CN105802251B - 一种自组装胶原模板组织工程材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自组装胶原模板组织工程材料及其制备方法与应用，属于生物医用材料领域。所述自组装胶原模板组织工程材料由胶原和多羟基醇经谷酰胺转氨酶交联固化而成。所述制备方法简单操作方便，工艺参数可控，成本低。采用微生物酶交联优于其它交联剂，避免了如甲基丙烯酸酐（MA），光引发剂等对细胞的毒副作用，所得材料具有较好的生物活性、生物相容性及力学性能，可为细胞生长构建较好的三维支架体系，也可用于装载药物。该材料可用于新组织的生成和受损组织的修复，在临床上用于软骨、骨、皮肤、血管等组织工程领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域。具体涉及一种自主装胶原基复合材料及其制备和在促进组织再生医学中的应用。
技术背景
人体细胞靠胶原蛋白在细胞外基质的黏合下形成组织，继而形成各种器官，形成具有生物功能性的个体。没有这些胶原蛋白为细胞构建支架，细胞就会崩解成一堆细胞泥，因此，在组织工程学中，细胞和胶原蛋白是相辅相成的，互相协调，在组织工程学中进行组织修复，如软骨、骨、和皮肤等。
当人体的组织器官受损以后，通过胶原蛋白支撑的结构也同时受损，如不能及时修复胶原蛋白支架，受损的器官组织将不易修复，因此，及时快速的构建修复支架材料才能弥补这一缺陷。
随着生物医学工程技术的发展，目前，自体移植和异体移植都将带来巨大的缺陷，如自体移植给患者带来更大的痛苦以及异体移植带来的免疫排斥反应等，都使更多的科研学者转向化学合成生物材料来解决这一问题。
目前，研究较多的合成生物材料是透明质酸、聚乳酸、海藻酸钠等，但是这些材料在特殊的合成过程中都带来诸多问题，如材料的强度及孔隙率等结构特性，化学交联等交联剂引发的不良反应，都将是这些材料的在组织工程学上使用的一个重大缺陷。
人体的支架材料主要是胶原蛋白，但是合成的或者提取的胶原蛋白由于分子结构没有自体的胶原蛋白完美，固在使用中会出现一系列问题，如材料的降解性、力学性能等均没有达到自体的胶原蛋白特性，因此通过蛋白链之间的交联使得凝胶稳定化很重要。目前，研究人员合成了一种GelMA，采用甲基丙烯酸酐（MA）进行交联，通过冷冻干燥，制备固体粉末，在进行三维细胞包裹构建组织工程支架时，采用光交联（光引发剂2959）[JasonW.Nichol, et al, Biomaterials, 200,31(2):5536-44]。但是该种方法制备复杂，且光交联时间长，导致装载细胞下沉，力学性能较差，降解太快，不能和细胞的动态生长相匹配；同时，使用的交联剂，甲基丙烯酸酐及光引发剂，对细胞有一定的毒副作用。
发明内容
针对上述问题，本发明提出采用一种微生物酶交联，进行胶原蛋白的固定，同时，为了提高其力学性能，加入自由基多元醇，这样，不但在力学上提高，同时，降解性也降低，所用试剂均无毒，且制备简单，操作方便，制备的材料为细胞生长提供良好的支撑基体。本发明提供了一种可装载细胞的可降解的胶原合成材料，为细胞的营养运输、细胞微环境调控与细胞与细胞之间的相互作用提供较好的基体支撑。用于组织工程学的细胞支架材料，进行各细胞的培养。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种自组装胶原模板组织工程材料，由胶原和多羟基醇经谷酰胺转氨酶交联固化而成。该材料制备简单，操作方便，交联剂无毒，且交联时间可控。所得材料为快速交联自主装的凝胶组织工程材料，具有良好的降解性能和力学性能，能够很好地满足组织工程支架的应用要求。
作为可选方式，所述自组装胶原模板组织工程材料形态可控，可以是二维薄膜材料，也可以是三维块体材料，在所述三维块体材料中在可控时间内装载细胞及生长因子等。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，所述交联剂加入灵活，交联剂加入量范围为0.0-2.0U.
