KR102525731B1 - 유체-유체 계면을 기초로 하는 적층 가공 - Google Patents

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앤드류 리
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Abstract

이 출원은 적층 가공을 위한 매립식 인쇄 시스템 및 방법을 기술한다. 인쇄재는 지지재 내에 인쇄된다. 인쇄재 및 지지재는 각각 유체 상 및 고체 상을 갖는다. 인쇄재는 지지재와의 유체-유체 상호작용에 기초하여 유체 상으로부터 고체 상으로 전이된다. 지지재의 하나 이상의 매개변수는 유체-유체 상호작용 동안 인쇄재의 지지재로의 확산 속도가 임계치 값 미만이 되도록 조정될 수 있다. 다수의 인쇄재가 지지재 내에 동시에 인쇄될 수 있다.

Description

유체-유체 계면을 기초로 하는 적층 가공
우선권 청구
본 출원은 2017년 4월 6일자로 출원된 미국 특허출원 제62/601,995호와 2017년 9월 28일자로 출원된 미국 특허출원 제62/606,581호에 대한 35 U.S.C. §119(e)하의 우선권을 주장하며 이들의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
정부 지원 청구
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health) 번호 HL117750 하의 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 출원은 적층 가공(additive manufacturing), 구체적으로는 매립식 인쇄(embedded printing)에 관한 것이다.
적층 가공은 3차원 물체 또는 구조물을 생성하는데 사용될 수 있다. 재료는 조립 과정에서 구조물을 일시적으로 지지하는 지지 스캐폴딩(support scaffolding) 내에 인쇄(print)될 수 있다. 조립이 완료되면 지지 스캐폴드(support scaffold)가 제거된다.
본 출원은 적층 가공에 사용되는 지지재(support material) 및 인쇄된 재료(printed material)를 기술한다. 현탁된 하이드로젤의 자유 가역적 매립(Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels)(FRESH)으로 불리는, 유체를 적층 가공하는 공정은, 유체 재료(예를 들면, 알기네이트, 콜라겐, 피브린 등)를 고체 상(solid phase)과 유체 상(fluid phase)을 포함하는 일시적 지지재(예를 들면, 슬러리를 포함함)로 매립(embedding)하는 단계를 포함한다.
지지재는 고체 상과 유체 상을 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 상은, 지지재에 빙엄 소성(Bingham Plastic) 거동을 부여하는 젤라틴 입자를 포함하며, 이는 젤화(gelation) 유체가 침착(deposition) 및 지지되게 한다. 유체 상은 젤라틴 입자를 현탁시키며, 이의 체적 및 조성은 지지재의 유동학적 특성에 영향을 끼치는 것으로 이전에 나타났다. 유체 상의 조성은 매립된 유체 잉크의 젤화 거동을 제어하는데 사용될 수 있다. 이전에, 알기네이트는, 알기네이트 젤화를 촉진하기 위해 칼슘 양이온을 함유하는 유체 상을 갖는 지지재 내에 인쇄되었다. 알기네이트의 최초 용도를 넘어서, 유체 상을 물리 화학적으로 변형시켜 다른 유체 잉크, 무엇보다도 특히 콜라겐의 젤화를 조정할 수 있다. 인쇄재(print material)의 유체 상은 지지재의 유체 상과 상호작용하여, 유체-유체 계면을 형성한다. 잉크의 젤화 거동을 조정하기 위해 매립된 하이드로젤 잉크 및 지지재 사이의 유체-유체 계면은, FRESH의 사용을 피브린, 콜라겐 및 매트리젤(matrigel)과 같은 유기 중합체, 및 에폭시, 고무 및 시멘트를 포함하는 합성 중합체 둘 다로 확대될 수 있게 한다.
후술되는 시스템은, 응력 발생에 응답하여 제1 고체 상으로부터 제1 유체 상으로 전이(transition)되도록 구성된 지지재, 및 지지재에 매립되어 있는 인쇄재를 포함하고, 인쇄재는 지지재의 제1 유체 상과 인쇄재의 제2 유체 상 사이의 유체-유체 상호작용에 의해 지지재에서 제2 유체 상으로부터 제2 고체 상으로 전이되도록 구성된다.
일부 구현예에서, 지지재는 염기성이고, 인쇄재는 산성이며, 지지재의 전이는 인쇄재와 지지재의 유체-유체 상호작용 동안의 인쇄재의 중화를 포함한다. 일부 구현예에서, 인쇄재는 콜라겐, 젤라틴, 및 알기네이트 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 인쇄재는 약 60 내지 80마이크로미터의 직경을 포함하는 스트랜드(strand)를 포함한다. 일부 구현예에서, 인쇄재는 제1 인쇄재고, 시스템은 제1 인쇄재를 둘러싸는 메쉬(mesh)를 형성하는 제2 인쇄재를 포함하고, 메쉬는 지지재가 제1 인쇄재로부터 제거될 때 제1 인쇄재의 기하구조를 지지하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 인쇄재는 콜라겐을 포함하고, 제2 인쇄재는 알기네이트를 포함하고, 지지재는 칼슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 인쇄재는 젤 입자를 인쇄재로부터 제거함으로써 형성된 공극(void)으로의 세포 침윤(cell infiltration)을 허용하도록 구성된다. 지지재는 코아세르베이트(coacervate) 슬러리를 포함한다.
일부 구현예에서, 지지재는 젤 입자를 포함하고, 젤 입자는 지지재의 염 농도를 조정함으로써 형성되며, 젤 입자는 인쇄재와 혼합된다.
본 출원에 기재된 공정은, 인젝터를 제1 고체 상과 제1 유체 상 사이에서 전이되도록 구성된 지지재 내로 이동시키는 단계; 인젝터에 의해, 지지재의 일부가 제1 고체 상으로부터 제1 유체 상으로 변화되게 하는 단계; 인쇄재를 지지재 내로 주입하는 단계; 지지재의 제1 유체 상과 인쇄재의 제2 유체 상 사이의 유체-유체 상호작용에 기초하여, 인쇄재를 지지재에서 제2 유체 상으로부터 제2 고체 상으로 전이시키는 단계; 및 지지재를 인쇄재로부터 제거하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 이 공정은 인쇄재를 산성화시키는 단계 및 지지재를 알칼리성화시키는 단계를 포함하고, 지지재의 전이는 인쇄재와 지지재의 유체-유체 상호작용 동안의 인쇄재의 중화를 포함한다.
