CN112608457A - 聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法，属于组织工程技术领域，包括以下步骤：取柠檬酸、1,8‑辛二醇、4‑羟基‑2‑丁烯酸置于容器中，在氮气保护下置于160‑165℃油浴中加热并搅拌，待混合物熔融后，将温度降至135‑140℃，加入2‑氨基乙醇‑1‑磷酸，得到预聚体；a、取上述预聚体，加入丙酮中使其充分溶解，倒入四氟乙烯模具中，投入NaCl颗粒，硫酸胍乙啶，搅拌均匀；b、取出样品，浸泡于去离子水中，将支架中的NaCl、硫酸胍乙啶全部洗去，干燥后得聚柠檬酸酯多孔支架。本发明能够提高多孔支架的孔隙率和分布的均匀性，提高支架的连通性，有利于细胞粘附和增殖。

Description

聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法
本申请是申请日为2020年3月23日、申请号为202010206790.4、发明名称为“多孔弹性体材料的制备方法及其用途”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法。
背景技术
生物材料按照其组成和属性可以分为生物医用高分子材料、生物医用无机非金属材料(陶瓷、复合材料等)和生物医用金属材料这三大类。相比金属材料和无机非金属材料而言，生物医用高分子材料除了具有较好的理化性能，还具有其他两者无法比拟的弹性和柔韧性，能够与人体组织及器官更好地进行匹配。随着科学以及医疗技术和医用材料的迅猛发展，各种医疗技术相继出现，如组织工程、药物释放、基因治疗等，这就对生物医用高分子材料提出了更高的要求，要求材料植入到人体后只是起到临时的替代作用，并且能够随着组织或器官的再生逐渐降解随人体代谢排出体外，尽可能地减少材料对机体的长期影响。
组织工程多孔支架是一类能与组织活体细胞相结合，同时能够满足生物体中不同组织的要求，可以植入生物体中进行组织替代的可生物降解材料。多孔支架起到了细胞外基质的作用，同时三维支架结构为细胞的生长、增殖和分化提供了一个良好的环境。具体是先在体外将组织细胞和支架材料进行复合培养，形成细胞-生物材料复合物，接着将此复合体植入生物体中，细胞在生物体内继续增殖并分泌基质，从而生成新的组织和器官。多孔支架能对病损组织进行修复和重建，甚至永久性替代。
现有技术如授权公告号为CN 102973984 B的中国发明专利，公开了一种复合材料多孔支架的制备方法。该方法将丝素蛋白、胶原蛋白和壳聚糖复合在一起，得到白色海绵状的复合多孔支架。该方法制备的多孔支架可应用于组织和创面的填充和修复，以及组织工程，药物释放等技术领域。本发明所制备的复合多孔支架的孔隙率达到98％以上，且尺寸分布于50～400μm，微孔之间互通。本发明所得的复合多孔支架再浸水后能保持原有的形态，有海绵的功能，挤压后能恢复原有形态。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
取柠檬酸、1,8-辛二醇、4-羟基-2-丁烯酸置于容器中，在氮气保护下置于160-165℃油浴中加热并搅拌，待混合物熔融后，将温度降至135-140℃，加入2-氨基乙醇-1-磷酸，常压反应5-7h，得到预聚体；
a、取上述预聚体，加入丙酮中使其充分溶解，倒入四氟乙烯模具中，投入NaCl颗粒，硫酸胍乙啶，搅拌均匀，通风使丙酮完全挥发，真空条件100-120℃后聚合4-7d；
b、取出样品，浸泡于去离子水中，将支架中的NaCl、硫酸胍乙啶全部洗去，干燥后得聚柠檬酸酯多孔支架。利用溶液浇铸/粒子沥滤技术制备多孔支架时，由于受到致孔剂分布的影响，尤其是在材料表面易形成致密的皮层，且致孔剂易于在容器底部沉淀，形成不均匀的孔结构，所得到的闭孔结构居多，孔间连通性差。制备多孔支架时加入硫酸胍乙啶，硫酸胍乙啶可以贯穿于改性POC网络结构中，能够包裹氯化钠，抑制氯化钠沉降，使得氯化钠能够均匀分布在聚合物中，有助于氯化钠形成开孔结构，能够提高多孔支架的孔隙率和分布的均匀性，提高支架的连通性，有利于细胞粘附和增殖。