作为可选方式，上述自组装胶原模板组织工程材料在交联固化时，在短时间内（1-10分钟），由液态变成固态，形态可控，操作简单，且在该时间段，随温度调节，也可控制其交联速度。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，胶原蛋白占整体复合材料体积百分含量在85%以上。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，所述胶原可直接购买或从动物提取。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，所述的转谷氨酰胺酶是试剂级微生物酰胺转氨酶，交联固化反应温度在35-70℃之间，且酶活不低于100U。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，所述多羟基醇为木糖醇、甘油、丙三醇中的至少一种。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，所述组织工程材料材料中装载有细胞和/或药物。通过调控交联固化温度，可以在液态下可装载细胞及细胞球，进行细胞自主装，也可装载药物等，构建组织工程支架或载药模板。通过使所述组织工程材料快速交联固化可有效防止细胞或药物沉降，使细胞或药物被可控包裹在材料内部。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，所述细胞和/或药物在自组装胶原模板组织工程材料中有序分布。例如，可以制备细胞密度梯度分布的组织工程材料以适应应用需要。
作为可选方式，在上述自组装胶原模板组织工程材料中，所述细胞和/或药物在自组装胶原模板组织工程材料中，自组装成环形结构。进一步的，在微流体环境下可使细胞自组装成多层同心环形结构。
本发明还提供了一种所述自组装胶原模板组织工程材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备胶原溶液；
（2）向胶原溶液中加入多羟基醇搅拌至溶液澄清；作为可选，所述胶原与多羟基醇的摩尔比为10：0.1-2，
（3）配制交联剂转谷氨酰胺酶溶液；
（4）将交联剂转谷氨酰胺酶溶液与步骤（2）制得的混合溶液均匀混合后加入到模具中在一定温度下固化成型。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤（1）具体为：将胶原蛋白在35-55℃之间溶解在PBS或Tris缓冲溶液中，搅拌至澄清。作为可选，所述胶原蛋白与PBS或Tris缓冲溶液的比例可以为1g：100mL。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤（2）搅拌得到澄清的粘稠状溶液。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤（3）具体为：将交联剂酶溶解在去离子水中后，用直径为0.2-0.45um的注射过滤膜进行过滤后，4℃冰箱中冷藏备用。作为可选，按去离子水:酶=10mL：2mg的比例混合。
作为可选方式，在上述制备方法中，在所述步骤（4）中将步骤（2）制得的混合溶液与步骤（3）中制备的交联剂溶液在35-45℃下一定比例配成溶液，在磁力搅拌下快速搅拌，制备混合溶液。
作为可选方式，在上述制备方法中，在所述步骤（1）或（2）或（4）中加入细胞和/或药物。进一步的，当在所述步骤（4）中加入细胞和/或药物时最好与所述交联剂转谷氨酰胺酶溶液同时加入，或者在加入交联剂转谷氨酰胺酶溶液后的较短时间内迅速加入。
作为可选方式，在上述制备方法中，在所述步骤（2）的混合溶液中加入细胞和/或药物混匀后，再加入步骤（3）中配制好的交联剂，用吸液枪轻轻混合、均匀，再加入到模具中并在一定温度下固化成型。
作为可选方式，在上述制备方法中，装载细胞后固化成型可控，也可在细胞培养成球后成型，在微流体环境下调控成型结构。
作为可选方式，在上述制备方法中，包括以下步骤：
（1）将胶原蛋白在35~55℃ 下搅拌至澄清， 加入多羟基化合物继续搅拌，混合均匀，得到澄清的粘稠状溶液；
（2）将交联剂酶溶解后，用直径为0.2-0.45um的注射过滤膜进行过滤后，4℃冰箱中冷藏备用；
（3）将上述两种液体在35-45℃下一定比例配成溶液，在磁力搅拌下快速搅拌，制备混合溶液，固化成型。
进一步的，在上述方法中，先将细胞装载到胶原/多羟基化合物中，使其分布均匀，再滴加交联剂酶溶液，在操作时间可控的范围内，制备三维的细胞装载支架，进行动态培养。
作为可选方式，在上述制备方法中，包括以下步骤：
（1）将胶原粉在35-55℃之间溶解在PBS或Tris缓冲溶液中，搅拌至澄清，制成胶原溶液；