일부 구현예에서, 이 공정은 지지재의 pH를 제어함으로써 제2 고체 상에서 인쇄재의 나노구조를 제어하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 인쇄재는 콜라겐, 젤라틴, 및 알기네이트 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 이 공정은, 지지재의 매개변수를 선택하는 단계; 및 인쇄재의 유형에 기초하여 지지재의 매개변수의 값을 조정하는 단계를 포함하며, 매개변수의 값은, 매개변수의 값이 조정되지 않을 때의 유체-유체 상호작용 동안 제2 유체 상으로부터 제2 고체 상으로의 인쇄재의 전이 속도에 비해, 유체-유체 상호작용 동안 제2 유체 상으로부터 제2 고체 상으로의 인쇄재의 전이 속도가 증가하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 지지재의 매개변수는 유체-상 조성, pH, 이온 강도, 완충 용량, 및 효소 활성 중 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 이 공정은 지지재의 매개변수를 선택하는 단계; 및 인쇄재의 유형에 기초하여 지지재의 매개변수의 값을 조정하는 단계를 포함하며, 매개변수의 값은, 매개변수의 값이 조정되지 않을 때의 유체-유체 상호작용 동안 인쇄재의 지지재로의 확산 속도에 비해, 유체-유체 상호작용 동안 인쇄재의 지지재로의 확산 속도가 감소하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 지지재의 매개변수는 유체-상 조성, pH, 이온 강도, 완충 용량, 및 효소 활성 중 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 이 공정은 주입 동안 지지재를 인쇄재 내로 혼합하는 단계를 포함하며, 지지재를 제거하면 인쇄재의 제2 고체 상에 하나 이상의 공극이 발생한다. 일부 구현예에서, 지지재를 인쇄재 내로 혼합하는 단계는 지지재에 젤 입자가 형성되도록 지지재의 염 농도를 제어하는 단계를 포함하며, 젤 입자는 유체-유체 상호작용 동안 인쇄재와 혼합된다.
일부 구현예에서, 인쇄재의 제2 고체 상은 약 60 내지 80마이크로미터의 평균 직경을 갖는 콜라겐 스트랜드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인쇄재는 제1 인쇄재를 포함하고, 이 방법은, 제1 인쇄재의 유형과 제2 인쇄재의 유형에 기초하여 지지재를 변형시키는 단계; 및 제1 인쇄재와 제2 인쇄재를 지지재 내로 주입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 인쇄재는 콜라겐을 포함하고, 제2 인쇄재는 알기네이트를 포함하고, 지지재는 칼슘 양이온을 포함한다.
일부 구현예에서, 인쇄 시스템은, 인젝터; 20g/L NaCl 초과의 염 농도 및 아라비아 검(gum arabic)을 포함하는, 코아세르베이트 젤라틴 지지조(support bath)로서, 젤라틴 지지조는 pH가 8을 초과하며, 항복 응력 임계치(yield stress threshold)를 초과하는 응력에 응답하여 제1 고체 상으로부터 제1 유체 상으로 전이되도록 구성되는, 코아세르베이트 젤라틴 지지조; 및 인젝터에 의해 지지재 내로 주입되도록 구성된 콜라겐 및 알기네이트로서, 여기서, 콜라겐 및 알기네이트는 각각 pH 6 미만이고, 콜라겐 및 알기네이트는 각각 코아세르베이트 젤라틴 지지조에서의 젤화를 위해 구성되고, 젤라틴 및 알기네이트는 각각 젤화 동안 지지조 내로 10% 미만으로 확산되는, 콜라겐 및 알기네이트를 포함한다.
하나 이상의 양태들의 세부사항은 하기 첨부 도면 및 설명에 기재되어 있다. 다른 특징, 목적 및 이점은 설명과 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 인쇄 시스템을 도시한다.
도 2 내지 도 7은 각각 예시적인 지지재의 인쇄된 스트랜드의 일례를 도시한다.
도 8은 다중 재료 매립식 인쇄의 일례를 도시한다.
도 9는 적층 가공 기술들 사이의 비교를 도시한다.
도 10 내지 도 11은 다중 재료 인쇄물의 일례를 도시한다.
도 12는 예시적인 매립식 인쇄 공정의 흐름도를 나타낸다.
여러 도면에서 유사한 참조부호는 유사한 부재를 나타낸다.
도 1은 인쇄 시스템(100)을 도시한다. 인쇄 시스템(100)은, 예를 들면 인젝터(120)를 통해 지지재(130)(예를 들면, 알기네이트, 젤라틴, 셀룰로스 등) 내에 매립되는 재료(110)(예를 들면, 콜라겐, 피브린, 매트리젤, 에폭시, 고무, 시멘트 등)를 인쇄하도록 구성된다. 인쇄되는 재료(110)와 지지재(130)는 각각 고체 상과 유체 상을 갖는다. 인쇄되는 재료(110)는 유체 상에 인쇄되고 지지재(130)와의 상호작용하에 고체 상으로 전이된다. 항복 응력(예를 들면, 임계 전단 응력(critical shear stress))을 초과하는 응력이 지지재에 가해질 때 지지재(130)는 고체 상으로부터 유체 상으로 전이된다. 예를 들면, 지지재(130)를 통한 인젝터(120)의 움직임은 지지재에 항복 응력 임계치를 초과하는 응력을 가할 수 있다. 이는 지지재(130)가 인젝터(120) 주변에서 유체 상으로 전이되게 할 수 있다.
인쇄가 수행되어 인쇄되는 재료가 유체 상으로부터 고체 상으로 경화되는 동안(예를 들면, 젤화가 발생하는 동안) 지지재(130)는 재료(110)를 지지하는 스캐폴드를 형성한다. 지지재(130)의 점도 및 항복 응력이 인쇄되는 재료(잉크로도 지칭됨)의 것과 유사하면, 인쇄 시스템(100) 지지재(130)의 점도 및 항복 응력이 지지재의 것과 일치하지 않거나 유사하지 않은 경우보다 더 큰 정밀도로 인쇄될 수 있다. 또한, 더 작은 입자를 갖는 슬러리를 형성하는 지지재(130)는, 인쇄 시스템(100)에 의해 지지재에 구조물을 높은 충실도(fidelity)로 인쇄하는 것을 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 지지재(지지조, 지지 매질(support medium) 등으로도 지칭됨)는 빙엄 소성 특성들 중 적어도 일부를 나타낸다. 예를 들면, 지지재는, 지지재에 항복 응력 값보다 큰 응력(예를 들면, 전단 응력)이 가해지지 않을 때에는 고체 재료의 특성을 나타낸다. 지지재의 적어도 일부에 항복 응력 값보다 큰 응력(예를 들면, 전단 응력)이 가해질 때 지지재의 적어도 일부는 점성 액체처럼 거동한다. 일부 구현예에서, 프린터 인젝터(120)는 지지재를 통해 이동할 때 지지재에 응력을 가한다. 이는 프린터 헤드가 인쇄되는 재료(110)(잉크로도 지칭됨)를 지지재(130) 내로 주입할 수 있게 하며, 이는 구조물이 형성될 때까지 잉크를 제자리에 지지한다. 잉크(110)는 콜라겐, 피브린, 에폭시, 시멘트, 고무, 알기네이트와 같은 조직, 또는 지지재(130) 내로 주입된 후 젤화되는 재료와 같은 다른 재료를 포함할 수 있다. 지지재(130)는 젤화가 완료될 때까지 잉크를 지지한다. 그 다음에 지지재를 제거할 수 있다(예를 들면, 용융 제거한다).
