CN117897477A - 用于经工程化的合成皮革的永生化细胞系 - Google Patents

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Abstract

本文公开的方法、组合物、试剂盒和系统可以涉及用于生产合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、层状结构的经工程化的细胞、由其生产的产品及其生产方法。

Description

用于经工程化的合成皮革的永生化细胞系
交叉引用
本申请要求2021年2月22日提交的美国临时申请号63/152,256的权益，所述申请通过引用并入本文。
发明内容
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括：将转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到支架上以形成人造真皮层，以及使转染或转导的分离的细胞与培养基接触，其中转染或转导的分离的细胞可以包含外源多核苷酸，其中：外源多核苷酸编码：(i)与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用并改变肿瘤抑制蛋白或其片段的活性的多肽，其中肿瘤抑制蛋白或其片段的活性可以通过体外测定来测量，或(ii)编码与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用的多肽的多核苷酸；当与培养基接触时，转染或转导的分离的细胞具有：(i)相对于不与培养基接触的其他方面相同的细胞，增加的胶原的产生，(ii)相对于不与培养基接触的其他方面相同的细胞，至少部分地增加的分化，或(iii)(i)和(ii)的任何组合。在一些实施方案中，方法可以进一步包括使人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的人造真皮层。在一些实施方案中，方法可以包括鞣制至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码SV40大T抗原(SV40-TAg)多肽、端粒酶(TERT)蛋白、Bmi-1蛋白、细胞周期素D1蛋白、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以包含SV40-TAg基因、TERT基因、BMI1基因、CCND1基因、这些中的任一者的转录物、这些中的任一者的外显子或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码SV40大T抗原(SV40-TAg)蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码TERT蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码Bmi-1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码细胞周期素D1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，肿瘤抑制蛋白或其生物活性片段可以是细胞周期素依赖性激酶4、成视网膜细胞瘤、p53、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，在转染或转导之后，转染或转导的分离的细胞的细胞生长周期可以至少部分地不受抑制。在一些实施方案中，在转染或转导之后，转染或转导的分离的细胞能够生长超过约50次细胞分裂、约70次细胞分裂、约90次细胞分裂或约100次细胞分裂。在一些实施方案中，培养基可以包括生长培养基、组织形成培养基或其组合。在一些实施方案中，在用外源多核苷酸转染或转导之后，当存在于生长培养基中时，转染或转导的分离的细胞(a)增殖，(b)避免衰老，或(c)两者。在一些实施方案中，在接种之前，可以使转染或转导的分离的细胞在生长培养基中扩增以形成多个转染或转导的细胞。在一些实施方案中，在接种之前，可以使转染或转导的分离的细胞在至少部分地抑制细胞黏附的容器中扩增。在一些实施方案中，在接种之后，可以使转染或转导的分离的细胞与组织形成培养基接触。在一些实施方案中，生长培养基可以包含生长因子、缓冲液、盐、糖、氨基酸、脂质、维生素、ECM蛋白、这些中的任一者的片段或其任何组合。本文在一些实施方案中公开了一种包含外源分子的分离的经工程化的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中外源分子至少部分地改变pRB或P53的活性，其中分离的经工程化的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以包括如本文所公开的分离的永生化牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，分离的经工程化的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中细胞可以与支架接触。在一些实施方案中，支架可以包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其组合。
本文在一些实施方案中公开了一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性可以在转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞中至少部分地改变，(ii)支架，和(iii)培养基，其中转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以至少部分地容纳在支架之上、之中或周围。在一些实施方案中，转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以与支架接触。在一些实施方案中，支架可以包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了一种人造真皮层，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，和(ii)支架，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性可以在转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞中至少部分地改变，并且其中转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以至少部分地容纳在支架之上、之中或周围。本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括使如本文所公开的人造真皮层至少部分地去细胞化以产生至少部分地去细胞化的人造真皮层。本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括鞣制如本文所公开的至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。本文在一些实施方案中公开了一种人造真皮层，其中支架可以包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了一种包含分离的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞和培养基的组合物，该培养基包含有效量的FBS、L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或其盐、转化生长因子β1(TGFB1)或其生物活性片段或其任何组合，其中当包含转染或转导的多核苷酸的报道细胞能够存在于培养基中时，相对于缺乏有效量的FBS、L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或其盐、转化生长因子β1(TGFB1)、其生物活性片段或组合的其他方面可比较的培养基，有效量可足以诱导报道细胞：增加(i)胶原的产生；(ii)胶原的分泌；或(iii)两者，并且阻抑报道细胞中的细胞生长，如通过以下确定：用编码SV40大T抗原、SV40大T抗原的生物活性片段、TERT、TERT的生物活性片段或其任何组合的多核苷酸转染或转导细胞；使细胞在培养基和其他方面可比较的培养基中生长；将在培养基中生长的细胞的生长率相对于其他方面可比较的培养基进行比较；以及将在培养基中产生的胶原的产量相对于其他方面可比较的培养基进行比较。在一些实施方案中，细胞与支架接触。在一些实施方案中，如本文所公开的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中支架可以包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括：1)将分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到支架上以形成人造真皮层；2)使人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的人造真皮层；以及3)鞣制至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。在一些实施方案中，在接种之前，可以使分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中扩增以形成多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过海弗利克(Hayflick)极限。在一些实施方案中，多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。在一些实施方案中，在扩增之后，可以将多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在低于0℃的温度下储存。在一些实施方案中，在储存之后，在接种之前，可以使多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中生长。在一些实施方案中，支架可以包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。在一些实施方案中，鞣制可以包括人造真皮层中胶原的交联。在一些实施方案中，将分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到支架上，方法进一步可以包括在支架上培养分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞以形成人造真皮层。在一些实施方案中，至少部分地去细胞化可以包括使人造真皮层与盐溶液、结晶盐或其组合接触。在一些实施方案中，接触可以包括将人造真皮层浸入盐溶液中。在一些实施方案中，盐溶液可以包含氯化钠。在一些实施方案中，氯化钠溶液可以包含约30-40％氯化钠。在一些实施方案中，动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以包括牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，鞣制可以包括植物鞣制、铬鞣制、醛鞣制、合成鞣剂鞣制、细菌染色或其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括：1)将分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到支架上以形成人造真皮层；2)从所述人造真皮层去除细胞层的至少一部分；以及3)鞣制人造真皮层以形成合成皮革。在一些实施方案中，在接种之前，可以使分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中扩增以形成多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过海弗利克极限。在一些实施方案中，多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。在一些实施方案中，在扩增之后，可以将多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在低于0℃的温度下储存。在一些实施方案中，在储存之后，在接种到支架上之前，可以使多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中生长。在一些实施方案中，培养分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以包括扩增永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，鞣制可以包括人造真皮层中胶原的交联。在一些实施方案中，动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以包括牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括：将分离的细胞接种到支架上，其中分离的细胞可以包含外源分子；其中外源分子能够基于直接或间接刺激而导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，细胞可以包括永生化细胞。在一些实施方案中，永生化细胞可以包括永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以包括永生化牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，分子可以包括RNA、DNA或蛋白质。在一些实施方案中，DNA编码蛋白质。
