人提出在Pluonic分子两端修饰双键(F127DA)，并以此双键功能化的纳米胶束作为交联剂引发丙烯酸酯单体的共交联来得到拉伸和压缩性能优异的水凝胶(Chemical Communication,2015,51(40)，8512-8515)。虽然这些水凝胶的机械性能得到了大幅提升，但是水凝胶网络中因残留聚合不完全的小分子单体而缺乏生物相容性，从而限制了其作为生物墨水的可能。
除了机械强度问题，水凝胶实现应用的另一个关键科学问题是水凝胶的成型加工。随着组织工程领域的不断发展，以3D打印为代表的增材制造方法引起了临床医生和科学家们的广泛关注。3D打印技术可以通过结合计算机数据模型，能同时满足材料宏观和微观的结构需求，适应个性化定制，在组织工程中具有极大的优势。实现水凝胶的3D打印除了要求水凝胶具有适当的机械性能以确保打印前后的结构稳定性外，对3D打印技术也提出了更高的要求。然而现有的打印技术对水凝胶墨水的机械和化学性质以及可打印的结构存在诸多限制。最近，Adam W.Feinberg课题报道了一种自由可逆嵌入打印技术(Freeformreversible embedding of suspended hydrogels,FRESH)，可以将传统生物墨水直接打印到明胶微球的物理支撑浴中从而维持打印材料的微观结构。该方法不仅可以实现软材料如蛋白和多糖类水凝胶的打印，而且可以用于打印复杂的生理结构。然而，该方法中明胶微球支撑浴的制作比较繁琐，而且由于明胶微球的颗粒不均匀，打印结构的精细度也受到了限制(Science Advances.2015,1(9)，e1500758)。
综上，力学性能、生物相容性以及3D可打印对于设计水凝胶支架并促进其在生物医药领域的应用尤为重要，开发出力学性能优异、生物相容性好，并能实现复杂、精密结构的生物墨水和3D打印方法，成为将水凝胶拓展到实际生物医用领域的关键点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高强度生物医用水凝胶材料。
本发明的第二个目的是提供一种采用所述高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种高强度生物医用水凝胶材料，是由以下重量份的组分制成：
FDA 15～40份，功能化生物医用大分子0～15份，引发剂0.05～0.3份，水20～200份。
优选的，所述高强度生物医用水凝胶材料是由以下重量份的组分制成：
FDA 15～30份，功能化生物医用大分子1～5份，引发剂0.1～0.2份，水20～200份。
所述FDA为丙烯酸酯功能化的普朗尼克，具体是由普朗尼克与过量丙烯酰氯经过酯化反应制得，优选为两端均是丙烯酸酯功能化的产物；所述普朗尼克(又名泊洛沙姆，Poloxamer)为聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物，具体选自牌号为F68(巴斯夫)、F77(巴斯夫)、F108(Sigma Aldrich)、F127(Sigma Aldrich)的商用产品。
所述FDA的制备方法包括以下步骤：将普朗尼克(选自牌号为F68(巴斯夫)、F77(巴斯夫)、F108(Sigma Aldrich)、F127(Sigma Aldrich)的商用产品)和过量的三乙胺溶解在无水二氯甲烷中，氮气保护下，冷却反应体系至0℃，缓慢滴加过量的丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完后，升温至常温下继续反应，反应结束后，水洗，有机相干燥，于无水乙醚中重沉淀，得到FDA。
所述功能化生物医用大分子是可通过光引发或离子络合进一步交联的生物大分子，选自丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯功能化的生物医用大分子、可与离子络合的糖类大分子等；所述丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯功能化的生物医用大分子是通过大分子与丙烯酸酐混合反应制得，优选为丙烯酸酯功能化的透明质酸(HAMA)、丙烯酸酯功能化的明胶(GelMA)、丙烯酸酯功能化的葡聚糖(DexMA)、丙烯酸酯功能化的壳聚糖(CsMA)、丙烯酸酯功能化的胶原(ColMA)、丙烯酸酯功能化的纤维素(CelMA)、丙烯酸酯功能化的硫酸软骨素(ChSMA)等；所述可与离子络合的糖类大分子为可与钙离子交联的海藻酸钠(Alg)。
所述丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯功能化的生物医用大分子的制备方法包括以下步骤：
将生物医用大分子溶解于溶剂(水或杜氏磷酸缓冲液(D-PBS))中，在温度为0～80℃的条件下加入过量的酸酐，继续反应，然后将反应液透析2～6天，冷冻干燥获得所述丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯功能化的生物医用大分子。
所述加入酸酐后，根据需要加入过量的碱，如氢氧化钠。
