ES2914053T3

ES2914053T3 - Biomateriales obtenidos mediante ingeniería reforzados y métodos de fabricación de los mismos

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Publication number: ES2914053T3
Application number: ES20158046T
Authority: ES
Inventors: Gabor Forgacs; Brendan Purcell; Karoly Jakab
Original assignee: Modern Meadow Inc
Current assignee: Modern Meadow Inc
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2035-11-03
Also published as: EP3215670B1; EP3690029A1; EP3215670A4; EP4067478A1; EP3215670A1; WO2016073453A1; EP3690029B1

Abstract

Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras, comprendiendo el material: un soporte fibroso que comprende una pluralidad de fibras, en el que las fibras están rodeadas por matriz extracelular, y en el que la matriz extracelular y la pluralidad de fibras están reticuladas entre sí.

Description

DESCRIPCIÓN

Biomateriales obtenidos mediante ingeniería reforzados y métodos de fabricación de los mismos

Campo

En el presente documento se describen métodos para fabricar cuero obtenido mediante ingeniería que incorpora una estructura de refuerzo, así como el cuero resultante formado mediante estos métodos. Estos cueros obtenidos mediante ingeniería pueden usarse en lugar de, o en combinación con, cueros de pellejo de animales.

Antecedentes

El cuero se usa en una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo tapicería de muebles, ropa, zapatos, equipaje, bolsos y accesorios, y aplicaciones en automoción. Actualmente, se usan pieles de animales como materia prima para el cuero natural. Sin embargo, las pieles del ganado plantean preocupaciones medioambientales porque la cría de ganado requiere enormes cantidades de alimento, pastos, agua y combustible fósil. El ganado también produce una contaminación significativa para el aire y las vías fluviales. Además, el uso de pieles de animales para producir cuero es objetable para las personas con conciencia social. La industria mundial del cuero sacrifica más de mil millones de animales al año. La mayor parte del cuero procede de países sin leyes de bienestar animal o que tienen leyes que no se aplican en gran medida o en su totalidad. El cuero producido sin matar animales sería una gran novedad y tendría atractivo en la moda.

Aunque el cuero sintético se desarrolló para abordar algunas de estas preocupaciones, carece de la calidad, la durabilidad y el prestigio del cuero natural. Hasta ahora, no se han desarrollado procedimientos científicamente sólidos e industrialmente viables para producir cuero natural. Por consiguiente, existe la necesidad de una solución a las demandas de alternativas al cuero producido a partir de animales vivos. Existe la necesidad de alternativas al cuero producido a partir de animales vivos y, en particular, existe la necesidad de un material de cuero duradero y que pueda producirse de manera sostenible.

El cuero natural normalmente es un material duradero y flexible creado mediante la curtición de cuero crudo y piel de animales, a menudo pellejo de ganado. Generalmente se entiende que la curtición es el procedimiento de tratar las pieles de animales para producir cuero. La curtición puede realizarse de varios modos bien conocidos, incluyendo curtición vegetal (por ejemplo, usando tanino), curtición al cromo (sales de cromo, incluyendo sulfato de cromo), curtición con aldehído (usando compuestos de oxazolidina o glutaraldehído), sintanos (taninos sintéticos, usando polímeros aromáticos) y similares.

El cuero natural normalmente se prepara en tres partes principales: fases preparatorias, curtición y formación de cuero semiterminado. También puede incluirse el recubrimiento de superficie. Las etapas preparatorias preparan el pellejo/piel para la curtición, y se retiran los componentes no deseados de la piel sin procesar. Las fases preparatorias pueden incluir: conservación, remojo (rehidratación), calero, pelambre, descarnado (retirada de material subcutáneo), dividido, nuevo calero, desencalado (para retirar los productos químicos del pelambre y el encalado), rendido (proteólisis de proteínas), desengrase, frisado, blanqueo, piquelado (cambio de pH), remoción del ácido y la sal (de-pickling), etc.

La curtición se realiza para convertir las proteínas en el pellejo/la piel en un material estable que no se pudrirá, al tiempo que permite que el material permanezca flexible. El cromo es el material de curtición usado más frecuentemente. El pH de la piel/el pellejo puede ajustarse (por ejemplo, reducirse, por ejemplo hasta pH 2,8-3,2) para mejorar la curtición; después de la curtición, el pH puede elevarse (“basificación” hasta un nivel ligeramente superior, por ejemplo, pH 3,8-4,2).

La formación de cuero semiterminado se refiere al tratamiento tras la curtición que puede incluir dar color (teñir), adelgazar, secar o hidratar y similares. Los ejemplos de técnicas de formación de cuero semiterminado incluyen: humectación (rehidratación), abrevado (secado), dividido (en capas más delgadas), afeitado, neutralización (ajuste del pH a un nivel más neutro), recurtición, teñido, engrasado, llenado, rellenado, pelado, blanqueo, fijación de productos químicos no unidos, endurecimiento, acondicionamiento, ablandamiento, pulido, etc.

En la práctica, el procedimiento de conversión de la piel de animal en cuero puede incluir etapas secuenciales tales como: depilado/pelambre, calero, desencalado y rendido, piquelado, curtición, neutralización/teñido y engrasado, secado y acabado. El proceso de pelambre puede retirar químicamente el pelo (por ejemplo, usando una disolución alcalina), mientras que la etapa de calero (por ejemplo, usando una disolución alcalina y de sulfuro) puede completar adicionalmente el proceso de retirada de pelo e hinchar (“abrir”) el colágeno. Durante la curtición, la estructura de la piel puede estabilizarse en la forma “abierta” reemplazando parte del colágeno con iones complejos de cromo. Dependiendo de los compuestos usados, el color y la textura del cuero pueden cambiar. El cuero curtido puede ser mucho más flexible que un pellejo sin tratar y también más duradero.

La piel, o el pellejo de animal, está formada principalmente por colágeno, una proteína fibrosa. El colágeno es un término genérico para una familia de al menos 28 tipos distintos de colágeno; la piel de animales normalmente es colágeno tipo 1 (por lo que se supone normalmente que el término colágeno es colágeno tipo 1), aunque pueden usarse otros tipos de colágeno para la formación del cuero. Los colágenos se caracterizan por un triplete de repetición de aminoácidos, -(Gly-X-Y)„-, de modo que aproximadamente un tercio de los residuos de aminoácido que se encuentran en el colágeno son glicina. X es a menudo prolina e Y es a menudo hidroxiprolina. Por tanto, la estructura del colágeno puede consistir en unidades triples entrelazadas de cadenas peptídicas de diferentes longitudes. Diferentes animales pueden producir diferentes composiciones de aminoácidos del colágeno, lo que puede dar como resultado diferentes propiedades (y diferencias en el cuero resultante). Los monómeros de fibra de colágeno pueden producirse a partir de cadenas alfa de aproximadamente 1050 aminoácidos de longitud, de modo que la triple hélice adopta la forma de una varilla de aproximadamente 300 nm de longitud, con un diámetro de 1,5 nm. En la producción de la matriz extracelular por las células de piel fibroblastos, pueden sintetizarse monómeros de triple hélice y los monómeros pueden unirse entre sí para dar lugar a una forma fibrosa. Estas triples hélices pueden mantenerse juntas mediante enlaces salinos, enlaces de hidrógeno, enlaces hidrófobos y enlaces covalentes. Las triples hélices pueden unirse entre sí en haces denominados fibrillas y los haces de fibrillas se unen entre sí para crear fibras. Las fibras normalmente se dividen y se unen entre sí a lo largo de una capa de piel. Las variaciones de la reticulación o la unión pueden proporcionar resistencia al material. Las fibras pueden tener una variedad de diámetros. Además del colágeno tipo I, la piel (pellejos) también puede incluir otros tipos de colágeno, incluyendo el colágeno tipo III (reticulina), el colágeno tipo IV y el colágeno tipo VII.

Los intentos anteriores de obtención de cueros obtenidos mediante ingeniería han resultado insatisfactorios o poco prácticos. Por ejemplo, el documento EP 1589098 (“la solicitud '098”) describe un método de hacer crecer fibroblastos sembrados en soportes bioactivos tridimensionales. Los soportes pueden estar compuestos por material de desecho de colágeno procedente de un procedimiento de curtición (“división”), micropartículas de colágeno puro, partículas de material de desecho de colágeno o soportes sintéticos (por ejemplo, compuestos por polímeros tales como HYAFF). La adición del material de soporte complica y aumenta el coste de su procedimiento propuesto y también afecta a las propiedades de cualquier cuero producido de este modo.

La solicitud '098 es un ejemplo de una técnica de soporte para cultivar cuero, sin embargo, un método como este, que usa un soporte de materiales de colágeno obtenido mediante ingeniería o de desecho, no se ha usado ampliamente porque es costoso y difícil de trabajar, y ha demostrado ser técnicamente difícil de trabajar y comercializar.

Hasta la fecha, la fabricación de cuero mediante técnicas ex vivo (por ejemplo, cultivo celular) ha resultado difícil. Una posible ventaja del cuero cultivado (por ejemplo, obtenido mediante ingeniería) es la posibilidad de añadir materiales, incluyendo materiales sintéticos, durante el procedimiento de fabricación, de modo que tales materiales puedan integrarse en el cuero resultante, por ejemplo, para proporcionar mayor resistencia, durabilidad y funcionalidad. Aunque referencias tales como la publicación de patente estadounidense n.° 2012/0023777 concedida a Greene han sugerido cultivar cuero añadiendo elementos al cuero cultivado, tales como soportes de refuerzo o miembros esféricos, incluyendo miembros huecos, que pueden modificar la densidad, el peso y la rigidez del material resultante. Desafortunadamente, referencias tales como esta no describen adecuadamente cómo pueden fabricarse tales materiales, particularmente en cuanto a cantidades y tamaños necesarios para una fabricación comercial significativa.

En el presente documento se describen cueros obtenidos mediante ingeniería que pueden incluir uno o más materiales de refuerzo, que pueden procesarse de una manera sencilla y altamente robusta que puede escalarse de modo que puedan fabricarse cantidades y calidades de cuero comercialmente relevantes. Los métodos y materiales descritos en el presente documento pueden abordar muchos de los problemas de los cueros naturales y obtenidos mediante ingeniería previamente descritos, incluyendo aquellos identificados anteriormente.

También se describen en el presente documento cueros obtenidos mediante ingeniería que pueden abordar los problemas mediante la formación de materiales similares a los materiales compuestos reforzados con fibras (FRC), en los que las células se cultivan sobre soportes fibrosos (formados por fibras tales como seda). En general, los FRC se refieren a materiales compuestos de construcción que forman una clase de materiales de alto rendimiento usados en varias industrias, incluyendo de la energía, la construcción, la automoción y el deporte. Los FRC consisten en una fase de matriz continua (normalmente una matriz de polímero), una fase de fibra dispersa (normalmente una fibra de vidrio, carbono o celulósica más fuerte) y una superficie de contacto entre la matriz y las fibras. Dentro de la superficie de contacto, las fibras se reticulan con la fase de matriz para unir el material entre sí y transmitir fuerzas desde la fase de matriz a las fibras más fuertes. Como resultado, pueden realizarse materiales con resistencias increíbles que no son posibles con cada material individualmente.

Tal como se ha mencionado, se han desarrollado numerosos soportes obtenidos mediante ingeniería de tejido a lo largo de los últimos 25 años para construir tejidos biológicos con estructuras y dimensiones definidas. Estos soportes proporcionan un área superficial para que las células se adhieran y hagan crecer tejido en tres dimensiones. Los materiales fibrosos que consisten en fibras entrelazadas o tejidas, de 100 nm a 100 um de diámetro, se han explorado ampliamente como soportes obtenidos mediante ingeniería de tejido debido a sus grandes áreas superficiales para el crecimiento celular por unidad de volumen y altas porosidades para permitir la infiltración celular en toda la arquitectura del soporte 3D. Normalmente, los soportes obtenidos mediante ingeniería de tejido son biodegradables, lo que permite que el tejido reemplace al soporte a medida que crece. Por tanto, el producto final consiste solo en tejido biológico para mejorar la biocompatibilidad tras la implantación.

Las construcciones obtenidas mediante ingeniería de tejido generalmente se hacen crecer para aplicaciones biomédicas, incluyendo la inserción en un cuerpo para reparar y/o reemplazar tejido biológico, por lo que la biocompatibilidad ha sido una consideración importante. Sin embargo, el uso de tejidos biológicos para aplicaciones de consumo requiere un conjunto de consideraciones muy diferente. En tales casos, debe considerarse la durabilidad, el aspecto y la capacidad para curtirse o conservarse. En el presente documento se describen métodos y técnicas para la fabricación de tejido biológico, así como el material obtenido mediante ingeniería resultante, que pueden abordar las preocupaciones descritas anteriormente. En particular, en el presente documento se describen materiales compuestos en los que el tejido se hace crecer a lo largo de un soporte fibroso y se reticula con el soporte durante un procedimiento análogo a la curtición para crear una clase novedosa de materiales compuestos de alto rendimiento, así como métodos para formar tales materiales compuestos. Estos cueros obtenidos mediante ingeniería pueden reproducir muchas de las estructuras y propiedades de los cueros naturales, pero pueden procesarse de una manera mucho más sencilla.

Sumario de la divulgación

La presente invención, tal como se reivindica en la reivindicación 1, se refiere a un material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras, comprendiendo el material: un soporte fibroso que comprende una pluralidad de fibras, en el que las fibras están rodeadas por una matriz extracelular, y en el que la matriz extracelular y la pluralidad de fibras están reticuladas entre sí. Las realizaciones preferidas de la invención se reivindican en las reivindicaciones dependientes adjuntas.

En el presente documento también se da a conocer lo siguiente:

En el presente documento se describen pellejos obtenidos mediante ingeniería reforzados y métodos para fabricar estos pellejos. Estos pellejos pueden curtirse para formar materiales de cuero, que pueden usarse en cualquier lugar en el que se use cuero natural, incluyendo la fabricación de prendas de vestir (ropa, zapatos, etc.), mobiliario (por ejemplo, tapicería) o similares (cinturones, pulseras, etc.).

Por ejemplo, un método para fabricar un pellejo obtenido mediante ingeniería reforzado puede incluir: colocar una primera pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre una primera superficie de una malla, teniendo la malla una primera superficie y una segunda superficie; cultivar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno para formar una primera capa de colágeno que cubra la primera superficie; voltear la malla y colocar una segunda pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre la segunda superficie de la malla; y cultivar la segunda pluralidad de células liberadoras de colágeno para formar una segunda capa de colágeno que cubra la segunda superficie, en el que la malla está incrustada entre las capas primera y segunda de colágeno y las capas primera y segunda de colágeno están conectadas entre sí a través de la malla.

En general, colocar las células puede incluir colocar (por ejemplo, sembrar) células individuales, grupos/agrupaciones de células y/o capas/láminas de células dentro de una lámina de colágeno que las células han secretado. Las células pueden colocarse directamente sobre la superficie, incluyendo sobre la superficie de la malla o capa previamente colocada.

