DE60214477T2

DE60214477T2 - Implantat zur Regeneration von Knorpelgewebe

Info

Publication number: DE60214477T2
Application number: DE60214477T
Authority: DE
Inventors: Guoping c/o AIST Tsukuba-shi Chen; Takashi Tsukuba-shi Ushida; Tetsuya Tsukuba-shi Tateishi
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2001-07-04
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2022-07-04
Also published as: EP1273312A2; JP3646162B2; US20030012805A1; JP2003010309A; DE60214477D1; EP1273312A3; EP1273312B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Geweberegeneration und insbesondere die Knorpelgeweberegeneration zur Reparatur von Knorpelschäden, verursacht beispielsweise durch Unfälle oder Krankheiten, einschließlich Osteoarthritis.
2. BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Gelenkknorpeldefekte aufgrund von Osteoarthritis oder traumatischer Schäden sind ein Hauptproblem bei der orthopädischen Chirurgie aufgrund der begrenzten Kapazität für Reparatur und Selbstregeneration. Therapien für Knorpeldefekte umfassen die Transplantation von körpereigenem Gewebe, Fremdgewebe und künstlichem prothetischem Ersatz. Jede dieser Techniken hat ihre eigenen Probleme und Grenzen. Körpereigenes Gewebe ist begrenzt aufgrund eines Mangels an passenden Spendern und durch spenderseitige Morbidität. Fremdkörpergewebe machen Probleme aufgrund möglicher Übertragung von Pathogenen und Gewebeabstoßung. Prothetische Implantate haben das Problem von Abnutzung, Lösen und unbekannten Langzeitnebenwirkungen (Langer, R. et al., Science 1993, 14;260(5110): 920–926). Gewebezucht durch Kombination eines biologisch abbaubaren porösen Gerüsts und Knorpelzellen oder multipotentialen Knorpelstammzellen haben sich als eine vielversprechende alternative Vorgehensweise bei der Knorpelreparatur herausgestellt (Boyan, B.D. et al., Clin. Plast. Surg. 19999, 26(4): 629–645).
Ein zeitlich begrenzt bestehendes dreidimensionales Gerüst wird benötigt, um als Haftsubstrat zu dienen, um ausreichend Zellen aufzunehmen und um als körperliche Stütze zu dienen, um die Ausbildung der neuen Organe zu lenken. Das Gerüst sollte es implantierten Zellen erlauben, weiter zu proliferieren, extrazelluläre Matrizen auszuscheiden, sich zu differenzieren und in ein neues Gewebe definierter Form zu organisieren. Während dieses Vorgangs sollte sich das Gerüst allmählich abbauen und schließlich beseitigt sein. Daher sollte zusätzlich zur Erleichterung von Zelleinbau, Förderung von Zellwachstum und Ermöglichung der Zurückhaltung differenzierter Zellfunktionen das Gerüst biokompatibel, biologisch abbaubar, hochporös, mechanisch belastbar und in gewünschte Formen formbar sein. Üblicherweise können die dreidimensionalen Gerüste aus einem synthetischen Polymer, beispielsweise Poly(Milchsäure) (PLA), Poly(Glykolsäure) (PGA) und deren Copolymere von Poly(DL-Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) und auf natürlichem Weg erhaltenen Polymeren wie Collagen erstellt werden (Freed, L.E. et al., J. Biomed. Mater. Res. 1993, 27(1): 11–23).
Synthetische Polymere können in gewünschte Formen mit relativ guter mechanischer Festigkeit bearbeitet werden und der Abbau kann so manipuliert werden, dass eine Anpassung an die Geschwindigkeit der Ausbildung neuen Gewebes vorliegt. Jedoch mangelt es synthetischen, aus Polymeren erhaltenen Gerüsten an Zellerkennungssignalen und die Oberflächen der Gerüste sind hydrophob, was ungehinderte Zellbesiedelung behindert. Die großen Öffnungen in dem Schwamm oder Gewebe von synthetischen Polymeren sind nicht vorteilhaft für die Zelleinlagerung. Die meisten Zellen treten durch die großen Öffnungen hindurch. Die gleichförmige durchgängige Verteilung ausreichender Zellen in dem dreidimensionalen porösen Gerüst ist schwierig zu erreichen und kann somit die Wirksamkeit bei der Ausbildung und der Funktionen neuer Gewebe verringern. Andererseits haben poröse dreidimensionale Gerüste von natürlich erhaltenen Polymeren, beispielsweise ein Collagenschwamm, den Vorteil einer guten Wechselwirkung mit Zellen und sind hydrophil, was die Zellansiedelung fördert. Sie sind jedoch mechanisch zu schwach, um die gewünschte Form und Struktur aufrecht zu erhalten und sie sind so weich, dass sie leicht zu verformen sind; somit sind sie bei klinischen Anwendungen schwierig zu handhaben (Kim, B.S. et al., Trends Biotechnol. 1998, 16(5): 224–230).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung trachtet danach, die Schwierigkeiten beim Stand der Technik gemäß obiger Beschreibung zu beseitigen.
Genauer gesagt, eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Traggerüst für einfache und gleichmäßige Zellansiedelung von Knorpelzellen oder deren Stammzellen zu schaffen, um die Regeneration funktionellen Knorpelgewebes zu unterstützen. Weiterhin hat das Gerüst hohe mechanische Festigkeit und ist klinisch einfach handhabbar. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Implantat für Knorpelgewebereparatur bereit zu stellen, welches das poröse Gerüst und Knorpelzellen oder sich zu diesen differenzierenden Stammzellen aufweist.