인쇄되는 재료(110)를 유체 상으로부터 고체 상으로 전이하는 것, 그리고 전이가 발생하는 방식은 인쇄되는 구조물의 품질에 영향을 끼친다. 전이의 제어는 인쇄 충실도를 증가시키는데 유용하다. 인쇄되는 재료(110)의 전이는, 인쇄되는 재료와 지지재(130) 사이의 유체-유체 상호작용을 제어함으로써 제어될 수 있다. 유체-유체 상호작용은 인쇄재의 유체 상과 지지재의 유체 상 사이의 상호작용이다. 인쇄재가 지지재 내로 삽입(예를 들면, 주입)되면 유체-유체 상호작용이 발생한다. 인쇄재의 삽입 동안 삽입 지점에서 지지재는 고체 상으로부터 유체 상으로 전이된다. 유체로서 인쇄된 인쇄재는 (예를 들면, 인쇄재 및 지지재가 만나서 상호작용하는) 유체-유체 계면에서 지지재를 만난다. 예를 들면, 지지재는 인쇄재의 젤화를 발생시키거나 유체로부터 고체로의 인쇄재의 전이를 발생시킨다. 후술된 바와 같이, 유체-유체 상호작용은 지지재(130)와 인쇄되는 재료(110)의 다양한 매개변수의 선택에 기초하여 제어될 수 있다.
지지재(130)의 유체 상은, 예상대로 지지내 내로의 콜라겐 I형 매립 및 젤화를 제어하기 위해 특별히 조작될 수 있다. 지지재의 유체 상을 제어하면 충실도가 높은 복잡한 인쇄 기하구조가 가능해진다. 콜라겐 I형은 산성 조건에 가용성이다. 콜라겐 I형 용액의 pH와 온도가 중성 pH 및 37℃가 되면 이러한 용해도는 역전된다. 지지재의 유체 상을 pH가 높은 용액으로 대체하여, 산성 콜라겐 I 용액의 중화를 달성한다. 중화는 인쇄재를 산성 또는 염기성 상태로부터 대략 중성이 되게 하여, 인쇄재의 pH가 대략 7(예를 들면, 6 내지 8)인 것을 의미한다. 간단하게, 지지재를 원심분리하여 고체 및 유체 상을 분리한다. 상청액을 제거하고 이를 고체 상과 완전히 혼합된 NaOH 용액으로 대체한다. 원하는 pH를 달성할 때까지 이들 단계를 반복한다. 이러한 높은 pH의 지지재 내로 인쇄하면, 도 2 내지 도 6에 도시되고 후술되는 바와 같이, 높은 충실도, 중합된 콜라겐 I형의 단일 80㎛ 스트랜드의 반복 가능한 매립이 초래된다.
지지재 pH는, 젤화재(gelling material)의 유체 대 고체 전이를 제어하기 위해 이러한 방식으로 변형될 수 있는 다수의 유체 상 매개변수들 중 하나일 뿐이다. 유체-상 조성, 화학, 이온 강도, 완충 용량, 효소 활성은 지지재 내에서 쉽게 미세 조정될 수 있고 다양한 잉크에 대해 특별히 맞춰질 수 있는 변수들 중 일부이다. 이 방법으로, 다수의 잉크를 각각의 잉크에 대한 젤화를 용이하게 하기 위해 변형된 단일 지지재(130) 내에 함께 인쇄할 수 있다. 예를 들면, 별도의 콜라겐 및 알기네이트 잉크를 칼슘 양이온 함유 단일 고 pH 지지재 내에 인쇄하여 단일 다중 재료 인쇄를 구성할 수 있다. 젤화를 제어하기 위한 유체-유체 계면을 조작하는 이 방법은, 변경된 유체 상이 고체 젤라틴 입자에 끼칠 수 있는 화학적 물리적 영향에서만 제한된다. 젤라틴 가수분해는 극단적인 pH에서 발생할 수 있으며, 이온의 존재는 젤라틴 입자 밀도, 크기 및 형태에 영향을 줄 수 있다. 지지재(130)의 유체 상이 용이하게 변형될 수 있고, 유체 상 내에서 조정될 수 있는 넓은 범위의 인자는 지지재의 유동학의 변화가 언급될 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 지지재는 예를 들면 2018년 4월 5일자로 출원된 출원 제62/601,949호 및 2017년 9월 28일자로 출원된 출원 제62/601,578호에 기재된 코아세르베이트 슬러리이며, 이들은 각각 참조로 본원에 인용되어 있다. 코아세르베이트 슬러리는 젤 마이크로입자를 포함한다. 입자의 크기 및 형상을 포함하는 입자의 기하구조는 코아세르베이트 슬러리가 생성되는 공정 및 코아세르베이트에 사용되는 재료에 기초하여 제어될 수 있다. 입자는 직경이 0.5 마이크로미터 내지 60마이크로미터일 수 있고, 변동은 35% 미만이다. 입자는 슬러리에서 단분산될 수 있다. 젤 입자는 인쇄 공정 동안 인쇄재(예를 들면 콜라겐)와 혼합될 수 있다. 슬러리가 제거 될 때(예를 들어 용융 제거), 인쇄된 콜라겐에 공극이 남는다. 따라서 공극은 인쇄재에 전체에 걸쳐 실질적으로 균일한 크기 및 분포를 갖는다. 반-다공성 인쇄재는 생체내 적용에 특히 유용하다. 인쇄재의 공극은 인쇄 구조물의 생체내 적용을 위한 세포 침윤을 촉진할 수 있다. 공극의 수 및 공극의 분포는 본 출원에 기재된 바와 같이 인쇄물의 젤화를 제어함으로써 제어될 수 있다.
도 2는 상이한 매개변수를 갖는 지지재로 인쇄된 스트랜드의 일례를 도시한다. 스트랜드(200, 210)는 Hyclone 10x 포스페이트 완충 식염수(PBS) 기반 지지재 내에 인쇄된다. 10x PBS로 인쇄된 스트랜드는 매끄럽고 직경이 일정하며, 후술된 다른 지지재로 인쇄된 스트랜드에 비해 스트랜드-대-스트랜드 융합이 비교적 낮다. 스트랜드(220)는 80g/L NaCl을 갖는 지지재 내에 인쇄되며, 이는 기준 지지재 염 농도에 비해 상승된 염 농도이다. 아마 염석(salting-out)을 통해, 높은 염 농도(80g/L) 만으로도 콜라겐 조립을 유도하기에 충분하다. 스트랜드(230)는 10x 포스페이트 완충액을 갖는 지지재 내에 인쇄된다. 스트랜드(240)는 10x 포스페이트 완충액 및 높은 NaCl 농도를 갖는 지지재 내에 인쇄된다. 높은 포스페이트 완충액 농도는 염이 포스페이트 완충액에 재첨가될 때처럼 매끄럽지 않은 스트랜드를 생성한다.