优选地，上述步骤a中预聚体，NaCl，硫酸胍乙啶的质量比为1:4-6:3-5。
提供一种多孔弹性材料，其特征在于：采用上述聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法进行制备。
提供一种多孔弹性材料在修复骨缺损中的用途。
本发明的有益效果为：
1)本发明通过在2-氨基乙醇-1-磷酸存在下，用4-羟基-2-丁烯酸对POC进行改性，4-羟基-2-丁烯酸上的醇羟基能够与柠檬酸上的醇羟基发生反应，形成醚键，从而在POC主链侧面引入含有碳双键及羧基键的柔性链段，并引入羧酸基团，利用改性POC制备多孔支架时，在增加交联的同时能够降低交联网络结构中分子主链的刚性，使得多孔支架具有更好的强度和韧性，同时能够增加支架亲水性，进而促进细胞粘附和增殖；
2)本发明制备多孔支架时加入硫酸胍乙啶，硫酸胍乙啶可以贯穿于改性POC网络结构中，能够包裹氯化钠，抑制氯化钠沉降，使得氯化钠能够均匀分布在聚合物中，有助于氯化钠形成开孔结构，能够提高多孔支架的孔隙率和分布的均匀性，提高支架的连通性，有利于细胞粘附和增殖。
附图说明
图1为本发明实施例1中未改性和改性POC预聚体的傅里叶红外光谱图；
图2为本发明实施例2中接枝率的测定结果；
图3为本发明试验例1中多孔支架的应力-应变曲线；
图4为本发明试验例1中多孔支架的断裂强度、断裂伸长率和弹性模量；
图5为本发明试验例1中多孔支架的水接触角；
图6为本发明试验例2中多孔支架的SEM图；
图7为本发明试验例2中孔隙率的测定结果；
图8为本发明试验例3中alamarBlue减少百分比的测定结果。
具体实施方式
除非另外说明，本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以整体援引的方式并入本文中，如同将其全文进行阐述。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在相抵触的情况下，则以本说明书中的定义为准。
当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或其他数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限制或优选值和任何较小的范围限制或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论这些范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5”的范围时，所描述的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。除非另有说明，在本文描述数值范围之处，所述的范围意图包括范围端值和范围内的所有整数和分数。
另外，在本发明的要素或组分之前的词语“一”和“一种”意图表示对于该要素或组分的出现(即发生)次数没有限制性。因此，“一”或“一种”应理解为包括一种或至少一种，除非明确表示数量为单数，否则单数形式的所述要素或组分也包括复数的情况。
本发明的实施方式，包括在发明内容部分中所述本发明的实施方式以及本文下述的任何其他的实施方式，均可任意地进行组合。
以下详述本发明。
提供4-羟基-2-丁烯酸提高聚柠檬酸酯韧性中的用途。
提供一种改性聚(1,8-辛二醇-柠檬酸)的制备方法，包括以下步骤：
S1、取柠檬酸、1,8-辛二醇、4-羟基-2-丁烯酸置于容器中，在氮气保护下置于160-165℃油浴中加热并搅拌，待混合物熔融后，将温度降至135-140℃，加入2-氨基乙醇-1-磷酸，常压反应5-7h，得到预聚体；