所述生物医用大分子为透明质酸、明胶、葡聚糖、壳聚糖、胶原、纤维素、硫酸软骨素。
所述酸酐为甲基丙烯酸酐或丙烯酸酐。
所述引发剂为商业光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959，Sigma Aldrich)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP，Sigma Aldrich)中的至少一种。
本发明的第二方面提供了一种所述高强度生物医用水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：按照所述配比将FDA、水混合，加入功能化生物医用大分子，低温混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，得到水凝胶前体溶液，然后加入引发剂，LED光或加入离子引发原位交联，获得所述高强度生物医用水凝胶材料。
本发明的第三方面提供了一种采用所述高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法，包括以下步骤：
第一步，使用Solidworks软件建立STL格式的三维打印模型，然后将待打印模型导入到Bioplotter RP切片软件进行分层处理，最后使用3D生物打印机控制软件VisualMachines进行打印，将未交联的高强度生物医用水凝胶材料置于3D打印机挤出头中，设置打印参数，在恒温普朗尼克水凝胶支撑浴中进行直接打印，使用内径为50～300μm点胶针头进行打印，打印材料温度为20～37℃，挤出压力为0.2～10bar，打印速度为4～35mm/s；
第二步，3D样品打印完成后，用LED光或普朗尼克水凝胶支撑浴中离子进行水凝胶交联固化；
第三步，待普朗尼克水凝胶支撑浴温度降温至4℃以下使普朗尼克水凝胶支撑浴解组装呈液态，取出打印好的样品，PBS多次洗涤，获得浴支撑水凝胶模型。
所述打印机采用挤出型生物3D打印机。
所述3D打印过程温度优选为20～37℃。
所述普朗尼克水凝胶支撑浴的制备方法包括以下步骤：冰浴条件下，普朗尼克溶解在去离子水或含有钙离子的溶液中，多次涡旋振荡完全溶解，配成固含为20％～40％的普朗尼克溶液，获得所述普朗尼克水凝胶支撑浴。
所述含有钙离子的溶液选自浓度为0.01～0.2mM mL-1的CaCO3溶液、葡萄糖酸内酯缓释液、CaCl2水溶液中的一种。
所述LED光为紫外光，波长为365nm、光强度为10mW cm-2；或可见光，波长为395nm、光强度为10mW cm-2。
所述高强度生物医用水凝胶材料在打印时可以选用不同种类的材料同时打印。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
为了提高水凝胶的力学性能，同时实现高精度、复杂结构的3D打印，本发明提供的高强度生物医用水凝胶材料，以兼具温敏、光敏的FDA为主要组分，通过与其它功能化的生物医用大分子共混，以此共交联制备了一种具有良好力学性能的生物医用水凝胶材料；普朗尼克胶束型自组装机制可为外力作用下的水凝胶提供能量耗散，由此解决传统水凝胶力学强度差、不易成型的问题。并进一步提供一种3D打印方法，以胶束型自组装的普朗尼克作为浴支撑实现水凝胶高精度、复杂结构的3D打印。该方法利用普朗尼克可在一定温度下自组装并在较高剪切应力下表现为粘性流体的特性，实现墨水简易、稳定、高精度的打印与复杂结构支撑，待水凝胶进一步交联固化后，即可通过降温使普朗尼克解组装释放打印的3D水凝胶，由此解决现有水凝胶3D打印技术中的低精度和复杂悬空结构不易打印的技术问题。
本发明以生物医用大分子为水凝胶骨架，避免以往使用小分子单体所带来的潜在毒性，通过组合非共价和共价交联实现水凝胶力学性能的提高，同时应用一种新的浴支撑打印方法实现这类水凝胶精细、复杂结构的3D打印。
本发明的采用所述高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法，根据普朗尼克温敏、可逆胶束组装，在低剪切应力下表现为刚性，但在较高剪切应力下表现为粘性流体的特征，使打印针头在支撑浴中移动时几乎没有机械阻力，并且能够快速发生自愈合，从而实现高精度、保持结构的复杂打印。打印精度最优可达20μm，与计算机模型具有良好的匹配度，可实现多材料的同时打印。此外，这种浴支撑水凝胶为打印墨水提供了一个物理包埋空间，阻止了氧气的渗入，避免了传统光固化水凝胶氧阻聚的问题。
本发明中水凝胶组分和打印方法具有良好的生物相容性，可作为支架材料用于细胞的培养，在药物缓释、组织修复等领域具有重大潜在应用。
本发明根据普朗尼克可逆胶束组装原理，可为外力作用下的水凝胶提供能量耗散，从而增强水凝胶的力学性能，其压缩断裂应力最高可达10MPa以上，压缩模量最高可达1.5MPa，拉伸断裂应力最高可达2.5MPa。
本发明利用功能化的生物大分子为水凝胶打印材料，以温敏的普朗尼克为打印浴支撑，打印后以光照或离子络合为交联固化方法，打印得到的水凝胶结构稳定、方法简单、精细度高，可连续、稳定、均匀打印复杂三维形状水凝胶模型。