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括：将分离的细胞接种到支架上，其中细胞可以包含至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者。在一些实施方案中，分离的细胞可以包括分离的永生化细胞。
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括：将分离的成纤维细胞转化成分离的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞；向分离的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞中引入至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者，其中至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸中的每一者或两者使得永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地增殖或至少部分地贴壁依赖性地增殖；以及使永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞非贴壁依赖性地增殖。
本文在一些实施方案中公开了一种经工程化的细胞，其包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合，其中至少部分地可逆的外源分子开关使得经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地生长或至少部分地贴壁依赖性地生长。
本文在一些实施方案中公开了一种组合物，其包含：包含体外培养的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞的分离的人造真皮层，和支架，其中永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可以至少部分地与支架接触。在一些实施方案中，分离的人造真皮层的细胞层的至少一部分已被去除。在一些实施方案中，支架可以包括天然支架、合成支架或其组合。在一些实施方案中，支架可以包括天然支架。在一些实施方案中，支架可以包括合成支架。在一些实施方案中，支架可以包括至少部分地中空的结构。在一些实施方案中，支架可以包含胶原、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻、藻酸盐、纤连蛋白、聚对苯二甲酰对苯二胺、聚乙烯、聚丙烯、角叉菜胶、琼脂糖、纤维蛋白、玻璃、二氧化硅、芳族聚酰胺、碳、聚(四氟乙烯)、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯腈、壳聚糖、聚氨酯、聚(氨酯-脲)、聚邻苯二甲酸乙二醇酯、甲壳质、弹性蛋白、角蛋白、聚羟基链烷酸酯、葡聚糖、普鲁兰多糖(pullane)、聚透明质酸、聚(3-羟基链烷酸酯)、聚(3-羟基辛酸酯)、聚(3-羟基脂肪酸)、聚(己内酯)、聚(对二氧环己酮)、层粘连蛋白、玉米醇溶蛋白、酪蛋白、明胶、谷蛋白、白蛋白、聚L-乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或其任何组合。在一些实施方案中，永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原、III型胶原、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，人造真皮层可以包含胶原。在一些实施方案中，胶原可以至少部分地由胶原产生细胞产生，可以是单独添加的，或其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括：将转染或转导的分离的细胞接种到支架上以形成人造真皮层。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以包含外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码：(i)与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用并改变肿瘤抑制蛋白或其片段的活性的多肽，其中肿瘤抑制蛋白或其片段的活性可以通过体外测定来测量，或(ii)编码与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，转染或转导的细胞可以与培养基接触。在一些实施方案中，当与培养基接触时，转染或转导的细胞可以具有：(i)相对于不与培养基接触的其他方面相同的细胞，增加的胶原的产生，(ii)相对于不与培养基接触的其他方面相同的细胞，至少部分地增加的分化，或(iii)(i)和(ii)的任何组合。在一些实施方案中，方法可以进一步包括使人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的真皮层。在一些实施方案中，方法可以进一步包括鞣制至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码SV40大T抗原(SV40-TAg)多肽、端粒酶(TERT)蛋白、Bmi-1蛋白、细胞周期素D1蛋白、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以包含SV40-TAg基因、TERT基因、BMI1基因、CCND1基因、这些中的任一者的转录物、这些中的任一者的外显子或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码SV40大T抗原(SV40-TAg)蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码hTERT蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码Bmi-1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码细胞周期素D1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，肿瘤抑制蛋白或其生物活性片段可以包含细胞周期素依赖性激酶4、成视网膜细胞瘤、p53、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，在转染或转导之后，分离的细胞的细胞生长周期可以至少部分地不受抑制。在一些实施方案中，在转染或转导之后，分离的细胞能够生长超过约50次细胞分裂。在一些实施方案中，在转染或转导之后，分离的细胞能够生长超过约70次细胞分裂。在一些实施方案中，在转染或转导之后，分离的细胞能够生长超过约90次细胞分裂。在一些实施方案中，在转染或转导之后，分离的细胞能够生长超过约100次细胞分裂。在一些实施方案中，在用外源多核苷酸转染或转导之后，当分离的细胞可以存在于生长培养基中时，分离的细胞(a)可以增殖，(b)可以避免衰老，或(c)两者。在一些实施方案中，在接种之前，可以使转染或转导的分离的细胞在生长培养基中扩增以形成多个转染或转导的细胞。在一些实施方案中，在接种之前，可以使转染或转导的分离的细胞在至少部分地抑制细胞黏附的容器中扩增。在一些实施方案中，培养基可以包括生长培养基、组织形成培养基或其组合。在一些实施方案中，在接种之后，可以使转染或转导的分离的细胞与组织形成培养基接触。在一些实施方案中，生长培养基可以包含生长因子、缓冲液、盐、糖、氨基酸、脂质、矿物质、ECM蛋白或其组合。在一些实施方案中，盐可以包括无机盐。在一些实施方案中，无机盐可以包括约0.2g/L氯化钙、约0.0001g/L硝酸铁·9H2O、约0.09767g/L硫酸镁(无水)、约0.4g/L氯化钾、约3.7g/L碳酸氢钠、约6.4g/L氯化钠、约0.109g/L磷酸二氢钠(无水)或其任何组合。在一些实施方案中，氨基酸可以包括约0.084g/L L-精氨酸·HCl、约0.0626g/L L-胱氨酸·2HCl、约0.03g/L甘氨酸、约0.042g/LL-组氨酸·HCl·H2O、约0.105g/L L-异亮氨酸、约0.105g/L L-亮氨酸、约1.46g/L L-赖氨酸·HCl、约0.03g/L L-甲硫氨酸、约0.066g/L L-苯丙氨酸、约0.042g/L L-丝氨酸、约0.095g/L L-苏氨酸、约0.016g/L L-色氨酸、约0.12037g/L L-酪氨酸·2Na·2H2O、约0.094g/L L-缬氨酸、约0.584g/L L-谷氨酰胺、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，维生素可以包括约0.004g/L氯化胆碱、约0.004g/L叶酸、约0.0072g/L myo-肌醇、约0.004g/L烟酰胺、约0.004g/L D-泛酸(半钙)、约0g/L吡哆醛·HCl、约0.004g/L吡哆醇·HCl、约0.0004g/L核黄素、约0.004g/L硫胺素·HCl、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，糖可以包括D-葡萄糖、其立体异构体、其盐或其任何组合。在一些实施方案中，pH指示剂可以包括约0.0159g/L酚红·Na、约0.11g/L丙酮酸·Na、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，生长培养基可以包含氨基酸、维生素、无机盐、胎牛血清、抗生素、抗真菌剂或其任何组合。在一些实施方案中，组织形成培养基可以包含生长因子、缓冲液、盐、糖、氨基酸、脂质、矿物质、ECM蛋白、人血小板裂解液、酸式柠檬酸右旋糖、肝素、抗坏血酸、TGF-β1、normocin、血清、血清替代物、非必需氨基酸、抗生素、抗真菌剂或其任何组合。在一些实施方案中，组织形成培养基进一步可以包括约0.1％至约40％血清、血清替代物或其组合。在一些实施方案中，氨基酸可以包括甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H2O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐-H2O、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，维生素可以包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、i-肌醇、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，无机盐可以包括氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，培养基进一步可以包括D-葡萄糖(右旋糖)、次黄嘌呤Na、亚油酸、硫辛酸、酚红、腐胺2HCl、丙酮酸钠、胸苷、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，血清替代物可以基本上不含动物衍生产品，可以无异种成分，或其组合。在一些实施方案中，血清替代物可以包含生长因子、胰岛素转铁蛋白、细胞因子、必需氨基酸、非必需氨基酸、蛋白质、细胞外基质蛋白(ECM)、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、细胞黏附肽、RGD、细胞外基质片段、激素、胶原、白蛋白、脂质、糖蛋白、蛋白质片段或其任何组合。在一些实施方案中，血清可以包括胎牛血清(FBS)、马血清、胎小牛血清或其任何组合。在一些实施方案中，培养基不包含TGFβ。在一些实施方案中，在接种之后，可以使转染或转导的分离的细胞与组织形成培养基接触。