En cualquiera de las variaciones descritas en el presente documento, la malla puede sujetarse (de manera liberable) en un armazón. El armazón puede manipularse para transferir, incluyendo voltear, la malla y cualquier capa de células/colágeno sobre la misma. Por ejemplo, colocar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno puede comprender colocar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre la primera superficie de la malla en la que la malla se sujeta de manera liberable en un armazón. El armazón puede permanecer sobre las células durante todo el procedimiento de fabricación del pellejo y puede retirarse antes, o en algunas variaciones después, de la curtición.

Cualquiera de estos métodos puede incluir voltear la malla una o más veces durante la formación del material, para aplicar capas adicionales de células (y, por tanto, colágeno) al material en crecimiento. Por ejemplo, el método puede incluir voltear la malla de modo que la segunda superficie quede hacia arriba y colocar al menos una primera pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno encima de la segunda superficie y cultivar la al menos una primera pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno para formar al menos una primera capa adicional de colágeno que cubra la segunda superficie. Alternativa o adicionalmente, el método puede incluir voltear la malla de modo que la primera superficie quede hacia arriba y colocar al menos una segunda pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno encima de la primera superficie y cultivar la al menos una segunda pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno para formar al menos una segunda capa adicional de colágeno sobre la segunda superficie.

Así, por ejemplo, el método puede incluir voltear secuencialmente la malla y colocar al menos una pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno encima de la primera superficie o de la segunda superficie y cultivar la al menos una segunda pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno para formar al menos una capa adicional de colágeno sobre la primera o segunda superficie.

Tal como se mencionó, el material puede curtirse para formar un cuero. Por ejemplo, el método puede incluir curtir el material que incluye la malla incrustada entre las capas primera y segunda de colágeno. La curtición puede incluir curtir el material que tiene la malla incrustada entre las capas primera y segunda de colágeno con la malla sujeta de manera extraíble por un armazón, en el que la malla se aseguró al armazón durante las etapas de colocación (por ejemplo, la etapa de colocar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre la primera superficie de la malla).

Tal como se mencionó, en algunas variaciones, colocar las células puede incluir colocar una lámina de células (y colágeno). Puede formarse una lámina de colágeno cultivando las células en una placa de cultivo (o sobre otro fragmento de malla) y transfiriendo la lámina al material en crecimiento que incluye la malla.

En algunas variaciones, el método incluye colocar la malla sobre una capa preliminar de células liberadoras de colágeno en una placa de cultivo de modo que la segunda superficie de la malla descanse sobre la capa preliminar antes de colocar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre la primera superficie de la malla. Este método puede ser particularmente útil en variaciones en las que la malla tiene tamaños de poro relativamente grandes (por ejemplo, las separaciones a través de la malla son mayores de o iguales a aproximadamente 0,5 mm). De manera similar, en algunas variaciones, el método puede incluir colocar un tapón contra la segunda superficie de la malla antes de colocar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre la primera superficie de la malla.

Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede incluir el uso de una malla formada por un material al que las células normalmente no se adhieren; a pesar de no adherirse, lo que puede dificultar que las células crezcan y liberen colágeno, las células pueden liberar colágeno sobre la malla. Esto puede ser posible en algunas variaciones, debido a los tamaños de poro relativamente grandes (por ejemplo, mayores que el diámetro de las células) de modo que las células se adhieran a través de las aberturas de la malla (por ejemplo, a un sustrato, tapón u otra capa de colágeno/células).

Un método para fabricar un pellejo obtenido mediante ingeniería reforzado puede incluir: colocar una primera pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre una primera superficie de una malla, teniendo la malla una primera superficie y una segunda superficie; cultivar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno para formar una primera capa de colágeno que cubra la totalidad de la primera superficie; voltear la malla y colocar una segunda pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre la segunda superficie de la malla; cultivar la segunda pluralidad de células liberadoras de colágeno para formar una segunda capa de colágeno que cubra la totalidad de la segunda superficie, en el que la malla está incrustada entre las capas primera y segunda de colágeno y las capas primera y segunda de colágeno están conectadas entre sí a través de la malla; y formar secuencialmente capas adicionales de colágeno sobre las superficies primera, segunda o primera y segunda de la malla para formar un pellejo obtenido mediante ingeniería reforzado que tenga la malla intercalada entre una pluralidad de capas de regiones densas en colágeno.

Formar secuencialmente capas adicionales de colágeno puede incluir formar un pellejo obtenido mediante ingeniería reforzado que tenga el patrón estriado que incluye una pluralidad de capas de regiones densas en colágeno y al menos una capa de malla.

Un método para fabricar un pellejo obtenido mediante ingeniería reforzado puede incluir: colocar una primera pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre una primera superficie de una malla, teniendo la malla una primera superficie y una segunda superficie, en el que la malla se sujeta de manera liberable en un armazón; cultivar la primera pluralidad de células liberadoras de colágeno para formar una primera capa de colágeno que cubra la primera superficie; voltear el armazón y la malla y colocar una segunda pluralidad de células liberadoras de colágeno sobre la segunda superficie de la malla; cultivar la segunda pluralidad de células liberadoras de colágeno para formar una segunda capa de colágeno que cubra la segunda superficie de modo que la malla se incruste entre las capas primera y segunda de colágeno y las capas primera y segunda de colágeno se conecten entre sí a través de la malla; colocar al menos una primera pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno encima de la segunda superficie y cultivar la al menos una primera pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno para formar al menos una primera capa adicional de colágeno que cubra la segunda superficie; voltear el armazón y la malla y colocar al menos una segunda pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno encima de la primera superficie y cultivar la al menos una segunda pluralidad adicional de células liberadoras de colágeno para formar al menos una segunda capa adicional de colágeno sobre la segunda superficie; y retirar la malla del armazón.

También se describen en el presente documento cualquiera de los pellejos obtenidos mediante ingeniería reforzados fabricados mediante los métodos descritos. Por ejemplo, un pellejo obtenido mediante ingeniería reforzado puede incluir: un cuerpo que se extiende en un plano y que tiene un volumen normal al plano, comprendiendo el volumen una pluralidad de capas de regiones densas en colágeno que se extienden en el plano dentro del volumen para formar un patrón estratificado de regiones densas en colágeno; y una malla de refuerzo dentro del cuerpo plano y que se extiende en el plano del cuerpo, en el que una primera capa de la pluralidad de capas de regiones densas en colágeno es adyacente a la malla sobre un primer lado y sigue un contorno del primer lado del malla y una segunda capa de la pluralidad de capas de regiones densas en colágeno es adyacente a la malla sobre un segundo lado y sigue un contorno del segundo lado de la malla. Los pellejos pueden curtirse.

Los pellejos pueden estar sustancialmente libres de células epiteliales o queratinocitos no diferenciados. En particular, los pellejos pueden estar libres de cualquier tejido vascular (por ejemplo, vasos sanguíneos o similares), o restos de los mismos, tal como se encontraría en cuero endógeno.

En general, el grosor de cada capa de región densa en colágeno puede ser de entre aproximadamente 10 |im y aproximadamente 200 |im (por ejemplo, entre aproximadamente 20 |im y aproximadamente 150 |im). El tamaño de poro de la malla puede ser, por ejemplo, de entre aproximadamente 2 |im y 5 mm.

En cualquiera de los pellejos obtenidos mediante ingeniería reforzados descritos en el presente documento, el pellejo puede incluir uno o más colorantes o pigmentos. Además, el pellejo puede tener un patrón, por ejemplo, incluyendo tener un patrón en relieve; en algunas variaciones, el patrón es el patrón de la malla. En general, la malla puede comprender una estructura similar a una red flexible que tiene un tamaño de poro de menos de 5 mm. En algunas variaciones, la malla comprende un material polimérico sintético.

Según la invención tal como se reivindica, se usa un soporte fibroso sobre el cual se cultivan células para producir un material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras tal como se reivindica.

Además del refuerzo de malla descrito en el presente documento, cualquiera de los métodos y los materiales textiles (cueros) obtenidos mediante ingeniería dados a conocer pueden incluir una matriz fibrosa. La propia malla puede ser una matriz fibrosa o puede estar formada por una matriz fibrosa. La malla puede estar formada completamente (o, en algunas variaciones, parcialmente) por un material de reticulación que puede reticularse con la matriz extracelular que las células cultivadas han hecho crecer durante el procedimiento de curtición, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la malla puede estar formada por una fibra de proteína que comprende grupos amina, ácido carboxílico y sulfhidrilo.

Por ejemplo, los materiales de cuero reforzados obtenidos mediante ingeniería (cueros obtenidos mediante ingeniería) descritos en el presente documento pueden incluir también o alternativamente un material compuesto de una matriz fibrosa que se ha curtido para permitir la reticulación de la matriz fibrosa con el colágeno formado por células cultivadas (por ejemplo, fibroblastos). Estos cueros obtenidos mediante ingeniería pueden denominarse materiales compuestos de tejido biológico reforzados con fibras. En el presente documento también se describen métodos de obtención de tales materiales compuestos de tejido biológico reforzados con fibras.

Por ejemplo, un método para formar un material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras puede incluir formar el material cultivando células productoras de tejido (por ejemplo, fibroblastos) sobre un soporte fibroso que tiene grupos funcionales amina (-NH²) y ácido carboxílico (-COOH), que pueden reticularse (por ejemplo, mediante curtición) con el tejido y/o las proteínas, tales como colágeno, formarse y/o secretarse por las células y luego la curtición (por ejemplo, reticulación química). La curtición puede realizarse una vez que las fibras del soporte se han cubierto al menos parcialmente con las células cultivadas y la matriz extracelular liberada por las células cultivadas. En general, los soportes descritos en el presente documento son soportes fibrosos formados por cualquier material reticulable, pero particularmente materiales proteicos (por ejemplo, que contienen grupos amina y ácido carboxílico), tales como la seda. La seda es sólo un ejemplo de un soporte fibroso que puede reticularse; la seda generalmente está formada por una fibra de proteína que puede estar compuesta principalmente por fibroína. Por ejemplo, las fibras de seda procedentes de gusanos de seda de cría normalmente tienen una sección transversal triangular con esquinas redondeadas, de 5-10 |im de ancho. La cadena pesada de fibroína está compuesta principalmente por láminas beta, debido a la secuencia de repetición de aminoácidos de 59 monómeros con algunas variaciones. Las fibras del gusano de seda se extruyen de manera natural a partir de dos glándulas del gusano de seda como un par de filamentos primarios (brin), que están pegados entre sí, con proteínas de sericina que actúan como pegamento, para formar un hilo de seda (bave). Los diámetros del hilo de seda para formar la seda tussah pueden alcanzar los 65 |im. La seda emitida por un gusano de seda puede consistir en dos proteínas principales, sericina y fibroína, siendo la fibroína el centro estructural de la seda, y siendo la serecina el material pegajoso que la rodea. La fibroína está compuesta por los aminoácidos Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala y forma láminas beta plegadas. Se forman enlaces de hidrógeno entre cadenas y se forman cadenas laterales por encima y por debajo del plano de la red de enlaces de hidrógeno.

Generalmente, una malla es una red de material (hilos, cordones, hebras, fibras, etc.) que están conectados, por ejemplo, mediante tejido o de otro modo. La malla puede tener poros de tamaño regular o irregular, y/o de forma regular o irregular, y/o de separación regular o irregular, y/o de patrón regular o irregular. Generalmente, la malla puede ser bidimensional (por ejemplo, formando una lámina o superficie); también se contemplan mallas tridimensionales. Como ejemplo, los poros pueden ser de entre 10 nm y 5 cm en uno o más de; diámetro o separación. Por ejemplo, el tamaño de poro puede estar generalmente entre un diámetro inferior de aproximadamente 10 nm, 20 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 0,6 mm, 0,7 mm, 0,8 mm, 0,9 mm, 1 mm, 1,1 mm, 1,2 mm, 1,3 mm, 1,4 mm, 1,5 mm, 1,6 mm, 1,7 mm, 1,8 mm, 1,9 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 12 mm, 15 mm, 2 cm, 2,5 cm, 3 cm, 4 cm, 5 cm, etc., y un diámetro superior de aproximadamente 20 nm, 50 nm, 100 nm , 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 0,6 mm, 0,7 mm, 0,8 mm, 0,9 mm, 1 mm, 1,1 mm, 1,2 mm, 1,3 mm, 1,4 mm, 1,5 mm, 1,6 mm, 1,7 mm, 1,8 mm, 1,9 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 12 mm, 15 mm, 2 cm, 2,5 cm, 3 cm , 4 cm, 5 cm, 6 cm, 7 cm, 8 cm, 9 cm, 10 cm, etc., donde el diámetro inferior siempre es menor que el diámetro superior. Las hebras (por ejemplo, fibras, hilos, tramas, etc.) o el material que forma la malla pueden tener diámetros de entre aproximadamente 100 nm y 5 mm de diámetro (o en algunos casos más). Una malla puede actuar como soporte; tal como se usa en el presente documento, el soporte puede ser, pero no tiene que ser, una malla.

Tal como se mencionó, en cualquiera de los métodos y aparatos (por ejemplo, cueros obtenidos mediante ingeniería) descritos en el presente documento, un soporte puede ser una fibra de proteína que contiene grupos amina y ácido carboxílico, tales como fibras de celulosa que se producen de manera natural que contienen (o que se modifican para contener) grupos amina y ácido carboxílico. Las fibras que forman el soporte pueden modificarse químicamente para potenciar la reticulación del tejido con el soporte. Por ejemplo, el soporte puede modificarse químicamente para contener grupos de reticulación de tejido, incluyendo aminas, ácidos carboxílicos, sulfatos, aldehídos, hidrazidas, sulfhidrilos, epóxidos, acrilatos, etc. Estos grupos de reticulación de tejidos pueden protegerse durante el crecimiento tisular y se activan para la reticulación cuando se completa el crecimiento tisular. En particular, la reticulación a la que se hace referencia en el presente documento es la curtición, que puede ser idéntica a, o derivarse de, los métodos y las técnicas de curtición tradicionales, incluyendo omitir aquellas etapas que se hacen innecesarias por el uso del cultivo tisular tal como se describe en el presente documento. Además, puede usarse una etapa de reticulación de refuerzo adicional para reticular compuestos químicos no implicados en el procedimiento de curtición tradicional (cualquiera distinto de grupos amina y ácido carboxílico). Entonces pueden usarse compuestos químicos de curtición tradicionales para dar el material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras una estética similar a la del cuero. Los soportes también pueden estar formados por (y/o pueden incluir) fibras de carbono, que también pueden modificarse tal como se comentó anteriormente.

En general, estos grupos de reticulación de tejido pueden ser colgantes con respecto al soporte con un espaciador entre 10 daltons y 100 megadaltons. El soporte puede reticularse con el tejido a través de interacciones no covalentes que incluyen fuerzas iónicas, hidrófobas y de van der Waals. Alternativa o adicionalmente, el soporte puede reticularse con el tejido a través de enlaces covalentes. Por ejemplo, el soporte puede hacerse reaccionar directamente con grupos amina o ácido carboxílico en el tejido. El soporte puede hacerse reaccionar con un agente de reticulación que reacciona con grupos amina o ácido carboxílico en el tejido. El peso molecular del agente de reticulación puede ser de entre 10 daltons y 100 megadaltons. El tejido al que se hace referencia en el presente documento son las células cultivadas y/o los productos liberados por esas células cultivadas (por ejemplo, proteínas de la matriz extracelular, en particular colágeno). Cualquiera de los agentes de reticulación descritos en el presente documento puede incluir una funcionalidad del agente de reticulación de entre 2 y 2000.