（2）向胶原溶液中加入多羟基醇，搅拌至溶液澄清；
（3）配制交联剂转谷氨酰胺酶溶液：将交联剂用去离子水溶解制成溶液，在用针头过滤膜（孔径0.2-0.45um）过滤备用；
（4）35℃下，将交联剂转谷氨酰胺酶溶液与步骤（2）制得的混合溶液均匀混合后固化成型。
进一步的，在上述方法中，先将悬浮的细胞和/或药物与步骤（2）制得的混合溶液混合均匀后，再加入步骤（3）交联剂溶液固化成型，放入三维培养板中培养。
本发明还提供了一种上述的自组装胶原模板组织工程材料的应用，其特征在于，将其用作软骨、骨、皮肤或血管的组织工程再生与修复材料。所述复合材料可装载药物、细胞等，进行药物释放的评估及动态细胞的培养。较好的力学特性及和细胞生长相匹配的降解特性可用于组织工程学领域的软骨、骨、及皮肤的再生与修复。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
本发明所述复合材料力学性能优于GelMA凝胶，且降解性在25天时，降解率在25%，和细胞的生长相匹配。
所述复合材料的凝胶时间可控，为细胞的自主装提供必要的条件，且细胞在混合溶液中分布均匀。
所述制备方法简单操作方便，工艺参数可控，成本低。采用微生物酶交联优于其它交联剂，避免了如甲基丙烯酸酐（MA），光引发剂等对细胞的毒副作用，所得材料具有较好的生物活性、生物相容性及力学性能，可为细胞生长构建较好的三维支架体系，也可用于装载药物、细胞/细胞生长因子等。该材料可用于新组织的生成和受损组织的修复，在临床上用于软骨、骨、皮肤、血管等组织工程领域。
附图说明：
图1为本发明方法制备的三维凝胶材料装载细胞在显微镜下的观察图片（绿色为活细胞，占图中绝大部分，红色为死细胞，图中基本没有）；
图2为本发明在不同酶活下转谷酰酰胺酶交联程度；
图3为装载细胞的三维培养中细胞增殖状况评估结果图；
图4为细胞在微流体环境下自组装成环形结构照片；
图5为0.1U的转谷氨酰胺酶交联的凝胶材料在PBS中浸泡不同时间内的降解状况。
具体实施方式：
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1
将10g 胶原蛋白溶于100毫升的Tris缓冲溶液中，在35~45℃下磁力搅拌至澄清，取丙三醇溶液以（10:1）比例滴加胶原溶液中混合均匀；将生物基转谷氨酰胺酶用去离子水溶解，加入量随酶活不同而改变，酶活在0.025-0.1之间，将配制好的两个溶液在35-45℃之间混合，使其交联，凝胶体随着酶加入量的不同，凝固时间不同。
表1：不同酶加入量对应的凝固时间
通过紫外光谱仪，在350nm附近出现氨基交联峰，交联度随着酶的加入量逐渐增加，吸收峰增强，固化时间缩短，但是在较高温度下（36.5℃）固化时间比在常温下（25℃）固化时间稍长些，表明交联剂随着温度变化较敏感。
实施例2
将2g 胶原蛋白溶于20毫升的Tris缓冲溶液中，在35~45℃下磁力搅拌至澄清，取丙三醇溶液以（10:1）比例滴加胶原溶液中混合均匀；将0.5g生物基转谷氨酰胺酶溶解在1ml去离子水中，将两种溶液磁力搅拌混合均匀，倒入铺有聚乙烯膜的玻板上，在25-37℃下干燥24小时，获得2D的胶原薄膜。
实施例3
细胞实验：将实例1配制好的胶原/丙三醇溶液，在10分钟内，和培养好的人类脐静脉内皮细胞(HUVECs) 细胞混合，再加入0.075U的转氨酶，在transwell 培养板中进行3D培养，在光学显微镜下观察其细胞生长状况，评估其细胞增殖及死活状况。
结果如图1所示，细胞均匀分布在胶原凝胶中，培养24小时后，发现很好有红色细胞，即死亡细胞出现；在每天更换细胞液过程中，通过presoblue进行细胞死活的评定，结果如图3所示，随着时间的变化，细胞在2D和3D形式下培养，由于2D细胞只是贴壁粘附生长，当细胞增殖到一定数量时，就会发生接触抑制，导致细胞增殖缓慢或停滞；而细胞在3D环境下培养，空间较大，细胞和细胞之间充分接触培养液，以及和材料的相互作用和支撑，导致细胞可以充分汲取营养而增殖较快，这在一段时间内，可促进细胞的分化和相互接触，形成网络型构架，这是形成组织的必然过程。因此，3D培养更加有利于细胞的增殖和分化，同时，交联的胶原凝胶为细胞的增殖和分化提供有利的载体，随和时间的延长，材料降解和细胞的生长相匹配，从而避免了材料降解过快而导致支架材料坍塌而不利于细胞的生长。
作为可选，先将胶原溶液与细胞混合后再加入丙三醇，混匀后再加入转氨酶。所得结果基本一致。
作为另一种可选，在上述方法中，最后加入细胞或在加入转氨酶的同时加入细胞，可以成功制备相应的支架材料，不过当胶原浓度较高时，加入转氨酶后材料会在对时间内凝胶化，如果细胞加入不及时会导致细胞在材料中分布不均匀甚至无法成功将细胞包载到凝胶中。
实施例4