在一些实施方案中，当存在于组织形成培养基中时，相对于未与组织形成培养基接触的其他方面可比较的转染或转导的分离的细胞，转染或转导的分离的细胞(a)至少部分地增加胶原的产生，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以在与组织形成培养基接触时至少部分地分化。在一些实施方案中，在接种之后，可以使转染或转导的分离的细胞与包含L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)、其盐、其生物活性片段或这些中的任一者的组合的培养基接触。在一些实施方案中，当存在于包含AA2P、其盐、TGFB1、其生物活性片段或组合的培养基中时，相对于缺乏AA2P、其盐、TGFB1、其生物活性片段或组合的其他方面可比较的培养基，转染或转导的分离的细胞(a)至少部分地增加胶原的产生，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以在与培养基接触时至少部分地分化。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以包括分离的永生化细胞、分离的重编程细胞、分离的祖细胞、分离的间充质干细胞或其任何组合。转染或转导的分离的细胞可以包括分离的成纤维细胞、分离的间充质细胞、分离的干细胞衍生细胞、分离的脐带干细胞、分离的羊膜组织细胞、分离的瘢痕组织细胞或其任何组合。在一些实施方案中，细胞可以展现胶原产生的标志物。在一些实施方案中，细胞可以通过流式细胞术分离。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以分离自牛、非人哺乳动物、爬行动物、鸟、鲨鱼、袋鼠、鱼或鳗鱼。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以分离自牛，并且其中转染或转导的分离的细胞可以包括牛成纤维细胞。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以分离自爬行动物。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以分离自非人哺乳动物。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以分离自鸟。在一些实施方案中，细胞可以包括动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以衍生自瘢痕组织、脐带或其组合。在一些实施方案中，在接种之前，可以针对外源多核苷酸的存在选择转染或转导的细胞。在一些实施方案中，针对外源多核苷酸的存在的选择可以包括抗生素选择。在一些实施方案中，抗生素可以包括嘌呤霉素。在一些实施方案中，支架可以包含多孔材料。在一些实施方案中，可以将转染或转导的分离的细胞移植到支架。在一些实施方案中，支架可以包含合成材料、非合成材料或其组合。在一些实施方案中，天然材料可以包括丝、天然组织黏合剂、纤维蛋白胶、胶原、基底膜蛋白、细胞外基质或其组合。在一些实施方案中，支架可以包含聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺6,6(PA 6,6)、聚酰胺11(PA 11)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚呋喃甲酸乙二醇酯(PEF)、聚氨酯(PU)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚(乙醇)酸(PGA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PVOH)、藻酸盐、PEG化纤维蛋白共聚物(P-纤维蛋白)、聚(癸二酸甘油酯)(PGS)、聚(L-乳酸)(PLLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚-D,L-乳酸/聚乙二醇/聚-D,L-乳酸(PDLLA-PEG)、透明质酸(HA)、碳纳米管、热塑性淀粉、莱赛尔(Lyocell)/天丝(Tencel)(纤维素)、棉、韧皮纤维、黏胶竹、TiO2纳米纤维、纤维素材料、水凝胶材料、藻酸盐、明胶、尼龙、聚酯、丝、与细胞黏附肽交联的材料、与生长因子交联的材料或其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了一种包含外源分子的经工程化的细胞。在一些实施方案中，外源分子至少部分地改变pRB或P53的活性。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包括永生化动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞可以包括非人动物细胞。在一些实施方案中，非人动物细胞可以包括牛细胞。在一些实施方案中，分子可以包括RNA、DNA、小分子、其盐、多肽、激素或其生物活性片段。在一些实施方案中，分子可以包括DNA，其中DNA可以编码多肽或其生物活性片段。在一些实施方案中，分子可以包括RNA，其中RNA可以包括mRNA、siRNA或miRNA。
本文在一些实施方案中公开了一种方法，其包括使包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞与包含约2％至约40％ FBS的培养基接触，其中当存在于包含FBS的培养基中时，转染或转导的细胞(a)产生胶原，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者，并且其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性可以在转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变。在一些实施方案中，培养基可以包含约20％ FBS。在一些实施方案中，培养基进一步可以包含L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)、AA2P的盐、转化生长因子β1(TGFB1)、TGFB1的生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码SV40大T抗原、hTERT、Bmi-1、细胞周期素D1、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以是成纤维细胞。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以分离自牛、非人哺乳动物、爬行动物、鸟、鲨鱼、袋鼠、鱼或鳗鱼。在一些实施方案中，合成皮革可以制成选自以下的任一项的形式：包袋、腰带、表带、包装、鞋子、靴子、鞋类、手套、衣服、背心、夹克、裤子、帽子、衬衫、内衣、行李、手拿包、钱包、球、背包、皮夹、鞍具、挽具、皮套裤(chap)、鞭子、家具、家具配件、室内装潢品、汽车车座、汽车内饰及其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性可以在转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变，(ii)支架，和(iii)培养基。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以至少部分地容纳在支架之上、之中或周围。
本文在一些实施方案中公开了一种人造真皮层，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，和(ii)支架。在一些实施方案中，在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性可以在转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以至少部分地容纳在支架之上、之中或周围。在一些实施方案中，组织的至少一部分可以至少部分地去细胞化。在一些实施方案中，至少部分地去细胞化的组织的至少一部分可以被鞣制以形成合成皮革。
本文在一些实施方案中公开了一种包含永生化成纤维细胞和培养基的组合物，该培养基包含有效量的：FBS、L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或其盐、转化生长因子β1(TGFB1)或其生物活性片段或其任何组合，其中当包含转染或转导的多核苷酸的报道细胞能够存在于培养基中时，相对于缺乏有效量的FBS、L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或其盐、转化生长因子β1(TGFB1)或其生物活性片段或组合的其他方面可比较的培养基，有效量可足以诱导报道细胞：增加(i)胶原的产生；(ii)胶原的分泌；或(iii)两者，并且阻抑报道细胞中的细胞生长，如通过以下确定：用编码SV40大T抗原、SV40大T抗原的生物活性片段、hTERT、hTERT的生物活性片段或其任何组合的多核苷酸转染或转导细胞；使细胞在培养基和其他方面可比较的培养基中生长；将在培养基中生长的细胞的生长率相对于其他方面可比较的培养基进行比较；以及将在培养基中产生的胶原的产量相对于其他方面可比较的培养基进行比较。本文在一些实施方案中公开了一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性可以在转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变，和(ii)如本文所公开的培养基。本文在一些实施方案中公开了一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性可以在转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变，和(ii)如本文所公开的培养基。
本文在一些实施方案中公开了方法，其包括将永生化牛成纤维细胞接种到支架上以形成人造真皮层。在一些实施方案中，方法可以进一步包括使人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的真皮层。在一些实施方案中，方法可以进一步包括鞣制至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。在一些实施方案中，在接种之前，可以使永生化牛成纤维细胞在培养物中扩增以形成多个永生化牛成纤维细胞。在一些实施方案中，多个永生化牛成纤维细胞能够生长超过海弗利克极限。在一些实施方案中，多个永生化牛成纤维细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。在一些实施方案中，在扩增之后，可以将多个永生化牛成纤维细胞在低于0℃的温度下储存。在一些实施方案中，在储存之后，在接种到支架之前，可以使多个永生化牛成纤维细胞在培养物中生长。在一些实施方案中，永生化牛成纤维细胞的培养可以包括扩增永生化牛成纤维细胞。在一些实施方案中，在将永生化牛成纤维细胞接种到支架上之后，方法可以进一步包括在支架上培养永生化牛成纤维细胞以形成人造真皮层。在一些实施方案中，至少部分地去细胞化可以包括使人造真皮层与盐溶液接触。在一些实施方案中，与盐溶液接触可以包括将人造真皮层浸入盐溶液中。在一些实施方案中，盐可以包括氯化钠。在一些实施方案中，氯化钠的浓度可以包含约30％至约40％。在一些实施方案中，鞣制可以包括人造真皮层中胶原的交联。在一些实施方案中，鞣制可以包括处理分离的人造真皮层以产生皮革。在一些实施方案中，鞣制可以产生类似于天然皮革的合成皮革。在一些实施方案中，鞣制可以包括植物鞣制、铬鞣制、醛鞣制、合成鞣剂鞣制、细菌染色或其任何组合。在一些实施方案中，植物鞣制可以包括使用单宁。在一些实施方案中，铬鞣制可以包括使用铬盐。在一些实施方案中，铬盐可以包括硫酸铬。在一些实施方案中，醛可以包括戊二醛化合物、噁唑烷化合物或其任何组合。在一些实施方案中，合成鞣剂可以包括合成单宁、芳族聚合物或其任何组合。在一些实施方案中，可以进行鞣制以将人造真皮层中的蛋白质转化成不会腐烂的稳定材料，同时允许材料保持柔性。在一些实施方案中，可以调节细胞层或层状结构的pH。在一些实施方案中，pH的降低可以包括降低至约6、约5、约4、约3、约2或约1。在一些实施方案中，pH的降低可以包括降低至约2.8-3.2。在一些实施方案中，在pH降低之后，可以升高pH。在一些实施方案中，pH的升高可以包括升高至约3.8-4.2。