本发明利用Pluronic支撑浴低温溶化特性实现打印水凝胶模型的分离，利用Pluonic温敏特性为打印墨水提供了一个物理包埋空间，阻止了氧气的渗入，避免了传统光固化水凝胶氧阻聚的问题。利用功能化的生物大分子为水凝胶打印材料，以温敏的Pluronic为打印支撑，打印后以光照或离子络合为交联固化方法，打印得到的水凝胶模型结构稳定、方法简单、精细度高，可连续、稳定、均匀打印复杂圆孔三维形状的水凝胶模型。
附图说明
图1为实施例1制备的FDA-HAMA水凝胶压缩(a)、拉伸(b)应力应变曲线示意图。
图2为实施例2采用FDA-HAMA水凝胶3D打印人耳模型的示意图。
图3是实施例2采用FDA-HAMA水凝胶3D打印人耳模型的示意图。
图4为实施例4FDA-HAMA 3D打印FDA-HAMA水凝胶模型的精细度调控示意图：a)60μm，b)90μm，c)210μm针头。
图5为实施例5中多种墨水复杂3D打印水凝胶模型的示意图。
图6为实施例6中采用浴支撑水凝胶3D打印方法打印的水凝胶支架用于MC3T3细胞共培养的示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明实施例中透明质酸(hyaluronic acid，HA，48kDa)购于山东福瑞达医药公司；海藻酸钠、明胶、普朗尼克F127、普朗尼克F108、光引发剂2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)、光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)、杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)、鼠尾胶原(Collagen)和胎牛血清(FBS)购于Sigma Aldrich。普朗尼克F77购买于巴斯夫，葡聚糖、壳聚糖、纤维素、明胶、硫酸软骨素、三乙胺、氢氧化钠、二氯甲烷、丙烯酰氯、甲基丙烯酸酐均从阿拉丁上购买。化学试剂均为分析纯，无需进一步纯化。本发明中所用小鼠成纤维细胞NIH-3T3细胞购买于中国科学院细胞库。
实施例1
F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶材料的制备方法包括以下步骤：
第一步，F127DA的合成：将10g普朗尼克F127和5倍摩尔当量的三乙胺溶解在100mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，冷却反应体系至0℃，缓慢滴加含5倍摩尔当量丙烯酰氯的二氯甲烷溶液(5mL)，滴加完后，升温至常温下继续反应24h，反应结束后，水洗，有机相干燥，于无水乙醚中重沉淀，得白色粉末产物即F127DA。
第二步，HAMA的合成：将2g透明质酸通过机械搅拌溶解在100mL水中，并冷却至0℃，加入12mL甲基丙烯酸酐混合均匀，缓慢滴加6mL 5M NaOH水溶液，保持0℃下继续反应24h，反应后的溶液透析4天(MWCO 3500，
Figure BDA0002469685660000061
)，冷冻干燥得到取代度为25％的HAMA，产品-20℃保存。
第三步：F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶材料的制备：称取200mg F127DA(第一步制备)溶解在1mL冰水中，配成固含为20％的F127DA水溶液(w/v)，称取20mg HAMA(第二步制备)溶解在上述溶液中，低温混合并涡旋分散(温度为0℃)，混合均匀后通氮气除氧，配成最终固含为22％的水凝胶前体溶液，加入1.5mg光引发剂LAP，用手持LED 365nm(10mWcm-2)光照交联成胶，时间为1min，获得F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶材料。
图1为实施例1制备的FDA-HAMA水凝胶压缩(a)、拉伸(b)应力应变曲线示意图。从图1中可以看出，F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶材料的性能如下：a)其压缩断裂应力最高可达10MPa以上，b)压缩模量最高可达1.5MPa，拉伸断裂应力最高可达2.5MPa。这充分说明FDA-HAMA水凝胶中F127DA网络与HAMA网络形成了杂化共交联，从而大大提高了水凝胶的弹性。具体测试方法：使用量程为100N的GT-TCS-2000双轴装置对水凝胶进行力学试验，对长方形水凝胶样品(3.85×20×0.75mm)进行拉伸实验，并以10mm min-1的速率拉伸样品直至将其拉断；对圆柱形水凝胶样品(直径10mm、高3mm，压缩速度0.5mm min-1)进行压缩和循环压缩试验。根据20-30％应变范围内的应力-应变曲线计算水凝胶拉伸模量和压缩模量。
实施例2
F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水用于3D打印人器官模型：