细胞自组装：将细胞培养后，在微流体作用下，溶液可装载细胞进行自组装，细胞不但可以分布有序且分布均匀，同时，基体良好的流动性和粘稠度可提供细胞良好的生存环境及细胞和细胞之间的相互作用，不会导致因为液体较稀而使细胞下沉现象发生。
还可得到如图4所示的细胞自组装成环形结构的材料。
实施例5 降解实验
以0.075U的转谷氨酰胺酶为交联，在室温下固化后，浸泡在PBS缓冲溶液中，在36.5℃培养箱中浸泡，每天换液，称量其质量，计算降解率。结果如图5所示，随着时间的延长，降解性增加，在14天时，达到25%，这由于MMA交联的胶原凝胶的降解率（75%/3days），这能和细胞的生长相匹配。
实施例6力学测试
在实例1中，制备胶原凝胶材料，加入不同含量的酶，在室温下固化，24小时后，采用纳米压痕仪测试其凝胶的力学性能。结果如下表所示。
实施例7
参照实施例1-6中所述的方法，调整胶原蛋白用量，将丙三醇换成木糖醇、甘油、丙三醇中的至少一种，制得胶原蛋白占整体复合材料体积百分含量在85%以上的一系列复合材料。所得材料性能与实施例1-6中所得材料的性能类似，都具有良好的生物相容性，力学性能优于GelMA凝胶，且降解性在25天时，降解率在25%，和细胞的生长相匹配，材料的凝胶时间可通过调整固化温度和酶活、酶加入量来灵活调控，从而可获得细胞在复合材料内部均匀分布的组织工程材料，其在微流体环境下还可获得细胞自组装成多层环状的结构。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种自组装胶原模板组织工程材料，其特征在于，由胶原和多羟基醇经转谷氨酰胺酶交联固化而成，所得材料为形态可控的快速交联自主装的凝胶组织工程材料，所述多羟基醇为木糖醇、丙三醇中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的自组装胶原模板组织工程材料，其特征在于，所述的转谷氨酰胺酶是试剂级微生物酰胺转氨酶，交联固化反应温度在35-70℃之间，且酶活不低于100U。
3.根据权利要求1所述的自组装胶原模板组织工程材料，其特征在于，所述组织工程材料材料中装载有细胞和/或药物。
4.根据权利要求3所述的自组装胶原模板组织工程材料，其特征在于，所述细胞和/或药物在自组装胶原模板组织工程材料中有序分布。
5.根据权利要求3所述的自组装胶原模板组织工程材料，其特征在于，所述细胞和/或药物在自组装胶原模板组织工程材料中自组装成环形结构。
6.一种如权利要求1所述自组装胶原模板组织工程材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备胶原溶液；
（2）向胶原溶液中加入多羟基醇，搅拌至溶液澄清；
（3）配制交联剂转谷氨酰胺酶溶液；
（4）将交联剂转谷氨酰胺酶溶液与步骤（2）制得的混合溶液均匀混合后加入到模具中在一定温度下固化成型。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）或(2)或（4）中加入细胞和/或药物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述固化成型在微流体环境下进行。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将胶原蛋白在35-55℃之间溶解在PBS或Tris缓冲溶液中，搅拌至澄清，制成胶原溶液；
（2）向胶原溶液中加入多羟基醇，搅拌至溶液澄清，加入悬浮的细胞和/或药物混合均匀；
（3）配制交联剂转谷氨酰胺酶溶液：将交联剂用去离子水溶解制成溶液，再用孔径为0.2-0.45μm的针头过滤膜过滤备用；
（4）35℃下，将交联剂转谷氨酰胺酶溶液与步骤（2）制得的混合溶液均匀混合，放入三维培养板中培养。
10.一种权利要求1所述的自组装胶原模板组织工程材料的应用，其特征在于，将其用作制备软骨、骨、皮肤或血管的组织工程再生与修复材料。
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Citations (4)
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| CN102726593A (zh) * | 2012-06-19 | 2012-10-17 | 安徽宝迪肉类食品有限公司 | 一种添加tg酶的大豆凝胶型蛋白胶体的制作方法 |
| CN103893827A (zh) * | 2014-04-21 | 2014-07-02 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 一种增强生物相容性的人工骨支架材料及其制备方法 |
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