도 3은 상이한 매개변수를 갖는 지지재로 인쇄된 스트랜드의 일례를 도시한다. 스트랜드(300)는 80g/L의 NaCl의 염 농도를 또한 포함하는 50mM HEPES 완충액 내에 인쇄된다. 스트랜드(310)는 40g/L의 NaCl의 염 농도를 또한 포함하는 50mM HEPES 완충액 내에 인쇄된다. 스트랜드(320)는 0.80g/L의 NaCl의 염 농도를 또한 포함하는 50mM HEPES 완충액 내에 인쇄된다. 스트랜드(330)는 80g/L의 NaCl의 염 농도를 또한 포함하는 200mM HEPES 완충액 내에 인쇄된다 지지재에서 높은 NaCl 농도는 "매끄러운" 인쇄된 콜라겐 스트랜드를 촉진시킨다. 이들 스트랜드의 형성에 충분한 지지재의 50mM HEPES 용액. 통상의 세포 배양물 배지는 15 내지 20mM HEPES이다. 스트랜드(300, 310, 320, 330)를 나타내는 각각의 이미지에서, 인쇄재가 지지재 내로 일부 확산되지만, 이는 인쇄재의 10% 미만으로 제한된다. 일부 구현예에서, 확산은 인쇄재의 1% 미만이다. 포스페이트 완충액을 HEPES 완충액으로 대체하는 능력으로 인해 칼슘 이온을 첨가할 수 있기 때문에, 이들 지지재는, 2중 알기네이트 및 콜라겐 인쇄에 특히 유용하다.
도 4는 상이한 완충액 강도에서 그리고 인쇄 이후 상이한 양의 경과 시간 후 인쇄된 스트랜드의 이미지(400)을 도시한다. 맨 윗줄은 10x PBS를 갖는 용액을 포함한 지지재에 인쇄된 스트랜드를 보여준다. 가운데 줄은 20x 1% 완충액을 갖는 용액을 포함한 지지재에 인쇄된 스트랜드를 보여준다. 맨 아래 줄에는 20x 2% 완충액을 갖는 용액을 포함한 지지재에 인쇄된 스트랜드를 보여준다. 좌측 열은 지지재 내에 인쇄된 직후의 스트랜드 이미지를 보여준다. 중간 열은 지지재 내에 인쇄된지 24시간이 지난 후의 스트랜드 이미지를 보여준다. 우측 열은 지지재 내에 인쇄되고 4℃에서 보관되고 24시간이 지난 후의 스트랜드 이미지를 보여준다. 각 스트랜드에 대해, 인쇄되는 재료는 2% Fisher Gel B를 포함한다. 0.25% F127 1% 아라비아 검이 포함되고, pH는 6이다. 세척액은 50mM HEPES, 0.16% CaCl2, 80g/L NaCl을 포함한다. 2000g에서 5분 동안 원심분리한다.
도 5a 내지 도 5b는 상이한 지지재로 인쇄된, 인쇄된 스트랜드(500 내지 570)의 예를 도시한다. 스트랜드의 좌측 이미지에는 멀리서 찍은 이미지가 포함되고 우측 이미지는 가까이서 찍은 것이다. 스트랜드(500 내지 530)는 Fisher Gel B pH 6, 0% 아라비아 검을 포함한다. 스트랜드(540 내지 570)는 Fisher Gel B pH 6, 1% 아라비아 검을 포함한다. 스트랜드(500 및 540)는 21℃에서 MW pH 7.4을 포함하는 지지재에 인쇄되어 인쇄 직후에 보여진 것이다. 스트랜드(510 및 550) 21℃에서 MW pH 7.4을 포함하는 지지재에 인쇄되어 인쇄된지 4시간이 지난 후에 보여진 것이다. 스트랜드(520 및 560)는 21℃에서 MW pH 5.85를 포함하는 지지재에 인쇄되어 인쇄된지 4시간이 지난 후에 보여진 것이다. 스트랜드(530 및 570)는 21℃에서 MW pH 7.4를 포함하는 지지재에 인쇄되어 인쇄된지 4시간이 지난 후에 보여진 것이다. MW pH 7.4의 인쇄된 스트랜드는 21℃에서 4시간 동안 교반된 후 악화된다. MW pH 5.85는 MW pH 7.4보다 급속 용융하기 때문에 인쇄에 사용할 수 없는 슬러리가 된다. HEPES/CaCl2 슬러리는 실온에서 열화(degradation)되지 않는다. HEPES/CaCl2는 다른 지지재보다 눈에 띄게 느리게 용융된다(두 번째 용융 주기). 인쇄된 젤 및 융점, 이온 강도 및 용해도가 변하기 때문에 높은 NaCl 농도는 슬러리 열화에 기여한다. NaCl의 첨가는 콜라겐 스트랜드 형태에 크게 영향을 미치며, 슬러리 유동학이 초기 콜라겐 스트랜드 형태를 결정하고, 콜라겐 중합의 완료가 최종 스트랜드를 결정하고 충실도를 결정한다는 것을 보여준다. 지지재(예를 들면, 슬러리) 유동학 매개변수는 포장, 전하를 통한 입자-입자 상호작용, 슬러리 유동, 혼합, 및 프랙킹(fracking)을 포함한다. 인쇄되는 재료(예를 들면, 콜라겐) 중합을 위한 매개변수는 pH, 이온 강도, 온도 등을 포함한다.
도 6은 스트랜드 중합에 대한 젤 B-GA(Acros) 액체 상 효과를 도시한다. 스트랜드(600)는 1x PBS를 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(610)는 10x PBS를 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(620)는 200nM HEPES를 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(630)는 8개의 필수 배지를 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(640)는 세포외 완충액을 포함하는 지지재에 인쇄된다.
도 7은 스트랜드 중합에 대한 pH 변경의 효과를 보여준다. 각 이미지는 인쇄된지 24시간이 지난 후의 스트랜드를 나타낸다. 스트랜드(700)은 pH 8.5의 완충액을 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(710)는 pH 9의 완충액을 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(720)는 pH 9.5의 완충액을 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(730)는 pH 10의 완충액을 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(740)는 pH 10.5의 완충액을 포함하는 지지재에 인쇄된다. 스트랜드(750)는 pH 11의 완충액을 포함하는 지지재에 인쇄된다.