El soporte puede estar compuesto por fibras. Tal como se mencionó, las fibras pueden tener una dimensión o un tamaño apropiado (por ejemplo, las fibras pueden tener una longitud de entre aproximadamente 100 nm y 1 m). Las fibras pueden unirse en una arquitectura tejida o no tejida (o una combinación de ambas). La densidad de las fibras en el soporte puede ser de entre 10 y 10.000 mg/cc. La porosidad del soporte fibroso puede ser de entre el 10 y el 99%.

Puede cultivarse cualquier célula apropiada sobre el soporte fibroso. Las células pueden originarse a partir de un tejido y/o línea celular. Por ejemplo, las células pueden tener como origen un mamífero (por ejemplo, bovino, porcino, ovino, etc.). Las células pueden tener como origen un reptil (por ejemplo, serpiente, lagarto, etc.). Las células pueden tener como origen un ave (por ejemplo, pollo, avestruz, pavo, etc.). Las células pueden tener como origen un pez (por ejemplo, tiburón, etc.). Las células pueden tener como origen un anfibio (por ejemplo rana, salamandra, etc.). Las células pueden modificarse genéticamente (por ejemplo, para aumentar la producción de ECM, incluyendo, por ejemplo, colágeno, etc.) o pueden no estar modificadas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una vista general de un método para fabricar cuero obtenido mediante ingeniería. En este ejemplo, se toman células de un animal a través de una biopsia sencilla y luego se aíslan y multiplican en un medio de cultivo celular. Luego se permite (y/o se induce) que las células produzcan colágeno, tal como harían de manera natural después de que las células se esparzan para que el colágeno forme láminas. Luego, las láminas se tratan para evitar la contracción, y las láminas delgadas que no se contraen (por ejemplo, descelularizadas) se apilan una encima de otra después de sembrarlas con células formadoras de colágeno adicionales, para formar láminas más gruesas que se permite que se adhieran mediante la acción de las células liberadoras de colágeno. Finalmente, el cuero se forma a partir de esta estructura multicapa mediante un procedimiento de curtición abreviado para modificar el colágeno.

Las figuras 2A-2C ilustran un ejemplo de formación de una pila de láminas de colágeno para crear un cuero obtenido mediante ingeniería reforzado. En este ejemplo, puede añadirse un material de malla (cualquier material de refuerzo) dentro de la pila/entre las capas y pueden hacerse crecer las pilas (y/o células individuales sembradas sobre las capas) sobre el material de refuerzo, encapsulando de ese modo el material de refuerzo dentro del material. Esta técnica puede ser particularmente eficaz con aberturas de gran tamaño de malla.

La figura 3A muestra un ejemplo de un material de malla sobre un armazón en el que pueden hacerse crecer células.

La figura 3B describe esquemáticamente un método a modo de ejemplo para fabricar cuero obtenido mediante ingeniería reforzado, tal como se describe en el presente documento, en el que las células se hacen crecer secuencialmente sobre un primer lado de una malla y la malla (con células que se hicieron crecer y colágeno) puede invertirse para hacer crecer células sobre el lado opuesto.

La figura 4 es una ilustración esquemática de una variación de un método de hacer crecer cuero reforzado.

La figura 5 es otra ilustración esquemática de un método para hacer crecer cuero reforzado sobre una malla.

La figura 6 es otra ilustración esquemática de un método para hacer crecer cuero reforzado sobre una malla.

La figura 7 es una ilustración esquemática de un método para hacer crecer cuero reforzado sobre una malla.

Las figuras 8A y 8B muestran vistas en sección y desde arriba, respectivamente, de un ejemplo de una sección de baja resolución a través de un ejemplo de un cuero reforzado fabricado usando métodos tales como el método ilustrado esquemáticamente en la figura 4 o la figura 5, anteriormente.

La figura 8C muestra el cuero obtenido mediante ingeniería de las figuras 8A y 8B en el que una capa exterior del material se ha desprendido parcialmente para revelar la malla de debajo.

La figura 9 ilustra esquemáticamente una sección a través de un ejemplo del cuero reforzado tal como se describe en el presente documento. La figura no se muestra a escala.

La figura 10 muestra una primera vista de un ejemplo de un soporte fibroso formado por fibras de seda que pueden usarse para formar el cuero fabricado por material compuesto descrito en el presente documento. En la figura 10 se muestra la imagen con un aumento reducido (la barra de escala es de 1 mm).

La figura 11 muestra el soporte fibroso de la figura 10 con un aumento superior (la barra de escala es de 0,5 mm). Las figuras 12A y 12B ilustran el crecimiento tisular sobre un soporte fibroso tal como el soporte de seda mostrado en las figuras 10A-10B. La figura 12A muestra el soporte fibroso y la figura 12B muestra el soporte fibroso de la figura 12A tras cuatro semanas de cultivo de fibroblastos. Las células se sembraron sobre el soporte de fibras de seda mostrado en la figura 12A y después de cuatro semanas de cultivo, el soporte fibras está rodeado por tejido (figura 12B).

La figura 13 muestra un ejemplo de un soporte de seda sobre el que se cultivan fibroblastos, antes de la curtición. En la figura 13, una sección del soporte sobre el que se han cultivado fibroblastos (por ejemplo, durante cuatro semanas) se ha teñido con rojo picrosirio para visualizar el colágeno.

La figura 14 es una micrografía electrónica de barrido que muestra una porción de un soporte de seda fibrosa sobre el que se han hecho crecer fibroblastos y que se ha permitido (y en algunas variaciones se ha estimulado) que secreten colágeno. El tejido rico en colágeno se ha hecho crecer por todo el soporte de fibra de seda.

La figura 15 muestra ejemplos de cuatro materiales compuestos diferentes de soportes fibrosos (seda, PLLA de alta densidad, poliéster, PLLA de baja densidad) y fibroblastos después de ocho semanas de cultivo, seguido por curtición. Sólo se curtió satisfactoriamente el material compuesto de soporte de seda fibrosa, y sólo el soporte de seda fibrosa incluye grupos amina y ácido carboxílico que pueden reticularse con el tejido durante el procedimiento de curtición.

La figura 16 muestra un ejemplo de la superficie similar al cuero de un material compuesto de soporte de seda fibrosa tras la curtición.

La figura 17 es un ejemplo del borde de un material compuesto de soporte de seda fibrosa tras la curtición, en el que se produjo un gradiente de tejido hacia el borde del soporte de seda, revelando las fibras de seda dispersas por toda la matriz de tejido.

Descripción detallada

En general, en el presente documento se describen biomateriales obtenidos mediante ingeniería reforzados y métodos para fabricarlos. Por ejemplo, en el presente documento se describen pellejos obtenidos mediante ingeniería (por ejemplo, cuero) que incorporan un material de soporte tal como una malla o un soporte incrustado dentro del pellejo, así como métodos para fabricar estos biomateriales obtenidos mediante ingeniería reforzados. En algunas variaciones, los pellejos obtenidos mediante ingeniería descritos en el presente documento pueden formarse formando capas secuenciales de células liberadoras de colágeno (por ejemplo, se les permite crecer y liberar colágeno para formar una capa) y combinando una o más capas de células liberadoras de colágeno de modo que puedan fusionarse con un material de soporte tal como una malla. Alternativa o adicionalmente, los pellejos obtenidos mediante ingeniería pueden formarse añadiendo células liberadoras de colágeno a un soporte fibroso formado por un material que puede reticularse durante la curtición directamente con la matriz extracelular liberada (por ejemplo, colágeno). Por tanto, la malla y/o el soporte pueden tratarse o formarse de otro modo con un material que puede reticularse con la ECM durante la curtición.

En algunas variaciones, los pellejos obtenidos mediante ingeniería descritos en el presente documento pueden formarse sembrando secuencialmente células liberadoras de colágeno o capas de células liberadoras de colágeno sobre un material de soporte, tal como una malla, y permitiendo que las células (o la capa de células) crezcan y liberen colágeno sobre el material de soporte. Las células o capas de células se aplican de manera que se les permita recibir nutrientes; se les puede permitir que maduren para formar la nueva capa (incluyendo una nueva capa de colágeno) antes de formar una nueva capa encima de estas células.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la malla puede proporcionarse como un soporte y, al formar la capa, el material de malla puede voltearse periódicamente de modo que las células o capas de células preformadas puedan colocarse encima de cualquiera de los lados primero segundo, y se les permite crecer y adherirse (liberando colágeno) antes de voltear el material y el pellejo en crecimiento para aplicar al lado opuesto del material.

Tal como se mencionó en la sección de antecedentes anteriormente, la tecnología de obtención mediante ingeniería de tejidos ofrece nuevas oportunidades para producir pieles y pellejos de animales (y cuero a partir de los mismos) que no están asociados con la degradación medioambiental de la cría de ganado. La obtención mediante ingeniería de tejidos se ha definido como un campo interdisciplinario que aplica los principios de la ingeniería y las ciencias de la vida hacia el desarrollo de sustitutos biológicos que restablecen, mantienen o mejoran la función de los tejidos o de un órgano completo. Langer R, Vacanti JP, Tissue Engineering, Science 260(5110):920-926 (mayo de 1993). Los productos obtenidos mediante ingeniería de tejidos fabricados usando materiales y métodos tradicionales tienen un tamaño limitado debido a las distancias cortas que los gases y los nutrientes pueden difundir para nutrir las células interiores, normalmente los grosores de las construcciones obtenidas mediante ingeniería son inferiores a aproximadamente 250-300 |im. Además, las técnicas existentes no proporcionan la velocidad y el rendimiento adecuados para la producción en masa de productos obtenidos mediante ingeniería. Como resultado, los métodos de ingeniería de tejidos existentes dan como resultado láminas y pastas delgadas poco atractivas a una escala comercialmente inviable. Por tanto, un objetivo de la piel/pellejo, o cuero animal, y los métodos para fabricar los mismos descritos en el presente documento es proporcionar piel, pellejo o cuero de animales comercialmente viable y atractivo. Otro objetivo es proporcionar métodos de alto rendimiento que puedan escalarse de manera fiable, precisa y reproducible hasta niveles comerciales. Las ventajas de la piel, el pellejo o el cuero de animales y de los métodos para fabricarlos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, la producción de tejidos personalizados de manera reproducible, de alto rendimiento y fácilmente escalable, manteniendo un control preciso de la formación de patrones, particularmente en casos de múltiples tipos de células, lo que puede dar como resultado piel, pellejo o cuero de animales obtenido mediante ingeniería con aspecto, textura, grosor y durabilidad atractivos.

En el presente documento se dan a conocer pellejo y cuero de animales obtenido mediante ingeniería y métodos para producirlos. En determinadas realizaciones, en el presente documento se dan a conocer pieles, pellejos o cueros de animales obtenidos mediante ingeniería que comprenden una o una pluralidad de capas de células animales que comprenden uno o más tipos de células de piel, en las dichas células animales se cultivan in vitro. En determinadas realizaciones, cada capa de células animales proporcionada en el presente documento está biofabricada. Puede incorporarse un soporte estructural, tal como una malla, en cualquiera de los materiales obtenidos mediante ingeniería descritos en el presente documento.

También se describen en el presente documento pellejo y cuero de animales obtenidos mediante ingeniería y métodos para producirlos, que incluyen un soporte fibroso que puede usarse para hacer crecer células que pueden liberar eCm que puede reticularse con el soporte fibroso durante la curtición. Por ejemplo, el soporte fibroso puede incluir grupos reactivos disponibles que pueden reticularse con una o más proteínas de ECM (por ejemplo, colágeno).

Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden incluir formar en primer lugar láminas de colágeno haciendo crecer (cultivando) células liberadoras de colágeno y permitiéndoles (y/o estimulándolas) para que secreten colágeno. En cultivo, las células pueden hacerse crecer hasta confluencia sobre un sustrato tal como el fondo de una placa de cultivo celular, un matraz, un rodillo, una cámara (por ejemplo, cámara giratoria) o similar, y/o en un soporte fibroso.

En general, las células liberadoras de colágeno descritas en el presente documento pueden derivarse de extractos/explantes de tejido, líneas celulares inmortalizadas o líneas celulares manipuladas (transgénicas), o cualquier variación de los mismos. En algunas variaciones, la célula puede hacerse crecer hasta confluencia completa (por ejemplo, 100% de confluencia), en la que se inhibe el crecimiento adicional de las células pero pueden continuar produciendo o pueden estimularse para producir y liberar colágeno. En algunas variaciones, las células pueden no hacerse crecer hasta confluencia completa (por ejemplo, aproximadamente el 99% de confluencia, el 95% de confluencia, el 90% de confluencia, el 85% de confluencia, el 80% de confluencia, etc.). Las células pueden cultivarse hasta una confluencia superior al 80%, una confluencia superior al 85%, una confluencia superior al 90%, una confluencia superior al 95% y/o justo por debajo de la confluencia total (100%).

Tal como se describe con mayor detalle a continuación, y en particular con referencia a las figuras 3-8C, las células y láminas de células pueden hacerse crecer directamente sobre un material de soporte (por ejemplo, una malla); alternativamente, las células pueden hacerse crecer inicialmente en una o más láminas que se combinan con un material de soporte (por ejemplo, una malla) y luego se les permite que crezcan adicionalmente (por ejemplo, mediante la adición de células o láminas adicionales de modo que liberan colágeno).

En general, las estructuras en crecimiento (por ejemplo, láminas) que incluyen colágeno pueden tratarse para evitar las contracciones. Las células cultivadas, incluyendo las células liberadoras de colágeno, pueden comenzar a contraerse durante el cultivo. Las células cultivadas que forman las múltiples láminas de colágeno pueden tratarse durante el crecimiento y/o hacia el final del crecimiento. Normalmente, las láminas de colágeno se tratan antes de que comience la contracción o antes de que se produzca una contracción superior a un umbral. En general, es deseable evitar las contracciones porque las células que se contraen en una lámina de colágeno pueden provocar que la lámina se deforme, lo que puede ser indeseable cuando se forma un cuero obtenido mediante ingeniería. En algunas variaciones, el tratamiento de las láminas de colágeno o el tratamiento de las células que forman las láminas de colágeno puede incluir la destrucción de las células. Por tanto, las láminas de colágeno que incluyen las células cultivadas pueden tratarse descelularizando (por ejemplo, retirando o destruyendo) las células liberadoras de colágeno. En algunas variaciones, esto puede incluir el tratamiento de las láminas de colágeno con etanol. Después del tratamiento, las láminas de colágeno resultantes pueden denominarse láminas “no contráctiles” o láminas “descelularizadas” (para láminas tratadas para destruir y/o retirar las células liberadoras de colágeno).

