CN113929957A - 一种多孔气凝胶支架及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多孔气凝胶支架及其制备方法与应用，在缓冲液中加入光引发剂和聚乙二醇二丙烯酸酯，加热溶解，并混合均匀，然后向混合液中加入普朗尼克F127，低温静置，得气凝胶支架材料；采用3D打印技术打印水凝胶支架，并紫外光照射，使其发生交联，形成结构稳定的三维支架，低温浸泡去除普朗尼克F127，冷冻干燥，即得。将普朗尼克F127作为牺牲材料，水凝胶支架3D打印完成后，将普朗尼克F127去除，结合冷冻干燥技术，可在支架中形成多孔结构，有利于细胞三维培养时存活、生长和增殖。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种多孔气凝胶支架及其制备方法与应用，该多孔气凝胶支架可用于细胞三维培养。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
组织工程支架能够为细胞生长提供一个三维环境，在众多组织工程支架中，气凝胶支架因其表面具有较多的微孔结构，能够为细胞贴附生长提供粘附位点而得到应用。
目前，气凝胶的制备材料有天然材料、合成材料和复合材料。制备方法主要有两步，首先是将材料交联制备成水凝胶，然后对水凝胶进行冷冻干燥，最终制备出气凝胶支架。
但是，目前针对气凝胶的制备中，大多采用模具铸造的方式，制备的结构简单，大多为普通的圆柱、立体状的块体结构，缺少可进行营养物质交换的宏观孔通道。另外，针对气凝胶支架的微孔结构设计，大部分研究仅仅依靠材料自身的特性，而关于人为可控的研究较少。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种多孔气凝胶支架及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种多孔气凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：
在缓冲液中加入光引发剂和聚乙二醇二丙烯酸酯，加热溶解，并混合均匀，然后向混合液中加入普朗尼克F127，低温静置，得气凝胶支架材料；
采用3D打印技术打印水凝胶支架，并紫外光照射，使其发生交联，形成结构稳定的三维支架，低温浸泡去除普朗尼克F127，冷冻干燥，即得。
第二方面，本发明提供一种多孔气凝胶支架，由所述制备方法制备而成。
第三方面，本发明提供所述多孔气凝胶支架在细胞三维培养中的应用。
上述本发明的一种或多种实施方式取得的有益效果如下：
普朗尼克F127和聚乙二醇二丙烯酸酯均具有良好的生物相容性，可应用于细胞培养。两种材料均为合成材料，不含生物结构，因此可以将其作为基础材料，根据具体应用环境，在材料中加入其他成分。
利用3D打印技术，可制备出复杂结构气凝胶支架。
将普朗尼克F127作为牺牲材料，水凝胶支架3D打印完成后，将普朗尼克F127去除，结合冷冻干燥技术，可在支架中形成多孔结构，有利于细胞三维培养时存活、生长和增殖。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1、2和3制备的生物材料流变性能图，其中，图a为凝胶动力学特征，图b为剪切变稀特征，图c为剪切恢复特征。
图2为本发明实施例2和3制备的气凝胶溶胀性能图，其中，图A为气凝胶在3、6、12和24h时的溶胀率变化，图B为气凝胶的最高溶胀率值。
图3为本发明实施例2和3制备的气凝胶扫描电镜微观形貌图，其中，图a和b为实施例2去除普朗尼克F127前的微观形貌，图c和d为实施例2去除普朗尼克F127后的微观形貌，图e和f为实施例3去除普朗尼克F127前的微观形貌，图g和h为实施例3去除普朗尼克F127后的微观形貌。
图4为本发明实施例2和3挤出3D打印气凝胶支架制备图，其中，图a、b和c分别为实施例2的原始三维水凝胶支架、干态气凝胶支架和湿态气凝胶支架图，图d、e和f分别为实施例3的原始三维水凝胶支架、干态气凝胶支架和湿态气凝胶支架图。
图5为本发明实施例2和3气凝胶支架上细胞培养图，其中，a为实施例2培养1天后细胞活死染色图；b为实施例3培养1天后细胞活死染色图；c为实施例2培养7天后细胞活死染色图；d为实施例3培养7天后细胞活死染色图。
