CN114470328A - 一种具有材料可控分布的3d打印生物墨水材料制作方法及三维仿生水凝胶支架制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法及三维仿生水凝胶支架制备方法，所述材料可控分布涉及材料的图案及组分可控分布，其包括以下步骤：S1、3D打印定制高精度图案化且与3D打印机针筒内表面间隙配合的模具，作为调控材料分布的模板；S2制备较高浓度且具有温敏特性的热致水凝胶与冷致水凝胶，热致水凝胶作为模具表面涂层材料；S3制备材料可控分布的生物墨水材料。本发明利用涂层材料，结合置入模具—浇筑外层冷致水凝胶—脱模—浇筑内层冷致水凝胶制作方法，很好的实现了材料分布的个性化定制与高精度调控，且赋予了3D打印的异质支架良好的三维结构。此外，结合细胞生物化学因子，可进一步赋予海藻酸盐基水凝胶支架的细胞调控能力。

Description

一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法及三 维仿生水凝胶支架制备方法
技术领域
本发明属于生物3D打印技术领域，特别涉及一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法及三维仿生水凝胶支架制备方法。
背景技术
目前临床上许多复杂的人体器官还缺少临床可用的替代物。组织工程方法采用添加支架、生长因子和细胞于培养液进行体外合成，或是将支架和生长因子植入体内进行合成，为组织器官修复提供了途径。3D打印技术采用离散/堆积思想，可制造出具有任意复杂内部结构的实体，不仅可以实现同一切片上不同的材料成分和复杂结构的制备，而且不同切片上的成分和结构形式可以任意变化，可以实现高度个性化的复杂支架结构的直接成形制造。
水凝胶材料由于其与生物组织相近的性质和较高的水含量，被广泛应用于无细胞或者装载细胞的生物墨水材料的3D打印。3D打印的生物墨水材料需要具备以下属性：(1)良好的流变学性质，确保可挤出、可成型性；(2)与组织匹配的力学性质，确保打印的支架结构的完整性，同时避免支架与组织器官间力学不匹配引起的应力遮挡效应；(3)可降解性，确保支架降解速度与组织再生速度的匹配性：(4)良好的生物相容性。
明胶为温敏性水凝胶，可温控交联固化；海藻酸钠水凝胶，通常对温度不敏感，可通过引入钙离子物理交联固化。明胶和海藻酸钠水凝胶生物相容性好，均被广泛应用于组织工程支架制备。然而目前报道的3D打印的水凝胶支架，对于调控功能化组织的形成有限。通常的策略是开发新的生物墨水材料或者将材料混合实现支架调控细胞行为。打印材料的来源有限，这严重阻碍了可调控细胞行为的3D打印支架的制备。如何实现功能化材料(如生物化学因子、牺牲材料、不同浓度光引发剂等)在支架内的可控分布，直接制造或结合后处理工艺形成药物可控释放、表面形貌可调、基质刚度可调的组织工程支架，是3D打印生物墨水材料中遇到的巨大挑战。传统组织工程支架主要聚焦于为细胞生长提供时间和空间的位置分辨率，难以调控细胞行为及制备功能化组织。
发明内容
本发明的目的是为了解决传统组织工程支架主要聚焦于为细胞生长提供时间和空间的位置分辨率，难以调控细胞行为及制备功能化组织的问题，提供一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法及三维仿生水凝胶支架制备方法，该方法通过定制模具、引入涂层材料及脱模，很好的实现了材料分布的个性化定制与高精度调控，赋予了3D打印的异质支架良好的三维结构。此外，结合细胞生物化学因子，可进一步赋予海藻酸盐基水凝胶支架的细胞调控能力。其制作流程简单，易于推广。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一：3D打印定制高精度的模具，其中模具与针筒内表面间隙配合；
步骤二：制备具有温敏特性且常温下动力粘度为3000～25000Pa.s的冷致水凝胶与1～500Pa.s的热致水凝胶，将热致水凝胶作为所述模具表面涂层材料；
步骤三：制备材料可控分布的生物墨水材料：利用模具装配工艺将步骤S2得到的具有涂层的高精度模具置入3D打印机针筒内，然后浇筑外层冷致水凝胶，并通过调控冷致水凝胶的预设温度和持续时间，同步实现冷致水凝胶固化与涂层材料液化，之后对模具进行脱模并倒置整个针筒，去除残余涂层材料，浇筑内层冷致水凝胶，得到一定材料分布的生物墨水材料，所述材料分布为材料图案及组分可控分布。