本文在一些实施方案中公开了方法，其包括将永生化牛成纤维细胞接种到支架上以形成人造真皮层。在一些实施方案中，方法可以进一步包括鞣制人造真皮层以形成合成皮革。在一些实施方案中，在接种之前，可以使永生化牛成纤维细胞在培养物中扩增以形成多个永生化牛成纤维细胞。在一些实施方案中，多个永生化牛成纤维细胞能够生长超过海弗利克极限。在一些实施方案中，多个永生化牛成纤维细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。在一些实施方案中，在扩增之后，可以将多个永生化牛成纤维细胞在低于0℃的温度下储存。在一些实施方案中，在储存之后，在接种到支架之前，可以使多个永生化牛成纤维细胞在培养物中生长。在一些实施方案中，永生化牛成纤维细胞的培养可以包括扩增永生化牛成纤维细胞。在一些实施方案中，在将永生化牛成纤维细胞接种到支架上之后，方法可以进一步包括在支架上培养永生化牛成纤维细胞以形成人造真皮层。在一些实施方案中，鞣制可以包括人造真皮层中胶原的交联。在一些实施方案中，鞣制可以包括人造真皮层中胶原的交联。在一些实施方案中，鞣制可以包括处理分离的人造真皮层以产生皮革。在一些实施方案中，鞣制可以产生类似于天然皮革的合成皮革。在一些实施方案中，鞣制可以包括植物鞣制、铬鞣制、醛鞣制、合成鞣剂鞣制、细菌染色或其任何组合。在一些实施方案中，植物鞣制可以包括使用单宁。在一些实施方案中，铬鞣制可以包括使用铬盐。在一些实施方案中，铬盐可以包括硫酸铬。在一些实施方案中，醛可以包括戊二醛化合物、噁唑烷化合物或其任何组合。在一些实施方案中，合成鞣剂可以包括合成单宁、芳族聚合物或其任何组合。在一些实施方案中，可以进行鞣制以将人造真皮层中的蛋白质转化成不会腐烂的稳定材料，同时允许材料保持柔性。在一些实施方案中，可以调节细胞层或层状结构的pH。在一些实施方案中，pH的降低可以包括降低至约6、约5、约4、约3、约2或约1。在一些实施方案中，pH的降低可以包括降低至约2.8-3.2。在一些实施方案中，在pH降低之后，可以升高pH。在一些实施方案中，pH的升高可以包括升高至约3.8-4.2。
本文在一些实施方案中公开了方法，其包括将细胞接种到支架上。在一些实施方案中，细胞可以包含外源分子。在一些实施方案中，外源分子能够基于直接或间接刺激而导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，细胞可以包括永生化细胞。在一些实施方案中，永生化细胞可以包括永生化成纤维细胞。在一些实施方案中，永生化成纤维细胞可以包括永生化牛成纤维细胞。在一些实施方案中，分子可以包括RNA、DNA或蛋白质。
本文在一些实施方案中公开了方法，其包括将细胞接种到支架上。在一些实施方案中，细胞可以包含至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者。在一些实施方案中，细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，方法可以进一步包括在接种之前，在一种或多种环境，例如第一环境中增殖细胞。在一些实施方案中，细胞可以包含至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者。在一些实施方案中，细胞可以是多个细胞。在一些实施方案中，多个细胞可以包含多个至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者。在一些实施方案中，方法可以包括多个细胞。在一些实施方案中，多个至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者可以在增殖期间至少部分地开启并且在接种期间至少部分地关闭。在一些实施方案中，多个至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者可以在增殖期间至少部分地开启并且在接种期间至少部分地关闭。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以单独地在增殖期间至少部分地开启并且在接种期间至少部分地关闭。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以单独在增殖期间至少部分地关闭并且在接种期间至少部分地开启。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以在增殖期间至少部分地开启。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以在增殖期间至少部分地关闭。在一些实施方案中，细胞可以是真核细胞。在一些实施方案中，细胞可以选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞和兔形动物细胞。在一些实施方案中，第一环境可以是在悬浮液中。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关至少部分地能够基于直接或间接刺激而导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以至少部分地是以下的表达增加的结果：整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以在增殖期间至少部分地开启并且在接种期间至少部分地关闭。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以在增殖期间至少部分地关闭并且在接种期间至少部分地开启。在一些实施方案中，刺激的存在可以使得编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸的表达增加或表达减少。在一些实施方案中，刺激的缺失可以使得编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸的表达增加或表达减少。在一些实施方案中，增殖可以在存在刺激的情况下进行。在一些实施方案中，增殖可以在缺少刺激的情况下进行。在一些实施方案中，刺激可以选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、培养介质组成的变化及其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以包括温度的变化。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以是基于温度可逆的。在一些实施方案中，在增殖期间，可以将细胞暴露于约28℃至约34℃的温度。在一些实施方案中，在接种期间或之后，可以将细胞暴露于约37℃至约41℃的温度。在一些实施方案中，支架可以是至少部分地天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可以包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶及其组合中的至少一者。在一些实施方案中，细胞可以产生细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，细胞外基质蛋白可以选自I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白及其组合。在一些实施方案中，细胞外基质蛋白可以包括胶原。在一些实施方案中，方法可以进一步包括生成包含细胞或由其发育的组织的一部分的合成皮革的至少一部分。在一些实施方案中，合成皮革可以包含组织的至少一部分。在一些实施方案中，组织可以包括I型胶原。在一些实施方案中，方法可以进一步包括在接种之前，在第一环境中增殖细胞，然后将至少部分地可逆的外源分子开关直接或间接添加到增殖细胞中。在一些实施方案中，细胞可以以约50,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2的密度接种。在一些实施方案中，将细胞接种到支架上可以包括接种支架的一侧。在一些实施方案中，可以在不翻转支架的情况下接种支架的第二侧。在一些实施方案中，将细胞接种到支架上可以包括在支架的多于一侧上接种。在一些实施方案中，接种可以连续地或同时地进行。在一些实施方案中，接种可以包括在支架的一侧上接种，然后翻转支架并接种支架的另一侧。在一些实施方案中，与可以不包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，细胞或永生化细胞可以被修饰成具有增强的细胞外基质产生。在一些实施方案中，细胞外基质可以包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。在一些实施方案中，方法可以进一步包括对包含细胞或永生化细胞的组织进行工程化。在一些实施方案中，方法可以进一步包括鞣制组织。在一些实施方案中，细胞外基质可以包括I型胶原。
本文还公开了方法，其包括将细胞转化成永生化细胞。在一些实施方案中，方法可以包括向永生化细胞中引入至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关、编码至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸中的每一者或两者可以使得永生化细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地增殖或至少部分地贴壁依赖性地增殖。在一些实施方案中，方法可以包括非贴壁依赖性地增殖永生化细胞。在一些实施方案中，细胞可以选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞和兔形动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以是牛细胞。在一些实施方案中，细胞可以是干细胞。在一些实施方案中，干细胞可以选自间充质干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，细胞可以选自成纤维细胞、动物脂肪组织衍生细胞、脐带衍生细胞、角质形成细胞(keratinocyte)、角质细胞(corneocyte)、黑素细胞、朗格汉斯(Langerhans)细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞及其组合。在一些实施方案中，细胞可以是成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，转化可以包括增加或减少癌基因或参与细胞增殖调节的基因的表达。在一些实施方案中，细胞可以表达由TERT、Bmi1或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。在一些实施方案中，永生化细胞可以表达由TERT、CcnD1、Cdk4或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。在一些实施方案中，方法可以进一步包括使永生化细胞暴露于刺激。在一些实施方案中，刺激可以选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、培养介质组成的变化及其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以包括温度的变化。在一些实施方案中，温度可以为约28℃至约34℃。在一些实施方案中，刺激可以使得永生化细胞至少部分地非贴壁依赖性地增殖。在一些实施方案中，非贴壁依赖性可以包括在悬浮液中增殖。在一些实施方案中，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以至少部分地是以下的表达增加的结果：整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合。在一些实施方案中，刺激的去除可以使得永生化细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。在一些实施方案中，方法可以进一步包括使永生化细胞暴露于第二刺激。在一些实施方案中，第二刺激可以选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、培养介质组成的变化及其任何组合。在一些实施方案中，第二刺激可以包括温度的变化。在一些实施方案中，温度可以为约37℃至约41℃。在一些实施方案中，第二刺激可以使得永生化细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。在一些实施方案中，第二刺激的去除可以使得永生化细胞至少部分地非贴壁依赖性地增殖。在一些实施方案中，贴壁依赖性可以包括在基底上增殖。在一些实施方案中，方法可以进一步包括将永生化细胞接种在基底上。在一些实施方案中，永生化细胞可以以约50,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2的密度接种。在一些实施方案中，将永生化细胞接种在基底上可以包括接种基底的一侧。在一些实施方案中，可以在不翻转基底的情况下接种基底的第二侧。在一些实施方案中，将永生化细胞接种在基底上可以包括在基底的多于一侧上接种。在一些实施方案中，接种可以连续地或同时地进行。在一些实施方案中，接种可以包括在基底的一侧上接种，然后翻转基底并接种基底的另一侧。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖可以至少部分地在基底之上、之中或周围进行。在一些实施方案中，基底可以包含支架。在一些实施方案中，支架可以是至少部分地天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可以包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶或其组合。在一些实施方案中，与可以不包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，细胞或永生化细胞可以被修饰成具有增强的细胞外基质产生。在一些实施方案中，细胞外基质可以包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。在一些实施方案中，细胞外基质蛋白可以包括胶原。在一些实施方案中，方法可以进一步包括对包含本文公开的细胞或永生化细胞的组织进行工程化。在一些实施方案中，方法可以进一步包括鞣制包含本文公开的永生化细胞的组织。在一些实施方案中，细胞外基质可以包括I型胶原。