图6为本发明实施例2和3气凝胶支架上细胞存活率对比图。
图7为本发明实施例2和3气凝胶支架上细胞培养增殖图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
第一方面，本发明提供一种多孔气凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：
在缓冲液中加入光引发剂和聚乙二醇二丙烯酸酯，加热溶解，并混合均匀，然后向混合液中加入普朗尼克F127，低温静置，得气凝胶支架材料；
采用3D打印技术打印水凝胶支架，并紫外光照射，使其发生交联，形成结构稳定的三维支架，低温浸泡去除普朗尼克F127，冷冻干燥，即得。
在一些实施例中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。
在一些实施例中，所述光引发剂LAP光引发剂。
进一步的，LAP光引发剂在缓冲液中的浓度为0.1-0.25wt％。
在一些实施例中，缓冲液中，聚乙二醇二丙烯酸酯的浓度为5-15wt％。
在一些实施例中，水浴加热的温度为35-40℃，水浴加热的时间为5-15min；优选的，水浴加热的温度为37℃，水浴加热的时间为10min，期间间隔震荡。
进一步的，水浴加热期间，每隔1-3min震荡一次，以使LAP充分溶解。
在一些实施例中，气凝胶支架材料中，普朗尼克F127的浓度为15-25wt％。
进一步的，气凝胶支架材料静置的温度为0-5℃，静置时间为2-5天，以使普朗尼克F127充分溶解。优选的，气凝胶支架材料静置的温度为4℃，静置时间为3天。
在一些实施例中，紫外光的波长为405nm。
进一步的，所述紫外光的光强为20-30mW/cm2，光照时间为5-15min。
在一些实施例中，采用PBS低温浸泡三维支架，去除普朗尼克F127。
进一步的，低温浸泡的温度为0-5℃，浸泡时间为20-30h。优选的，低温浸泡的温度为4℃，浸泡时间为24h。
在一些实施例中，冷冻干燥的温度为-60～-50℃，冷冻干燥的时间为20-30h。
在一些实施例中，还包括对制备得到的气凝胶支架进行灭菌的步骤。
进一步的，采用乙醇溶液对气凝胶支架进行灭菌。
更进一步的，采用乙醇溶液对气凝胶支架进行浸泡灭菌。
第二方面，本发明提供一种多孔气凝胶支架，由所述制备方法制备而成。
第三方面，本发明提供所述多孔气凝胶支架在细胞三维培养中的应用。
在一些实施例中，在对细胞进行培养之前，还包括将气凝胶支架进行功能化的步骤。
进一步的，所述功能化的步骤具体如下：将气凝胶支架浸泡在完全培养基中，置于37℃、5％CO2环境下孵育设定时间，即可。
更进一步的，孵育的时间为20-30h。
本发明的原理为：
普朗尼克F127是一种温敏性材料，当温度在临界胶束温度之上时，表现为凝胶状，当温度在临界胶束温度之下时，表现为液态，在生物墨水中加入普朗尼克F127有两种作用，一是在材料打印时，使接收平板的温度高于材料的临界胶束温度，生物材料落在接收平板上后呈凝胶状，保证可打印性；二是支架打印完成后，将支架置于温度低于临界胶束温度的环境中，使材料溶解挥发，结合冷冻干燥技术，可以调节支架中微孔结构，利于氧气营养物质和废物的交换，提高细胞的存活率。
聚乙二醇二丙烯酸酯是一种可光固化材料，在生物墨水中加入聚乙二醇二丙烯酸酯，当支架打印完成后，利用紫外光照射，使聚乙二醇二丙烯酸酯固化，提高支架结构的稳定性。在生物墨水中加入不同浓度的聚乙二醇二丙烯酸酯，可以对支架的力学性能进行调控。
3D打印技术可以根据设计，制备出所需的结构，利用3D打印技术制备出的气凝胶支架，具有宏观孔结构，能够为细胞提供营养物质交换通道。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
取0.025g光引发剂LAP，倒入20mL棕色瓶内，向其中加入7.475g PBS和0.5g聚乙二醇二丙烯酸酯，在37℃环境下水浴加热10min，期间每隔2min震荡一次，水浴加热后，将溶液置于4℃环境下保存10min，之后取2g普朗尼克F127加入到溶液中，震荡1min后，在4℃环境下静置3天。