一种利用上述方法制作的生物墨水材料制备三维仿生水凝胶支架的方法，所述方法具体步骤为：
(1)将上述具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料离心脱泡；
(2)控制打印速度为6～12mm/s，针筒挤出压力为100～350kPa，喷嘴规格为20～22G，在利于细胞存活的温度下，挤出打印，使所述生物墨水材料在低温打印平台上初步固化成预设的支架结构；
(3)将初步固化的水凝胶进行氯化钙溶液的钙离子物理交联处理，得到具有一定力学强度的三维结构的异质水凝胶支架。
本发明相对于现有技术的有益效果为：
(1)本发明采用涂层材料，结合置入模具、浇筑外层冷致水凝胶、脱模和浇筑内层冷致水凝胶制备用于3D打印的材料可控分布的生物墨水材料，相比于传统化学修饰后的生物墨水材料或者与功能化材料的引入形成的复合材料，不仅满足了生物墨水材料的可打印性，同时实现了材料分布的个性化定制，最终赋予3D打印的支架对细胞生长与组织形成的多样化调控能力。
(2)本发明采用的普朗尼克F127涂层材料生物相容性好，广泛应用于药物载体、细胞载体剪切保护剂、生物3D打印等。采用的海藻酸钠与明胶的复合冷致水凝胶与热致普朗尼克F127涂层材料温敏特性相反，环境温度的调控很好的同步实现了普朗尼克F127的液化与海藻酸钠与明胶的复合水凝胶的固化，赋予模具较高的脱模精度。
(3)本发明的可控材料分布的生物墨水材料的打印过程中，利用较小直径的喷嘴规格，可调控打印纤维的材料图案分布精度至几十微米，可以有效实现生物墨水材料支架的生物物理及生物化学特征的可调控性。
(4)本发明设计的材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，制作工艺简单，所用材料和工艺成本低廉，易于推广。打印纤维的材料分布很容易通过调控模具图案、生物墨水材料的组分分布实现。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为模具CAD图；
图3为本发明实例中的调控涂层材料液化实现的模具脱模效果图；
图4为本发明实例中的最终制备的可控材料分布的生物墨水材料效果图；
图5为本发明实例中的生物墨水材料3D打印成型过程CFD流体仿真结果图；
图6为本发明实例中的3D打印的水凝胶支架图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
图1显示了具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作工艺流程。首先，将具有温敏特性热致水凝胶F127涂层的高精度图案模具置入3D打印机针筒内，实现与针筒内表面的间隙配合，然后浇筑冷致水凝胶海藻酸钠与明胶复合材料，利用复合材料与涂层材料的温敏性差异，同步实现冷致水凝胶固化与涂层材料液化，之后对模具进行脱模并去除液化的涂层材料。接着浇筑内层冷致水凝胶海藻酸钠与明胶复合材料，从而得到材料可控分布的3D打印生物墨水材料(内外层冷致水凝胶浓度可以不同)。实例中所用试剂均可从市场常规购得。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一：3D打印定制高精度的模具，其中模具与针筒内表面间隙配合(不是紧密贴合，有一些随机的间隙)；
步骤二：制备具有温敏特性且常温下动力粘度为3000～25000Pa.s的冷致水凝胶与1～500Pa.s的热致水凝胶，将热致水凝胶作为所述模具表面涂层材料；模具的表面涂层指的并不是所有表面都涂层，实际上只是局部涂层。实现配合是利用的未涂层的模具表面与针筒内表面产生间隙配合，这个间隙配合起的是固定模具的作用，不是用于外层冷致水凝胶与涂层材料间的脱模。涂完涂层后能放进针筒，因为实际上设计的模具，与涂层相对应的局部模具直径是明显小于未涂层的局部模具直径的。