第一步，F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水的制备：称取200mg F127DA溶解在1mL冰水中，配成固含为20％的F127DA水溶液(w/v)，称取20mg HAMA溶解在上述溶液中，低温混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，配成最终固含为22％的水凝胶前体溶液，加入1.5mg光引发剂LAP，低温保存备用，获得F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水。
第二步，F127水凝胶支撑浴的配制：称取40g普朗尼克F127粉末溶解在120mL去离子水中，于冰浴条件下多次涡旋振荡使得普朗尼克F127粉末完全溶解，配成固含为33％的普朗尼克F127溶液，4℃保存备用，获得F127水凝胶支撑浴。
第三步，3D打印：3D打印是一种基于计算机辅助设计(CAD)的快速成型技术。使用Solidworks软件建立STL格式的三维打印模型，该格式以三角面片的形式拟合模型的表面信息，并记录相应的坐标信息；在3D打印设备中，STL文件所包含的三维模型通过BioplotterRP切片软件分层处理，以固定高度被分割成一系列二维的水平截面，然后每一层二维截面生成相应的打印路径，以G代码的形式储存成可打印文件；最后使用3D生物打印机控制软件Visual Machines进行打印。具体的打印方法：将第一步制备的F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水置于3D生物打印机挤出头中，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，将第二步制备的F127水凝胶支撑浴置于玻璃皿中，在恒温F127水凝胶支撑浴中进行直接打印，打印温度稳定在26±2℃，打印机采用挤出型生物3D打印机，使用内径为160μm点胶针头进行打印，打印材料温度为37℃，挤出压力为1.7～2.5bar，打印速度为4～6mm/s；3D样品打印完成后，用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min，然后将F127水凝胶支撑浴温度降至4℃以下，待F127水凝胶支撑浴呈液态，将打印好的样品轻轻取出，并放置于培养皿中，PBS多次洗涤，获得浴支撑水凝胶耳朵模型。
图2为实施例2采用FDA-HAMA水凝胶3D打印人耳模型的示意图。从图2中可以看出，a)CT扫描真实的耳朵，b)三维耳朵模型的建立和切片，c)利用生物打印机进行浴支撑打印，由于普朗尼克F127的温敏自组装特性使得双组分水凝胶前体溶液在F127水凝胶支撑浴中原位挤出成型，d)光照固化(365nm，10mW/cm2，光照时间1min)后的打印成品通过4℃冷却，从F127水凝胶支撑浴中取出。打印后的耳朵结构与模型结构相对比，整体的打印结构具有极高的分辨率和保真度，说明F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水能够满足3D复杂结构打印的需求，为水凝胶在生物打印领域提供了新的材料。
图3是实施例2采用FDA-HAMA水凝胶3D打印人耳模型的示意图。图中，1)利用生物打印机进行浴支撑打印，2)由于普朗尼克F127的温敏性使得双组分水凝胶在F127水凝胶支撑浴中原位挤出成型，3)光照固化(365nm，10mW/cm2，光照时间1min)后的打印耳朵模型通过4℃冷却，并从F127水凝胶支撑浴中取出，通过物理和化学共交联构建一类新型温敏-光固化水凝胶(FDA-HAMA)，能够满足3D复杂结构打印的需求，为水凝胶在生物打印领域提供了新的材料。
实施例3
FDA-Alg高强度生物医用水凝胶墨水用于3D打印血管模型：
第一步，FDA-Alg高强度生物医用水凝胶墨水的制备：称取200mg F127DA(实施例1第一步制备得到)溶解在1mL冰水中，配成固含为20％的F127DA水溶液(w/v)，称取20mg Alg溶解在上述溶液中，低温混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，配成最终固含为22％的水凝胶前体溶液，加入1.5mg光引发剂LAP，低温保存备用，获得FDA-Alg高强度生物医用水凝胶墨水。
第二步，F127水凝胶支撑浴的配制：称取40g普朗尼克F127粉末溶解在120mL浓度为0.1mM mL-1的CaCl2水溶液中，于冰浴条件下多次涡旋振荡使得普朗尼克F127粉末完全溶解，配成固含为33％的Pluronic溶液，4℃保存备用，获得F127水凝胶支撑浴。