도 8은 다중 잉크(multi-ink) 인쇄의 예를 도시한다. 전술된 바와 같이, 콜라겐 및 다른 느린 젤화 잉크는 슬러리에서 확산되기 쉽다. 이러한 현상은 콜라겐 FRESH 인쇄를 둘러싼 확산 헤이즈로서 볼 수 있으며, 이에 대한 유일한 해결책은 인쇄조(print bath)에서의 보다 공격적인 젤화 방법이다. 이러한 확산을 억제하기 위한 노력은 NaOH, 양성자 스펀지(Proton Sponge)(Sigma), 및 리보플라빈, 트랜스글루타미나제 및 글루타르알데히드와 같은 후처리 가교 화학 물질의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 주변 젤과 같이 보강 없이 인쇄된 콜라겐 고리는 취급 가능하지 않다. 변경되지 않은 대부분의 콜라겐 하이드로젤 3D 인쇄는 영구적인 변형 없이 용액에서 들어올려질 수 없으며, 이는, 콜라겐 하이드로젤이 너무 약해서 용액 외부를 지지할 수 없기 때문이다. 콜라겐과 함께 알기네이트와 같은 강성(rigid) 하이드로젤을 포함하면 콜라겐의 기하구조를 용액으로부터 융합하고 유지하는 보강이 제공될 것이다.
인쇄된 알기네이트 메쉬에 의해 지지된 인쇄된 콜라겐 하이드로젤(800)의 고리(ring)는, 2개의 하이드로젤의 경계(border)에서 융합된 상태로 유지될 뿐만 아니라 공기 중에서 여러 번 운반된 후에도 정확한 치수를 유지하는 것으로 나타났다. 다중 재료 인쇄물(800)은 알시안 블루(Alcian Blue)로 염색된 알기네이트 하이드로젤로 둘러싸인 콜라겐 하이드로젤의 내부 고리를 나타내며, 단위는 미국 페니(U.S. penny)로 표시된다. 파일(file)로부터의 가장 큰 치수 편차는 알기네이트 메쉬의 측면에서 발견되었으며 이는 8mm인 것으로 간주되었지만 8.25mm에 더 가까웠다. 콜라겐 고리는 4.4mm의 내부 직경 및 6mm의 외부 직경을 갖는 것으로 간주되었다. 알기네이트 메쉬의 엣지(edge) 및 콜라겐 링의 내부 및 외부 직경에 대한 측정치(810)가 도시되어 있다. 측정된 작제물(810)은 의도된 직경과 일치하는 치수를 도시한다. 다른 예에서, 이들의 알기네이트 메쉬 대응물(820)로부터 수동으로 뜯어낸 콜라겐부(830)는 해리 동안 알기네이트 메쉬의 일부를 가져왔다. 해리된 다중 재료 인쇄물(820)은 우측에 콜라겐 링을 나타내고 좌측에 알기네이트 메쉬를 도시한다. 이들 다중 재료 인쇄물의 알기네이트 부분과 콜라겐 부분 사이의 융합은 취급 동안 콜라겐 기하구조를 유지하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 또한, 규모가 커진 유선관 상피(mammary duct epithelium)의 다중 재료 콜라겐 및 알기네이트 인쇄물은 실험실 바닥으로 떨어져도 생존하였다. 다중 재료 안쇄물(840)은 이의 모 비커(parent beaker)의 파편(shard)과 함께 수 피트 떨어져 있는 실험실 바닥에 도시되어 있다. 이는 회수되어 이미지화된 후, 이는 손상되지 않고 알기네이트 섬유에 싸여있는 것으로 나타났다. 제거된 콜라겐 고리(850)는, 콜라겐에 융합되었고 분리될 수 없어서 젤의 융합을 입증하는 알기네이트 섬유를 보여준다. 인쇄물(840)은 회수되어 암시야 조명하에 보여지며, 부서지기 쉬운 콜라겐 성분(850)의 인쇄물 내부에서의 유지를 나타낸다. 인셋(inset)은 콜라겐 성분의 파일이다.
콜라겐 자체는 용액 외부의 중량을 견디는 방식으로 섬세하게 인쇄될 수 없는 부서지기 쉬운 재료이기 때문에, 알기네이트로 콜라겐을 보강하는 이 방법은 복잡한 콜라겐 성분들의 생성 및 조작을 위한 해결책이다. 콜라겐은 칼슘-킬레이팅조(chelating bath)에 침지함으로써 손상없이 알기네이트로부터 분리될 수 있으며, 이는 알기네이트 메쉬의 용해 및 콜라겐 성분의 완전한 배출을 초래한다(860). 콜라겐계 3D 인쇄된 조직(860)은 알기네이트 쓰레드(thread)로부터 제거된다. 이들 작제물은, 세포와 함께 씨딩(seeding)될 때, 전체적인 기하학적 충실도를 유지하면서 콜라겐 작제물의 압축을 나타내었다. 알기네이트 메쉬의 존재로 인해, 이들 작제물은 콜라겐 성분에 닿거나 방해하지 않고 용이하게 취급, 씨딩, 배양 및 고정될 수 있다는 것이 주목된다.
유체 잉크를 사용하는 다른 기술과 비교하여 FRESH는 더 빠르고 더 많은 재료를 인쇄할 수 있으며, 이는, 매립 매질로부터 인쇄물의 완전한 배출을 허용하면서도 가능하다. 하기 표 3.2에 차이점이 요약되어 있다.
도 9는 FRESH를 다른 유체 인쇄 기술과 비교한 것이다. 직접 기록형 인쇄(direct write printing)는 유체 및 기타 여러 기술의 FDM을 대표한다.
예시적인 구조물
변경되지 않은 ECM의 조합으로부터 모든 기하구조를 제작할 수 있으므로 생체내 조건을 모방하는 구조의 조직을 조작할 수 있다. FRESH 기술은 조직 배양에 적합한 일련의 복잡한 생체모방 다중 재료 하이드로젤 스캐폴드의 적층 가공에 사용되었다.
콜라겐 하이드로젤 함유 세포는 세포의 부착, 증식 및 재형성으로 인해 시간이 지남에 따라 압축될 수 있다. 이 과정이 규제되지 않으면, 많은 작제물이 괴사 핵(necrotic core)을 포함하는 조밀한 상태로 압축된다. 다수의 조작된 조직은 젤 내부의 응력에 기초하여 내부 세포를 정렬시키는 맨드릴(mandrel) 또는 일련의 강성 기둥(rigid post) 주위에 압축된 세포질 젤로 이루어진다. 제한되지 않은 관형 작제물(tubular construct)에서, 압축은 내부 루멘(lumen)의 초기 폐쇄 및 궁극적으로 치밀한 덩어리(dense mass)로의 융합으로 드러난다. 따라서, 도관 상피(ductal epithelium)와 같은 조작된 분지(branching) 작제물이 괴사 부위 및 부분 루멘 폐쇄(partial lumen closure)와 함께 조밀하고 기능이상인 상태로 압축될 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 배양에서 압축되지 않는 콜라겐형 세포형 하이드로젤 잉크를 제형화하는 것이 가능할 수 있지만, 이에 대한 요구 사항은 본 발명의 범주를 벗어난 것으로 보인다. 대신, 강성 알기네이트 하이드로젤 압출의 희박한 그물(sparse net) 내에 콜라겐 작제물을 매립하는 것이 더 용이해야 한다.