本文还公开了经工程化的细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是永生化牛细胞。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以使得经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地生长或至少部分地贴壁依赖性地生长。在一些实施方案中，经工程化的细胞的增殖可以至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以选自成纤维细胞、动物脂肪组织衍生细胞、脐带衍生细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞及其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以衍生自多能干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是来自包括多种细胞的细胞系的细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以表达外源癌基因或参与细胞增殖调节的基因。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以表达由TERT、Bmi1或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以表达由TERT、CcnD1、Cdk4或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。在一些实施方案中，与不包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，经工程化的细胞可以被修饰成具有增强的细胞外基质产生。在一些实施方案中，细胞外基质可以包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。在一些实施方案中，细胞外基质蛋白可以包括胶原。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以被配置成响应于刺激而至少部分地增加或减少表达。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的增加的表达可以导致至少部分地贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的增加的表达可以导致至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的减少的表达可以导致至少部分地贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的减少的表达可以导致至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，与非贴壁依赖性增殖相比，至少部分地贴壁依赖性增殖可以消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。在一些实施方案中，与至少部分地贴壁依赖性增殖相比，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。在一些实施方案中，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以至少部分地是以下的表达增加的结果：整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以是单个开关或多个开关。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以编码可选择标志物。在一些实施方案中，可选择标志物可以包括荧光蛋白。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含重组可选择标志物。在一些实施方案中，可选择标志物可以选自抗生素抗性基因、编码荧光蛋白的基因和表达营养缺陷型标志物的基因。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源开关的多核苷酸可以位于基因组中，可以在染色体外，或其组合。在一些实施方案中，刺激可以是环境刺激。在一些实施方案中，刺激可以选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、机械刺激、一种或多种离子类型的存在、培养介质组成的变化及其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以包括温度的变化。在一些实施方案中，用于至少部分地非贴壁依赖性增殖的温度可以为约28℃至约34℃。在一些实施方案中，用于至少部分地贴壁依赖性增殖的温度可以为约37℃至约41℃。在一些实施方案中，刺激的存在可以导致贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激的缺失可以导致贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激的存在可以导致非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激的缺失可以导致非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激可以选自以下的存在、缺失或水平的变化：抗生素、蛋白质、化学化合物、这些中的任一者的盐及其任何组合。在一些实施方案中，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以至少部分地是以下的表达增加的结果：整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以在生物反应器中生长。在一些实施方案中，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以至少部分地在悬浮液中进行。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖可以至少部分地在支架之上、之中或周围进行。在一些实施方案中，支架可以是至少部分地天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可以包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶或其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包括选自c-MycER系统、Tet-on系统、Tet-off系统的任一者及其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包括选自Cre-LoxP系统、TALENS、锌指、CRISPR系统或其组件的任一者及其任何组合。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括DNA、RNA或其组合。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括DNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括cDNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括RNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括mRNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括诱导型启动子或操纵子，其中启动子或操纵子可以被配置成阻遏或激活基因的表达。在一些实施方案中，启动子或操纵子可以包括选自四环素控制的转录单位、地塞米松(dexamethasone)控制的转录单位、强力霉素控制的转录单位、C-mycR转录控制单位中的任一者及其任何组合。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以是密码子优化的。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包含表观遗传修饰的碱基。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括嘧啶。在一些实施方案中，嘧啶可以是胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括选自甲基化碱基、羟甲基化碱基、甲酰化碱基和含羧酸碱基中的任一者。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括羟甲基化碱基。在一些实施方案中，羟甲基化碱基可以包括5-羟甲基化碱基。在一些实施方案中，5-羟甲基化碱基可以包括5-羟甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括甲基化碱基。在一些实施方案中，甲基化碱基可以包括5-甲基化碱基。在一些实施方案中，5-甲基化碱基可以包括5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，分离的组织可以包含本文描述的经工程化的细胞。在一些实施方案中，组织可以包含多个聚酯纤维。在一些实施方案中，组织的至少一部分可以被鞣制。在一些实施方案中，组织的至少一部分可以用鞣剂鞣制，该鞣剂包括：铬、铝、锆、钛、铁、硅酸铝钠、甲醛、戊二醛、噁唑烷、异氰酸酯、碳二亚胺、聚氨基甲酰硫酸酯、四羟基硫酸鏻、对-[(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]苯磺酸钠、邻苯三酚、邻苯二酚、合成鞣剂或其任何组合。在一些实施方案中，组织的至少一部分可以进一步包含细胞外基质。在一些实施方案中，皮革可以包含经工程化的细胞的至少一部分、其衍生物、其子代或分离的组织。在一些实施方案中，皮革可以呈选自以下中的任一者的形式：包袋、腰带、表带、包装、鞋子、靴子、鞋类、手套、衣服、背心、夹克、裤子、帽子、衬衫、内衣、行李、手拿包、钱包、球、背包、皮夹、鞍具、挽具、皮套裤、鞭子、家具、家具配件、室内装潢品、汽车车座、汽车内饰及其任何组合。在一些实施方案中，皮革可以包含生物制造材料。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含区域性质。在一些实施方案中，方法可以包括使本文公开的经工程化的细胞与刺激接触。在一些实施方案中，刺激可以包括选自以下的变化的任一者：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、机械刺激的变化、离子水平、一种或多种离子类型的存在及其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以包括温度的变化。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以在用于至少部分地非贴壁依赖性增殖的约28℃至约34℃的温度下生长。在一些实施方案中，刺激的去除可以减弱至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以在用于至少部分地贴壁依赖性增殖的约37℃至约41℃的温度下生长。在一些实施方案中，刺激的去除可以减弱至少部分地贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，可以通过转染、电穿孔或转导将至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸引入到经工程化的细胞中。