第三步，3D打印：使用Solidworks软件建立STL格式的三维打印模型，然后将血管模型导入到Bioplotter RP切片软件进行分层处理，最后使用3D生物打印机控制软件Visual Machines进行打印，具体的打印方法：将FDA-Alg高强度生物医用水凝胶墨水置于3D生物打印机挤出头中，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，将第二步制备的F127水凝胶支撑浴置于玻璃皿中，在恒温F127水凝胶支撑浴中进行直接打印，打印温度稳定在26±2℃，打印机采用挤出型生物3D打印机，使用内径为160μm点胶针头进行打印，挤出压力为0.2～0.4bar，打印速度为7～10mm/s；3D样品打印完成后，用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min，然后将F127水凝胶支撑浴温度降至4℃以下，待F127水凝胶支撑浴呈液态，将打印好的样品轻轻取出，并放置于培养皿中，PBS多次洗涤，获得浴支撑水凝胶模型。打印同时利用支撑浴中溶解的Ca2+离子进行海藻酸钠交联，钙离子-海藻酸钠和F127DA网络形成双网络结构，增强了水凝胶的机械性能。通过离子和共价化学双交联而成的水凝胶血管模型保持了优异的结构稳定性，并且管壁光滑，管腔中间保持通透，拓宽水凝胶软材料在组织工程的应用。
实施例4
采用实施例2制备的F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水3D打印的精细度调控：
60μm针头(34G)FDA-HAMA打印参数：装上上述F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，使用内径为60μm点胶针头进行打印，打印温度控制在26±2℃，挤出压力为4.2～4.9bar，打印速度为18～23mm/s，打印完成后使用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min，打印出直径为20μm的F127DA纤维线。
90μm针头(32G)FDA-HAMA打印参数：装上上述F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，使用内径为90μm点胶针头进行打印，打印时室温稳定在26±2℃，挤出压力为5-5.7bar，打印速度为18～23mm/s，打印完成后使用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min，打印出直径为60μm的F127DA纤维线。
210μm针头(27G)FDA-HAMA打印参数：装上上述F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，使用内径为210μm点胶针头进行打印，打印时室温稳定在26±2℃，挤出压力为2-2.8bar，打印速度为18～23mm/s，打印完成后使用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min，打印出直径为120μm的F127DA纤维线。
图4为实施例4FDA-HAMA 3D打印FDA-HAMA水凝胶模型的精细度调控示意图：a)60μm，b)90μm，c)210μm针头。从图4中可以看出，a)使用34G(直径60μm)号打印针头打印出直径为20μm的F127DA纤维线。b)使用32G(直径90μm)号打印针头打印出直径为60μm的F127DA纤维线。c)使用27G(直径210μm)号打印针头打印出直径为120μm的F127DA纤维线。说明通过调控打印参数可以实现高分辨率打印，其中F127DA的打印最高线条精度可达20μm。
实施例5
复杂结构和不同组分水凝胶3D打印
将实施例2制备的F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水和实施例3制备的FDA-Alg高强度生物医用水凝胶墨水，分别装在不同打印料筒中，使用Solidworks软件建立STL格式的三维打印模型，然后将模型导入到Bioplotter RP切片软件进行分层处理，最后使用3D生物打印机控制软件Visual Machines进行打印，具体的打印方法：将实施例2制备的F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水和实施例3制备的FDA-Alg高强度生物医用水凝胶墨水，分别装在不同打印料筒中，置于3D生物打印机挤出头中，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，将实施例1第二步制备的F127水凝胶支撑浴置于玻璃皿中，在恒温F127水凝胶支撑浴中进行直接打印，打印温度稳定在26±2℃，打印机采用挤出型生物3D打印机，使用内径为160μm点胶针头进行打印，打印材料温度为37℃，挤出压力为1.7～2.5bar，打印速度为4～6mm/s。
3D样品打印完成后，用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min，然后将F127水凝胶支撑浴温度降至4℃以下，待F127水凝胶支撑浴呈液态，将打印好的样品轻轻取出，并放置于培养皿中，PBS多次洗涤，获得浴支撑水凝胶模型包括复杂的、多材料的、非平面的几何模型、Y型管模型和DNA双螺旋模型。