将生物材料装入10cc打印机料桶，喷嘴为20G。设置打印参数，挤出压力50kPa，打印速度250mm/min，移动速度900mm/min，移动抬升0，回抽速度2000mm/min，回抽长度0，打印方式为逐个打印，打印在玻璃板上，玻璃板放置在接收平台上，层层堆积形成三维支架结构。料筒和接收平台温度均设置为37℃。三维支架层高0.8mm，层数3层，复打次数为1次，间距为1.5*1.5mm，夹角90°，长度12mm，宽度12mm，Brim Width为1mm，Brim speed为200mm/min。然后用405nm波长，光强为25mW/cm2紫外光照射三维支架10min，使材料发生交联，形成结构稳定的三维水凝胶支架。向水凝胶支架中加入PBS，然后将支架置于4℃环境下孵育24h，去除支架中的普朗尼克F127牺牲材料。
将水凝胶支架置于-80℃预冷12h，然后冷冻干燥24h，冷冻干燥温度为-55℃，制备出气凝胶支架。将气凝胶支架置于75％的乙醇中3小时进行灭菌，然后用PBS冲洗5次，每次5分钟，以完全去除乙醇。将灭菌后的气凝胶支架浸泡在完全培养基中，然后放置在37℃、5％CO2环境下孵育24h，对支架进行功能化。向功能化后的气凝胶支架上加入细胞悬浮液，浓度为106个/mL，放于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
实施例2
取0.025g光引发剂LAP，倒入20mL棕色瓶内，向其中加入6.975gPBS和1g聚乙二醇二丙烯酸酯，在37℃环境下水浴加热10min，期间每隔2min震荡一次，水浴加热后，将溶液置于4℃环境下保存10min，之后取2g普朗尼克F127加入到溶液中，震荡1min后，在4℃环境下静置3天。
将生物材料装入10cc打印机料桶，喷嘴为20G。设置打印参数，挤出压力50kPa，打印速度250mm/min，移动速度900mm/min，移动抬升0，回抽速度2000mm/min，回抽长度0，打印方式为逐个打印，打印在玻璃板上，玻璃板放置在接收平台上，层层堆积形成三维支架结构。料筒和接收平台温度均设置为37℃。三维支架层高0.8mm，层数3层，复打次数为1次，间距为1.5*1.5mm，夹角90°，长度12mm，宽度12mm，Brim Width为1mm，Brim speed为200mm/min。然后用405nm波长，光强为24mW/cm2紫外光照射三维支架10min，使材料发生交联，形成结构稳定的三维水凝胶支架。向水凝胶支架中加入PBS，然后将支架置于4℃环境下孵育24h，去除支架中的普朗尼克F127牺牲材料。
将水凝胶支架置于-80℃预冷12h，然后冷冻干燥24h，冷冻干燥温度为-55℃，制备出气凝胶支架。将气凝胶支架置于75％的乙醇中3小时进行灭菌，然后用PBS冲洗5次，每次5分钟，以完全去除乙醇。将灭菌后的气凝胶支架浸泡在完全培养基中，然后放置在37℃、5％CO2环境下孵育24h，对支架进行功能化。向功能化后的气凝胶支架上加入细胞悬浮液，浓度为106个/mL，放于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
实施例3
取0.025g光引发剂LAP，倒入20mL棕色瓶内，向其中加入6.475gPBS和1.5g聚乙二醇二丙烯酸酯，在37℃环境下水浴加热10min，期间每隔2min震荡一次，水浴加热后，将溶液置于4℃环境下保存10min，之后取2g普朗尼克F127加入到溶液中，震荡1min后，在4℃环境下静置24h。
将生物墨水装入10cc打印机料桶，喷嘴为20G。设置打印参数，挤出压力30kPa，打印速度250mm/min，移动速度900mm/min，移动抬升0，回抽速度2000mm/min，回抽长度0，打印方式为逐个打印，打印在培养皿中，培养皿放置在接收平台上，层层堆积形成三维支架结构。三维支架层高0.8mm，层数3层，复打次数为1次，间距为1.5*1.5mm，夹角90°，长度12mm，宽度12mm，Brim Width为1mm，Brim speed为200mm/min。然后用405nm波长，光强为25mW/cm2紫外光照射三维支架60s，使材料发生交联，形成结构稳定的形成结构稳定的三维水凝胶支架。向水凝胶支架中加入PBS，然后将支架置于4℃环境下孵育24h，去除支架中的普朗尼克F127牺牲材料。