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以通过选自载体的任一者引入，其中载体可以是病毒、病毒样颗粒、腺相关病毒载体、脂质体、纳米颗粒、质粒、线性dsDNA及其组合。在一些实施方案中，载体可以包括质粒。在一些实施方案中，经工程化的细胞的增殖可以至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。在一些实施方案中，经工程化的细胞的增殖可以通过使用选自计数室、集落形成单位计数、电阻、流式细胞术、图像分析、体视学细胞计数、分光光度法和阻抗微生物学的方法来确定。在一些实施方案中，方法可以包括鞣制本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，鞣制可以包括组织的至少一部分。在一些实施方案中，组织可以包含层状结构。在一些实施方案中，层状结构可以包括选自真皮层、表皮层、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原的任一者及其组合。在一些实施方案中，组织可以包括选自成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞的任一者及其组合。在一些实施方案中，方法可以包括选择或筛选经工程化的细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含经工程化的细胞。在一些实施方案中，合成皮革在鞣制之前可以包含组织的一部分。在一些实施方案中，组织可以至少部分地经受进一步加工。在一些实施方案中，进一步加工可以选自鞣制、防腐、浸水、软化、浸酸、脱酸、削薄、复鞣、润滑、半硝(crusting)、润湿、挤水、刮削、复铬鞣、中和、染色、乳液加脂、填充、剥离、加脂、增白、固定、定型、干燥、回潮(conditioning)、滚软、拉软、磨革、涂饰、涂油、刷涂、揩涂、浸涂、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、熨光、压花、熨平、打光、滚光及其任何组合。在一些实施方案中，合成皮革可以包含生物制造材料。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含区域性质。在一些实施方案中，培养器皿可以包含本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，培养器皿可以包括选自塑料、金属、玻璃的任一者及其组合。在一些实施方案中，培养器皿可以包含导致经工程化的细胞黏附到培养器皿的至少一部分的试剂。在一些实施方案中，试剂可以包含聚-L-赖氨酸。在一些实施方案中，制造设施可以包含经工程化的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包含本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含生长培养基。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含使用说明。
本文还公开了经工程化的细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关可以使得经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地生长或至少部分地贴壁依赖性地生长。在一些实施方案中，经工程化的细胞的增殖可以至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是动物细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是分离的细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是非人细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞和兔形动物细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是牛细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以选自成纤维细胞、动物脂肪组织衍生细胞、脐带衍生细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞及其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以衍生自多能干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是来自包括多种细胞的细胞系的细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以表达外源癌基因或参与细胞增殖调节的基因。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以表达由TERT、Bmi1或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以表达由TERT、CcnD1、Cdk4或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。在一些实施方案中，与不包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，经工程化的细胞可以被修饰成具有增强的细胞外基质产生。在一些实施方案中，细胞外基质可以包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。在一些实施方案中，细胞外基质可以包括胶原。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以被配置成响应于刺激而至少部分地增加或减少表达。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的增加的表达可以导致至少部分地贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的增加的表达可以导致至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的减少的表达可以导致至少部分地贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸的减少的表达可以导致至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，与非贴壁依赖性增殖相比，至少部分地贴壁依赖性增殖可以消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。在一些实施方案中，与至少部分地贴壁依赖性增殖相比，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以是单个开关或多个开关。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以编码可选择标志物。在一些实施方案中，可选择标志物可以包括荧光蛋白。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含重组可选择标志物。在一些实施方案中，可选择标志物可以选自抗生素抗性基因、编码荧光蛋白的基因和表达营养缺陷型标志物的基因。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以位于基因组中，可以在染色体外，或其组合。在一些实施方案中，刺激可以是环境刺激。在一些实施方案中，刺激可以选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、机械刺激、一种或多种离子类型的存在、培养介质组成的变化及其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以包括温度的变化。在一些实施方案中，用于至少部分地非贴壁依赖性增殖的温度可以为约28℃至约34℃。在一些实施方案中，用于至少部分地贴壁依赖性增殖的温度可以为约37℃至约41℃。在一些实施方案中，刺激的存在可以导致贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激的缺失可以导致贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激的存在可以导致非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激的缺失可以导致非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激可以选自以下的存在、缺失或水平的变化：抗生素、蛋白质、化学化合物、这些中的任一者的盐及其任何组合。在一些实施方案中，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以至少部分地是以下的表达增加的结果：整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以在生物反应器中生长。在一些实施方案中，至少部分地非贴壁依赖性增殖可以至少部分地在悬浮液中进行。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖可以至少部分地在支架之上、之中或周围进行。在一些实施方案中，支架可以是至少部分地天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可以包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶或其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包括选自c-MycER系统、Tet-on系统、Tet-off系统的任一者及其组合。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包括选自Cre-LoxP系统、TALENS、锌指、CRISPR系统或其组件的任一者及其任何组合。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括DNA、RNA或其组合。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括DNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括cDNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括RNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括mRNA。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包括诱导型启动子或操纵子，其中启动子或操纵子可以被配置成阻遏或激活基因的表达。在一些实施方案中，启动子或操纵子可以包括选自四环素控制的转录单位、地塞米松控制的转录单位、强力霉素控制的转录单位、C-mycR转录控制单位的任一者及其任何组合。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以是密码子优化的。在一些实施方案中，编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以包含表观遗传修饰的碱基。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括嘧啶。在一些实施方案中，嘧啶可以是胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括选自甲基化碱基、羟甲基化碱基、甲酰化碱基和含羧酸碱基的任一者。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括羟甲基化碱基。在一些实施方案中，羟甲基化碱基可以包括5-羟甲基化碱基。在一些实施方案中，5-羟甲基化碱基可以包括5-羟甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以包括甲基化碱基。在一些实施方案中，甲基化碱基可以包括5-甲基化碱基。在一些实施方案中，5-甲基化碱基可以包括5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，分离的组织可以包含本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，组织可以包含多个聚酯纤维。