Después de tratar las láminas para formar láminas no contráctiles, las láminas pueden lavarse (por ejemplo, enjuagarse o similar) para retirar el material usado para tratar las células. También pueden realizarse otros tratamientos adicionales. Después de eso, puede formarse un cuero obtenido mediante ingeniería de un grosor deseado usando las láminas no contráctiles. Por ejemplo, las láminas pueden apilarse secuencial o simultáneamente y adherirse entre sí. La adhesión puede lograrse sembrando nuevamente las láminas (por ejemplo, una superficie de la lámina) de modo que las células liberadoras de colágeno puedan comunicarse con uno o ambos lados de las láminas no contráctiles. Este segundo grupo de células pueden ser las mismas células usadas para hacer crecer las láminas de colágeno, o pueden ser tipos de células diferentes (aunque también liberadoras de colágeno) o distribuciones de tipos de células diferentes en las que se usan múltiples tipos de células para hacer crecer las láminas de colágeno. Puede aplicarse un material de soporte, tal como una malla, entre láminas o sobre una sola lámina sobre la que se hacen crecer células liberadoras de colágeno adicionales por sí mismas o debajo de otra lámina.

Al añadir cada nueva capa de células o malla y células liberadoras de colágeno (o capa de células y colágeno liberado), entonces se le puede permitir crecer (por ejemplo, cultivarse) al segundo grupo de células liberadoras de colágeno hasta que se obtenga una adhesión suficiente entre las dos láminas. La adhesión suficiente puede determinarse mediante el tiempo en cultivo (por ejemplo, aproximadamente: 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, etc.), o puede determinarse empíricamente. Por ejemplo, se le puede permitir crecer a la “pila” de láminas (dos láminas que se adhieren entre sí mediante el segundo grupo sembrado de células liberadoras de colágeno) durante más de aproximadamente 4 días, más de aproximadamente 5 días, más de aproximadamente 6 días, más de aproximadamente 7 días, más de aproximadamente 8 días; y/o menos de aproximadamente 9 días, menos de aproximadamente 8 días, menos de aproximadamente 7 días, menos de aproximadamente 6 días, menos de aproximadamente 5 días, etc., incluyendo expresamente entre aproximadamente 2 y 9 días, entre aproximadamente 4 y 7 días, aproximadamente 5 días, etc.

En algunas variaciones, puede insertarse un material de relleno entre las láminas antes de cultivarlas para permitir que se adhieran. Puede usarse cualquier material de relleno apropiado, pero particularmente material de relleno colagenoso. El material de relleno puede ser útil para aumentar el grosor de la pila que forma el cuero obtenido mediante ingeniería y/o reducir el número de capas de colágeno usadas para formar un cuero obtenido mediante ingeniería. Los ejemplos de materiales de relleno incluyen colágeno reconstituido y/o pulpa de colágeno (por ejemplo, colágeno cortado mecánicamente). El colágeno reconstituido puede ser despolimerizado (por ejemplo, monómeros de colágeno o polímeros pequeños). Puede añadirse material de relleno hasta un grosor deseado. En algunas variaciones, el material de relleno puede sembrarse con células del segundo grupo de células liberadoras de colágeno, además o alternativamente a las células liberadoras de colágeno sembradas sobre una o ambas capas que van a apilarse entre sí alrededor del material de relleno.

Cuando se añaden láminas adicionales de colágeno a una pila (por ejemplo, láminas de colágeno no contráctiles) formando un cuero artificial, pueden añadirse láminas adicionales secuencial o paralelamente, o una combinación de ambas, en las que un pequeño número (por ejemplo, menos de aproximadamente 8, menos de aproximadamente 7, menos de aproximadamente 6, menos de aproximadamente 5, menos de aproximadamente 4, menos de aproximadamente 3, 2, etc.) de láminas pueden apilarse encima de una primera lámina no contráctil de colágeno y se puede permitir que las láminas se adhieran cultivando el segundo grupo de células liberadoras de colágeno colocadas entre las dos o más láminas (con o sin material de relleno) con o sin el material de refuerzo (por ejemplo, malla). De esta manera, puede formarse una “pila” de láminas de colágeno que se han adherido. Después de eso, las dimensiones (por ejemplo, el grosor) de la pila pueden aumentarse combinando dos o más pilas y permitiéndoles adherirse cultivando una (o más) encima de otra con o sin material de relleno después de sembrarlas con parte del segundo grupo de células liberadoras de colágeno.

Células

Pueden usarse muchos tipos de células para las células liberadoras de colágeno usadas para producir las láminas/capas de colágeno y, por tanto, los productos de piel, pellejo y cuero obtenidos mediante ingeniería descritos en el presente documento. Las células liberadoras de colágeno pueden ser homogéneas (por ejemplo, del tipo de célula) o pueden ser una mezcla de células liberadoras de colágeno y/o células que liberan otros materiales de ECM y/o células que no liberan colágeno. En algunas realizaciones, los productos de piel, pellejo y cuero de animales obtenidos mediante ingeniería están diseñados para parecerse a productos de piel, pellejo y cuero de animales tradicionales y los tipos de células se eligen para aproximarse a los que se encuentran en los productos de piel, pellejo y cuero de animales tradicionales. En realizaciones adicionales, los productos de piel, pellejo y cuero de animales obtenidos mediante ingeniería, y las láminas/capas, incluyen epidermis, membrana basal, dermis, hipodermis, escama, escudo, osteodermo de animales o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la epidermis animal proporcionada en el presente documento comprende estrato córneo, estrato lúcido, estrato granuloso, estrato espinoso, estrato germinativo, estrato basal o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la dermis animal proporcionada en el presente documento comprende estrato papilar, estrato reticular o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las escamas animales proporcionadas en el presente documento comprenden escamas placoides, escamas cosmoides, escamas ganoides, escamas elasmoides, escamas cicloides, escamas ctenoides, escamas crenadas, escamas espinoides o una combinación de las mismas.

En determinadas realizaciones, las células animales proporcionadas en el presente documento comprenden células epiteliales, fibroblastos, queratinocitos, comeocitos, melanocitos, células de Langerhans, células basales o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las células epiteliales proporcionadas en el presente documento comprenden células escamosas, células cuboidales, células columnares, células basales o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, los fibroblastos proporcionados en el presente documento son fibroblastos dérmicos. En algunas realizaciones, los queratinocitos proporcionados en el presente documento son queratinocitos epiteliales, queratinocitos basales, queratinocitos basales en proliferación, queratinocitos suprabasales diferenciados o una combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 15:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 25:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 24:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 23:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 22:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 21:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 20:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 19:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 18:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 17:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 16:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 15:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 14:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 13:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 12:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 11:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 9:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 8:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 7:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 6:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la razón de fibroblastos animales con respecto a queratinocitos animales proporcionada en el presente documento es de aproximadamente 2:1.

En determinadas realizaciones, las células animales proporcionadas en el presente documento están sustancialmente libres de células epiteliales, fibroblastos o queratinocitos no diferenciados.

En otras realizaciones, los productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería incluyen células neurales, tejido conjuntivo (incluyendo huesos, cartílagos, células que se diferencian en células formadoras de huesos y condrocitos, y tejidos linfáticos), células epiteliales (incluyendo células endoteliales que forman revestimientos en cavidades y vasos o canales, células epiteliales secretoras exocrinas, células epiteliales absorbentes, células epiteliales queratinizantes y células de secreción de matriz extracelular) y células indiferenciadas (tales como células embrionarias, células madre y otras células precursoras), entre otros.

En determinadas realizaciones, la piel, el pellejo o el cuero de animales obtenidos mediante ingeniería comprende además una matriz extracelular o tejido conjuntivo. En determinadas realizaciones, la piel, el pellejo o el cuero de animales obtenidos mediante ingeniería comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en colágeno, queratina, elastina, gelatina, proteoglicano, proteoglicano de sulfato de dermatano, glicosoaminoglicano, fibronectina, laminina, dermatopontina, lípido, ácido graso, hidrato de carbono y una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las células se obtienen de fuentes comerciales. En determinadas realizaciones, las células se derivan, a modo de ejemplos no limitativos, de mamíferos, aves, reptiles, peces, crustáceos, moluscos, cefalópodos, insectos, invertebrados no artrópodos y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, las células animales son células humanas. En determinadas realizaciones, las células animales proporcionadas en el presente documento son células no humanas. En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de mamíferos tales como antílope, oso, castor, bisonte, jabalí, camello, caribú, gato, vaca, ciervo, perro, elefante, alce, zorro, jirafa, cabra, liebre, caballo, cabra salvaje, canguro, león, llama, lince, visón, reno, buey, pecarí, cerdo, conejo, foca, oveja, ardilla, tigre, ballena, lobo, yak y cebra, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de aves tales como gallina, pato, emú, ganso, urogallo, avestruz, faisán, paloma, codorniz y pavo, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de reptiles tales como tortuga, serpiente, cocodrilo y caimán, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de peces tales como anchoa, lubina, siluro, carpa, bacalao, anguila, platija, pez globo (fugu), mero, abadejo, halibut, arenque, caballa, lampuga, mantarraya, marlín, reloj anaranjado, perca, lucio, salmón, sardina, tiburón, pargo, lenguado, raya, pez espada, tilapia, trucha, atún y lucioperca, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de anfibios tales como rana, sapo, salamandra, tritón o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de crustáceos tales como cangrejo, langosta, langostino y gamba, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de moluscos tales como abulón, almeja, cobo, mejillón, ostra, vieira y caracol, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de cefalópodos tales como sepia, pulpo y calamar, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de insectos tales como hormigas, abejas, escarabajos, mariposas, cucarachas, grillos, caballitos del diablo, libélulas, tijeretas, pulgas, moscas, saltamontes, mantis, efímeras, polillas, pececillos de plata, termitas, avispas o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células adecuadas se derivan de invertebrados no artrópodos (por ejemplo, gusanos) tales como platelmintos, tenias, trematodos, lombrices intestinales, ascárides, anquilostomas, gusanos segmentados (por ejemplo, lombrices de tierra, poliquetos, etc.), o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, los materiales obtenidos mediante ingeniería (por ejemplo, productos de piel, pellejo o cuero de animales) incluyen uno o más aditivos además del/de los material(es) de soporte. Por ejemplo, uno o más aditivos se seleccionan de: minerales, fibra, ácidos grasos y aminoácidos. En algunas realizaciones, en los productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería, las láminas/capas incluyen uno o más aditivos para potenciar el atractivo comercial (por ejemplo, aspecto, color, olor, etc.). En realizaciones adicionales, en los productos de piel, pellejo y cuero obtenidos mediante ingeniería, las láminas/capas incluyen uno o más colorantes y/o uno o más odorantes.

En algunas realizaciones, en los productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería, las láminas/capas obtenidas mediante ingeniería incluyen uno o más de: proteínas de matriz, proteoglicanos, antioxidantes, perfluorocarbonos y factores de crecimiento. El término “factor de crecimiento”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína, a un polipéptido o a un complejo de polipéptidos, incluyendo citocinas, que se producen por una célula y que pueden afectarse a sí mismos y/o a una variedad de otras células vecinas o distantes. Normalmente, los factores de crecimiento afectan al crecimiento y/o a la diferenciación de tipos específicos de células, o bien durante el desarrollo o bien en respuesta a una multitud de estímulos fisiológicos o ambientales. Algunos, pero no todos, los factores de crecimiento son hormonas. Factores de crecimiento a modo de ejemplo son insulina, factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), incluyendo FGF básico (bFGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), incluyendo PDGF-AA y PDGF-AB, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-P), incluyendo TGFpi y TGFP3, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interleucina-6 (IL-6), IL-8, y similares.

En algunas realizaciones, en los productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería, las láminas/capas obtenidas mediante ingeniería incluyen uno o más conservantes conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los conservantes son conservantes antimicrobianos que incluyen, a modo de ejemplos no limitativos, propionato de calcio, nitrato de sodio, nitrito de sodio, sulfitos (por ejemplo, dióxido de azufre, bisulfito de sodio, hidrogenosulfito de potasio, etc.) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de disodio. En algunas realizaciones, los conservantes son conservantes antioxidantes que incluyen, a modo de ejemplos no limitativos, hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT).

Piel, pellejo y cuero de animales obtenidos mediante ingeniería

En el presente documento se dan a conocer productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería (por ejemplo, fabricados usando estos pellejos obtenidos mediante ingeniería). En algunas realizaciones, los productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería se procesan adicionalmente mediante cualquier método conocido en la técnica. Los ejemplos de métodos de procesamiento conocidos incluyen el procesamiento mediante conservación, remojo, calero, depilado, descarnado, dividido, desencalado, nuevo calero, rendido, desengrase, frisado, blanqueo, piquelado, remoción del ácido y la sal, curtición, adelgazado, recurtición, lubricación, formación de cuero semiterminado, humectación, abrevado, afeitado, recromado, neutralización, teñido, engrasado, llenado, pelado, rellenado, blanqueo, fijación, endurecimiento, secado, acondicionamiento, molienda, apilamiento, bruñido, acabado, aceitado, cepillado, foulardado, impregnación, pulverización, recubrimiento con rodillo, recubrimiento con cortina, pulido, enchapado, grabado, planchado, esmaltado y volteado. Es importante que los métodos descritos en el presente documento no requieran ninguna de las etapas de procesamiento previo que son necesarias cuando se usa pellejo de animales natural, incluyendo pelambre (depilado), calero, descarnado, dividido, desencalado, nuevo calero, etc. Los cuerpos en capas formados tal como se describe en el presente documento pueden formarse de cualquier longitud apropiada, y el colágeno (y otras moléculas de ECM) puede estar formado por las células cultivadas, lo que da como resultado un cuerpo en capas que no incluye estructuras tales como folículos pilosos, vasos sanguíneos, músculo (por ejemplo, músculo erector del pelo), etc.

En general, el cuero obtenido mediante ingeniería descrito en el presente documento puede curtirse (o procesarse mediante un procedimiento similar) para modificar el material de matriz extracelular. Tal como se comentó anteriormente, uno de los componentes principales de la ECM es el colágeno (y particularmente el colágeno tipo I). La curtición puede modificar el colágeno. Por ejemplo, un agente de curtición, el sulfato de cromo (III) ([Cr(H2O)6]2(SO4)a), se ha considerado durante mucho tiempo como el agente de curtición más eficiente y efectivo. El sulfato de cromo (III) se disuelve para dar el catión hexaacuacromo(III), [Cr(H²O)⁶]3+, que a un pH más elevado experimenta procesos denominados olación para dar compuestos de policromo (III) que son activos en la curtición, siendo la reticulación de las subunidades de colágeno. Algunos ligandos incluyen el anión sulfato, los grupos carboxilo del colágeno, los grupos amina de las cadenas laterales de los aminoácidos, así como agentes de enmascaramiento. Los agentes de enmascaramiento son ácidos carboxílicos, tales como el ácido acético, que se usan para suprimir la formación de cadenas de policromo (III). Los agentes de enmascaramiento permiten que el curtidor aumente adicionalmente el pH para aumentar la reactividad del colágeno sin inhibir la penetración de los complejos de cromo (III). El alto contenido de hidroxiprolina del colágeno permite una reticulación significativa mediante enlaces de hidrógeno dentro de la estructura helicoidal. Los grupos carboxilo ionizados (RCO²-) se forman por hidrólisis del colágeno mediante la acción del hidróxido. Esta conversión puede producirse durante el procedimiento de calero, antes de la introducción del agente de curtición (sales de cromo). Los grupos carboxilo ionizados pueden coordinarse como ligandos con los centros de cromo (III) de las agrupaciones de oxohidróxido. La curtición puede aumentar la separación entre las cadenas de proteínas en el colágeno (por ejemplo, desde 10 hasta 17 A), en consonancia con la reticulación por especies de policromo, del tipo que surge de la olación y la oxolación. El cromo puede reticularse con el colágeno. La capacidad del cromo para formar puentes tan estables explica por qué se considera uno de los compuestos de curtición más eficientes. El cuero curtido al cromo puede contener entre el 4 y el 5% de cromo. Esta eficiencia se caracteriza por su mayor estabilidad hidrotérmica del cuero y su resistencia a la contracción en agua caliente. Pueden usarse otros agentes de curtición para curtir el cuerpo en capas y modificar el colágeno.