S2、将上述预聚体溶于丙酮并在乙醇中沉淀除去未反应的单体，倒入模具中静置，待丙酮完全挥发后，真空条件100-120℃后聚合4-7d。聚(1,8-辛二醇-柠檬酸)(POC)是将柠檬酸和1,8-辛二醇反应制得的网络型聚酯生物弹性体，由于其良好的力学性能和生物学性能而被广泛应用于组织工程领域。通过调节反应单体的摩尔比以及固化交联程度可以调节POC的力学性能，但这种调控是有限的。在提高POC拉伸变形能力的同时，必然牺牲交联程度，从而导致材料粘性增加，不利于使用。热固性树脂一般由于其具有很高的交联密度所以才导致脆性特别大。在2-氨基乙醇-1-磷酸存在下，用4-羟基-2-丁烯酸对POC进行改性，4-羟基-2-丁烯酸上的醇羟基能够与柠檬酸上的醇羟基发生反应，形成醚键，从而在POC主链侧面引入含有碳双键及羧基键的柔性链段，并引入羧酸基团，利用改性POC制备多孔支架时，在增加交联的同时能够降低交联网络结构中分子主链的刚性，使得多孔支架具有更好的强度和韧性，同时能够增加支架亲水性，进而促进细胞粘附和增殖。
优选地，上述步骤S1中柠檬酸、1,8-辛二醇、4-羟基-2-丁烯酸的摩尔比为5-6:4-5:2-3。
优选地，上述步骤S1中2-氨基乙醇-1-磷酸与4-羟基-2-丁烯酸的质量比为1:2-3。
提供一种可降解生物弹性体，采用上述的制备方法进行制备。
提供一种聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
a、取上述步骤S1中的预聚体，加入丙酮中使其充分溶解，倒入四氟乙烯模具中，投入过100-400目筛的NaCl颗粒，硫酸胍乙啶，搅拌均匀，通风使丙酮完全挥发，真空条件100-120℃后聚合4-7d；
b、取出样品，浸泡于去离子水中，将支架中的NaCl、硫酸胍乙啶全部洗去，干燥后得聚柠檬酸酯多孔支架。利用溶液浇铸/粒子沥滤技术制备多孔支架时，由于受到致孔剂分布的影响，尤其是在材料表面易形成致密的皮层，且致孔剂易于在容器底部沉淀，形成不均匀的孔结构，所得到的闭孔结构居多，孔间连通性差。制备多孔支架时加入硫酸胍乙啶，硫酸胍乙啶可以贯穿于改性POC网络结构中，能够包裹氯化钠，抑制氯化钠沉降，使得氯化钠能够均匀分布在聚合物中，有助于氯化钠形成开孔结构，能够提高多孔支架的孔隙率和分布的均匀性，提高支架的连通性，有利于细胞粘附和增殖。
优选地，上述步骤a中预聚体，NaCl，硫酸胍乙啶的质量比为1:4-6:3-5。
提供一种多孔弹性材料，其特征在于：采用上述聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法进行制备。
提供硫酸胍乙啶在提高支架的连通性中的用途。
提供一种可降解生物弹性体在制备组织支架和或药物控制释放载体中的用途。
提供一种多孔弹性材料在修复骨缺损中的用途。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1.一种改性聚(1,8-辛二醇-柠檬酸)的制备方法，包括以下步骤：
1.1 115.3g取柠檬酸、58.5g 1,8-辛二醇、20.4g 4-羟基-2-丁烯酸置于四口烧瓶中，在氮气保护下搅拌，置于165℃油浴中加热并搅拌，待混合物熔融后，将温度降至140℃，加入10g 2-氨基乙醇-1-磷酸，常压反应5h，得到改性POC预聚体。未改性和改性POC预聚体的傅里叶红外光谱图见图1。
1.2将上述预聚体溶于丙酮并在乙醇中沉淀除去未反应的单体，纯化过程重复两次，倒入不锈钢模具中使其自然流延至平，待丙酮完全挥发后，真空条件下120℃后聚合6d。
2.一种聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
2.1取10g上述1.1中的预聚体，加入丙酮中使其充分溶解，倒入四氟乙烯模具中，投入60g过400目筛的NaCl颗粒，30g硫酸胍乙啶，搅拌均匀，通风使丙酮完全挥发，后在120℃下，真空条件后聚合6d；
2.2取出样品，浸泡于去离子水中，将支架中的NaCl、硫酸胍乙啶全部洗去，干燥后得聚柠檬酸酯多孔支架。
实施例2：
对聚(1,8-辛二醇-柠檬酸)进行改性时未加入2-氨基乙醇-1-磷酸，其余部分和实施例1完全一致。对实施例1和实施例2得到的改性POC预聚体利用傅里叶红外光谱进行接枝率测定，接枝率的测定结果见图2。