将水凝胶支架置于-80℃预冷12h，然后冷冻干燥24h，冷冻干燥温度为-55℃，制备出气凝胶支架。将气凝胶支架置于75％的乙醇中3小时进行灭菌，然后用PBS冲洗5次，每次5分钟，以完全去除乙醇。将灭菌后的气凝胶支架浸泡在完全培养基中，然后放置在37℃、5％CO2环境下孵育24h，对支架进行功能化。向功能化后的气凝胶支架上加入细胞悬浮液，浓度为106个/mL，放于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
本实施例所获多孔气凝胶支架可应用于细胞三维培养中。
下面通过几种性能测试展示本实施例所获多孔气凝胶支架在三维细胞培养中的应用优势。
流变性测试：利用流变仪测量生物材料的流变性，包括凝胶动力学、剪切变稀行为和剪切恢复行为。进行凝胶动力学测量时，将应变设置为1％，频率设置为1Hz，从4℃升至37℃进行温度扫描，加热速率为5℃min-1；进行剪切变稀测量时，将温度设定为37℃，剪切速率设置为0.01-1000s-1，观察材料的粘度随剪切速率的变化；进行剪切恢复测量时，频率设置为1Hz，先在100s内施加低应变1％，然后100s内施加高应变600％，最后100s内恢复低应变1％，储能模量G’和损耗模量G”记录三个循环。凝胶动力学、剪切变稀和剪切恢复测量结果分别如图1(a)、图2(b)、图3(c)所示，实施例1、实施例2和实施例3样品分别标记为F20P5、F20P10、F20P15，选择20wt％纯普朗尼克F127作为对照，标记为F20P0。实施例1、实施例2和实施例3生物材料在37℃时均能变为凝胶状态，并且具有剪切变稀和剪切恢复性能，说明实施例1、实施例2和实施例3生物材料适用于挤出式3D打印，在打印过程中，将料筒和接收平台温度设置为37℃，材料在料筒中可保持为类固态，施加气压将材料挤出时，材料变为液态，可顺利挤出，当材料离开喷头，落在接收平台上时可以迅速恢复为类固态，从而保持打印结构的稳定。
溶胀性测试：将实施例1、实施例2和实施例3生物材料分别经光固化、低温浸泡，冷冻干燥后，制备成直径和高度均为8mm圆柱状气凝胶结构，选择未低温浸泡的样品做对照，进行溶胀性测试，首先测量冷冻干燥后试样的质量(Wd)，然后将试样在PBS中分别浸泡0h/3h/6h/12h/24h，在相应时间点取出试样，拭去表面水分，称量质量(Ws)，然后利用下面的公式计算每个时间节点溶胀率。
溶胀率＝(Ws-Wd)/Wd×100％
实施例1材料无法光固化，因此选择实施例2和实施例3进行溶胀性测试。实施例2低温浸泡处理样品标记为F20P10R，未低温浸泡处理样品标记为F20P10N，实施例3低温浸泡处理样品标记为F20P15R，未低温浸泡处理样品标记为F20P15N。溶胀性测试结果如图2所示，对于实施例2和实施例3，将普朗尼克F127去除后，溶胀性都有显著提高。
微观结构：将实施例1、实施例2和实施例3生物材料分别经光固化、低温浸泡、冷冻干燥、喷金后，制备成直径和高度均为8mm圆柱状气凝胶结构，选择未低温浸泡的样品做对照，在扫描电镜下观察微观结构。
实施例1材料无法光固化，因此选择实施例2和实施例3进行微观结构观察。实施例2低温浸泡处理样品标记为F20P10R，未低温浸泡处理样品标记为F20P10N，实施例3低温浸泡处理样品标记为F20P15R，未低温浸泡处理样品标记为F20P15N。观察结果如图3，结果表明普朗尼克F127去除后，孔的尺寸明显变大。
力学性能测试：力学性能通过拉伸机测试，将实施例2和实施例3经光固化、低温浸泡、冷冻干燥后，制备成直径和高度均为15mm的圆柱状气凝胶结构，测试时，压缩速率设置为2mm/min，压缩距离为原始尺寸的1/2，将压缩模量定义为应力应变曲线中5％应变的斜率，获得实施例1和实施例2，去除普朗尼克F127后的压缩模量分别为0.415±0.081MPa和0.818±0.141MPa，表明两种支架均有较高的力学性能，因此，支架结构在培养过程中能够保持良好的稳定性。
气凝胶支架宏观结构：实施例2和实施例3的原始三维水凝胶支架、干态气凝胶支架和湿态气凝胶支架分别如图4所示，可以看到气凝胶支架在制备过程中尺寸无明显变化，干态气凝胶支架浸泡在PBS中后，得到的湿态气凝胶支架中，有明显的宏观孔结构，可以为支架上种植的细胞提供营养物质通道。