En algunas realizaciones, los productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería están sustancialmente libres de microorganismos patógenos. En realizaciones adicionales, los métodos controlados y sustancialmente estériles de preparación celular, cultivo celular, preparación de láminas/capas y preparación de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería dan como resultado un producto sustancialmente libre de microorganismos patógenos. En realizaciones adicionales, una ventaja adicional de un producto de este tipo es una mayor utilidad y seguridad.

En algunas realizaciones, los productos de piel, pellejo o cuero de animales obtenidos mediante ingeniería están conformados. En realizaciones adicionales, la piel, el pellejo o el cuero de animales se conforman, por ejemplo, controlando el número, el tamaño y la disposición de las láminas/capas no contráctiles usadas para fabricar la piel, el pellejo o el cuero de animales. En otras realizaciones, la piel, el pellejo o el cuero de animales se conforman, por ejemplo, cortando, prensando, moldeando o estampando. En algunas realizaciones, la forma del producto de piel, pellejo o cuero de animales se selecciona para parecerse a un producto de piel, pellejo o cuero de animales tradicional.

Materiales de soporte

Cualquiera de los materiales obtenidos mediante ingeniería descritos en el presente documento puede incluir un material de soporte. Los materiales de soporte pueden incluir cualquier material exógeno no biológico. Aunque pueden usarse otros materiales, son de particular interés las mallas, incluyendo las láminas de mallas que están tejidas, extruidas o similar, y que incluyen aberturas (por ejemplo, poros) a través de las mismas. En general, la incrustación de los materiales de soporte puede modificar las propiedades físicas del cuero y también puede hacerse de una manera que potencie la capacidad de fabricar tamaños (por ejemplo, áreas superficiales) más grandes del material.

Por ejemplo, puede incorporarse o incrustarse un componente texturizado exógeno, no biológico, en el cuero obtenido mediante ingeniería. El material (o componente) de soporte puede actuar como soporte para las células vivas (o una capa de células vivas), y las células/capa de células pueden adherirse al soporte y secretar matriz extracelular, incrustándolo así completamente.

Los ejemplos de materiales de soporte incluyen materiales de origen animal (pelo, seda, etc.), materiales de origen vegetal (algodón, hilo fino, sisal, cáñamo, etc.), materiales derivados de polímeros, petróleo/plásticos (por ejemplo, poliestireno, poliéster, Kevlar, polietileno, polipropileno, poliuretano, nailon, etc.) y otros materiales poliméricos (por ejemplo, poli(ácido láctico), polihidroxialcanoatos, etc.), metales, minerales (joyas, rocas, etc.), alótropos de carbono (por ejemplo, grafeno, nanotubos, fullerenos, etc.), o similares, incluyendo combinaciones de estos.

En algunas variaciones, la geometría del material de soporte puede ser una capa de material sustancialmente bidimensional (por ejemplo, que tiene una longitud y un ancho mucho mayores que el grosor), tal como una malla 2D. La malla puede crearse mediante cualquier método apropiado, incluyendo tejido (por ejemplo, tricotado, fieltro, trenzado, lazada, etc.), extrusión, fundición, corte, o similares. Por ejemplo, el tejido puede incluir tejer con fibras

perpendiculares entre sí o en una variedad de ángulos. Otros ejemplos de mallas 2^dincluyen las creadas mediante

diversos métodos de grabado, perforación, impresión, expansión, etc. Las mallas pueden crearse mediante

impresión 3D de mallas planas, curvas o estampadas.

La malla 2D puede modificarse para adaptarse a una superficie curva 3D (material compuesto 3D), o puede ser

sustancialmente plana. El tamaño de malla y la cobertura de área (incluyendo, por ejemplo, el área de orificios o

hebras con respecto al área total) pueden variar desde micrómetros hasta milímetros. Por ejemplo, el tamaño de las

aberturas en la malla puede variar desde 0 (tejido cerrado) hasta justo <100% (tejido muy abierto). Además, el

grosor de la malla 2D puede variar, por ejemplo, desde dimensiones atómicas hasta milímetros. En general, las

aberturas a través de la malla pueden denominarse tamaño de poro de la malla. El tamaño de poro de la malla

(“tamaño de poro”) puede ser uniforme o variable. Tal como se describe con más detalle a continuación, diferentes

tamaños de poro de la malla pueden interaccionar de manera diferente con los cultivos celulares tal como se

describe en el presente documento.

Aunque pueden usarse otras estructuras de soporte en lugar de, o además de, las mallas, existen numerosas

ventajas al usar una estructura de soporte que comprende una malla. Cuando se forma el material textil obtenido

mediante ingeniería (por ejemplo, cuero), las células liberadoras de colágeno pueden unirse a ambos lados de la

malla, y toda la malla puede encapsularse fácilmente, mientras permanece flexible y potencia la durabilidad y otras

propiedades. Esta adhesión también puede ayudar en la fabricación de la malla. Por ejemplo, las células pueden

adherirse a las superficies de la malla. Las células pueden estar recubiertas sobre ambos lados de la malla,

envolviendo la malla. Tal como se ilustra a continuación (por ejemplo, figuras 8A-8C), las células que forman el

pellejo obtenido mediante ingeniería pueden estar conectadas por pequeños fragmentos que crecen en los poros o

se extienden entre los poros. Aunque pueden usarse materiales sin malla (y no porosos), que permitan que las

células crezcan sobre ambos lados tal como se describe en el presente documento, es beneficioso usar una malla

que tenga poros que permitan la fusión de las células/capas sobre cualquier lado de la malla. Por tanto, incluso las

mallas que están formadas por materiales relativamente no adherentes, para los cuales las propias células no se

adhieren fácilmente, pueden usarse como soporte, ya que las células/capas de células usadas para formar el pellejo

obtenido mediante ingeniería pueden unirse a través de los poros. En general, el material que forma la estructura de

soporte puede ser biocompatible, sin embargo, no es necesario que proporcione una superficie sobre la que se

adhieran las células (o que requiera una superficie adherente intermedia). Por tanto, en general, la malla puede

incorporarse o encapsularse en (rodear) el pellejo y/o cuero obtenido mediante ingeniería. Por tanto, los métodos

descritos en el presente documento permiten una gama más amplia de materiales que pueden usarse para formar el

pellejo/cuero obtenido mediante ingeniería compuesto que los examinados previamente.

Por ejemplo, en algunas variaciones, el material de soporte de malla (o la “malla”) puede comprender una estructura

La malla puede ser elástica o bastante rígida. Por ejemplo, la malla puede tener una elasticidad que varía desde

rígida hasta diversos valores de alargamiento (lo que permite el estiramiento), y la rigidez a la flexión puede variar

desde rígida hasta flexible. En general, la malla puede resistir al menos un método de esterilización antes de

agregarse al entorno de cultivo celular estéril (por ejemplo, esterilización por calor, esterilización por vapor,

esterilización por radiación, etc.). Además, el soporte de la estructura (por ejemplo, malla) puede ser químicamente

inerte y puede resistir tratamiento(s) químico(s) sin perder la integridad estructural o las propiedades del material,

incluyendo la resistencia al procedimiento de curtición. Por ejemplo, la malla puede resistir un amplio intervalo de pH

en disolución acuosa.

Cualquiera de los materiales de malla descritos en el presente documento puede fomentar la unión celular, o bien

por sus propiedades superficiales inherentes o bien lograrse por la preparación de la superficie (por ejemplo,

recubrimiento, funcionalización, etc.). Alternativa o adicionalmente, tal como se mencionó anteriormente, el material

de malla puede quedar atrapado en la estructura de cuero durante el ensamblaje sin requerir la unión de células al

propio material de malla.

A continuación, con referencia a las figuras, se describen ejemplos de métodos para incorporar un material de malla

dentro de los pellejos y/o cueros formados a partir de los pellejos obtenidos mediante ingeniería. Por ejemplo, las

figuras 1 y 2 ilustran esquemáticamente un método para formar un cuero obtenido mediante ingeniería que incluye el

uso de una malla para formar un pellejo obtenido mediante ingeniería final que se refuerza con el material de malla.

Las figuras 3-7 ilustran tres métodos alternativos en los que las células se cultivan sobre la malla y las capas de

colágeno (liberadas por las capas de células formadas) se forman directamente sobre la malla, que también puede

actuar como soporte durante el procedimiento de fabricación.

En la figura 1, puede extraerse y cultivarse un explante de tejido (por ejemplo, tomado de un animal tal como una vaca) (véase, por ejemplo, el documento US-2013-0255003-A1 o la solicitud P.C.T. n.° PCT/US2014/042384, presentada el 13 de junio de 2014). Las células (células de piel) pueden extraerse a través de una biopsia sencilla y luego aislarse y multiplicarse en un medio de cultivo celular. En particular, las células pueden cultivarse en un medio como una capa y se les permite o induce a que secreten colágeno; las células pueden extenderse de modo que el colágeno forme láminas, tal como se ilustra. A continuación, las láminas pueden tratarse para evitar la contracción, y las láminas delgadas que no se contraen (por ejemplo, descelularizadas) pueden apilarse una encima de otra después de sembrarlas con células formadoras de colágeno adicionales. Como parte de este procedimiento, la capa de malla puede añadirse entre las capas y también sembrarse con células. Este procedimiento puede dar como resultado la formación de láminas más gruesas de material obtenido mediante ingeniería. En un ejemplo, se coloca una malla sobre una lámina preformada de colágeno y se siembran células sobre ella y se permite que crezcan y secreten colágeno; las células y el colágeno secretado, mientras que se organizan principalmente en la capa superior (y al menos incorporan parcialmente la malla), también pueden adherirse a cualquiera o ambas de la malla y la capa debajo de la malla. Después de un tiempo adecuado para que se secrete el colágeno, pueden formarse capas adicionales en los lados superior y/o inferior de la malla. Por ejemplo, pueden formarse una o más capas adicionales encima de la nueva capa sembrando nuevas células y permitiéndoles crecer y liberar colágeno, y/o pueden añadirse capas preformadas adicionales de colágeno sobre la pila en crecimiento (que incluye la malla) y se permite la fusión de la nueva capa. Pueden añadirse células adicionales o las células en la capa previa pueden actuar para anclarse a la(s) capa(s) de colágeno existente(s) en la nueva capa añadida. Periódicamente, la pila (que incluye la malla) puede voltearse para que pueden añadirse nuevas capas a la parte inferior (ahora superior) de la pila. Estos procedimientos pueden repetirse según sea necesario para hacer crecer la pila hasta un grosor deseado. Finalmente, el cuero se forma a partir de esta estructura multicapa a través de un procedimiento de curtición abreviado para modificar el colágeno.

La figura 2 ilustra esquemáticamente un poco más de detalle de una variación de las etapas descritas anteriormente. En este ejemplo, se forman capas delgadas de colágeno cultivándolas en láminas, luego las láminas se combinan con un material de malla entre ellas y se permite su fusión. Como antes, la contracción de las células cuando se cultivan en láminas puede evitarse mediante el tratamiento de las células (por ejemplo, destruyéndolas) o mediante otros tratamientos, en cuyo caso puede ser beneficioso añadir nuevas células a las láminas para potenciar la fusión de las capas de colágeno, tal como se muestra en la figura 2B. Aunque en teoría pueden añadirse múltiples capas simultáneamente, en la práctica, la difusión puede limitar la capacidad de crecimiento de las células cuando se apilan en grosores superiores a dos (o tres) capas. La figura 2C ilustra un ejemplo de la capa plana de colágeno liberado por las capas de células que pueden fusionarse juntas tal como se describe.

Alternativa o adicionalmente, en algunas variaciones, las células pueden cultivarse directamente sobre y/o alrededor de un material de malla que va a incorporarse al material textil resultante. Por ejemplo, la figura 3A ilustra un ejemplo de un material de malla soportado en un armazón (mostrado como redondo, aunque puede usarse cualquier forma) que puede usarse para cultivar células para formar cualquiera de los materiales descritos en el presente documento. En este ejemplo, el armazón puede retirarse de la malla, ya que la malla formará una parte integral del material textil resultante (pellejo/cuero). El armazón y la malla pueden flotar o sumergirse en un medio de cultivo durante el crecimiento del tejido.

La figura 3B es una ilustración esquemática de un método general para formar materiales de cuero obtenido mediante ingeniería tal como se describe en el presente documento. En este ejemplo, las células pueden aplicarse en primer lugar (por ejemplo, sembrarse) sobre el primer lado de la malla 303. La malla puede mantenerse plana y sumergirse en un medio de cultivo. En algunas variaciones, la malla se mantiene en un armazón tal como se muestra en la figura 3A. La malla puede no tener soporte (acepta cualquier armazón) o puede estar respaldada por un respaldo de soporte, tal como una superficie sobre la cual las células pueden crecer y luego retirarse (por ejemplo, agar, fondo de placa de cultivo celular, etc.). A continuación, las células pueden cultivarse sobre el primer lado (por ejemplo, la parte superior) de la malla 305 y permitir que crezcan y liberen colágeno (por ejemplo, en alguna variación, crecer hasta confluencia o casi confluencia, tal como se describió anteriormente). Por ejemplo, las células pueden cultivarse durante horas, días o semanas (por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, etc.). Opcionalmente, después de eso, pueden colocarse células adicionales (y/o una capa de células liberadoras de colágeno tal como se describió anteriormente) encima de la malla 307 y permitir que liberen colágeno y se adhieran adicionalmente a la pila en crecimiento. Esta etapa puede repetirse secuencialmente para expandir el tamaño de la pila. Después de eso, la malla puede voltearse 309, y el procedimiento se repite sobre el segundo lado (ahora superior). Por tanto, pueden colocarse células adicionales (y/o capas de colágeno o células y colágeno) sobre el segundo lado 313 y cultivarse y permitir que liberen colágeno adicional para su adhesión 315. Como antes, las células y/o capas de colágeno (o colágeno y células) adicionales pueden colocarse sobre este segundo lado y cultivarse para expandir el grosor del material 317. El material puede voltearse nuevamente y repetirse las etapas para continuar el crecimiento del material. Una vez que se alcanza el grosor deseado, puede detenerse el procedimiento, y el material, ahora con la malla incrustada, puede retirarse y tratarse (por ejemplo, curtirse).