在一些实施方案中，组织的至少一部分可以被鞣制。在一些实施方案中，组织的至少一部分可以用鞣剂鞣制，该鞣剂包括：铬、铝、锆、钛、铁、硅酸铝钠、甲醛、戊二醛、噁唑烷、异氰酸酯、碳二亚胺、聚氨基甲酰硫酸酯、四羟基硫酸鏻、对-[(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]苯磺酸钠、邻苯三酚、邻苯二酚、合成鞣剂或其任何组合。在一些实施方案中，组织的至少一部分可以进一步包含细胞外基质。在一些实施方案中，皮革可以包含本文公开的经工程化的细胞的至少一部分、其衍生物、其子代的或分离的组织。在一些实施方案中，皮革可以呈选自以下中的任一者的形式：包袋、腰带、表带、包装、鞋子、靴子、鞋类、手套、衣服、背心、夹克、裤子、帽子、衬衫、内衣、行李、手拿包、钱包、球、背包、皮夹、鞍具、挽具、皮套裤、鞭子、家具、家具配件、室内装潢品、汽车车座、汽车内饰及其任何组合。在一些实施方案中，皮革可以包含生物制造材料。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含区域性质。在一些实施方案中，方法可以包括使本文公开的经工程化的细胞与刺激接触。在一些实施方案中，刺激可以包括选自以下的变化的任一者：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、机械刺激的变化、离子水平、一种或多种离子类型的存在及其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以包括温度的变化。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以在用于至少部分地非贴壁依赖性增殖的约28℃至约34℃的温度下生长。在一些实施方案中，刺激的去除可以减弱至少部分地非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以在用于至少部分地贴壁依赖性增殖的约37℃至约41℃的温度下生长。在一些实施方案中，刺激的去除可以减弱至少部分地贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，可以通过转染、电穿孔或转导将至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸引入到经工程化的细胞中。在一些实施方案中，至少部分地可逆的外源分子开关或编码至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸可以通过选自载体的任一者引入，其中载体可以是病毒、病毒样颗粒、腺相关病毒载体、脂质体、纳米颗粒、质粒、线性dsDNA及其组合。在一些实施方案中，载体可以包括质粒。在一些实施方案中，经工程化的细胞的增殖可以至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。在一些实施方案中，经工程化的细胞的增殖可以通过使用选自计数室、集落形成单位计数、电阻、流式细胞术、图像分析、体视学细胞计数、分光光度法和阻抗微生物学的方法来确定。在一些实施方案中，方法可以包括鞣制本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，鞣制可以包括组织的至少一部分。在一些实施方案中，组织可以包含层状结构或包含本文描述的经工程化的细胞的结构。在一些实施方案中，层状结构可以包括选自真皮层、表皮层、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原的任一者及其组合。在一些实施方案中，组织可以包括选自成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞的任一者及其组合。在一些实施方案中，方法可以包括选择或筛选本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，合成皮革在鞣制之前可以包含组织的一部分。在一些实施方案中，组织可以至少部分地经受进一步加工。在一些实施方案中，进一步加工可以选自鞣制、防腐、浸水、软化、浸酸、脱酸、削薄、复鞣、润滑、半硝、润湿、挤水、刮削、复铬鞣、中和、染色、乳液加脂、填充、剥离、加脂、增白、固定、定型、干燥、回潮、滚软、拉软、磨革、涂饰、涂油、刷涂、揩涂、浸涂、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、熨光、压花、熨平、打光、滚光及其任何组合。在一些实施方案中，合成皮革可以包含生物制造材料。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含区域性质。在一些实施方案中，培养器皿可以包含本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，培养器皿可以包括选自塑料、金属、玻璃的任一者及其组合。在一些实施方案中，培养器皿可以包含导致经工程化的细胞黏附到培养器皿的至少一部分的试剂。在一些实施方案中，试剂可以包含聚-L-赖氨酸。在一些实施方案中，制造设施可以包含本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包含本文公开的经工程化的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含生长培养基。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含使用说明。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体并且单独地指示为通过引用并入一样。
附图说明
图1A示出了传代次数对以小时为单位的群体倍增时间的影响。未修饰的牛真皮成纤维细胞(BDF)能够在体外扩增约40个群体倍增(PD)，其平均群体倍增时间(PDT)为35.5小时。原代BDF在多次传代中改变其PDT，其中从第0代到第11代，最小PDT为21.6小时，而最大PDT为51.5小时。图1B示出，相比之下，VL-001(SV40-TAg转导的细胞)细胞在嘌呤霉素选择之后可以再扩增至少20代，以在第25代达到100的累积PD。该数字并不指示衰老，相反，这是扩增实验停止的时间。VL-001细胞系的平均PDT(21.2小时)比未修饰的原代BDF短40％。VL-001细胞系在连续传代中也表现出更一致的PDT。如图1A中所示，从第6代到第25代，VL-001细胞系的最小PDT为19.1小时，而最大PDT为23.7小时。图1C和图1D示出了第9代未修饰的牛真皮成纤维细胞(BDF)和第24代VL-001(SV40-TAg转导的)细胞的相位显微图像。在广泛传代的VL-001细胞系中没有观察到衰老细胞，而在后来传代的未修饰的原代BDF中可以识别到衰老形态。
图2A示出了来自野生型牛真皮成纤维细胞的组织的三色蓝染色横切面。图2B示出了来自VL-001(SV40-TAg转导的)细胞的组织的三色蓝染色横切面。图2A和图2B的比较示出，VL-001细胞可以在PET支架上形成类似于野生型真皮成纤维细胞(BDF)的组织。图像是用三色蓝染色的组织的横切面，其突出了组织中的胶原。将野生型牛真皮成纤维细胞和VL-001(SV40-TAg转导的细胞)以500,000个细胞/cm2接种在PET支架上。将野生型牛真皮成纤维细胞在基于人血小板裂解液(HPL)的培养基(DMEM+10％ HPL+抗坏血酸-2-磷酸酯(AA2P)+TGFB1+ACD+Normocin)中培养4周。将VL-001在基于胎牛血清(FBS)的培养基(DMEM+20％FBS+NEAA+抗生素/抗真菌剂)中培养2周，然后将AA2P添加到基于FBS的培养基中再培养2周。
图3描绘了用于用SV40-T抗原(SV40-Tag)、嘌呤霉素报道基因(Puror)横切细胞的构建体和用于绿色荧光蛋白(GFP)表达的构建体的示意图。
图4A示出了-LV-Puro细胞。图4B示出了-LV+Puro细胞。图4C示出了SV40 TAg+Puro细胞。图4D示出了SV40 TAg+Puro细胞。
图5示出了在组织形成培养基中和在组织形成培养基+TGFb1+AA2P中生长的BDF和VL-001细胞的培养介质中的胶原量(ug/ml)。
图6A示出了在HPL培养基中生长的BDF细胞的组织扫描图像。图6B示出了在HPL培养基10X中生长的BDF细胞的10x放大组织扫描图像。图6C示出了在HPL培养基中生长的VL-001细胞的组织扫描图像。图6D示出了在HPL培养基中生长的VL-001细胞的10X放大组织扫描图像。图6E示出了在20％ FBS培养基中生长的VL-001细胞的组织扫描图像。图6F示出了在20％ FBS培养基中生长的VL-001细胞的10x放大组织扫描图像。
图7描绘了在数周培养过程中的在培养介质中生长的BDF和VL-001细胞的培养介质中的胶原量(ug/ml)。
图8描绘了BDF和VL-001细胞的以湿重(ug/g)归一化的胶原量。
图9A示出了在培养物中生长零周的VL-001细胞系。图9B示出了在培养物中生长一周的VL-001。在悬浮培养一周之后，观察到清晰的团块形成。图9C示出了在培养物中生长两周的VL-001。图9D示出了在培养物中生长四周的VL-001。
图10示出了在TGFB1和AA2P处理后的COL1基因的表达增加。在暴露于转化生长因子β1(TGFB1)和抗坏血酸-2-磷酸酯(AA2P)后，COL1A1和COL1A2基因的表达水平在原代牛真皮成纤维细胞(BDF)和永生化细胞系(VL-001)中均上调。
图11A和图11B各自示出了从PLA支架上的永生化牛成纤维细胞系生长的人造真皮层。
图12示出，由VL-001细胞生成的组织具有与原代牛真皮成纤维细胞衍生组织相似的总胶原水平。VL-001S1和VL-001S2的测量取自图11A和图11B中示出的组织的活检物。
图13示出了来自PLA支架上的永生化牛成纤维细胞系的组织活检物的天狼猩红(PSR)染色切片。将组织活检物固定在塑料树脂中，生成5um的切片并用天狼猩红(PSR)染色。染色示出，VL-001细胞可以在整个PLA支架中沉积胶原。
图14示出了处于半硝阶段(在干燥以去除多余的水之后)的VL-001组织的图像。将VL-001细胞接种到小牛血清(BCS)包被的聚-L-丙交酯酸(PLA)三维非织造支架上，在由5％hPL(人血小板裂解液)、肝素(2mg/L)、非必需氨基酸(1x浓度)、抗坏血酸(82ug/L)、抗生素-抗真菌剂(1x浓度；100单位/mL青霉素、100ug/mL链霉素和250ng/mL的Gibco两性霉素B)组成的细胞培养介质中生长4周。
具体实施方式
为了说明，下面参考示例性应用来描述若干方面。应理解，阐述了许多具体细节、关系和方法，以提供对本文描述的特征的全面理解。本文描述的特征可以在没有一个或多个具体细节的情况下实践或者用其他方法来实践。本文描述的特征不受动作或事件的所示顺序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非所有示出的动作或事件都是实施根据本文描述的特征的方法所必需的。
本文使用的术语仅是为了描述特定的情况，而不是旨在进行限制。如本文所用，除非上下文清楚地另外指示，否则单数形式“一”、“一个/一种”和“所述/该”旨在也包括复数形式。此外，就具体实施方式和/或权利要求中使用的术语“包括”、“具有”或其变体而言，此类术语旨在是包含性的，其方式类似于术语“包含”。
在本公开内容中，术语“约”或“大约”可以意指给定值的至多10％的范围。在本公开内容中，术语“基本上”是指能够在很大程度上完成的事物。
如本文所用，术语“成纤维细胞”可以包括在身体的皮肤和肌腱中发现的结缔组织细胞。成纤维细胞可以获自皮肤或肌腱的的活检物。成纤维细胞也普遍存在于除了皮肤和肌腱之外的许多组织和器官中。成纤维细胞可以是一种合成细胞外基质和胶原的生物细胞。成纤维细胞可以是一种为动物组织产生结构框架(基质(stroma))并在伤口愈合中起关键作用的生物细胞。成纤维细胞可能是动物中的结缔组织的最常见的细胞。成纤维细胞可以包含在培养物中生长的组织层的主要部分，其可以被鞣制成皮革。
如本文所用，术语“成纤维细胞样细胞”可以指已在培养物中生长的成纤维细胞、已永生化的成纤维细胞或其组合。成纤维细胞样细胞可以包括已经分化以具有基本上类似成纤维细胞的形态、表型或其组合的细胞。成纤维细胞样细胞可以包含相较于成纤维细胞的遗传或表型改变，同时仍表达与成纤维细胞基本上相似的基因表达。成纤维细胞样细胞可以具有与成纤维细胞相似的特性，诸如合成胶原、细胞外基质、动物组织的结构基质(基质)或其任何组合的能力。与成纤维细胞相比，成纤维细胞样细胞可以产生基本上相似水平的胶原。
如本文所用，术语“多能干细胞”可以指具有形成除胎盘之外的任何成体细胞的能力的任何前体细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”或“ESC”可以指具有形成任何成体细胞的能力的前体细胞。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPS细胞”或“iPSC”可以指一种人工地衍生自非多能细胞(例如，成体体细胞)的多能干细胞。诱导多能干细胞在形成任何成体细胞的能力上可以与胚胎干细胞相同，但可以不衍生自胚胎。