도 10은 인쇄물(1000)에 의해 도시된, 콜라겐 상에 알기네이트 스캐폴드를 사용하는 다중 재료 인쇄 공정을 도시한다. 연질 콜라겐 하이드로젤 덩어리는 보다 강성의 알기네이트 하이드로젤의 희박한 그물을 따라 3D 인쇄된다. 콜라겐 하이드로젤을 통상 변형시키는 힘은 작제물을 둘러싸는 알기네이트 메쉬에 대항하여 작용하도록 강제된다. 알기네이트는 추가 압출기에서 별도의 잉크로서 인쇄물에 포함되며 메쉬는 일반적으로 3D 인쇄물의 내부에서 보이는 희박한 충전 패턴(sparse infill pattern)으로 생성된다. 콜라겐형 하이드로젤과 알기네이트 잉크의 이중 압출은 이중 압출기(1010)에 의존한다. 하나의 인쇄된 재료를 다른 재료 내에 고정시키는 이러한 접근법을 시험하려면 콜라겐 젤의 수직 튜브와 같은 단순화된 기하구조가 알기네이트 메쉬(1020)에 인쇄되어야 한다. 2개의 스테퍼(stepper)는 콜라겐 및 알기네이트 하이드로젤 잉크를 갖는 한 쌍의 실린지 펌프 압출기에 전원을 공급한다. 교정 인쇄물을 사용하여 인쇄 정확도를 검량하는 것과 같이 튜브의 치수를 측정하며, 현미경사진을 알려진 디지털 치수와 비교한다. 중공 튜브는, 취급 또는 배양 동안에 그 형상을 유지하기 위해 알기네이트 메쉬 내부의 연질 하이드로젤로부터 인쇄된다.
생체내 환경을 시험관내에서 복제하는 것은 생체내 등가물의 외관을 밀접하게 모방하는 조작된 작제물을 의미한다. 이미징 데이터는 전체 장착 조직 샘플의 광학 투영 단층촬영(optical projection tomography)(OPT)으로부터 처리될 수 있으며, 소프트웨어 분석을 통해 조직을 3D 인쇄 가능한 고체로 모델링할 수 있다. 이미징 데이터로부터 모델링된 전체 도관 상피를 인쇄함으로써, 분지 나무(branching tree) 내의 분기점(bifurcation)과 같은 상피의 내부 특징이 원시 조직을 기하학적으로 나타내는 것을 보장한다.
도관 상피는 유방암 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 3가지 마우스 균주(strains)와 밀접하게 관련되어 있는 4가지 뚜렷한 발달 형태를 갖는다는 것이 밝혀졌으므로, 선택된 상피의 기하구조 변화시키는 것과, 상이한 형태들에 걸쳐 유사한 수준의 정확도를 얻는 것이 중요하다. 3D 인쇄물의 정확도를 검증하는 것은 OPT 또는 공초점 현미경(confocal microscopy)과 같은 기술을 사용하여 이들을 이미징함을 포함하며, 이러한 공정으로부터 얻은 데이터를 사용하여 3D 프린터의 출력을 입력 파일의 크기와 직접 비교할 수 있다. 상피 배양을 위한 도관 상피의 정확한 모델의 3D 인쇄에 의해, 연구원들은 DCIS에 대한 생체내 환경을 면밀히 시뮬레이션할 수 있으며 잠재적으로는 숙주 유기체(host organism)를 사용하지 않고 동일반응계-대-침습성 전이(in situ-to-invasive transition)를 연구할 수 있다. 생체모방적이고 전적으로 사용자 특이적인 환경에서 DCIS의 거동을 조사(probe)할 수 있는 기회는, 어떤 DCIS 사례가 개입(intervention)이 필요한지를 이해하는 데 유용한 도구가 될 것이다. 실제로, 인쇄된 상피(epithelial) 모델은 DCIS를 갖는 특정 환자의 영상 데이터로부터 생성될 수 있으며, 이어서 코링 니들 생검(coring needle biopsy)이 환자의 상피 세포 및 용의자 병변 둘 다에 작제물을 시딩하는데 사용될 수 있다. 환자 밖에서 병변이 성장하면, 의사는 현재 환자들 사이에서 널리 퍼져 있는 최악의 전악성종양 시나리오(worst-case pre-malignant scenario)를 가정하지 않고도 필요한 치료 루틴과 표적 요법을 식별할 수 있다.
전술된 다중 인쇄 적용의 유연성(flexibility)은, 세포의 존재 또는 부재하에 그리고 복잡한 기하구조를 압축하는 세포의 우려 없이 모든 연질 하이드로젤에서 섬세한 분기 구조물을 프로토타입할 수 있게 한다.
인쇄물은 3D 인쇄 소프트웨어로 모델링되었다. 특정 모델의 콜라겐 성분을 소프트웨어로 가져온 다음, 소프트웨어 메쉬-편집 메뉴를 사용하여, 함께 제공되는 알기네이트 성분을 본래의 콜라겐 성분의 "부분"으로 가져왔다. 콜라겐 성분은 제1 압출기를 사용하여 지정되었고 알기네이트 성분은 제1 압출기를 사용하여 지정되었다. 이어서 알기네이트 성분은 하기 표 1에 나타낸 설정 변경자(setting modifier)를 할당하였다.
Figure 112019113488470-pct00001
2가지 재료를 인쇄하기 위해, 듀엣 프린터(duet printer)의 제1 및 제2 Replistruder에, 80㎛ 니들이 특징인 콜라겐 100㎕ 시린지와 150㎛ 니들이 특징인 알기네이트 2.5mL 시린지가 부하되었다. 콜라겐 시린지 상의 80㎛ 니들은 너무 길고 얇아 인쇄 과정에서 휘어져, 압출기에 의한 기계 움직임의 렌더링이 불량해졌다. 이 니들에 의해 인쇄된 모든 수직 튜브는 융착되었고, 날카로운 모서리는 둥글게 되었다. 이에 대한 해결책은, 버팀목(brace)으로 사용하기 위해 더 큰 니들을 레이저 절단하는 것이었다. 길다란 250㎛ 니들의 1/2을 레이저 절단하고, 미경화 에폭시로 채우고, 80㎛ 니들로 미끄러뜨리고, 65℃에서 2시간 동안 베이킹하였다.