Alternativamente, en algunas variaciones, también pueden apilarse múltiples capas/pilas con una malla incrustada una sobre otra para formar capas más gruesas. Por ejemplo, puede hacerse crecer una malla con una o más capas tal como se describe en la figura 3B, y también puede apilarse una capa adicional de malla sobre el material en crecimiento e incorporarse al mismo mediante la adición de células adicionales (que luego secretan colágeno) sobre la pila en crecimiento. Por tanto, pueden incorporarse múltiples capas de malla en un solo material, potenciando las propiedades del material.

La figura 4 ilustra una variación de un método tal como se describió anteriormente. En la figura 4, se muestra un tamaño de malla relativamente pequeño (por ejemplo, un tamaño de poro de entre 2 y 300 |im). Los tamaños de malla pequeños pueden atrapar células o agregados celulares (por ejemplo, tamaño de célula típico de 10-20 micrómetros, tamaño de agregado típico de 100-500 micrómetros). Tal como se mencionó anteriormente, la malla puede montarse en un armazón (por ejemplo, un armazón 2D de forma libre, circular, rectangular) que inmoviliza y endereza la malla, creando una superficie lisa, plana y horizontal, tal como se ilustra en la figura 3A. La malla con armazón puede transferirse a un recipiente (placa de Petri para histocultivo) que contiene medio de histocultivo, luego sembrarse con células tal como se muestra en la figura 4a. A continuación, las células pueden adherirse, extenderse y secretar matriz extracelular (colágeno) sobre el lado superior de la malla (figura 4b). Después de un periodo de tiempo predeterminado (en el que las células liberan colágeno para formar una capa de colágeno), el armazón puede invertirse y se siembra el otro lado con células, tal como se muestra en la figura 4c. En las figuras 4b y 4c, el colágeno también puede extenderse entre los poros (no mostrado). Las nuevas células también pueden adherirse y secretar una capa de colágeno sobre el otro lado de la malla (figura 4d). Este procedimiento puede repetirse (figuras 4e y 4f) para lograr el grosor deseado del material obtenido mediante ingeniería. El material resultante, con la malla incrustada, puede curtirse posteriormente. Obsérvese que esta figura no se muestra a escala.

En este ejemplo, los tamaños de malla pequeños pueden permitir que las células (o grupos de células) se asienten directamente sobre la malla, y el colágeno todavía se libera entre los poros (no mostrado), fusionando las capas sobre ambos tamaños de la malla y bloqueando la posición de la malla. Por tanto, pueden encapsularse incluso con materiales a los que las células normalmente no se adhieren tal como se muestra.

Para mallas con un tamaño de poro ligeramente mayor (por ejemplo, mallas que tienen un tamaño de poro superior a 300 micrómetros), las células también pueden hacerse crecer directamente sobre la malla, tal como se muestra en la figura 5. En la figura 5a, las células se siembran en una placa de histocultivo que contiene medio de cultivo y se cultivan durante un periodo de tiempo predeterminado, durante el cual las células secretan una capa de matriz extracelular (en particular, colágeno) tal como se muestra esquemáticamente en la figura 5b. La malla no retenida se coloca entonces sobre esta capa de matriz celular-extracelular- y se siembra de nuevo con células (figura 5c). El número de células en la segunda siembra puede variar dependiendo del grosor y del área de cobertura de la malla. Durante el segundo intervalo de tiempo de incubación (que puede ser el mismo que el primero), las células de la segunda siembra se dividirán y eventualmente llenarán los orificios de la malla mientras secretan matriz extracelular y acoplan la malla y la capa de matriz celular/extracelular subyacente tal como se muestra en la figura 5d. El procedimiento de siembra puede repetirse nuevamente (figura 5e) para cubrir completamente la malla, creando una capa superior de ECM, cultivada durante la misma duración que las dos capas previas (figura 5f). El material compuesto de malla-lámina de ECM puede separarse entonces de la placa y cultivarse en un entorno no adhesivo hasta que esté listo para la curtición, o pueden realizarse capas adicionales para aumentar el grosor. Por ejemplo, el material compuesto de malla/ECM puede retenerse en el armazón y sembrarse adicionalmente invirtiendo regularmente los armazones para lograr un recubrimiento del mismo grosor sobre ambos lados.

Otro ejemplo (tampoco se muestra a escala) se ilustra en la figura 6. En este ejemplo, se usa un tamaño de poro grande (por ejemplo, superior a 500 |im (por ejemplo, entre 0,5 mm y 5 mm)). En la figura 6, la malla se coloca sobre una placa de cultivo o sustrato 601 (que potencialmente incluye, tal como se mencionó anteriormente, sobre una capa existente de colágeno, por ejemplo, una capa descelularizada). En este ejemplo, las células se cultivan en primer lugar directamente sobre el sustrato (figura 6a) y se permite que liberen colágeno (figura 6b). Luego se aplica una malla (tamaño de poro grande) tal como se muestra en la figura 6c. Luego se aplican células (y/o una capa adicional) sobre y en la malla, tal como se muestra en las figuras 6c y 6d, y se permite que las células crezcan y liberen colágeno. Después de eso, pueden añadirse capas adicionales añadiendo secuencialmente células y cultivándolas para que crezcan, tal como se ilustra en las figuras 6e-6h. Después de eso, la pila que incluye la malla puede retirarse de la placa (separando toda de la placa, ya que las células se adhieren a la malla mejor que la superficie de la placa), y se voltea la malla, y se aplican células/capas adicionales, tal como se muestra en la figura 6i.

En la figura 7 se muestra otra variación que usa una malla de tamaño de poro grande. Cuando la interacción entre las células y la placa de cultivo puede ser más fuerte que la interacción entre las células y la malla, la separación de la estructura compuesta de la placa de cultivo (figura 6f) puede provocar que la capa de células/ECM se desprenda de la malla, lo cual es indeseable. Por tanto, en algunas variaciones, la malla puede retenerse en un armazón y puede colocarse un tapón 703 no adhesivo (por ejemplo, Teflon, agarosa, etc.) debajo de la malla y en contacto con ella. A continuación, la malla puede sembrarse con células (figura 7a), en la que las células se acumularán en las aberturas y sobre la superficie superior de la malla, secretando matriz extracelular (figura 7b). A continuación, puede retirarse el tapón, y puede invertirse la malla y sembrarse células sobre su otro lado (figura 7c). A continuación, puede realizarse inversión secuencial, siembra y cultivo celular para depositar múltiples capas sobre ambos lados para engrosar la construcción (figuras 7c, 7d, 7e, 7f).

Cualquiera las construcciones de malla/ECM compuestas descritas en el presente documento puede curtirse o bien antes o bien después de liberarlas del armazón, o curtirlas mientras están retenidas. La curtición mientras están retenidas por el armazón puede ser deseable cuando los agentes de curtición son excesivamente astringentes y deformarían la construcción. Por tanto, puede usarse un armazón liberable, y liberarse después de la curtición. En las figuras 8A-8C se muestra un experimento de prueba de concepto. En este ejemplo, se preparó un material compuesto de poliéster-cuero con el método ilustrado en la figura 6 anterior. Después de separar la estructura de la placa de cultivo, el material compuesto se cultivó adicionalmente durante 3 semanas en un entorno no adhesivo y, posteriormente, se curtió con métodos convencionales de curtición al cromo. Incluso después de la curtición, el material de colágeno cubre completamente la malla con una capa delgada de cuero obtenido mediante ingeniería, tal como se muestra en las figuras 8A y 8B. La malla 801 de poliéster está encapsulada con colágeno 805 curtido. Una sección transversal muestra una cobertura uniforme sobre los hilos 801 (figura 8A), llenando completamente la malla (figura 8B). En la figura 8C, el material resultante se deconstruyó retirando parcialmente la capa 813 superior antes de la curtición (por ejemplo, al retirarlo de la placa) para ilustrar la estructura de triple capa. La malla 815 subyacente se expone a la derecha de la región 817 rasgada.

Las células en las láminas emergentes formadas tal como se describió anteriormente pueden secretar y ensamblar matriz extracelular. Para cada siembra, la tasa de secreción y el ensamblaje pueden depender del tipo de célula y se ralentiza una vez que se alcanza un determinado grosor de la lámina. Esto puede deberse a que o bien (i) las células agotaron su capacidad para producir matriz extracelular, (ii) la capa de matriz extracelular impide que los nutrientes del medio de cultivo lleguen a las células, o bien (iii) la matriz se degrada o remodela por la actividad enzimática de la célula.

En respuesta, las láminas que están formándose (por ejemplo, la capa de células y matriz extracelular) pueden sembrarse con células liberadoras de colágeno recién preparadas o bien del mismo tipo o bien de un tipo diferente al de la capa ya formada. Normalmente, estas nuevas células se adhieren fuertemente al colágeno en la capa subyacente y comienzan a dividirse y producir nueva matriz extracelular. El procedimiento de resiembra anterior puede iterarse (es decir, repetirse) hasta que se logre el grosor deseado de la construcción de tejido multicapa emergente.

En general, durante el tiempo de cultivo, tanto las células recién añadidas como las células de la capa inicial pueden secretar colágeno, lo que da como resultado la interconexión entre las capas de colágeno. La secreción por las células en la capa inicial puede producirse a un ritmo más lento que por las células recién añadidas a medida que se alejan del medio de cultivo sobre ambos lados de la malla.

En algunas variaciones, se realizan dos resiembras que conducen a una estructura de tres capas sobre ambos lados de la malla. En otras variaciones, el número de resiembras puede ser superior a 3. Obsérvese que al aumentar el número de resiembras, las células de las capas inferiores se alejan progresivamente de la superficie de contacto de la construcción con el medio de cultivo que contiene nutrientes. Esto puede conducir a la ralentización de sus funciones celulares, en particular la liberación de colágeno, y eventualmente puede conducir a su muerte por inanición.

En algunas variaciones, las muestras se recubren adicionalmente con un polímero para impartir mayor funcionalidad al material, por ejemplo, impermeabilización, resistencia muy alta, resistencia química, etc.

En general, cada capa se forma cultivando las células hasta que se forma una capa de colágeno dentro de la nueva capa. Esto puede tardar, por ejemplo, aproximadamente una semana (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y 10 días). Por ejemplo, si una capa necesita 10 días para crecer, en algunas variaciones, cada lado puede volver a sembrarse antes de que la capa crezca por completo, y la estructura puede voltearse después de que las células se adhieran suficientemente (en el plazo de unos pocos días).

Cualquiera de los materiales (materiales textiles, pellejos, cueros, etc.) obtenidos mediante ingeniería descritos en el presente documento puede tener una ultraestructura distinta que incluya el material incrustado (por ejemplo, malla), pero también está en capas, como resultado del método de fabricación descrito. Por ejemplo, la figura 9 ilustra esquemáticamente una ultraestructura de un material obtenido mediante ingeniería que tiene múltiples capas en las que se incrusta un material de malla. En la figura 9, la malla 901 está incrustada dentro de una pluralidad de capas formadas mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. El resultado son capas en las que una sección transversal muestra estratos de regiones 904 densas en colágeno alternando con regiones 906 menos densas. Las regiones menos densas pueden corresponder a la región celular y la región de adhesión entre las capas aplicadas secuencialmente. Esta ultraestructura es diferente a los materiales nativos, tanto en la inclusión del material 901 de malla como en la formación en capas del colágeno.

Los métodos descritos en el presente documento representan un método muy flexible para incrustar prácticamente cualquier material de soporte (por ejemplo, malla) en un cuero obtenido mediante ingeniería, lo que puede cambiar sustancialmente las propiedades físicas del cuero. Aunque los ejemplos descritos en el presente documento son específicos de las mallas, debe entenderse que también pueden usarse materiales distintos de mallas (por ejemplo, hebras, etc.).

Soportes fibrosos

En el presente documento también se describen cueros obtenidos mediante ingeniería formados usando un soporte que comprende un soporte fibroso que se curte (por ejemplo, se reticula) con las células cultivadas y/o cualquier componente de la matriz extracelular (ECM) liberado por las células cultivadas que se forman. El cuero obtenido mediante ingeniería resultante puede denominarse un material compuesto de tejido reforzado con fibras y pueden tener propiedades superiores (por ejemplo, durabilidad, resistencia, etc.) en comparación con otros cueros obtenidos mediante ingeniería. También se describen métodos de formación de estos materiales compuestos de tejido reforzados con fibra, incluyendo métodos de hacerlos crecer/cultivarlos y métodos de curtición de los mismos.

En general, los soportes descritos en el presente documento están configurados para reticularse con la matriz extracelular liberada (por ejemplo, colágeno) de células cultivadas sobre el soporte. Estos soportes pueden formarse de un material que puede formar reticulaciones con la ECM y/o las células durante la curtición. Además la estructura del soporte (por ejemplo, la porosidad, la longitud de las fibras, la densidad de las fibras, etc.) puede elegirse para permitir la reticulación y/o para estimular el crecimiento de las células y la liberación de la matriz extracelular. El soporte se curte con y a la ECM para formar el producto final, el material compuesto de tejido reforzado con fibras. Por tanto, el soporte forma una parte integral del producto final, y sus dimensiones, incluyendo el grosor, pueden ayudar a determinar el grosor final del cuero resultante.

Un ejemplo particular de un soporte fibroso que puede usarse tal como se describe en el presente documento es la seda. La seda (por ejemplo, la seda orgánica y/o sintética) puede formarse (por ejemplo, hilarse) hasta un grosor de fibra predeterminado y puede usarse en una lámina tejida y/o no tejida que forma el soporte sobre el que pueden cultivarse células que liberan ECM. Tales células pueden ser, por ejemplo, fibroblastos dérmicos, células del músculo liso, etc.

En general, el soporte está formado por un material (tal como seda) que puede curtirse para reticular grupos reactivos sobre el soporte (por ejemplo, grupos amina y ácido carboxílico) con la ECM liberada (por ejemplo, colágeno).

El soporte fibroso puede proporcionar una gran cantidad de área superficial sobre la que pueden cultivarse las células. Por ejemplo, el soporte puede estar formado por fibras relativamente dispersas que forman un soporte fibroso disperso. Un soporte fibroso puede tener mucha área superficial para permitir el crecimiento celular y para permitir una superficie de contacto de fibra-matriz tisular fuerte (lo que también puede mejorar la resistencia global del material compuesto resultante). En algunas variaciones, la longitud de las fibras que forman el soporte es de entre 100 nm y 100 |im. En algunas variaciones, la longitud de las fibras es de entre 100 nm y hasta 1 mm, 10 mm, 100 mm o 1 m. La densidad del material fibroso en el soporte puede ser de entre 10 y 100 mg/cc. En algunas variaciones, la densidad del material fibroso es de entre 10 y 10.000 mg/cc. La porosidad del soporte fibroso (incluyendo las fibras tejidas/no tejidas) puede ser de entre el 10 y el 99%.

En general, puede resultar ventajoso proporcionar una alta porosidad. Esto puede permitir mucha infiltración celular y crecimiento tisular, incluyendo dentro del grosor del soporte. El soporte puede tener cualquier grosor apropiado (por ejemplo, entre 10 |im y 5 mm, por ejemplo, entre 100 |im y 1 mm, entre 100 |im y 500 |im, entre 50 |im y 300 |im, etc., o entre cualquier valor menor de 10 |im, 30 |im, 50 |im, 75 um, 100 um, 200 um, 300 |im , etc. y un valor superior de 50 |im, 100 |im, 150 |im, 200 |im, 300 |im, 400 |im, 500 |im, 600 |im, 700 |im, 800 |im, 900 |im, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, etc.). La porosidad puede determinarse como el espacio (por ejemplo, diámetro promedio) entre fibras.