Folglich schafft die vorliegende Erfindung eine Materialzusammensetzung, aufweisend ein Netz oder einen porösen Schwamm aus einem biologisch abbaubaren synthetischen Polymer und einen porösen Schwamm eines auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers, ausgebildet auf und/oder in dem Netz oder dem porösen Schwamm, beispielsweise in den Öffnungen, wie den Poren eines Schwamms oder den Öffnungen in einem Netz, wobei die Materialzusammensetzung vernetzt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung in Form einen dünnen Platte. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung in Form eines Laminats oder ist eine Rolle. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung ein Poly(D,L-Milch-co-Glykolsäure)-Netz und einen Collagenschwamm auf, der vernetzt ist.
Das biologisch abbaubare synthetische Polymer oder der poröse Schwamm dienen als mechanisches Skelett, um die Ausbildung der Materialzusammensetzung in gewünschten Formen mit guter mechanischer Festigkeit und einfacher Handhabbarkeit zu erleichtern. Der poröse Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenem Polymer trägt zur guten Wechselwirkung mit Zellen und zur Hydrophilie bei und damit zur problemlosen homogenen Zellansiedlung von Knorpelzellen und deren Stammzellen. Somit kombiniert die Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung die Vorteile von sowohl synthetischen Polymeren als auch auf natürlichem Weg erhaltenen Polymeren. Weiterhin ist die Materialzusammensetzung in Form der dünnen Platte insbesondere gut hinsichtlich der Ansiedlungseffizienz, so dass ausreichend Zellen homogen durchgängig in dem porösen Gerüst aufgenommen werden können. Wenn die Knorpelzellen oder deren sich zu diesen differenzierende Stammzellen auf der Materialzusammensetzung angesiedelt werden und in den verletzten Knorpel implantiert werden, kann aufgrund dieser Eigenschaften ein neues funktionelles Knorpelgewebe rasch regeneriert werden.
Folglich schafft die vorliegende Erfindung auch ein Gerüst zum Tragen einer Zelle, aufweisend die Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform trägt das Gerüst Knorpelzellen oder deren sich hierzu differenzierende Stammzellen.
Weiterhin schafft die vorliegende Erfindung ein Implantat zur Verwendung bei der Regeneration von Knorpelgewebe, aufweisend Knorpelzellen oder deren sich hierzu differenzierende Stammzellen und ein Traggerüst, welches die Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung aufweist.
Somit sind das Gerüst und das Implantat, welches Knorpelzellen und deren sich hierzu differenzierende Stammzellen aufweist, äußerst vorteilhaft als Mittel zur Knorpelgeweberegeneration.
Weiterhin schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen einer Materialzusammensetzung, aufweisend:

(a) Abscheiden und Imprägnieren einer wässrigen Lösung aus einem auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer in einem Netz oder einem porösen Schwamm aus einem biologisch abbaubaren synthetischen Polymer;
(b) Gefriertrocknen des mit der wässrigen Lösung imprägnierten Netzes oder porösen Schwamms; und
(c) Behandeln der sich ergebenden Materialzusammensetzung mit einem gasförmigen chemischen Vernetzungsmittel.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1(a) zeigt einen schematischen Querschnitt durch ein Beispiel einer Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in dünner Plattenform.
1(b) zeigt eine schematische Schnittdarstellung durch ein anderes Beispiel einer Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in dünner Plattenform.
2 zeigt eine schematische Schnittdarstellung einer Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in Laminatform.
3 zeigt eine schematische Schnittdarstellung einer Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in Rollenform.
4 eine Elektronen-Mikrografie der Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung in dünner Plattenform.
5 eine Fotografie des Aussehens eines regenerierten Gelenkknorpelgewebes bei einem Rind.
6 eine Fotografie einer histologischer Einfärbung eines regenerierten Gelenkknorpelgewebes bei einem Rind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das poröse Gerüst zum Tragen von Knorpelzellen oder deren sich hierzu differenzierenden Stammzellen gemäß der vorliegenden Erfindung weist eine Materialzusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf, welche wiederum ein Netz oder einen porösen Schwamm eines biologisch abbaubaren synthetischen Polymers und einen porösen Schwamm eines auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers aufweist, welches auf und/oder in dem Netz oder porösem Schwamm ausgebildet ist, wobei die Materialzusammensetzung vernetzt ist.
Das Netz oder der poröse Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer (nachfolgend auch als „biologisch abbaubares synthetisches Polymernetz oder poröser Schwamm" genannt) wird hier hauptsächlich verwendet, um die mechanische Festigkeit der Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhöhen. Das Netz kann aus einem Textil, einem gewebtem Tuch, einem nicht gewebtem Stoff oder dergleichen bestehen. Ein derartiges Netz ist im Stand der Technik allgemein bekannt und von einer Anzahl von Herstellern im Handel erhältlich, beispielsweise ein Vicryl-Gewebenetz von Ethico, INC. (Sommerville, New Jersey). Der poröse Schwamm kann durch ein irgendein allgemein bekanntes Verfahren hergestellt werden, einschließlich eines Gasschaumformens unter Verwendung eines porenerzeugenden Auslaugungsverfahrens. Bei dem Gasschaumformen eines porösen Schwamms werden ein Schäumungsmittel, beispielsweise ein Hochdruckgas, und ein gaserzeugender Festkörper zu synthetischem Polymer zusammengefügt und nach Sättigung expandiert, um den porösen Schwamm zu bilden. Bei letzterem wird ein porenerzeugendes Material, beispielsweise wasserlöslicher Zucker oder Salz, mit einer Lösung eines synthetischen Polymers in einem organischen Lösungsmittel gemischt, beispielsweise Chloroform, die Mischung des synthetischen Polymers und des porenerzeugenden Mittels wird in einer Form mit gewünschter Formgebung gegossen und nach Trocknung der Mischung wird das porenerzeugende Mittel durch Waschen mit Wasser ausgelaugt, um die Poren zur Bildung des porösen Schwamms zu erzeugen.