图5为实施例5中多种墨水复杂3D打印水凝胶模型的示意图。从图5中可以看出，a)复杂的、多材料的、非平面的几何模型打印，说明两种材料之间可以实现相互交替，完美的衔接。b)DNA双螺旋模型打印，浴支撑打印的双螺旋结构与三维模型具有良好的匹配度，而且整体的分辨率非常高。c)Y型管模型打印，打印后的Y型管不仅保持了良好的Y型物理结构，而且管壁光滑，管腔中间保持通透。以上进一步说明浴支撑打印可以实现各种复杂结构的打印以及不同组分水凝胶材料的构建。
实施例6
3D打印FDA-HAMA支架并用于MC3T3细胞培养
F127水凝胶支撑浴的配制：称取40g普朗尼克F127粉末溶解在120mL去离子水中，于冰浴条件下多次涡旋振荡使得普朗尼克F127粉末完全溶解，配成固含为33％的普朗尼克溶液，4℃保存备用，打印前对F127水凝胶支撑浴进行高温高压(温度为121.3℃、压力为103.4kPa、时间为15min)灭菌。
对实施例2制备的F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水在0℃进行过膜灭菌后加入至打印料筒中，使用Solidworks软件建立STL格式的三维打印模型，然后将网格状支架模型导入到Bioplotter RP切片软件进行分层处理，最后使用3D生物打印机控制软件Visual Machines进行打印，具体的打印方法：将实施例2制备的F127DA-HAMA高强度生物医用水凝胶墨水置于3D生物打印机挤出头中，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，F127水凝胶支撑浴置于玻璃皿中，在恒温F127水凝胶支撑浴中进行直接打印，打印温度稳定在26±2℃，打印机采用挤出型生物3D打印机，使用内径为210μm点胶针头进行打印，打印材料温度为37℃，挤出压力为2-2.8bar，打印速度为16-20mm/s；打印完成后使用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min。然后将F127水凝胶支撑浴温度降至4℃以下，待F127水凝胶支撑浴呈液态，将打印好的样品轻轻取出，并放置在24孔板中，PBS多次洗涤过夜，获得浴支撑FDA-HAMA支架。然后用0.01mg/mL的鼠尾胶原溶液(购于Sigma Aldrich)对水凝胶支架进行常温包被12h，包被完成后用培养基轻轻洗涤两次，吸水纸吸去支架表面多余的水分备用。
以小鼠颅顶前骨细胞MC3T3作为细胞模型，培养基为10％(v/v)FBS和1％(v/v)P/S的α-MEM培养基，对增殖后的MC3T3细胞进行消化，离心，通过计数板计数后进行稀释，稀释后的细胞悬液浓度为5×105cells/mL。在每块水凝胶支架表面种200μL MC3T3细胞悬液，并在37℃预孵育1h，再加入1mL培养基。培养过程中，每两天更换一次培养基。培养一定时间后，通过细胞活/死染剂(Calcein-AM/PI)对3D水凝胶支架上的细胞进行染色，并轻轻冲洗掉支架上未黏附的细胞，通过共聚焦显微镜评估细胞的存活与状态，发现支架上的细胞保持了很高的存活率，几乎没有死细胞，而且细胞在水凝胶支架表面发生了黏附铺展。
图6为实施例6中采用浴支撑水凝胶3D打印方法打印的水凝胶支架用于MC3T3细胞共培养的示意图。图6从左到右分别为Calcein和PI通道，以及它们的双通道和与明场叠加的荧光照片。从中可以看出，支架上的细胞保持了很高的存活率，几乎没有死细胞，而且细胞在水凝胶支架表面发生了黏附铺展。说明3D打印的水凝胶支架不仅细胞相容，而且可用于3D细胞培养，为实现其在组织工程和再生医学领域的应用提供可能。
实施例7
F127DA高强度生物医用水凝胶材料的制备方法包括以下步骤：
第一步，F127DA的合成：将10g普朗尼克F127和5倍摩尔当量的三乙胺溶解在100mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，冷却反应体系至0℃，缓慢滴加含5倍摩尔当量丙烯酰氯的二氯甲烷溶液(5mL)，滴加完后，升温至常温下继续反应24h，反应结束后，水洗，有机相干燥，于无水乙醚中重沉淀，得白色粉末产物即F127DA。
第二步：F127DA高强度生物医用水凝胶材料的制备：称取300mg F127DA(第一步制备)溶解在1mL冰水中，低温混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，配成固含为30％的F127DA水溶液(w/v)，加入1.5mg光引发剂LAP，用手持LED 365nm(10mW cm-2)光照1min交联成胶，获得F127DA高强度生物医用水凝胶材料。性能如下：其压缩断裂应力最高可达1.8MPa以上，压缩模量最高可达0.2MPa，拉伸断裂应力最高可达0.25MPa。
实施例8
F127DA-GelMA高强度生物医用水凝胶材料的制备方法包括以下步骤：
第一步，F127DA的合成：将10g普朗尼克F127和5倍摩尔当量的三乙胺溶解在100mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，冷却反应体系至0℃，缓慢滴加含5倍摩尔当量丙烯酰氯的二氯甲烷溶液(5mL)，滴加完后，升温至常温下继续反应24h，反应结束后，水洗，有机相干燥，于无水乙醚中重沉淀，得白色粉末产物即F127DA。