En funcionamiento, el método de formación de los materiales compuestos de tejido reforzados con fibras descritos en el presente documento puede incluir cultivar células sobre el soporte fibroso hasta que se ha formado una cantidad deseada de ECM (por ejemplo, colágeno) en y/o sobre el soporte fibroso. Opcionalmente, el soporte fibroso puede formarse y/o prepararse para recibir las células que van a cultivarse sobre el mismo. Por ejemplo, el soporte puede tratarse para exponer grupos reactivos o sitios de unión celular. En algunas variaciones, el soporte fibroso puede aplicarse en un reactor celular para la siembra y el crecimiento de las células sobre el soporte. Como ejemplo, las células, que pueden ser por ejemplo una línea celular de mamífero que tiene propiedades conocidas de liberación de ECM, que van a sembrarse sobre el soporte fibroso preparado y que se permiten crecer, se dividen y depositan ECM. Las células pueden cultivarse en condiciones de cultivo típicas durante un periodo de tiempo apropiado (por ejemplo, 2-90 días). Pueden añadirse células adicionales durante este periodo. A continuación, el material resultante, que comprende el soporte fibroso con la ECM y las células liberadas, puede denominarse una construcción tisular intermedia (no curtida), que puede procesarse adicionalmente. Esta construcción tisular intermedia (no curtida) puede descelularizarse (por ejemplo, mediante el tratamiento con alcoholes u otros agentes) o no. La construcción tisular intermedia (no curtida) puede procesarse entonces mediante curtición, que puede incluir compuestos químicos de curtición tradicionales, así como reacciones de reticulación para reforzar el soporte para el tejido.

A continuación se proporciona un ejemplo de diversos métodos de refuerzo y curtición que pueden usarse y/o modificarse. El soporte fibroso y la ECM cultivada que crece sobre el soporte se curten (y se reticulan) entre sí mediante este procedimiento, y los materiales compuestos de tejido reforzados con fibras resultantes pueden usarse como material de cuero obtenido mediante ingeniería.

Puede incluirse una etapa de refuerzo para reticular la ECM depositada con el soporte fibroso revestido en la ECM, seguido por un procedimiento de curtición para producir el aspecto y la sensación del cuero tradicional. Aunque los compuestos químicos de curtición tradicionales pueden reticular eficazmente la ECM al soporte si el soporte tiene la funcionalidad apropiada (tal como grupos amina y ácido carboxílico de superficie), pueden incorporarse otros compuestos químicos de superficie de soporte y agentes de reticulación para reforzar la superficie de contacto ECM-soporte. Estos incluyen epóxido, acrilato, aldehído, sulfhidrilo, diazirinas, aril-azidas, etc., así como compuestos químicos protegidos que pueden activarse tras el crecimiento tisular para reducir la citotoxicidad de la superficie del soporte. El soporte puede modificarse con compuestos químicos reactivos antes de la siembra de células que cuelgan de moléculas espaciadoras de tamaño entre 0 Da y 100 MDa. Los compuestos químicos de la superficie del soporte pueden hacerse reaccionar directamente con la ECM o a través de agentes de reticulación con funcionalidad de entre 1 y 2000 y con un tamaño de entre 1 Da y 100 MDa. Además las moléculas de reticulación pueden polimerizarse dentro de la construcción de soporte-ECM con un tamaño de entre 1 Da y 100 MDa. La polimerización de estos agentes de reticulación puede iniciarse tras el crecimiento tisular con factores desencadenantes tales como exposición a la luz, cambio de temperatura, adición de iniciadores químicos, etc.

En general, puede usarse cualquier método de curtición apropiado, incluyendo un método derivado de la curtición tradicional, que puede dar como resultado cuero que tiene el aspecto y el tacto de los pellejos curtidos tradicionales. Por ejemplo, tras cultivar las células sobre los soportes tal como se describió anteriormente (por ejemplo, en un entorno estéril), la construcción tisular intermedia (no curtida) que consiste en células y ECM crecidas sobre el soporte fibroso plano (por ejemplo, lámina relativamente delgada, pero larga y ancha) puede lavarse (por ejemplo, para retirar el medio de cultivo), y curtirse. Pueden incluirse etapas tradicionales tales como calero (por ejemplo, tratamiento con un compuesto básico tal como lechada de cal y/o la adición de “activadores” incluyendo agentes de reducción de disulfuro, tales como sulfuro de sodio, cianuros, aminas, etc.). Sin embargo, tales etapas pueden modificarse ya que la construcción intermedia no incluye pelo, uñas y otra materia queratinosa que se encuentra normalmente en las pieles nativas. Tales etapas pueden mantenerse o modificarse para retirar algunos materiales de ECM y/o para hinchar y dividir las fibras en la construcción intermedia o para preparar de otro modo colágeno en la construcción para curtición.

Los métodos pueden incluir o evitar (como innecesario) el uso de agentes de depilado tales como sulfuro de sodio, hidróxido de sodio, hidrosulfito de sodio, hidrosulfuro de calcio, dimetilamina y sulfhidrato de sodio.

También puede incluirse una etapa que retire el material celular a la vez que se conserva la ECM. Pueden usarse métodos de descelularización usados en la obtención de tejidos mediante ingeniería para este fin, incluyendo el uso de tensioactivos, enzimas, energía ultrasónica, ciclos de congelación-descongelación, etc.

También puede incluirse una etapa de desencalado. Por ejemplo, el pH del colágeno puede reducirse hasta un nivel inferior, de modo que las enzimas puedan actuar sobre él. Dependiendo del uso final del cuero, la construcción intermedia puede tratarse con enzimas para ablandarla, un proceso denominado rendido. Si se usa el rendido, una vez completado, la construcción tisular intermedia puede tratarse en primer lugar con sal y luego con ácido sulfúrico, si va a realizarse una curtición mineral, que puede reducir el pH de colágeno hasta un nivel muy bajo para facilitar la penetración del agente de curtición mineral en la sustancia. Este proceso se conoce como piquelado. La sal (por ejemplo, cloruro de sodio) puede penetrar más rápido que el ácido y limitar el efecto nocivo de una caída repentina del pH. Si se usa curtición vegetal, el agente de curtición puede ser un tanino. Los taninos son una clase de productos químicos astringentes polifenólicos que se encuentran de manera natural en la corteza y las hojas de muchas plantas. Los taninos se unen a las proteínas de colágeno y pueden ocultarlas y recubrirlas, haciendo que sean menos solubles en agua y más resistentes al ataque bacteriano. El proceso también puede hacer que el material sea más flexible. Tradicionalmente, las cortezas primarias, procesadas en molinos de corteza y usadas actualmente, son castaño, roble, redor, tanoak, cicuta, quebracho, mangle, acacia y mirobálano. Tradicionalmente, los pellejos se estiran sobre armazones y se sumergen durante varias semanas en cubas de concentraciones crecientes de tanino. Las construcciones tisulares intermedias descritas en el presente documento pueden proporcionar un acceso más directo, más fácil a los taninos y, por tanto, pueden requerir menos tiempo de procesamiento en general.

En la curtición al cromo, antes de la introducción de la especie básica de cromo, pueden usarse varias etapas para preparar el material, tal como se mencionó anteriormente, incluyendo la introducción de agentes alcalinos tales como hidróxido de sodio, restablecimiento del pH neutro, rendido (ablandamiento con enzimas) y piquelado (disminución del pH del material que está procesándose, por ejemplo, con sal y ácido sulfúrico).

En la curtición tradicional, el pH es muy ácido cuando se introduce el cromo, para garantizar que los complejos de cromo sean lo suficientemente pequeños como para caber entre las fibras y los residuos del colágeno. Una vez que se logra el nivel deseado de penetración de cromo en la sustancia, el pH del material se eleva de nuevo para facilitar el proceso. Esta etapa se conoce como basificación. La curtición al cromo normalmente es más rápida que la curtición vegetal.

El sulfato de cromo (III) ([Cr(H2O)6]2(SO4)3) se ha considerado durante mucho tiempo como el agente de curtición más eficaz y efectivo. Los compuestos de cromo (III) del tipo usado en curtición son significativamente menos tóxicos que el cromo hexavalente. El sulfato de cromo (III) se disuelve para dar el catión hexaacuacromo (III), [Cr(H²O)⁶]3+, que a pH superior experimenta procesos denominados olación para dar compuestos de policromo (III) que son activos en curtición, que es la reticulación de las subunidades de colágeno. La química de [Cr(H²O)⁶]3+ es compleja debido a la presencia de una variedad de ligandos. Algunos ligandos incluyen el anión sulfato, los grupos carboxilo del colágeno, grupos amina de las cadenas laterales de los aminoácidos, y agentes de enmascaramiento. Los agentes de enmascaramiento son ácidos carboxílicos, tales como ácido acético, usado para suprimir la formación de las cadenas de policromo (III). Los agentes de enmascaramiento permiten que el curtidor aumente adicionalmente el pH para aumentar la reactividad del colágeno sin inhibir la penetración de los complejos de cromo (III).

Tal como se mencionó anteriormente, el colágeno se caracteriza por un alto contenido de glicina, prolina e hidroxiprolina, habitualmente en la repetición -Gly-Pro-Hypro-Gly-. Estos residuos dan lugar a la estructura helicoidal del colágeno. El alto contenido en colágeno de la hidroxiprolina permite la reticulación significativa por enlaces de hidrógeno dentro de la estructura helicoidal. Los grupos carboxilo ionizados (RCO2-) se forman mediante la hidrólisis del colágeno por la acción del hidróxido. Esta conversión se produce durante el proceso de calero, antes de la introducción del agente de curtición (sales de cromo). Los grupos carboxilo ionizados se coordinan como ligandos a los centros de cromo (III) de las agrupaciones de oxo-hidróxido.

La curtición aumenta la separación entre las cadenas de proteínas en el colágeno desde 10 hasta 17 A. La diferencia concuerda con la reticulación por especies policromo, del tipo que surge a partir de la olación y la oxolación.

Después de la aplicación del agente de cromo, el baño puede tratarse con bicarbonato de sodio para aumentar el pH hasta 4,0-4,3. Este aumento induce la reticulación entre el cromo y el colágeno. El aumento de pH normalmente puede ir acompañado por un aumento gradual de la temperatura hasta 40°C. El cuero curtido al cromo puede contener entre el 4 y el 5% de cromo. Esta eficacia se caracteriza por su estabilidad hidrotérmica aumentada del cuero, y su resistencia al encogimiento en agua caliente.

Pueden usarse otras formas de curtición, incluyendo las basadas en alumbre, circonio, titanio, sales de hierro, o una combinación de los mismos. Puede usarse curtición en blanco en las construcciones tisulares intermedias descritas en el presente documento. La curtición es un método que usa alumbre y sales de aluminio, generalmente junto con otros productos tales como yema de huevo, harina y otras sales. El material se curte en blanco sumergiéndolo en una disolución tibia de alumbre de potasa y sales (o equivalente), entre 20 y 30°C. el proceso puede aumentar la flexibilidad, estirabilidad, suavidad y calidad resultante del cuero. La adición de yema de huevo y harina (o equivalentes) a la disolución de remojo convencional puede potenciar adicionalmente sus características de manipulación fina. Entonces, la construcción tisular intermedia se seca y se deja que se estabilice.

Dependiendo del acabado deseado, el material puede encerarse, enrollarse, lubricarse, aceitarse (por ejemplo, inyectarse con aceite), y/o secarse. Pueden formarse ante, nobuk, etc., por ejemplo, induciendo acabados de superficie. El material puede acabarse adicionalmente mediante una nueva curtición en blanco. Los agentes de la nueva curtición en blanco y/o colorantes pueden aplicarse al material para potenciar la resistencia física y las propiedades deseadas dependiendo del producto final. Puede usarse una fase final, el acabado, para aplicar el material de acabado a la superficie o para acabar la superficie.

Ejemplos

Las figuras 10-16 ilustran ejemplos de materiales compuestos de tejido reforzados con fibras y métodos para formarlos tal como se describió anteriormente.

Por ejemplo, las figuras 10 y 11 muestran un ejemplo de un soporte de tejido fibroso que puede usarse. En este ejemplo, el soporte está formado por fibras de seda. El soporte tiene un grosor de aproximadamente 0,5 mm, y diámetros de fibra de aproximadamente 15-20 micrómetros (por ejemplo, como promedio/media). En este ejemplo, la densidad total del material es de aproximadamente 80 mg/cc, que corresponde a una porosidad de aproximadamente el 95%. La orientación de las fibras puede afectar a las propiedades generales de los materiales, y el proceso de unión puede variarse para producir una variedad de arquitecturas no tejidas, tejidas y tricotadas. Además, la longitud de las fibras puede afectar a las propiedades generales del material, y la longitud, el diámetro y/o la porosidad de las fibras pueden variar. Por ejemplo, pueden usarse nanofibras que tienen desde aproximadamente 10 |im (micrómetros) hasta 20 |im o más. La figura 11 muestra una vista ampliada de una región del soporte mostrado en la figura 10.

La figura 12A muestra un ejemplo de un soporte fibroso “seco” (seda) antes de sembrarse con células. En la figura 12B, el soporte mostrado en la figura 12A se ha sembrado con células (en este ejemplo, fibroblastos dérmicos bovinos) a una densidad de 8,5x106 células/ml. El volumen del soporte fue de 100 |il/cm2 de soporte (similar al mostrado en la figura 10-11). En este ejemplo, las células se siembran encima del soporte y se ha observado que se depositan (por ejemplo, por gravedad) sobre el soporte poroso. A continuación, el soporte puede girarse, voltearse, hacerse rotar, etc., lo que puede ayudar a distribuir las células y/o el medio de cultivo por todo el sustrato. En la práctica, puede ser beneficioso tener un sustrato fibroso que inicialmente sea poroso en más del 50%. Tal como se mencionó anteriormente, en algunas variaciones, el soporte puede modificarse para potenciar la adhesión celular. En el ejemplo mostrado en la figura 12B, las células pueden cultivarse durante aproximadamente 4 semanas, con cambio regular de medios (por ejemplo, cada pocos días); las técnicas de cultivo tisular convencionales pueden adaptarse para su uso con el soporte; por ejemplo, pueden usarse factores de crecimiento, o agentes para potenciar la liberación y/o el tipo de ECM depositada. Además, pueden usarse entornos de cultivo dinámicos tales como perfusión o carga mecánica para potenciar la deposición de ECM. En las figuras 12A-12B, el soporte tiene un grosor de aproximadamente 0,5 mm. También pueden usarse soportes más gruesos (por ejemplo, hasta 5 cm). Después de cuatro semanas de cultivo, las fibras del soporte están rodeadas por tejido (incluyendo colágeno).