Je größer die Maschen oder die Porengröße des Netzes oder porösen Schwamms sind oder ist, um so höher ist die Porendichte in dem porösen Schwamm des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers pro Einheit oder Pore des Netzes oder porösen Schwamms, obgleich die mechanische Festigkeit der Materialzusammensetzung abnimmt. Da die Zellen sich innerhalb des porösen Schwamms des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers gemäß der Erfindung ansiedeln und hierin gehalten werden, kann die Anzahl der anzusiedelnden Zellen in der Materialzusammensetzung erhöht werden. Im Ergebnis können Knorpelgewebe wirksamer regeneriert werden.
Somit kann die Maschen- oder Porengröße des Netzes oder des porösen Schwamms abhängig von den Stellen in einem Organismus, wo implantiert werden muss, der gewünschten mechanischen Festigkeit oder Elastizität oder der Regenerationsrate von Knorpelgewebe etc. passend bestimmt werden.
Das biologisch abbaubare synthetische Polymer, welches das Netz oder den porösen Schwamm bildet, kann Polyester wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Poly(D,L-Milch-co-Glykolsäure) (PLGA), Polymalatsäure und Poly-ε-Caprolacton enthalten, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Bevorzugt ist das biologisch abbaubare synthetische Polymer, das bei der Erfindung verwendet wird, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Poly(D,L-Milch-co-Glykolsäure).
Was den porösen Schwamm des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers betrifft (nachfolgend auch als „auf natürlichem Weg erhaltener poröser Polymerschwamm" bezeichnet), so kann jedes auf natürlichem Weg erhaltene Polymer verwendet werden, welches unter Verwendung von Gentechnik rekombinant erhalten wird oder welches von einem lebenden Organismus erhalten wird und Biokompatibilität zeigt. Bevorzugt kann das auf natürlichem Weg erhaltene Polymer aus der Gruppe bestehend aus Collagen, Gelatine, Fibronektin und Laminin ausgewählt werden, wobei Collagen besonders bevorzugt ist. Collagen umschließt Typen I, II, III und IV, von denen jeder bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Das auf natürli chem Weg erhaltene Polymer kann individuell oder in jeglicher Kombination verwendet werden, beispielsweise als eine Mischung aus Collagen und Laminin oder Collagen, Laminin und Fibronektin.
Die Poren des auf natürlichem Weg erhaltenen porösen Polymerschwamms dienen als Plattform oder Verankerung für die Anbringung und Vermehrung von angesiedelten Zellen und zur Geweberegeneration. Die Poren sind bevorzugt offen. Die Porengröße kann 1–300 μm, bevorzugt 20–100 μm betragen.
Zusätzlich kann die Dicke der Materialzusammensetzung der Erfindung abhängig von den Anwendungen der Materialzusammensetzung der Erfindung passend bestimmt werden. Üblicherweise beträgt die Dicke 0,1–5 mm, bevorzugt 0,1–1 mm. Die Porosität kann üblicherweise 80% oder mehr und bevorzugt 80–99% betragen.
Bei der Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein poröser Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenem Polymer auf und/oder in dem Netz oder porösem Schwamm ausgebildet, genauer gesagt, in den Öffnungen des porösen Gerüsts aus synthetischem Polymer, beispielsweise an den Maschen eines Netzes oder in Poren eines porösen Schwamms aus synthetischem Polymer. Die Oberflächen der Öffnungen von porösen Gerüsten aus synthetischem Polymer, beispielsweise die Wandoberflächen von Maschen eines Netzes oder die Wandoberflächen von Poren eines porösen Schwamms aus synthetischem Polymer sind ebenfalls mit auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer beschichtet. Die Materialzusammensetzung gemäß dieser Erfindung kann mit einer Anzahl von Vorgängen hergestellt werden. Beispielsweise kann sie erhalten werden, indem der auf natürlichem Weg erhaltene poröse Polymerschwamm in das biologisch abbaubare synthetische Polymernetz oder den porösen Schwamm eingebracht wird.
Das obige Verfahren weist die Schritte auf von:

(a) Abscheiden und Imprägnieren einer wässrigen Lösung eines auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers wie Collagen in dem Netz oder porösen Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer;
(b) Gefriertrocknen des mit der wässrigen Lösung imprägnierten Netzes oder porösen Schwamms; und
(c) Behandeln der sich ergebenden Materialzusammensetzung mit einem gasförmigen chemischen Vernetzungsmittel.

Bei dem obigen Schritt (a) wird das Netz oder der poröse Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer mit einer wässrigen Lösung behandelt, welche das auf natürlichem Weg erhaltene Polymer aufweist. Es gibt verschiedene Behandlungsprozeduren, jedoch wird oft bevorzugt Eintauchen oder Beschichten verwendet.