第二步，GelMA的合成：将10g明胶溶解在30mL杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)中，50℃条件下搅拌30min，待明胶完全溶解后，将4mL甲基丙烯酸酐缓慢滴加至上述溶液中，并于50℃下继续搅拌反应1h。然后将反应后的溶液倒入透析袋(MWCO 3500，
Figure BDA0002469685660000111
)中，反应后的溶液透析3天(MWCO 3500，
Figure BDA0002469685660000112
)，冷冻干燥得到取代度为25％的GelMA，产品-20℃保存。
第三步：F127DA-GelMA高强度生物医用水凝胶材料的制备：称取250mg F127DA(第一步制备)溶解在1mL冰水中，配成固含为25％的F127DA水溶液(w/v)，称取20mg GelMA(第二步制备)溶解在上述溶液中，低温混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，配成最终固含为27％的水凝胶前体溶液，加入1.5mg光引发剂LAP，用手持LED 365nm(10mW cm-2)光照1min交联成胶，获得F127DA-GelMA高强度生物医用水凝胶材料。性能如下：其压缩断裂应力最高可达3.2MPa以上，压缩模量最高可达0.36MPa，拉伸断裂应力最高可达0.45MPa。
实施例9
FDA-Alg高强度生物医用水凝胶材料制备包括以下步骤：
第一步，F127DA的合成：将10g普朗尼克F127和5倍摩尔当量的三乙胺溶解在100mL无水二氯甲烷中，氮气保护下，冷却反应体系至0℃，缓慢滴加含5倍摩尔当量丙烯酰氯的二氯甲烷溶液(5mL)，滴加完后，升温至常温下继续反应24h，反应结束后，水洗，有机相干燥，于无水乙醚中重沉淀，得白色粉末产物即F127DA。
第二步，FDA-Alg高强度生物医用水凝胶材料的制备：称取150mg F127DA溶解在1mL浓度为0.1mM mL-1的CaCl2水溶液中，配成固含为15％的F127DA水溶液(w/v)，称取30mgAlg溶解在上述溶液中，低温混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，配成最终固含为18％的水凝胶前体溶液，加入1.5mg光引发剂LAP，用手持LED 365nm(10mW cm-2)光照1min交联成胶，获得FDA-Alg高强度生物医用水凝胶材料。性能如下：其压缩断裂应力最高可达2.7MPa以上，压缩模量最高可达0.3MPa，拉伸断裂应力最高可达0.4MPa。
对比例1
GelMA生物医用水凝胶材料：
第一步，甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)的合成：将10g明胶溶解在30mL D-PBS溶液中，50℃条件下搅拌30min，待明胶完全溶解后，将4mL甲基丙烯酸酐缓慢滴加至上述溶液中，并于50℃下继续搅拌反应1h。然后将反应后的溶液倒入透析袋(MWCO 3500，
Figure BDA0002469685660000121
)中，并用去离子水在37℃条件下透析3天。将透析后的溶液冷冻干燥，得到甲基丙烯酸酯修饰的明胶，反应产物最终保存在-20℃。
第二步：GelMA生物医用水凝胶材料的制备：称取50mg GelMA(第一步制备)溶解在1mL 40℃去离子水中，混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，配成固含为5％的水凝胶前体溶液，加入1.5mg光引发剂LAP，用手持LED 365nm(10mW cm-2)光照1min交联成胶，获得GelMA生物医用水凝胶材料。性能如下：其压缩断裂应力最高可达0.18MPa以上，压缩模量最高可达0.1MPa，拉伸断裂应力最高可达0.04MPa。
对比例2
GelMA生物医用水凝胶墨水用于3D打印几何模型：
第一步，GelMA生物医用水凝胶墨水的制备：称取50mg GelMA(对比例1第一步制备得到)溶解在1mL 40℃去离子水中，混合并涡旋分散，混合均匀后通氮气除氧，配成固含为5％的水凝胶前体溶液，加入1.5mg光引发剂LAP，低温保存备用。
第二步，F127水凝胶支撑浴的配制：称取40g普朗尼克F127粉末溶解在120mL去离子水中，于冰浴条件下多次涡旋振荡使得普朗尼克F127粉末完全溶解，配成固含为33％的Pluronic溶液，4℃保存备用，获得F127水凝胶支撑浴。