细胞存活率表征：采用Calcein-AM/PI分别对活/死细胞进行染色，然后用荧光显微镜对细胞存活率进行表征。Calcein-AM能够对活细胞染色，发绿色荧光，PI能够对死细胞进行染色，发红色荧光。图5为实施例2和实施例3中，细胞培养1天和7天后的细胞活死染色图，图6为实施例2和实施例3中,细胞培养1天和7天后的存活率。实施例2支架标记为F20P10，实施例3支架标记为F20P15。可以看到，在实施例2和实施例3中制备的多孔气凝胶支架上，细胞在整个培养周期内存活率均高于80％，在第7天超过了90％。
细胞增殖表征：采用CCK-8实验对细胞存活率进行表征。取培养了1、3、5和7天的支架，放置在新的6孔板中，用PBS冲洗2次。取完全培养基和CCK-8溶液按10:1体积比配制成工作液，向每孔中加入3ml工作液，然后将6孔板放置在37℃、5％CO2培养箱中孵育3个小时。孵育完成后，取出培养板，然后将6孔板中孵育液转移到96孔板中，每孔注入100μL。将分装好孵育液的96孔板放入到酶标仪中，在450nm处测试吸光度。图6实施例1和实施例2中,细胞培养1、3、5、7天时的增殖情况，实施例2支架标记为F20P10，实施例3支架标记为F20P15，可以看到，在实施例1和实施例2中制备的多孔气凝胶支架上，细胞均能良好增殖。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
在缓冲液中加入光引发剂和聚乙二醇二丙烯酸酯，加热溶解，并混合均匀，然后向混合液中加入普朗尼克F127，低温静置，得气凝胶支架材料；
采用3D打印技术打印水凝胶支架，并紫外光照射，使其发生交联，形成结构稳定的三维支架，低温浸泡去除普朗尼克F127，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述光引发剂LAP光引发剂；
进一步的，LAP光引发剂在缓冲液中的浓度为0.1-0.25wt％。
4.根据权利要求1所述的多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：缓冲液中，聚乙二醇二丙烯酸酯的浓度为5-15wt％；
在一些实施例中，水浴加热的温度为35-40℃，水浴加热的时间为5-15min；优选的，水浴加热的温度为37℃，水浴加热的时间为10min，期间间隔震荡；
进一步的，水浴加热期间，每隔1-3min震荡一次。
5.根据权利要求1所述的多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：气凝胶支架材料中，普朗尼克F127的浓度为15-25wt％；
进一步的，气凝胶支架材料静置的温度为0-5℃，静置时间为2-5天；优选的，气凝胶支架材料静置的温度为4℃，静置时间为3天。
6.根据权利要求1所述的多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：紫外光的波长为405nm；
进一步的，所述紫外光的光强为20-30mW/cm2，光照时间为5-15min。
7.根据权利要求1所述的多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：采用PBS低温浸泡三维支架，去除普朗尼克F127；
进一步的，低温浸泡的温度为0-5℃，浸泡时间为20-30h。优选的，低温浸泡的温度为4℃，浸泡时间为24h。
8.根据权利要求1所述的多孔气凝胶支架的制备方法，其特征在于：冷冻干燥的温度为-60～-50℃，冷冻干燥的时间为20-30h；
在一些实施例中，还包括对制备得到的气凝胶支架进行灭菌的步骤；
进一步的，采用乙醇溶液对气凝胶支架进行灭菌；
更进一步的，采用乙醇溶液对气凝胶支架进行浸泡灭菌。
9.一种多孔气凝胶支架，其特征在于：由权利要求1-8任一所述制备方法制备而成。
10.权利要求1-8任一所述多孔气凝胶支架在细胞三维培养中的应用；
在一些实施例中，在对细胞进行培养之前，还包括将气凝胶支架进行功能化的步骤；
进一步的，所述功能化的步骤具体如下：将气凝胶支架浸泡在完全培养基中，置于37℃、5％CO2环境下孵育设定时间，即可；
更进一步的，孵育的时间为20-30h。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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