Tauchen ist effektiv, wenn die Konzentration oder Viskosität der wässrigen Lösung mit dem auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer niedrig ist. Genauer gesagt, das Netz oder der poröse Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer wird in eine wässrige Lösung des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers mit niedriger Konzentration eingetaucht.
Beschichtung ist effektiv, wenn die Konzentration oder Viskosität der wässrigen Lösung, die das auf natürlichem Weg erhaltene Polymer aufweist, hoch ist und Eintauchen nicht anwendbar ist. Genauer gesagt, das Netz oder der poröse Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer wird mit einer hochkonzentrierten wässrigen Lösung des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers beschichtet.
Die sich ergebende Zusammensetzung, bei der die wässrige Lösung des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers in das Netz oder den porösen Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer einimprägniert oder hierauf abgeschieden wurde, wird dann dem Gefriertrocknungsschritt (b) unterworfen.
Der Gefriertrocknungsschritt dient zum Einfrieren der obigen Zusammensetzung und zur Gefriertrocknung im Vakuum und dieser Schritt erlaubt, dass das auf natürlichem Weg erhaltene Polymer porös wird und eine Materialzusammensetzung bildet, welche das Netz oder den porösen Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer und den porösen Schwamm des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers aufweist.
Als ein Vorgang zur Gefriertrocknung kann jedes üblicherweise bekannte Verfahren unverändert angewendet werden. Die Temperatur während der Gefriertrocknung wird für gewöhnlich unter –20°C gesetzt. Der Gefriertrocknungsdruck kann auf einen Unterdruckzustand gesetzt werden, so dass gefrorenes Wasser in Gasform verdampfen kann und wird für gewöhnlich auf einen Unterdruck von ungefähr 0,2 Torr eingestellt.
Die gefriergetrocknete Materialzusammensetzung wird dann dem Vernetzungsschritt (c) unterworfen. Dieser Schritt wird benötigt, um den porösen Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenem Polymer, der die Materialzusammensetzung bildet, mittels eines gasförmigen Vernetzungsmittels zu vernetzen, um den porösen Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenem Polymer zu festigen und die Verbindung mit dem Netz oder porösen Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischem Polymer zu verbessern, so dass Elastizität und Festigkeit geschaffen werden, die jeweils ausreichend zur Stabilisierung der porösen Struktur einer gewünschten vernetzten Materialzusammensetzung sind.
Als Vernetzungsvorgang gibt es allgemein bekannte physikalische Vernetzungsverfahren, beispielsweise thermisches Vernetzen und photochemisches Vernetzen durch Ultraviolettbestrahlung und chemische Vernetzungsverfahren durch ein flüssiges oder gasförmiges Vernetzungsmittel. Besonders bevorzugt wird bei dieser Erfindung ein gasförmiges Vernetzungsmittel verwendet.
Bei der thermischen Vernetzung oder photochemischen Vernetzung mittels Ultraviolettstrahlung sind die Vernetzungsgrade begrenzt und eine weitere Zersetzung oder Verschlechterung des biologisch abbaubaren synthetischen Polymers, welches die Materialzusammensetzung bildet, kann verursacht werden. Bei der chemischen Vernetzung unter Verwendung eines flüssigen Vernetzungsmittels kann das auf natürlichem Weg erhaltene Polymer während der Vernetzung gelöst werden. Zusätzlich kann, um zu verhindern, dass das auf natürlichem Weg erhaltene Polymer sich in der Lösung des Vernetzungsmittels auflöst, die photochemische oder thermische Vernetzung angewendet werden, bevor eine Vernetzung unter Verwendung eines solchen flüssigen Vernetzungsmittels erfolgt. In diesem Fall kann jedoch Licht oder Wärme zu einer Zersetzung oder Verschlechterung des biologisch abbaubaren synthetischen Polymers führen, wie oben beschrieben.
Folglich ist bei der vorliegenden Erfindung der Vorgang, der ein gasförmiges Vernetzungsmittel verwendet, bevorzugt, da das auf natürlichem Weg erhaltene Polymer auf gewünschte Weise vernetzt werden kann, um eine 3D-Struktur (dreidimensionale Struktur) zu bilden, ohne dass sich das biologisch abbaubare synthetische Polymer verschlechtert oder zersetzt, wobei die Verbindung mit dem Netz oder porösem Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer verbessert wird. Somit lässt sich eine vernetzte Materialzusammensetzung erhalten, welche die gewünschte Festigkeit und Elastizität hat.
Das Vernetzungsmittel, welches gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jegliches Mittel sein, welches allgemein bekannt ist; bevorzugt können hier Aldehyde einschließlich Glutaraldehyde, Formaldehyd und Paraformaldehyd, insbesondere Glutaraldehyd verwendet werden.
Bei dem Vernetzungsschritt gemäß der Erfindung wird das Vernetzungsmittel in Form eines Gases verwendet, wie oben beschrieben. Insbesondere wird die Vernetzung des porösen Schwamms aus natürlich erhaltenem Polymer über eine bestimmte Zeitdauer bei einer bestimmten Temperatur in einer Atmosphäre durchgeführt, wel che mit einer wässrigen Vernetzungsmittellösung einer gegebenen Konzentration gesättigt ist.
Die Vernetzungstemperatur kann auf einen derartigen Bereich festgelegt werden, dass das Netz oder der poröse Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer nicht schmilzt und das Vernetzungsmittel verdampfen kann und liegt für gewöhnlich zwischen 20–50°C.