第三步，3D打印：使用Solidworks软件建立STL格式的三维打印模型，然后将圆环模型导入到Bioplotter RP切片软件进行分层处理，最后使用3D生物打印机控制软件Visual Machines进行打印，具体的打印方法：将GelMA生物医用水凝胶墨水置于3D生物打印机挤出头中，在5分钟内将打印筒的温度升高至37℃，将第二步制备的F127水凝胶支撑浴置于玻璃皿中，在恒温F127水凝胶支撑浴中进行直接打印，打印温度稳定在26±2℃，打印机采用挤出型生物3D打印机，使用内径为160μm点胶针头进行打印，挤出压力为0.2～0.4bar，打印速度为7～10mm/s；3D样品打印完成后，用365nm(10mW/cm2)LED光交联1min，然后将F127水凝胶支撑浴温度降至4℃以下，待F127水凝胶支撑浴呈液态，将打印好的样品轻轻取出，并放置于培养皿中，PBS多次洗涤，获得浴支撑水凝胶模型。发现GelMA打印的模型粗细不均匀，圆环周围出现凹凸不平的缺陷。进一步对墨水流变性能进行表征，GelMA打印效果不理想是由于GelMA墨水的粘度太低导致周边F127浴向GelMA墨水中渗入，从而最终导致整个GelMA水凝胶不均匀；而且由于GelMA水凝胶仅依靠共价键交联来维持整个水凝胶网络，打印出来的模型存在力学强度较低，性质较脆的缺陷。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种高强度生物医用水凝胶材料，其特征在于，是由以下重量份的组分制成：
FDA 15～40份，功能化生物医用大分子0～15份，引发剂0.05～0.3份，水20～200份。
2.根据权利要求1所述的高强度生物医用水凝胶材料，其特征在于，所述高强度生物医用水凝胶材料是由以下重量份的组分制成：FDA 15～30份，功能化生物医用大分子1～5份，引发剂0.1～0.2份，水20～200份。
3.根据权利要求1或2所述的高强度生物医用水凝胶材料，其特征在于，所述FDA为丙烯酸酯功能化的普朗尼克；
所述FDA的制备方法包括以下步骤：将普朗尼克和过量的三乙胺溶解在无水二氯甲烷中，氮气保护下，冷却反应体系至0℃，缓慢滴加过量的丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完后，升温至常温下继续反应，反应结束后，水洗，有机相干燥，于无水乙醚中重沉淀，得到FDA。
4.根据权利要求1或2所述的高强度生物医用水凝胶材料，其特征在于，所述功能化生物医用大分子选自丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯功能化的生物医用大分子、可与离子络合的糖类大分子。
5.根据权利要求4所述的高强度生物医用水凝胶材料，其特征在于，所述丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯功能化的生物医用大分子的制备方法包括以下步骤：将生物医用大分子溶解于溶剂中，在温度为0～80℃的条件下加入过量的酸酐，继续反应，然后将反应液透析2～6天，冷冻干燥获得所述丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯功能化的生物医用大分子。
6.根据权利要求1或2所述的高强度生物医用水凝胶材料，其特征在于，所述引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂中的至少一种。
7.一种采用权利要求1至6任一项所述的高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，使用Solidworks软件建立STL格式的三维打印模型，然后将待打印模型导入到Bioplotter RP切片软件进行分层处理，最后使用3D生物打印机控制软件Visual Machines进行打印，将未交联的高强度生物医用水凝胶材料置于3D打印机挤出头中，设置打印参数，在恒温普朗尼克水凝胶支撑浴中进行直接打印，使用内径为50～300μm点胶针头进行打印，打印材料温度为20～37℃，挤出压力为0.2～10bar，打印速度为4～35mm/s；
第二步，3D样品打印完成后，用LED光或普朗尼克水凝胶支撑浴中离子进行水凝胶交联固化；
第三步，待普朗尼克水凝胶支撑浴温度降温至4℃以下使普朗尼克水凝胶支撑浴解组装呈液态，取出打印好的样品，PBS多次洗涤，获得浴支撑水凝胶模型。
8.根据权利要求7所述的采用高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法，其特征在于，所述打印机采用挤出型生物3D打印机；
所述3D打印过程温度为20～37℃。
9.根据权利要求7所述的采用高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法，其特征在于，所述普朗尼克水凝胶支撑浴的制备方法包括以下步骤：冰浴条件下，普朗尼克溶解在去离子水或含有钙离子的溶液中，多次涡旋振荡完全溶解，配成固含为20％～40％的普朗尼克溶液，获得所述普朗尼克水凝胶支撑浴；
所述LED光为紫外光，波长为365nm、光强度为10mW cm-2；或可见光，波长为395nm、光强度为10mW cm-2。
10.根据权利要求9所述的采用高强度生物医用水凝胶材料进行浴支撑水凝胶3D打印方法，其特征在于，所述含有钙离子的溶液选自浓度为0.01～0.2mM mL-1的CaCO3溶液、葡萄糖酸内酯缓释液、CaCl2水溶液中的一种。
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