由图1可以看出，改性POC预聚体3512cm-1处羟基的O-H伸缩振动峰减弱，在1082cm-1处出现脂肪醚的C-O键的伸缩振动峰，在1630cm-1处出现-C＝C-双键的伸缩振动峰，在2718cm-1处出现羧基的O-H伸缩振动峰，这说明，用4-羟基-2-丁烯酸对POC进行改性，4-羟基-2-丁烯酸上的醇羟基能够与柠檬酸上的醇羟基发生反应，形成醚键，在POC主链侧面引入含有碳双键及羧基键的柔性链段，并引入羧酸基团，由图2可以看出，实施例2中POC预聚体上4-羟基-2-丁烯酸的接枝率几乎为0，这说明，在2-氨基乙醇-1-磷酸存在下，4-羟基-2-丁烯酸能够以较高接枝率成功接枝到POC上。
实施例3：
未对聚(1,8-辛二醇-柠檬酸)进行改性，其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
制备聚柠檬酸酯多孔支架时未加入硫酸胍乙啶，其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
制备聚柠檬酸酯多孔支架时未加入硫酸胍乙啶，其余部分和实施例3完全一致。
试验例1：
力学性能表征：通过模具冲头(最窄宽度为2.67mm，计量长度为7.49mm)将实施例1、实施例3、实施例4、实施例5制得的多孔支架切成哑铃形样条，以10mm/min拉伸速度在HY-941万能材料试验机上(上海恒驭仪器有限公司)进行测试。测量5次，得到断裂强度、断裂伸长率和弹性模量数据，取平均值。多孔支架的应力-应变曲线见图3，多孔支架的断裂强度、断裂伸长率和弹性模量见图4。
亲水性的检测：采用型号为Data Physics OCA200的高速视频光学接触角测量仪测量实施例1、实施例3、实施例4、实施例5制得的多孔支架的接触角。将试样放置在实验台上，然后用水平调节仪调节试样的位置，接着用微量注射器在试样上滴2μL去离子水，然后在红外线热像摄影仪拍摄下测量接触角的大小。随机选三个点对试样进行测试，采用三个点的平均值作为试样表面亲疏水性的结果。多孔支架的水接触角见图5。
由图3，图4可以看出，实施例1中多孔支架的断裂强度、断裂伸长率和弹性模量明显高于实施例3，实施例4中多孔支架的断裂强度、断裂伸长率和弹性模量明显高于实施例5，由图5可以看出，实施例1中多孔支架的水接触角明显高于实施例3，实施例4中多孔支架的水接触角明显高于实施例5，这说明，在2-氨基乙醇-1-磷酸存在下，用4-羟基-2-丁烯酸对POC进行改性后，利用改性POC制备得到的多孔支架在增加交联的同时能够降低交联网络结构中分子主链的刚性，使得多孔支架具有更好的强度和韧性，同时能够增加支架亲水性。
试验例2：
SEM观察：使用TM-100型扫描电镜(日本Hitachi公司)对实施例3和实施例5中多孔支架孔结构进行观察。在液氮中淬断，断面使用低温喷金处理。多孔支架的SEM图见图6。
采用乙醇取代法测定多孔支架材料的孔隙率。将装满乙醇的比重瓶质量称为m1；把质量为ms的多孔支架材料浸入乙醇中，多次抽真空脱气泡，使乙醇完全充满多孔支架的孔中，然后再加满乙醇，称得质量为m2；把浸满了乙醇的多孔支架样品取出，剩余的乙醇与比重瓶再称得质量为m3。Q为乙醇的密度。
多孔支架本身体积：Vs＝(m1-m2+ms)/Q；
多孔支架孔体积：Vp＝(m2-m3-ms)/Q；
多孔支架孔隙率：E＝Vp/(Vp+Vs)＝(m2-m3-ms)/(m1-m3)；
每个样品称取5组称量计算，最后取平均值。孔隙率的测定结果见图7。
由图6可以看出，实施例5中多孔支架上部表面孔隙少，较致密，底部孔径较大，形成不均匀的孔结构，实施例3中多孔支架孔结构分布均匀，连通性好，由图7可以看出，实施例1中多孔支架的孔隙率明显高于实施例4，实施例3中多孔支架的孔隙率明显高于实施例5，这说明制备多孔支架时加入硫酸胍乙啶，硫酸胍乙啶可以贯穿于改性POC网络结构中，能够包裹氯化钠，抑制氯化钠沉降，使得氯化钠能够均匀分布在聚合物中，有助于氯化钠形成开孔结构，能够提高多孔支架的孔隙率和分布的均匀性，提高支架的连通性。
试验例3：
多孔支架细胞相容性的检测：
多孔支架处理：将不同成型技术制备的PLA多孔支架分别置于24孔的聚苯乙烯培养板，使用前培养板先经酒精浸泡和高压灭菌器消毒后，再用PBS(phosphate bufferedsaline)润洗，然后用培养液(DMEM，GIBCO)浸泡。本实验所用的培养液是实验室自行配制的。