La figura 13 muestra una sección tomada de la construcción tisular intermedia a modo de ejemplo (no curtida) mostrada en la figura 12B en sección transversal a través del tejido. En este ejemplo, la mancha muestra (en rojo en la versión en color original) colágeno; las fibras del soporte se indican (en sección) por las puntas de flecha. Se muestra que la muestra tiene una red densa de colágeno que se extiende alrededor y a través (por ejemplo, dentro del soporte fibroso poroso). Se fijó esta muestra para histología. En la figura 14 se proporciona una imagen de microscopía electrónica de barrido de una construcción tisular intermedia (no curtida) similar a la mostrada en la figura 12B.

En la figura 14, se muestra una sección a través de un soporte fibroso sobre el que se han cultivado células que liberan colágeno. El soporte fibroso en este ejemplo es seda, y el SEM muestra tejido rico en colágeno que crece por todo el soporte de fibra de seda.

La figura 15 muestra una comparación entre un soporte fibroso que permite (por ejemplo, seda) y que no permite (por ejemplo, poli(ácido láctico), PLLA) la reticulación de refuerzo durante un procedimiento de curtición tal como se describe en el presente documento. En la figura 15, las células se han cultivado de manera equivalente en cuatro soportes fibrosos diferentes y se han curtido: seda 501, PLLA 503 de alta densidad, poliéster 505 y PLLA 507 de baja densidad. Sólo el soporte de seda incluyó grupos amina y ácido carboxílico que se reticulan con tejido/ECM durante el procedimiento de curtición (curtición con sal de cromo). Cada uno de estos soportes son por lo demás aproximadamente equivalentes. Cada uno tiene aproximadamente 4 cm de largo y aproximadamente 1,5 cm de ancho; la seda 501 y el PLLA 507 de baja densidad tienen cada uno 0,5 mm de grosor y el PLLA de alta densidad y el poliéster tienen cada uno aproximadamente 1 mm de grosor. Después de la curtición, sólo las muestras en las que el soporte era reticulable durante la curtición (por ejemplo, la seda 501) dio como resultado materiales que tenían una textura y un aspecto similares al cuero nativo. La seda curtida sin células cultivadas no; el material resultante (seda sola) se separa.

Las figuras 16 y 17 ilustran un ejemplo de materiales compuestos de tejido reforzados con fibras formados tal como se describe en el presente documento después de la curtición. La figura 16 muestra una superficie exterior de un material curtido que se ha formado y procesado tal como se describió anteriormente. En este ejemplo, la superficie exterior similar al cuero tiene un tacto similar al cuero nativo. El material está formado por un soporte de seda fibrosa sobre el que se han cultivado células (fibroblastos dérmicos) y se ha curtido la construcción tisular intermedia resultante. La figura 17 muestra una vista ampliada de una región de borde de una construcción tisular reforzada con fibras curtida (seda). Después de la curtición, se produjo un gradiente de tejido hacia el borde del soporte de seda, revelando las fibras de seda dispersas través de la matriz de tejido (en la derecha en la figura).

En general, el producto resultante tendrá un aspecto y tacto similares al cuero nativo, pero es diferente de manera detectable (por ejemplo, tras el examen de la ultraestructura). Por ejemplo, el material resultante tendrá el material de soporte fibroso disperso por todas partes, y normalmente está rodeado por ECM (por ejemplo, colágeno); el colágeno y el soporte se curten y se reticulan entre sí. Normalmente habrá una capa exterior de tejido sobre el soporte.

Por ejemplo, en el presente documento se describen métodos para formar un material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras, comprendiendo el método: cultivar células sobre un soporte fibroso hasta que las fibras del soporte fibroso estén rodeadas por tejido que comprende matriz extracelular, formando una construcción de tejido intermedia; y curtir la construcción de tejido intermedia para reticular las fibras del armazón fibroso con el tejido. El cultivo puede comprender cultivar células sobre un soporte de seda fibrosa, cultivar células sobre un soporte de proteína fibrosa, etc. El soporte de proteína fibrosa puede comprender uno o más de: un soporte de lana fibrosa, un soporte de seda fibrosa o un soporte de colágeno fibroso.

El cultivo puede comprender cultivar células sobre un soporte de fibra proteica que comprende grupos amina, ácido carboxílico y sulfhidrilo. El cultivo puede comprender cultivar células sobre un soporte celulósico fibroso. El soporte celulósico fibroso puede comprender uno o más de un soporte de lino fibroso, un soporte de piña fibrosa o un soporte de algodón fibroso. El cultivo puede comprender cultivar células sobre un soporte de fibra sintética con una química de superficie reticulable.

El soporte sintético fibroso puede comprender uno o más de un soporte de fibra de carbono, un soporte de Kevlar o un soporte de fibra de vidrio.

El cultivo puede incluir cultivar células sobre el soporte fibroso hasta que las fibras estén rodeadas por colágeno. El cultivo puede incluir cultivar células sobre el soporte fibroso que comprende fibras que tienen una longitud de entre aproximadamente 100 nm y 1 m. El cultivo puede incluir cultivar células sobre el soporte fibroso que tiene una porosidad de entre el 10 y el 99%. El cultivo puede comprender cultivar células de mamífero sobre el soporte fibroso. La curtición puede incluir reticular grupos amina, hidroxilo, sulfhidrilo, tirosilo y ácido carboxílico en las proteínas de la matriz extracelular en el tejido con el soporte. La curtición puede comprender reticular las fibras del soporte fibroso con el tejido a través de enlaces covalentes. La curtición puede comprender reticular las fibras del soporte fibroso con el tejido a través de interacciones iónicas, hidrófobas y de van der Waals.

Un material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras puede incluir: un soporte fibroso que comprende una pluralidad de fibras, en el que las fibras están rodeadas por matriz extracelular, en el que la matriz extracelular y la pluralidad de fibras están reticuladas entre sí.

El soporte puede ser una fibra de proteína que se produce de manera natural que contiene grupos amina hidroxilo, sulfhidrilo, tirosilo y ácido carboxílico. El soporte puede ser una fibra celulósica que se produce de manera natural que contiene grupos amina, hidroxilo y ácido carboxílico. El soporte puede ser una fibra sintética que contiene químicas de superficie para reticularse con la ECM. Las fibras pueden modificarse químicamente para potenciar la reticulación del tejido con el soporte.

El soporte puede modificarse químicamente para contener grupos de reticulación de tejido que incluyen uno o más de: aminas, ácidos carboxílicos, sulfatos, aldehídos, hidrazidas, sulfhidrilos, diazirinas, aril-azidas, acrilatos y epóxidos.

Los grupos de reticulación de tejidos pueden protegerse durante el crecimiento del tejido y activarse para la reticulación cuando se completa el crecimiento del tejido. Los grupos de reticulación de tejidos pueden colgar del soporte con un espaciador de entre 1 dalton y 100 megadaltons.

El soporte puede reticularse con el tejido a través de interacciones no covalentes, incluyendo interacciones iónicas, hidrófobas y de van der Waals. El soporte puede reticularse con el tejido a través de enlaces covalentes. El soporte puede reaccionar directamente con grupos amina, hidroxilo, sulfhidrilo o ácido carboxílico en el tejido. El soporte puede hacerse reaccionar con un agente de reticulación que reacciona con grupos amina, hidroxilo, sulfhidrilo o ácido carboxílico en el tejido. El peso molecular del agente de reticulación puede ser de entre 1 dalton y 100 megadaltons. El soporte puede hacerse reaccionar con grupos amina, hidroxilo, sulfhidrilo o ácido carboxílico en el tejido a través de una reacción de polimerización que crea agentes de reticulación poliméricos. El soporte puede comprender fibras tejidas, tricotadas o no tejidas que tienen una longitud de entre 100 nm y 1 m. La densidad del material fibroso en el soporte puede ser de entre 10 y 10.000 mg/cc. La porosidad del soporte fibroso puede ser de entre el 10 y el 99%.

Cuando en el presente documento se hace referencia a una característica o elemento como “sobre” otra característica o elemento, puede estar directamente sobre la otra característica o elemento o también pueden estar presentes características y/o elementos intermedios. En cambio, cuando se hace referencia a una característica o elemento como “directamente sobre” otras característica o elemento, no hay características o elementos intermedios presentes. También se entenderá que, cuando se hace referencia a una característica o elemento como “conectado”, “unido” o “acoplado” a otra característica o elemento, puede estar conectado, unido o acoplado directamente a la otra característica o elemento o pueden estar presentes características o elementos intermedios. En cambio, cuando se hace referencia a una característica o elemento como “directamente conectado”, “directamente unido” o “directamente acoplado” a otra característica o elemento, no hay características o elementos intermedios presentes. Los expertos en la técnica también apreciarán que las referencias a una estructura o característica que se dispone “adyacente” a otra característica pueden tener partes que se superponen o que subyacen a la característica adyacente.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Se entenderá además que los términos “comprende” y/o “que comprende,” cuando se usan en esta memoria descriptiva, especifican la presencia de características, etapas, operaciones, elementos y/o componentes establecidos, pero no excluyen la presencia o la adición de uno o más de otras características, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el término “y/o” incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados y puede abreviarse como “/”.

Los términos relativos espacialmente, tales como “bajo”, “debajo de”, “inferior”, “sobre”, “superior” y similares, pueden usarse en el presente documento para facilitar la descripción para describir la relación de un elemento o característica con otro(s) elemento(s) o característica(s), tal como se ilustra en las figuras. Se entenderá que se pretende que los términos relativos espacialmente engloben diferentes orientaciones del dispositivo u operación en uso además de la orientación representada en las figuras. Por ejemplo, si se invierte un dispositivo en las figuras, los elementos descritos como “bajo” o “por debajo de” otros elementos o características se orientarían entonces “sobre” los otros elementos o características. Por tanto, el término a modo de ejemplo “bajo” puede englobar tanto una orientación de sobre como de bajo. El dispositivo puede orientarse de otro modo (rotado 90 grados o en otras orientaciones) y los descriptores relativos espacialmente usados en el presente documento pueden interpretarse en consecuencia. De manera similar, los términos “hacia arriba”, “hacia abajo”, “vertical”, “horizontal” y similares se usan en el presente documento con fines explicativos únicamente, a menos que se indique específicamente otra cosa.

Aunque los términos “primero” y “segundo” pueden usarse en el presente documento para describir diversas características/elementos (incluyendo etapas), estas características/elementos no deben limitarse por estos términos, a menos que el contexto indique otra cosa. Estos términos pueden usarse para distinguir una característica/elemento de otra característica/elemento. Por tanto, una primera característica/elemento comentada más adelante podría denominarse una segunda característica/elemento, y de manera similar, una segunda característica/elemento comentada más adelante podría denominarse una primera característica/elemento sin apartarse de las enseñanzas de la presente invención.

A lo largo de toda esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” significa que pueden emplearse conjuntamente diversos componentes en los métodos y artículos (por ejemplo, composiciones y aparatos incluyendo dispositivo y métodos). Por ejemplo, se entenderá que el término “que comprende” implica la inclusión de cualquier etapa o elemento establecido, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento.

Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, incluyendo tal como se usa en los ejemplos y a menos que se especifique expresamente otra cosa, todos los números pueden leerse como si estuvieran precedidos por la palabra “aproximadamente” o “alrededor de,” aunque el término no aparezca expresamente. La expresión “aproximadamente” o “alrededor de” puede usarse cuando se describe la magnitud y/o la posición para indicar que el valor y/o la posición descritos están dentro de un intervalo esperado razonable de valores y/o posiciones. Por ejemplo, un valor numérico puede tener un valor que es /- el 0,1% del valor establecido (o intervalo de valores), /- el 1% del valor establecido (o intervalo de valores), /- el 2% del valor establecido (o intervalo de valores), /- el 5% del valor establecido (o intervalo de valores), /- el 10% del valor establecido (o intervalo de valores), etc. Cualquier valor numérico facilitado en el presente documento también debe entenderse que incluye aproximadamente o alrededor de ese valor, a menos que el contexto indique otra cosa. Por ejemplo, si se da a conocer el valor “10”, entonces también se da a conocer “aproximadamente 10”. Se pretende que cualquier intervalo numérico citado en el presente documento incluya todos los subintervalos incluidos en el mismo. También se entiende que cuando se da a conocer un valor que es “menor que o igual a” el valor, “mayor que o igual al valor” y posibles intervalos entre valores también se dan a conocer, según lo entienda de manera apropiada el experto en la técnica. Por ejemplo, si se da a conocer el valor “X”, también se da a conocer “menor que o igual a X” así como “mayor que o igual a X” (por ejemplo, cuando X es un valor numérico). También se entiende que a lo largo de la solicitud, los datos se proporcionan en varios formatos diferentes, y que estos datos representan puntos finales y puntos de partida, e intervalos para cualquier combinación de los puntos de datos. Por ejemplo, si se da a conocer un punto de datos particular “10” y un punto de datos particular “15”, se entiende que mayor que también se considera que se dan a conocer mayor que o igual a, menor que, menor que o igual a, e igual a 10 y 15 entre 10 y 15. También se entenderá que se da a conocer cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se dan a conocer 10 y 15, entonces también se dan a conocer 11, 12, 13 y 14.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras, comprendiendo el material:

un soporte fibroso que comprende una pluralidad de fibras,

en el que las fibras están rodeadas por matriz extracelular, y

en el que la matriz extracelular y la pluralidad de fibras están reticuladas entre sí.

2. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que cada una de las fibras de la pluralidad de fibras tiene una longitud en un intervalo de desde 100 nm hasta 1 m, más preferiblemente desde 100 nm hasta 1 mm.

3. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que las fibras de la pluralidad de fibras comprenden al menos una de fibras tejidas, fibras tricotadas o fibras no tejidas.

4. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que el soporte fibroso tiene una porosidad en un intervalo de desde el 10% hasta el 99%.

5. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que el soporte fibroso tiene una densidad dentro de un intervalo de 10 mg/cc a 10.000 mg/cc.

6. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que el soporte fibroso tiene un grosor en un intervalo de desde 10 |im hasta 5 mm.

7. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que el soporte fibroso comprende un material seleccionado del grupo que consiste en fibra de carbono, Kevlar, fibra de vidrio, un material celulósico fibroso, lana fibrosa, seda fibrosa y colágeno fibroso.

8. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que el soporte fibroso comprende una fibra de proteína que se produce de manera natural, comprendiendo la fibra de proteína que se produce de manera natural al menos uno de un grupo amina hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo tirosilo o un grupo ácido carboxílico.

9. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que el soporte fibroso tiene una química de superficie configurada para permitir la reticulación entre las fibras dentro de la pluralidad de fibras y la matriz extracelular.

10. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que las fibras de la pluralidad de fibras se modifican químicamente para potenciar la reticulación del tejido con el soporte fibroso.

11. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que el soporte fibroso se modifica químicamente para contener un grupo de reticulación de tejido seleccionado del grupo que consiste en aminas, ácidos carboxílicos, sulfatos, aldehídos, hidrazidas, sulfhidrilos, diazirinas, aril-azidas, acrilatos y epóxidos.

12. Material compuesto de tejido biológico reforzado con fibras según la reivindicación 1, en el que la matriz extracelular y la pluralidad de fibras están reticuladas entre sí a través de al menos uno de enlaces covalentes, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas o interacciones de van der Waals.