Die Vernetzungszeit wird, obgleich sie von den Arten des verwendeten Vernetzungsmittels und den Vernetzungstemperaturen abhängt, bevorzugt in einen derartigen Bereich gelegt, dass die Hydrophilie und biologische Abbaubarkeit des porösen Schwamms aus auf natürlichem Weg erhaltenem Polymer nicht nachteilig beeinflusst werden und die Vernetzung kann bis zu einem solchen Grad durchgeführt werden, dass die Materialzusammensetzung sich nicht löst, selbst wenn sie für die Zellkultur und für Implantationszwecke verwendet wird.
Je kürzer die Vernetzungszeit, um so schlechter ist die Vernetzungsimmobilisierung, so dass sich der poröse Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer während der Zellansiedlung auflösen kann. Mit längeren Vernetzungszeiten können höhere Vernetzungsgrade erreicht werden. Wenn die Zeit jedoch zu lange ist, kann die Hydrophilie abnehmen und die biologische Abbaubarkeit kann sich verlangsamen. Somit sollte die Vernetzungszeit so eingestellt werden, dass ausreichende Fixierung erreicht wird, jedoch die Hydrophilie und biologische Abbaubarkeit nicht allzu merklich abnehmen und kann ungefähr 2–8 Stunden und bevorzugt 3–5 Stunden betragen, wenn Glutaraldehyddampf, gesättigt mit einer 25%-igen wässrigen Glutaraldehydlösung bei 37°C verwendet wird.
Bei dem Verfahren zur Herstellung der Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung kann der poröse Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer zunächst in einer beliebigen 3D-Form ausgebildet werden, beispielsweise in einer zylindrischen Form entsprechend dem Implantationsbereich und dann kann der porö se Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer in den Poren des porösen Schwamms ausgebildet werden. Ein derartiges Verfahren ist einfach im Vorgang und liefert gute mechanische Festigkeiten, wobei Knorpelzellen oder deren sich zu diesen differenzierende Stammzellen manchmal schwierig in das Innerste der Poren des porösen Schwamms aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers einbringbar sind, so dass eine Abnahme der Zellansiedlungsdichte dieser Zellen verursacht wird.
Die Form der Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung kann eine dünne Plattenform, eine Laminatform oder eine Rollenform umfassen, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Die bevorzugte Form der Materialzusammensetzung ist bei der Erfindung die dünne Platte. Auf der Oberfläche und/oder in den Öffnungen einer derartigen dünnen Plattenform des Netzes oder porösen Schwamms aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer, das heißt innerhalb der Maschen oder Poren hiervon, ist der poröse Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer auszubilden. Die Gesamtdicke der Materialzusammensetzung in dünner Plattenform kann 0,1–5 mm, bevorzugt 0,1–1 mm betragen. Die Dicke des porösen Schwamms aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer kann passend eingestellt werden, ist jedoch bevorzugt im wesentlichen identisch zu derjenigen des Netzes oder porösen Schwamms aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer. Die Porosität solcher poröser Schwämme aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer beträgt für gewöhnlich 90% oder mehr, bevorzugt 95% bis 99,9%. Der Ausdruck „dünne Platte", wie er hier verwendet wird, kann auch eine Film- und Membranform umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zur Herstellung der Materialzusammensetzung in dünner Plattenform gemäß 1(a) bei der Erfindung ein Netz oder ein poröser Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer in dünner Plattenform in der Mitte der wässrigen Lösung des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers angeordnet und eingefroren und dann gefriergetrocknet. Dies erlaubt, dass sich eine Materialzusammensetzung in dünner Plattenform ausbildet, wobei ein Netz oder poröser Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer beidseitig in einem porösen Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer einge schlossen ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird, wenn ein Netz oder ein poröser Schwamm aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer zum Einfrieren auf der Ober- oder Unterseite einer wässrigen Lösung eines auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers angeordnet wird, eine Materialzusammensetzung in dünner Plattenform gemäß der Darstellung von 1(b) gebildet, wo eine Seite das Netz oder der poröse Schwamm aus dem biologisch abbaubarem synthetischen Polymer ist und die andere Seite der poröse Schwamm des auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers ist.
Die 1(a) und 1(b) zeigen schematisch Materialzusammensetzungen, bei denen der poröse Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer auf der Oberfläche des Netzes oder porösen Schwamms aus biologisch abbaubarem synthetischen Polymer ausgebildet ist. Es versteht sich jedoch, dass ersterer auch innerhalb der Maschen oder Poren des letzteren ausgebildet ist, wie ohne weiteres aus der Elektronen-Mikrografie von 4 zu sehen ist.
Die Knorpelzellen oder deren sich zu diesen differenzierende Stammzellen, wie sie in der Erfindung verwendet werden können, können unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens von organischen Geweben isoliert werden.
Beispielsweise werden die Knorpelzellen mit Enzymen (einschließlich Collagenase, Trypsin, Lipase und Proteinase) behandelt, um extrazelluläre Matrizen zu zerlegen, werden mit Serummedium gemischt und zentrifugiert, um die Zellen zu isolieren. Die isolierten Knorpelzellen werden in einem Kulturbehälter angesiedelt und in einem DMEM-Medium (DMEM-Serum-Medium) inkubiert, welches 10% Kälberfötusserum, 4.500 mg/L Glukose, 584 mg/L Glutamin, 0,4 mM Prolin und 50 mg/L Ascorbinsäure enthält. Bis eine ausreichende Anzahl von Zellen erhalten worden ist, werden diese Zellen in 2 oder 3 Durchläufen tochterkultiviert und die sich ergebenden tochterkultivierten Zellen werden durch Trypsinisierung zurückgewonnen, um eine Zelllösung für die Ansiedlung zu erhalten.