MK2는, 25mM Na-HEPES 및 50% v/v 에탄올을 갖는 70mM CaCl2 내에 침지하기 전에, 25mM Na-HEPES를 갖는 따뜻한 70mM CaCl2에서 적어도 24시간 동안 철저히 세척하였다. 이어서, 이 50% 에탄올 용액 중의 MK2를 4℃에서 24시간 동안 정치시켰다. 씨딩 및 배양 개시일에, 작제물을 이 에탄올 용액으로부터 제거하고 25mM Na-HEPES를 갖는 따뜻한 70mM CaCl2 내에 넣었다. 이 유체에 적어도 30분 동안 둔 다음, 작제물을 25mM Na-HEPES와 함께 새로운 70mM CaCl2로 세척 한 후 10mM CaCl2가 보충된 세포 배지에 넣었다.
ATCC MCF7 (HTB-22) 및 ATCC MCF 10A (CRL-10317) 세포를 pHIV-ZSGreen 렌티바이러스로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 선택하도록 유동 분류하였다. 생성된 세포를 ATCC 지침에 따라 배양하였다. 작제물을 멸균-여과된 20℃ 1% CaCl2에서 25mM Na-HEPES로 세척하였다. 이어서, 작제물을, 10mM CaCl2 및 200㎍/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 20℃ 멸균-여과된 ATCC 배지에 10분 동안 침지시켰다. 이어서, 작제물을 웰당 하나의 작제물로 6-웰 플레이트에 넣었다. 작제물의 절반이 침지될 때까지(대략 3mL) 보충된 배지를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 1×106 세포/mL의 보충 배지에 현탁시켰다. 50㎕의 세포 현탁액을 각 작제물의 깔대기 부분의 중심으로 직접 피펫팅하였다. 작제물의 절반에 대해, 이들의 4개 면들 중 하나를 켜고 37℃에서 20분 동안 그대로 두었다. 이어서, 씨딩을 반복한 다음, 각각의 작제물이 각각의 면에 씨딩될 때까지 4회 더 휴지 기간을 두었다. 세포가 작제물 내에 있음을 확인하기 위해 작제물을 Olympus IX83 형광 현미경으로 신속하게 이미지화하였다. 씨딩 동안 회전하지 않은 각각의 세포 유형에 대한 3가지 중 하나의 구조물은 직립 위치에서 200,000개의 세포로 씨딩되었다. 모든 구조물을 이의 최종 조건으로 되돌리고, 정기적인 배지 교환으로 7일 동안 37℃ 배양에 두었다. 7일 후, 고정 전에 각각의 웰로부터 배지를 흡인하였다.
배양된 MK2를 37℃에서 1X PBS(0.625mM MgCl2 및 10mM CaCl2로 보충됨)로 세정하고, 10mM CaCl2(Polysciences, Inc.)와 함께 4% w/v 포름알데히드로 15분간 세정한 후 25mM Na-HEPES와 함께 11mM CaCl2에서 3회 세척하였다. 고정된 MK2는 5x 대물렌즈(0.45 NA)를 갖는 Nikon AZ-C2 매크로 공초점 현미경 및 10x(NA=0.4) 대물렌즈 및 25x(NA=0.95) 침수 대물렌즈(water immersion objective)를 갖는 Leica SP5 다광자 현미경으로 이미지화하였다. 3D 이미지 스택을 AutoQuant X3로 분리하고 Imaris 7.5로 처리하였다.
콜라겐 및 세포가 알기네이트 쓰레드에 의해 가려진 경우, 고정된 MK2를 100mM Na-시트레이트 완충액에서 12시간 동안 세척하여 알기네이트를 제거할 수 있었다. 이어서 작제물을 10% w/v 젤라틴 A에 매립시키고 구획화할 수 있었다. 내부 세포가 부착된 생성된 콜라겐 성분은 현미경으로 접근 가능하였다. 알기네이트 쓰레드를 제거한 후 Leica SP5 다광자 현미경 및 25x 수 대물렌즈(water objective)(NA=0.95)로 435nm에서 콜라겐 I의 반사율 이미징을 사용하여 3D z-스택을 획득하였다.
콜라겐 압출기의 니들이 보강된 후, 코아세르베이트 슬러리에서 생성된 MK2 작제물은, 압출의 변형 또는 지연이 거의 또는 전혀 없는 것으로 보이는, 콜라겐의 완전 동심 원형 압출을 가졌다. 출력 인쇄물(1100)을 도시한다. 이러한 출력 품질은 단분산 미세 입자를 갖는 코아세르베이트의 매우 미세한 질감 및 별도의 압출기 니들 사전-인쇄물의 정렬에 대한 관심에 크게 기인한다. MK1 및 MK2 작제물의 외부는 알기네이트 메쉬의 90° 크로스해치 패턴을 갖는 정사각형 프로파일을 가졌다. 깔때기의 테두리(rim)는 거의 항상 의도된 값의 1% 이내의 직경을 가졌다. 초기 데이터는 도관의 내부 직경이 의도된 값의 대략 2% 내에 있음을 보여준다. 동일한 데이터에 따라, 배양 후 인쇄물이 배출될 때 인쇄물을 인쇄하는 데 사용된 파일의 의도된 직경의 2% 내에 있는 싹(bud)이 있는 것으로 밝혀졌다.
도 12는 예시적인 매립식 인쇄 공정의 흐름도(1200)을 도시한다. 인젝터를 제1 고체상과 제1 유체 상 사이에서 전이되도록 구성된 지지재 내로 이동시킨다(1210). 인젝터에 의해 지지재의 일부가 제1 고체상으로부터 제1 유체 상으로 변화된다(1220). 인젝터는 인쇄재를 지지재 내로 주입한다(1230). 지지재의 제1 유체 상과 인쇄재의 제2 유체 상 사이의 유체-유체 상호작용에 기초하여, 인쇄재를 지지재에서 제2 유체 상으로부터 제2 고체 상으로 전이시킨다(1240). 지지재를 인쇄재로부터 제거한다(1250).