步骤三：制备材料可控分布的生物墨水材料：利用模具装配工艺将步骤S2得到的具有涂层的高精度模具置入3D打印机针筒内，然后浇筑外层冷致水凝胶，并通过调控冷致水凝胶的预设温度和持续时间，同步实现冷致水凝胶固化与涂层材料液化，之后对模具进行脱模并倒置整个针筒，去除残余涂层材料，浇筑内层冷致水凝胶，得到一定材料分布的生物墨水材料，所述材料分布为材料图案及组分可控分布。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，步骤一中，模具的形状直接影响了所述3D打印生物墨水材料的材料分布，3D打印使用打印精度不低于0.05mm的高精度树脂3D打印机。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，步骤一中，所述3D打印的模具图案根据生物墨水材料分布的预设图案进行调整与个性化定制；所述间隙配合的配合间隙为+0.01～+0.1mm，以确保模具在针筒内表面的固定及生物墨水材料制作过程中的模具置入与移除。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，步骤二中，所述热致水凝胶为普朗尼克F127，冷致水凝胶为明胶与海藻酸钠或甲基丙烯酰胺基明胶与海藻酸钠的复合水凝胶。普朗尼克F127与所述冷致水凝胶温敏特性相反，调控温度既可实现涂层材料的粘附，又可同时实现所述海藻酸盐基水凝胶的固化与普朗尼克F127水凝胶的液化，使模具与所述海藻酸盐基水凝胶形成间隙，便于脱模。甲基丙烯酰胺基明胶与明胶的理化性质(如流变学性质)相近，当冷致水凝胶为甲基丙烯酰胺基明胶与海藻酸钠的复合水凝胶，热致水凝胶保持不变时，也可采用同样的制作方法实现。
具体实施方式五：具体实施方式四所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，所述热致水凝胶普朗尼克F127的浓度为20％～40％(w/v)，冷致水凝胶包含3.75％～15％(w/v)的明胶与3％～4％(w/v)的海藻酸钠水凝胶或3.75％～15％(w/v)的甲基丙烯酰胺基明胶与3％～4％(w/v)的海藻酸钠水凝胶，其中，w/v是指溶质质量(g)/溶剂体积(ml)。20％～40％(w/v)指的是溶质是20～40g普朗尼克(溶质)，然后溶于100mL的水(溶剂)中。
作为涂层材料，低浓度的普朗尼克F127水凝胶粘度低，难以在树脂模具表面形成涂层，但浓度过高，难以制备。引入的明胶或甲基丙烯酰胺基明胶，除了影响3D打印过程中生物墨水材料的成型精度，还影响所述生物墨水材料的制作工艺中，海藻酸盐基水凝胶温敏固化后的强度，其浓度需要确保脱模过程中海藻酸盐基水凝胶结构的不被破坏，但浓度不宜过大，否则导致海藻酸盐基水凝胶粘度过大，不易于海藻酸盐基水凝胶材料的浇筑。海藻酸钠的添加量，显著影响海藻酸盐基水凝胶的粘度，其添加量需确保制作后的材料可控分布的生物墨水材料的可挤出性，添加量过少，打印过程挤出的纤维难以形成丝状，添加量过多，生物墨水材料难以被挤出。
具体实施方式六：具体实施方式一所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，步骤二中，所述表面涂层的形成方式是通过将模具浸入半流动状态涂层材料，立即室温环境下以10s～20s为间隔正立倒置重复多次，直至涂层材料凝固实现。所述正立倒置的时间间隔根据所述涂层材料的浓度进行调整，其浓度越高，时间间隔越小。
具体实施方式七：具体实施方式一所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，步骤三中，所述冷致水凝胶固化与涂层材料液化的环境温度为0～10℃，保持时间为15～60min；所述去除残余涂层材料的针筒倒置时间为30～120min，倒置时环境温度为0～10℃。所述海藻酸盐基水凝胶中明胶或甲基丙烯酰胺基浓度越高、涂层材料浓度越低时，上述环境温度均可在确定范围内选择较高的温度，或者在确定范围内选择较短的保持时间和倒置时间。反之亦然。
具体实施方式八：具体实施方式一所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，步骤三中，所述内层材料的浇筑工艺，浇筑前将包含外层材料的针筒采用0.4～1mm外径的针头作通气处理，实现内层材料的填充及针筒活塞与打印材料的无间隙接触，4℃密封保存。针头不宜过大，否则易破坏已填充的外层材料的结构。