Die Stammzellen, die sich in die Knorpelzellen differenzieren, werden durch Zentrifugieren von Knochenmarkextrakt direkt isoliert oder durch Verwendung einer dichtengradienten Zentrifugierung mit einem dichtengradienten Perkoliermedium. Diese Zellen werden in einem Kulturbehälter angesiedelt und in 2 oder 3 Durchläufen in einem DMEM-Serum-Medium auf eine passende Anzahl von Zellen tochterkultiviert. Die tochterkultivierten Zellen werden durch Trypsinisierung zurückgewonnen, um eine Zellensuspension für die Ansiedlung zu erhalten.
Zur Ansiedlung von Knorpelzellen oder deren sich zu diesen differenzierenden Stammzellen in der Materialzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Materialzusammensetzung zunächst mit einer geringen Menge von Kulturmedium angefeuchtet und dann mit der Zellsuspension für die Ansiedlung imprägniert. Alternativ kann die Materialzusammensetzung direkt mit einer solchen Zellsuspension für die Ansiedlung imprägniert werden.
Die Zelldichte der Zellsuspension zur Ansiedlung beträgt bevorzugt 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁷ Zellen/ml und das Volumen der angesiedelten Zellsuspension ist bevorzugt größer als das Volumen der Materialzusammensetzung.
Das Implantat zur Regeneration von Knorpelgewebe gemäß der Erfindung kann erhalten werden, indem die Materialzusammensetzung mit der Zellsuspension zur Ansiedlung imprägniert wird, ein Kulturmedium hinzugefügt wird und die Knorpelzellen in der Materialzusammensetzung in einem DMEM-Serum-Medium bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ in einem Inkubator kultiviert und vermehrt werden.
Bei Stammzellen ist ein zusätzlicher Schritt notwendig, um diese in Knorpelzellen zu differenzieren. Das Implantat der Erfindung kann erhalten werden, indem die Materialzusammensetzung mit einer Zellsuspension für die Ansiedlung imprägniert wird, welche die Stammzellen enthält, welche sich zu den Knorpelzellen differenzieren, dann diese in einem Kulturmedium wie einem DMEM-Serum-Medium für 1–2 Wochen kultiviert und vermehrt werden und sie unter Differenzierungsbedingungen weiter inkubiert werden, beispielsweise in einem DMEM-Medium mit 4.500 mg/L Glukose, 584 mg/L Glutamin, 0,4 mM Prolin und 50 mg/L Ascorbinsäure, sowie Dexamethason und transformierendem Wachstumsfaktor – β3 (TGF-β3) für 1 bis 2 Wochen, um sie zu differenzieren.
Ein Beispiel für Verfahren zum Erhalten eines Implantats zur Regeneration von Knorpelgewebe durch Ansiedeln von Knorpelzellen oder deren sich hierzu differenzierender Stammzellen auf eine derartige dünne Plattenform einer Materialzusammensetzung in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nachfolgend näher beschrieben.
Die Materialzusammensetzung in dünner Plattenform gemäß der vorliegenden Erfindung wird in einem sauber sterilisiertem Gefäß angeordnet, beispielsweise einer Schale und mit einer geringen Menge Kulturmedium angefeuchtet, gefolgt von tropfenweisem Aufbringen der Zellsuspension für die Ansiedlung.
Die Ansiedlung kann zweimal oder öfter wiederholt werden, wobei einmal oder zweimal bevorzugt ist. Wenn die Zellen zweimal angesiedelt werden, sollte dies auf einer Seite der dünnen Platte beim ersten Mal erfolgen und bevor es das zweite Mal erfolgt, wird die Materialzusammensetzung in dünner Plattenform umgedreht. Das Intervall zwischen der ersten und zweiten Ansiedlung beträgt bevorzugt 24 Stunden.
Während des Ansiedlungsschritts werden, damit die angesiedelten Zellen nicht aus der Materialzusammensetzung in dünner Plattenform austreten, die Ränder der dünnen Platte bevorzugt mit einem Ring, beispielsweise einem Gummiring, eingefasst.
Dann wird die Materialzusammensetzung in dünner Plattenform, in welche die Zellsuspension imprägniert wurde, in einem Inkubator für zusätzliche 4 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ inkubiert. Danach wird der Gummiring entfernt und eine große Menge an Kulturmedium wird hinzugefügt, gefolgt von einer weiteren Inkubation, was zu einem Implantat zur Knorpelgeweberegeneration führt.
Der Vorteil der Verwendung einer Materialzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in dünner Plattenform ist der Tatsache zuschreibbar, dass ein dünnerer poröser Schwamm aus auf natürlichem Weg erhaltenen Polymer, beispielsweise ein Collagenschwamm innerhalb der Materialzusammensetzung gebildet wird. In einem solchen dünneren porösen Schwamm kann die angesiedelte Zellsuspension in die Poren des porösen Schwamms ohne auszutreten imprägniert werden, was zu einer höheren Dichte und einer gleichförmigeren Verteilung der innerhalb der Materialzusammensetzung gehaltenen Zellen und zu einer rascheren und effizienten Knorpelgeweberegeneration führt.