다수의 양태들이 설명되었다. 그럼에도, 청구범위의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서도 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 양태들은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (23)

  1. 시스템으로서,
    응력 발생에 응답하여 제1 고체 상으로부터 제1 유체 상으로 전이되도록 구성된 지지재(support material); 및
    상기 지지재에 매립되어 있는 인쇄재(print material)로서, 상기 인쇄재는 상기 지지재의 상기 제1 유체 상과 상기 인쇄재의 제2 유체 상 사이의 유체-유체 상호작용에 의해 상기 지지재에서 상기 제2 유체 상으로부터 제2 고체 상으로 전이되도록 구성되고, 상기 지지재는 상기 지지재의 상기 제1 유체 상과 상기 인쇄재의 상기 제2 유체 상 사이의 유체-유체 상호작용에 기초하여 상기 인쇄재의 젤화를 제어하는, 인쇄재
    를 포함하는, 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지지재는 염기성이고, 상기 인쇄재는 산성이며, 상기 지지재의 전이는 상기 인쇄재와 상기 지지재의 상기 유체-유체 상호작용 동안의 상기 인쇄재의 중화를 포함하는, 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인쇄재는 콜라겐, 젤라틴, 및 알기네이트 중 적어도 하나를 포함하는, 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인쇄재는 60 내지 80마이크로미터의 직경을 포함하는 스트랜드(strand)를 포함하는, 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인쇄재는 제1 인쇄재이고, 상기 시스템은 상기 제1 인쇄재를 둘러싸는 메쉬(mesh)를 형성하는 제2 인쇄재를 포함하고, 상기 메쉬는 상기 지지재가 상기 제1 인쇄재로부터 제거될 때 상기 제1 인쇄재의 기하구조를 지지하도록 구성되는, 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 인쇄재는 콜라겐을 포함하고, 상기 제2 인쇄재는 알기네이트를 포함하며, 상기 지지재는 칼슘을 포함하는, 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 지지재는 젤 입자를 포함하고, 상기 젤 입자는 상기 지지재의 염 농도를 조정함으로써 형성되고, 상기 젤 입자는 상기 인쇄재와 혼합되는, 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인쇄재는 상기 젤 입자를 상기 인쇄재로부터 제거함으로써 형성된 공극(void)으로의 세포 침윤(cell infiltration)을 허용하도록 구성되는, 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 상기 지지재는 코아세르베이트(coacervate) 슬러리를 포함하는, 시스템.
  10. 적층 가공 방법으로서,
    인젝터를 제1 고체 상과 제1 유체 상 사이에서 전이되도록 구성된 지지재 내로 이동시키는 단계;
    상기 인젝터에 의해, 상기 지지재의 일부가 상기 제1 고체 상으로부터 상기 제1 유체 상으로 변화되게 하는 단계;
    인쇄재를 상기 지지재 내로 주입하는 단계;
    상기 지지재의 상기 제1 유체 상과 상기 인쇄재의 제2 유체 상 사이의 유체-유체 상호작용에 기초하여, 상기 인쇄재를 상기 지지재에서 상기 제2 유체 상으로부터 제2 고체 상으로 전이시키는 단계로서, 상기 지지재는 상기 지지재의 상기 제1 유체 상과 상기 인쇄재의 상기 제2 유체 상 사이의 유체-유체 상호작용에 기초하여 상기 인쇄재의 젤화를 제어하는, 단계; 및
    상기 지지재를 상기 인쇄재로부터 제거하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인쇄재를 산성화시키는 단계; 및
    상기 지지재를 알칼리성화시키는 단계
    를 추가로 포함하고,
    상기 지지재의 전이는 상기 인쇄재와 상기 지지재의 상기 유체-유체 상호작용 동안의 상기 인쇄재의 중화를 포함하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 지지재의 pH를 제어함으로써 상기 제2 고체 상에서 인쇄재의 나노구조를 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 인쇄재는 콜라겐, 젤라틴, 및 알기네이트 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 지지재의 매개변수를 선택하는 단계; 및
    상기 인쇄재의 유형에 기초하여 상기 지지재의 상기 매개변수의 값을 조정하는 단계로서, 상기 매개변수의 상기 값은, 상기 매개변수의 상기 값이 조정되지 않을 때의 상기 유체-유체 상호작용 동안 상기 제2 유체 상으로부터 상기 제2 고체 상으로의 상기 인쇄재의 전이 속도에 비해, 상기 유체-유체 상호작용 동안 상기 제2 유체 상으로부터 상기 제2 고체 상으로의 상기 인쇄재의 전이 속도가 증가하도록 구성되는, 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 지지재의 상기 매개변수는 유체-상 조성, pH, 이온 강도, 완충 용량, 및 효소 활성 중 하나를 포함하는, 방법.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 지지재의 매개변수를 선택하는 단계; 및
    상기 인쇄재의 유형에 기초하여 상기 지지재의 상기 매개변수의 값을 조정하는 단계로서, 상기 매개변수의 상기 값은, 상기 매개변수의 상기 값이 조정되지 않을 때의 상기 유체-유체 상호작용 동안 상기 인쇄재의 상기 지지재로의 확산 속도에 비해, 상기 유체-유체 상호작용 동안 상기 인쇄재의 상기 지지재로의 확산 속도가 감소하도록 구성되는, 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 지지재의 상기 매개변수는 유체-상 조성, pH, 이온 강도, 완충 용량, 및 효소 활성 중 하나를 포함하는, 방법.
  18. 제10항에 있어서, 상기 주입 동안 상기 지지재를 상기 인쇄재 내로 혼합하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 지지재를 제거하면 상기 인쇄재의 상기 제2 고체 상에 하나 이상의 공극이 발생하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 지지재를 상기 인쇄재 내로 혼합하는 단계는, 상기 지지재에 젤 입자가 형성되도록 상기 지지재의 염 농도를 제어하는 단계를 포함하며, 상기 젤 입자는 상기 유체-유체 상호작용 동안 상기 인쇄재와 혼합되는, 방법.
  20. 제10항에 있어서, 상기 인쇄재의 상기 제2 고체 상은 60 내지 80마이크로미터의 평균 직경을 갖는 콜라겐 스트랜드를 포함하는, 방법.
  21. 제10항에 있어서, 상기 인쇄재는 제1 인쇄재를 포함하고, 상기 방법은
    상기 제1 인쇄재의 유형과 제2 인쇄재의 유형에 기초하여 상기 지지재를 변형시키는 단계; 및
    상기 제1 인쇄재와 상기 제2 인쇄재를 상기 지지재 내로 주입하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제1 인쇄재는 콜라겐을 포함하고, 상기 제2 인쇄재는 알기네이트를 포함하며, 상기 지지재는 칼슘 양이온을 포함하는, 방법.
  23. 시스템으로서,
    인젝터;
    20g/L NaCl 초과의 염 농도 및 아라비아 검을 포함하는, 코아세르베이트 젤라틴 지지조로서, 상기 젤라틴 지지조는 pH가 8을 초과하며, 항복 응력 임계치를 초과하는 응력에 응답하여 제1 고체 상으로부터 제1 유체 상으로 전이되도록 구성되는, 코아세르베이트 젤라틴 지지조; 및
    상기 인젝터에 의해 지지재 내로 주입되도록 구성된 콜라겐 및 알기네이트로서, 여기서, 상기 콜라겐 및 상기 알기네이트는 각각 pH 6 미만이고, 상기 콜라겐 및 상기 알기네이트는 각각 상기 코아세르베이트 젤라틴 지지조에서의 젤화를 위해 구성되고, 상기 젤라틴 및 상기 알기네이트는 젤화 동안 상기 지지조 내로 각각 10% 미만으로 확산되는, 콜라겐 및 알기네이트
    를 포함하는, 시스템.
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