细胞种植：种植前先将NIH-3T3鼠成纤维细胞用EDTA(Ethylene DiamineTetraacetic Acid)处理5分钟后用PBS清洗，然后以1.25×105cells/cm2的浓度分布种植到处理好的支架上进行细胞培养。种植好细胞的支架置于37℃，CO2浓度为5％，温度为95％的孵化箱中，每天更换培养液。细胞培养10天后进行观察和表征。每组支架重复3个。
配制alamarBlue细胞活性检测液：本实验中采用浓度为10％的alamarBlue检测液，即取细胞培养液(DMEM/F12+10％FBS)9亳升，加入1亳升alamarBlue试剂液，充分混匀后，避光保存备用。
细胞活性检测：分别在NIH-3T3鼠成纤维细胞被种植在样品表面培养了1天、2天和5天后，吸除装有各样品的板孔内的细胞培养液，并向每孔加入上述制备好的alamarBlue细胞活性检测液200微升，放回细胞培养箱继续培养4小时。此后，从每个装有样品的孔中分别吸取100微升液体，转移入新的96孔板对应的孔中，并放入定量酶标仪内在570nm和600nm波长下分别读板、记录。
细胞活性数据处理：枯附生长于样品表面的NIH-3T3鼠成纤维细胞的数量是通过alamarBlue降低比例来间接体现的，计算公式如下：
alamarBlue减少百分比(％)＝{[(O2×A1)-(O1×A2)]/[(R1×N2)-(R2×N1)]}×100％
O1表示alamarBlue在570nm波长下的摩尔吸收光系数(等于80586)；
O2表示alamarBlue在600nm波长下的摩尔吸收光系数(等于117216)；
R1表示减少的alamarBlue在570nm波长下的摩尔吸收光系数(等于155677)；
R2表示减少的alamarBlue在600nm波长下的摩尔吸收光系数(等于14652)；A1表示检测样品板孔在570nm波长处的吸光度值；
A2表示检测样品板孔在600nm波长处的吸光度值；
N1表示阴性对照板孔(细胞培养液加入alamarBlue，但无细胞)在570nm波长处的吸光度值；
N2表示阴性对照板孔(细胞培养液加入alamarBlue，但无细胞)在600nm波长处的吸光度值。
alamarBlue减少百分比的测定结果见图8。
由图8可以看出，培养了1天、2天和5天后，实施例1的alamarBlue减少百分比均明显高于实施例3、实施例4、实施例5，实施例3的alamarBlue减少百分比均明显高于实施例5，制备多孔支架时加入硫酸胍乙啶，能够提高支架的连通性，进而促进细胞粘附和增殖；实施例4的alamarBlue减少百分比均明显高于实施例5，这说明，在2-氨基乙醇-1-磷酸存在下，用4-羟基-2-丁烯酸对POC进行改性后，利用改性POC制备多孔支架，能够提高多孔支架的亲水性，进而促进细胞粘附和增殖。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (4)

1.一种聚柠檬酸酯多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取柠檬酸、1,8-辛二醇、4-羟基-2-丁烯酸置于容器中，在氮气保护下置于160-165℃油浴中加热并搅拌，待混合物熔融后，将温度降至135-140℃，加入2-氨基乙醇-1-磷酸，常压反应5-7h，得到预聚体；
a、取所述的预聚体，加入丙酮中使其充分溶解，倒入四氟乙烯模具中，投入NaCl颗粒，硫酸胍乙啶，搅拌均匀，通风使丙酮完全挥发，真空条件100-120℃后聚合4-7d；
b、取出样品，浸泡于去离子水中，将支架中的NaCl、硫酸胍乙啶全部洗去，干燥后得聚柠檬酸酯多孔支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤a中预聚体，NaCl，硫酸胍乙啶的质量比为1:4-6:3-5。
3.一种多孔弹性材料，其特征在于：采用权利要求1或2所述的方法进行制备。
4.权利要求3所述的一种多孔弹性材料在修复骨缺损中的用途。
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