Wenn die Materialzusammensetzung, in der Knorpelzellen und die zu diesen differenzierenden Stammzellen angesiedelt sind, in dünner Plattenform verwendet wird, ist es möglich, dass ein dünneres Knorpelgewebe regeneriert wird. Auch ist es bei einer Materialzusammensetzung, in welcher solche Zellen angesiedelt sind, möglich, eine Laminatform gemäß 2 zu verwenden. Die Dicke des in diesem Fall regenerierten Knorpels kann durch die Anzahl von laminierten Schichten der Materialzusammensetzung eingestellt werden. In 2 ist, da die Zellen innerhalb einer jeden Schicht der Laminatform der Materialzusammensetzung angesiedelt sind, die Dichte und Verteilung der angesiedelten Zellen in der gesamten Materialzusammensetzung so hoch und gleichförmig wie in einer Schicht. Wenn daher die laminierte Materialzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als Traggerüst im Implantat für Geweberegeneration verwendet wird, erlaubt eine in-vivo-Implantierung hiervon, dass das Knorpelgewebe sich gut regeneriert.
Wie in 3 gezeigt, kann die Materialzusammensetzung in dünner Plattenform, welche mit den Zellen besiedelt ist, auch aufgerollt werden, um eine Rollenform anzunehmen. In diesem Fall kann die Länge des regenerierten Knorpels durch die Rollenhöhe eingestellt werden und sein Durchmesser kann durch die Anzahl von Wicklungen eingestellt werden. Alternativ kann bei der vorliegenden Erfindung die Materialzusammensetzung in dünner Plattenform geeignet geformt und dann zu sammengebaut werden, um mit der Form eines fehlenden Teils des zu regenerierenden Knorpelgewebes übereinzustimmen.
Um verschiedene Formen von Implantaten zu erhalten, welches eine Materialzusammensetzung in Laminatform oder Rollenform aufweist, wird die Inkubation bevorzugt für 5 Tage bis 2 Wochen fortgeführt, bevor die Formung in solche Formgebungen erfolgt.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden und nicht einschränkend zu verstehenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Ein Netz aus Poly(D,L-Milch-co-Glykolsäure) (PLGA), erhältlich von Ethico, INC. unter der Bezeichnung Vicrylnetz und bekannt als biologisch abbaubares Polymer mit hoher mechanischer Festigkeit wurde in eine 0,5 gewichtsprozentige wässrige saure Lösung (pH 3,0) von Rinderatelocollagen I getaucht und bei –80°C 12 Stunden lang gefroren. Das gefrorene Material wurde dann 24 Stunden lang in Vakuum (0,2 Torr) gefriergetrocknet, um eine nicht kreuzvernetzte Materialzusammensetzung aufweisend ein PLGA-Netz und einen Collagenschwamm in Form einer dünnen Platte zu bilden.
Die sich ergebende nicht kreuzvernetzte Materialzusammensetzung wurde mit Glutaraldehyddampf, gesättigt mit 25 Gewichtsprozent wässriger Glutaraldehydlösung bei 37°C 4 Stunden lang behandelt und dann mit einem Phosphatpuffer 10 mal gewaschen. Zusätzlich wurde das Material 4 Stunden lang in eine 0,1 M wässrige Glycinlösung getaucht, 10 mal mit Phosphatpuffer und 3 mal mit destilliertem Wasser gewaschen und 12 Stunden lang bei –80°C gefroren. Es wurde im Vakuum (0,2 Torr) 24 Stunden gefriergetrocknet, um eine kreuzvernetzte Materialzusammenset zung zu erhalten, aufweisend einen Collagenschwamm und ein PLGA-Netz in Form einer dünnen Platte.
Dieses Material wurde mit Gold beschichtet und der Aufbau wurde unter einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) untersucht. Das Ergebnis ist in 4 gezeigt. Wie in 4 gezeigt, ist innerhalb der Maschen des PLGA-Netzes ein Collagenschwamm ausgebildet.
Beispiel 2
Eine kreuzvernetzte Materialzusammensetzung in dünner Plattenform aus dem PLGA-Netz und dem Collagenschwamm, erhalten in Beispiel 1, wurde in eine Probe von 5,0 mm Breite × 20,0 mm Länge geschnitten. Diese Probe wurde dann in 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl]Ethansulfonsäure-(HEPES-) Puffer (pH 7,4) getaucht. Die nasse Probe wurde einem statischen Dehnungstest unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

* Vergleichsprobe: PLGA-Netz, wie in Beispiel 1 verwendet.
** Vergleichsprobe: kreuzvernetzter Collagenschwamm, erhalten durch Behandlung der 0,5 gewichtsprozentigen wässrigen sauren Lösung (pH 3,0) von Rinderatelocollagen I wie in Beispiel 1.

Wie aus Tabelle 1 zu sehen ist, zeigt die kreuzvernetzte Materialzusammensetzung aus einem Collagenschwamm und einem PLGA-Netz gemäß der Erfindung eine wesentlich höhere Zugfestigkeit als das auf natürlichem Weg erhaltene Material beste hend aus Collagenschwamm, der in HEPES-Pufferlösung getaucht wurde und eine ähnliche Zugfestigkeit wie das PLGA-Netz.
Beispiel 3
Die kreuzvernetzte Materialzusammensetzung in dünner Plattenform aus einem Collagenschwamm und dem PLGA-Netz, wie in Beispiel 1 erstellt, wurde mittels Ethylenoxidgas sterilisiert.