具体实施方式九：一种利用具体实施方式一至八任一项制作的生物墨水材料制备三维仿生水凝胶支架的方法，所述方法具体步骤为：
(1)将上述具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料离心脱泡，以消除气泡；
(2)控制打印速度为6～12mm/s，针筒挤出压力为100～350kPa，喷嘴规格为20～22G，在利于细胞存活的温度下，挤出打印，使所述生物墨水材料在低温打印平台上初步固化成预设的支架结构；
(3)将初步固化的水凝胶进行2％～5％(w/v)氯化钙溶液的钙离子物理交联处理，得到具有一定力学强度的三维结构的异质水凝胶支架。
具体实施方式十：具体实施方式九所述的一种三维仿生水凝胶支架的制备方法，(2)中，所述细胞存活的温度为37℃；所述低温打印平台的温度为0～4℃；(3)中，所述钙离子物理交联处理为：将打印后的样品立即浸入氯化钙溶液中交联3min，然后用磷酸盐缓冲生理盐水冲洗三次。
实施例1：
一种具有材料核壳式分布的生物墨水材料制备及其3D打印方法
图2显示了三维CAD软件构建的模具三维模型，其中，a为3mm，b为9.49mm。通过切片，导入STL模型于打印精度为0.025mm的树脂打印机，定制高精度模具。接着，将普朗尼克F127采用低温静置溶解，期间振荡数次，得到30％(w/v)的普朗尼克F127水凝胶，其中，w/v为溶质质量(g)/溶剂体积(ml)；将明胶与海藻酸钠分别配制成水凝胶溶液，按一定体积比混合得到复合水凝胶溶液，复合水凝胶溶液中海藻酸钠的浓度为3％(w/v)，明胶的浓度为5％(w/v)。取适当配置的复合水凝胶与固绿染料混合，溶液染色完成时均停止染料加入，且加入的染料体积不超过复合水凝胶溶液体积的0.1％，得到固绿染色的明胶与海藻酸钠复合水凝胶溶液。再将配置的普朗尼克F127水凝胶置于15℃环境保持15min，然后将模具浸入所述普朗尼克F127涂层材料，立即室温环境下以10s～20s为间隔正立倒置重复多次，直至涂层材料凝固，实现模具表面涂层。然后，利用模具装配工艺，室温下将表面涂层的高精度模具置入3ml的3D打印机针筒内，模具与针筒间隙配合的配合间隙为0.05mm。随后注射器注射配置的固绿染色的明胶与海藻酸钠复合水凝胶0.5ml于针筒内，并排除气泡。接着，调控海藻酸钠与明胶的复合水凝胶固化与普朗尼克F127涂层材料液化的环境温度为4℃，保持时间为30min；之后对模具进行脱模，图3为模具脱模的效果图，可以看出脱模后模具表面无复合水凝胶材料残留，形成复合水凝胶壳结构完好，保持了较高形状精度。之后，将整个针筒在4℃环境温度下倒置60min，去除残余普朗尼克F127涂层材料。在进行壳层材料填充前，采用0.6mm外径的针头将包含外层材料的针筒作通气处理，注射器填充未染色的海藻酸钠与明胶的复合水凝胶于针筒，并置入活塞，使活塞与打印材料无间隙接触。得到材料核壳式分布的3D打印生物墨水材料。图4为最终制备的核壳式分布的生物墨水材料的效果图。
对上述制备的核壳式分布生物墨水材料的成型纤维材料分布及生物墨水材料的可打印性进行了研究。
打印参数为：
挤出气压：140kPa，打印速度：10mm/s，针头尺寸：20G(内径0.6mm)，针筒处温度：37℃，打印平台温度：4℃。
预设的线条尺寸为10mm，线条直径为0.6mm；网格支架尺寸10mm×10mm×1.23mm，线条间间距为0.8mm。
将打印后的纤维及网格支架结构浸入4％(w/v)氯化钙溶液中交联3min，然后用磷酸盐缓冲生理盐水冲洗三次，使水凝胶物理交联，形成水凝胶支架。
3D打印的水凝胶纤维成型过程的CFD流体仿真结果如图5所示，可以看出成型的纤维，形成了与预设生物墨水材料分布相似的核壳式分布图案。
3D打印的水凝胶支架如图6所示(背景黑线为钢板尺刻线)，可以看出打印效果良好，保持较好的形貌。基于所述生物墨水材料，结合荧光纳米粒子，可在显微镜下观察到支架结构中，线条截面形成的与预设生物墨水材料分布相似的核壳式分布图案。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本技术领域的技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均有可变之处，在不脱离本发明的精神实质与原理下所作出的各种变形和改进，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