Andererseits wurde mittels eines Skalpells eine Biopsieprobe von einem Rinderellbogenknorpel geschabt, in feine Stücke geschnitten und in einem DMEM-Medium mit 0,2 (w/v)% Collagenase bei 36°C 12 Stunden lang inkubiert. Weiterhin wurde der durch Filtration mit einem Nylonfilter von 70 μm Porengröße erhaltene Überstand mit 2000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert und dann 2 mal mit einem DMEM-Serum-Medium gewaschen, welches 10% Rinderfötusserum und einige Antibiotika enthielt, um Knorpelzellen vom Rinderellbogenknorpel zu erhalten. Die sich ergebenden Knorpelzellen wurden in DMEM-Serum-Medium bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ kultiviert. Die Knorpelzellen nach 2 Zyklen einer Tochterkultivierung wurden separiert und mit 0,025% Trypsin/0,01% EDTA/PBS (–) gesammelt, um eine Zellsuspension von 1 × 10⁷ Zellen/ml zu erstellen.
Danach wurde die kreuzvernetzte Materialzusammensetzung in dünner Plattenform aus Collagenschwamm und PLGA-Netz mittels Ethylenoxidgas sterilisiert und mit DMEM-Serum-Medium benetzt. Die Ränder der Materialzusammensetzung (Membran) wurden mit einem Gummiring eingefasst und 1,3 ml/cm² der Zellsuspension wurde tropfenweise aufgebracht. Das Material wurde in einem Inkubator bei 37°C in einer 5%-igen CO₂-Atmosphäre 4 Stunden lang statisch kultiviert. Dann wurde der Gummiring abgenommen und eine große Menge an Kulturmedium wurde hinzugefügt, gefolgt von einer weiteren Inkubation. Das Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht.
Nach einer einwöchigen Inkubation wurde die Materialzusammensetzung subkutan in einen Nacktmaus-Unterleib implantiert. Sechs (6) Wochen nach der Implantation wurde eine Probe entnommen und mit HE (Hämatoxilyn und Eosin) oder Safranin-O gefärbt. Die m-RNA wurde von der Probe entnommen und auf Typ II Collagen und Aggrecan-Ausdruck, ein Charakteristikum des Gelenkknorpelgewebes unter Verwendung von RT-PCR analysiert.
Wie in 5 sichtbar, hatte die Probe des subkutanen Implantats aus dem Mausunterleib nach 6 Wochen eine glänzende Oberfläche und zeigte eine opake weiße Farbe.
Weiterhin wurden gemäß 6 abgerundete Zellen in Lakunen und mit Safranin-O gefärbten extrazellulären Matrizen in der Probe beobachtet, welche mit HE oder Safranin-O gefärbt wurde. Weiterhin wurde in die entnommenen m-RNA-Proben aus dem Untersuchungsmaterial gelenkknorpelspezifische Gene, beispielsweise Typ II Collagen und Aggrecan erkannt, eine Anzeige dafür, dass das regenerierte Gewebe Gelenkknorpelgewebe war.
Obgleich die Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf gewisse bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht sich, dass viele Änderungen und Abwandlungen von einem Fachmann auf diesem Gebiet innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung gemacht werden können, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert ist. Zum Beispiel versteht sich, obgleich das erfindungsgemäße Implantat bei der Regeneration von Knorpeln (unter Verwendung von Knorpelzellen) bei den bevorzugten Ausführungsformen angewendet wurde, dass die Erfindung auch bei der Herstellung von Implantaten anderer Gewebe verwendet werden kann, beispielsweise Knochen, Blutgefäße, Bändern, Haut, Blase, Herzklappe etc., in dem die Materialzusammensetzung gemäß der Erfindung und ihre jeweiligen Zellen oder Stammzellen wie Osteoblasten, Muskelzellen, Epithelzellen, Fibroblasten und mesenchymale Stammzellen mittels der gleichen Vorgehensweise gemäß der vorliegenden Erfindung kombiniert werden.

Claims

Eine Materialzusammensetzung, aufweisend ein Netz oder einen porösen Schwamm aus einem biologisch abbaubaren synthetischen Polymer und einen porösen Schwamm eines auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers, ausgebildet auf und/oder in dem Netz oder porösen Schwamm, wobei die Materialzusammensetzung vernetzt ist.
Die Materialzusammensetzung nach Anspruch 1, welche die Form einer dünnen Platte hat.
Die Materialzusammensetzung nach Anspruch 2, welche die Form eines Laminats oder einer Rolle hat.
Die Materialzusammensetzung nach Anspruch 1, aufweisend ein Poly(D,L-Milch-co-Glykolsäure)-Netz und einen Kollagen-Schwamm, der vernetzt ist.
Ein Gerüst zum Tragen einer Zelle, aufweisend das Material nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Das Gerüst nach Anspruch 5 zum Tragen von Knorpelzellen oder sich zu diesen differenzierenden Stammzellen.
Ein Implantat zur Verwendung bei der Regeneration von Knorpelgewebe, mit Knorpelzellen oder sich zu diesen differenzierenden Stammzellen und ein Gerüst, welches das Material nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.
Ein Verfahren zum Bereitstellen einer Materialzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, aufweisend: (a) Abscheiden und Imprägnieren einer Lösung aus einem auf natürlichem Weg erhaltenen Polymers in einem Netz oder porösen Schwamm aus einem biologisch abbaubaren synthetischen Polymer; (b) Gefriertrocknen des mit der Lösung imprägnierten Netzes oder porösen Schwamms; und (c) Behandeln der sich ergebenden Materialzusammensetzung mit einem gasförmigen chemischen Vernetzungsmittel.