步骤一：3D打印定制高精度的模具，其中模具与针筒内表面间隙配合；
步骤二：制备具有温敏特性且常温下动力粘度为3000～25000Pa.s的冷致水凝胶与1～500Pa.s的热致水凝胶，将热致水凝胶作为所述模具表面涂层材料；
步骤三：制备材料可控分布的生物墨水材料：利用模具装配工艺将步骤S2得到的具有涂层的高精度模具置入3D打印机针筒内，然后浇筑外层冷致水凝胶，并通过调控冷致水凝胶的预设温度和持续时间，同步实现冷致水凝胶固化与涂层材料液化，之后对模具进行脱模并倒置整个针筒，去除残余涂层材料，浇筑内层冷致水凝胶，得到一定材料分布的生物墨水材料，所述材料分布为材料图案及组分可控分布。
2.根据权利要求1所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于：步骤一中，3D打印使用打印精度不低于0.05mm的高精度树脂3D打印机。
3.根据权利要求1所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于：步骤一中，所述3D打印的模具图案根据生物墨水材料分布的预设图案进行调整与个性化定制；所述间隙配合的配合间隙为+0.01～+0.1mm。
4.根据权利要求1所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于：步骤二中，所述热致水凝胶为普朗尼克F127，冷致水凝胶为明胶与海藻酸钠或甲基丙烯酰胺基明胶与海藻酸钠的复合水凝胶。
5.根据权利要求4所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于：所述热致水凝胶普朗尼克F127的浓度为20％～40％(w/v)，冷致水凝胶包含3.75％～15％(w/v)的明胶与3％～4％(w/v)的海藻酸钠水凝胶或3.75％～15％(w/v)的甲基丙烯酰胺基明胶与3％～4％(w/v)的海藻酸钠水凝胶。
6.根据权利要求1所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于：步骤二中，所述表面涂层的形成方式是通过将模具浸入半流动状态涂层材料，立即室温环境下以10s～20s为间隔正立倒置重复多次，直至涂层材料凝固实现。
7.根据权利要求1所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于，步骤三中，所述冷致水凝胶固化与涂层材料液化的环境温度为0～10℃，保持时间为15～60min；所述去除残余涂层材料的针筒倒置时间为30～120min，倒置时环境温度为0～10℃。
8.根据权利要求1所述的一种具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料制作方法，其特征在于：步骤三中，所述内层材料的浇筑工艺，浇筑前将包含外层材料的针筒采用0.4～1mm外径的针头作通气处理，实现内层材料的填充及针筒活塞与打印材料的无间隙接触，4℃密封保存。
9.一种利用权利要求1～8任一项制作的生物墨水材料制备三维仿生水凝胶支架的方法，其特征在于：所述方法具体步骤为：
(1)将上述具有材料可控分布的3D打印生物墨水材料离心脱泡；
(2)控制打印速度为6～12mm/s，针筒挤出压力为100～350kPa，喷嘴规格为20～22G，在利于细胞存活的温度下，挤出打印，使所述生物墨水材料在低温打印平台上初步固化成预设的支架结构；
(3)将初步固化的水凝胶进行氯化钙溶液的钙离子物理交联处理，得到具有一定力学强度的三维结构的异质水凝胶支架。
10.根据权利要求9所述的一种三维仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：(2)中，所述细胞存活的温度为37℃；所述低温打印平台的温度为0～4℃；(3)中，所述钙离子物理交联处理为：将打印后的样品立即浸入氯化钙溶液中交联3min，然后用磷酸盐缓冲生理盐水冲洗三次。
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