如本文所用，术语“分离的”可以指从动物取出的细胞。分离的细胞可以在培养物中或在体外生长。分离的细胞可以与其他分离的细胞、支架、培养基或其组合接触。
如本文所用，术语“贴壁依赖性”和“非贴壁依赖性”增殖可以指在任何培养基、任何条件、任何设备或其任何组合中的细胞增殖。非贴壁依赖性生长可以指不黏附到基底的细胞生长。贴壁依赖性生长可以指至少部分地黏附到基底(例如，支架)的细胞生长。非贴壁依赖性生长也可以称为非贴壁生长或在悬浮液中生长。在一些实施方案中，非贴壁依赖性和贴壁依赖性生长可以包括被培养基包围的细胞。在一些实施方案中，非贴壁依赖性生长可以包括不与另一个细胞或表面(例如，支架)接触的细胞。在一些实施方案中，在非贴壁依赖性生长中，表面可以是另一个细胞。在一些实施方案中，非贴壁依赖性生长可以是在培养物中作为单个细胞而生长。在一些实施方案中，贴壁依赖性生长可以是细胞与培养物中(例如，支架上)的多个细胞接触而生长。
如本文所用，术语“去细胞化”或“去细胞化的”可以指从细胞层去除细胞。术语“至少部分地去细胞化的”可以指从细胞层去除至少一些细胞。“去细胞化”可以指去除细胞以形成去细胞化细胞层的过程，并且可以通过诸如盐析等方法或通过使用洗涤剂来实现。
如本文所用，术语“合成皮革”可以意指本文描述的皮肤等同物可以用作任何哺乳动物或非哺乳动物的皮肤等同物。本公开内容可以用非人哺乳动物来实践，诸如非人灵长类动物和牛、绵羊、猪、马、犬和猫物种的成员，以及啮齿动物；兔形动物家族的成员；鱼；鸟；和爬行动物。在一些实施方案中，合成皮革可以包括人造皮革。在一些实施方案中，合成皮革可以包括零残忍的皮革、生态友好的皮革、不含塑料的皮革或其任何组合。在一些实施方案中，合成皮革可以包含鞣制的人造细胞层、鞣制的至少部分地去细胞化的细胞层或其组合。在一些实施方案中，细胞层或至少部分地去细胞化的细胞层可以包括真皮层、表皮层、至少部分地去细胞化的真皮层、至少部分地去细胞化的表皮层或其任何组合。在一些实施方案中，可以形成的哺乳动物合成皮革可以取决于本文描述的本发明中使用的细胞来源，例如角质形成细胞和成纤维细胞，例如当牛角质形成细胞和成纤维细胞可以用于形成皮肤等同物时，可以形成牛合成皮革。
本文公开的方法、组合物、试剂盒和系统可以涉及用于生产合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、层状结构的经工程化的细胞、由其生产的产品及其生产方法。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是动物细胞，例如牛细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以被永生化。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含分子开关，其中分子开关可以是多核苷酸。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含在合成皮革中。在一些实施方案中，合成皮革可以包含一个或多个层。在一些实施方案中，一个或多个层可以包含细胞，其中细胞可以在体外培养。在一些实施方案中，本文描述的方法可以提供高生产量的方法，该方法可靠、准确且可重复地将合成皮革的生产扩展到商业水平。本文公开的合成皮革、经工程化的表皮等同物、经工程化的全厚度皮肤等同物及其制造方法的优点可以包括，以可重复、高生产量和易于扩展的方式生产定制的组织，并且该组织具有吸引人的外观、质地、厚度、耐久性或其任何组合。在一些实施方案中，全厚度皮肤等同物可以包含至少一个真皮层和至少一个表皮层。在一些实施方案中，全厚度皮肤等同物和全皮肤等同物可以互换使用。在一些实施方案中，真皮层可以包含本文描述的经工程化的细胞。
在一些实施方案中，本文公开的合成皮革可以包含一层包含成纤维细胞的人造真皮层、包含角质形成细胞的人造表皮层或其组合。在一些实施方案中，真皮层和表皮层可以形成层状结构。在一些实施方案中，合成皮革可以包含一个或多个层状结构。在一些实施方案中，合成皮革可以被鞣制并且进一步加工。在一些实施方案中，形成合成层的细胞可以包括永生化牛成纤维细胞。在一些实施方案中，真皮层可以放置在诸如丝等支架上以获得天然皮革厚度和质地。在一些实施方案中，合成皮革可以包含人造真皮层，该人造真皮层包含本文描述的经工程化的细胞。
在一些实施方案中，制造合成皮革的方法可以包括形成包含人造真皮层的结构，并鞣制结构。在一些实施方案中，方法可以包括进一步加工人造结构，例如以获得天然皮革厚度和质地。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含细胞层。在一些实施方案中，合成皮革可以包含多个细胞层。在一些实施方案中，合成皮革可以包含至少部分地去细胞化的细胞层。在一些实施方案中，细胞层可以包括真皮层、表皮层、组织层、基底膜、基底膜替代物或其任何组合。在一些实施方案中，合成皮革可以进一步包含下皮、鳞片、盾片、皮骨或其组合。在一些实施方案中，合成层可以包含全厚度皮肤等同物。在一些实施方案中，全厚度皮肤等同物可以包含本文公开的层中的任一者或组合。在一些实施方案中，可以去除合成皮革中的一个或多个细胞层的一部分。在一些实施方案中，去除一个或多个细胞层的至少一部分可以包括至少部分地去细胞化、刮削或其组合。在一些实施方案中，至少部分地去细胞化可以包括使细胞层与盐溶液接触。在一些实施方案中，与盐溶液接触可以包括浸入盐溶液中。在一些实施方案中，盐溶液可以包含氯化钠、粗盐晶体、盐水溶液或其组合。在一些实施方案中，盐水溶液可以包含约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约12％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％盐。在一些实施方案中，细胞层或至少部分地去细胞化的细胞层可以被鞣制。在一些实施方案中，可以在形成一个或多个细胞层或层状结构之后进行鞣制。在一些实施方案中，细胞层或层状结构可以包含经工程化的细胞。在一些实施方案中，可以在细胞层至少部分地去细胞化之后进行鞣制。在一些实施方案中，合成皮革可以被进一步加工。在一些实施方案中，细胞层可以包含毛囊细胞、黑素细胞或其组合。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含真皮层或其至少部分地去细胞化的部分。在一些实施方案中，真皮层可以是经工程化的真皮等同物，例如体外形成的人造真皮层。
在一些实施方案中，真皮层可以包含结缔组织的细胞。在一些实施方案中，真皮层可以包含成纤维细胞。在一些实施方案中，真皮层中的成纤维细胞可以表达一种或多种标志物，包括但不限于分化群10(CD10)、分化群73(CD73)、分化群44(CD44)、分化群90(CD90)、分化群105(CD105)、I型胶原、III型胶原、脯氨酰-4-羟化酶β成纤维细胞或其组合。在一些实施方案中，真皮层可以包含其他类型的细胞，诸如免疫细胞、巨噬细胞、脂肪细胞或其组合。在一些实施方案中，真皮层可以包含经工程化的细胞。在一些实施方案中，细胞层可以包括永生化细胞、牛细胞、成纤维细胞或其任何组合。在一些实施方案中，细胞层可以包含永生化牛成纤维细胞。
在一些实施方案中，除了细胞之外，真皮层还可以包含基质组分。在一些实施方案中，基质组分可以包括胶原、弹性蛋白、纤维外基质、主要由糖胺聚糖构成的细胞外凝胶样物质、蛋白聚糖、糖蛋白中的任一者或多者或其任何组合。在一些实施方案中，主要由糖胺聚糖构成的细胞外凝胶样物质可以包括透明质酸。
在一些实施方案中，真皮层可以包含基质载体。在一些实施方案中，基质载体可以是支架。在一些实施方案中，基质载体可以包含收缩的胶原凝胶。在一些实施方案中，纯胶原基质可以是覆盖有硅橡胶膜(C-GAG)、生物聚合物或其任何组合的聚乙醇酸网或胶原和糖胺聚糖基质。在一些实施方案中，生物聚合物可以包括壳聚糖。在一些实施方案中，可以用成纤维细胞接种基质。在一些实施方案中，用成纤维细胞接种可以产生器官型模型。在一些实施方案中，细胞层可以包含天然来源的真皮、角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，天然来源的真皮可以获自同种异体尸体皮肤。在一些实施方案中，角质形成细胞可以形成角质形成细胞片。在一些实施方案中，细胞层可以包含来自尸体皮肤的冻干失活真皮，以承载角质形成细胞片。
在一些实施方案中，皮革单位的厚度可以以毫米、盎司或iron来报告。在一些实施方案中，一盎司可以等于1/64in.或0.0156in.或0.396mm。在一些实施方案中，一iron可以等于1/48in.或0.0208in.或0.53mm。
在一些实施方案中，真皮层的厚度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.01mm至约50mm的厚度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的厚度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.02mm至5mm的厚度。例如，真皮层可以具有约0.1mm至0.5mm的厚度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.2mm至0.5mm的厚度。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，真皮层可以具有至少约50mm的厚度。
在一些实施方案中，真皮层的长度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.01mm至约50m的长度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的长度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.02mm至5mm的长度。例如，真皮层可以具有约0.1mm至0.5mm的长度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些实施方案中，真皮层的长度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，真皮层的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，真皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，真皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，真皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
在一些实施方案中，真皮层的宽度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.01mm至约50m的宽度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的宽度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.02mm至5mm的宽度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.1mm至0.5mm的宽度。在一些实施方案中，真皮层可以具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些实施方案中，真皮层的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，真皮层的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，真皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，真皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，真皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含一个或多个真皮层。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、40、60、80或100个真皮层。在一些实施方案中，当合成皮革可以包含多于一个真皮层时，一个真皮层可以放置在另一个真皮层上。在一些实施方案中，合成皮革可以包含两个真皮层，例如第一真皮层和第二真皮层。在一些实施方案中，第一真皮层可以放置在第二真皮层上。
在一些实施方案中，真皮层或其至少部分地去细胞化的部分可以分层，例如具有多个子层。在一些实施方案中，子层可以具有不同的组成，例如不同浓度的纤维。在一些实施方案中，真皮层的子层或其至少部分地去细胞化的部分可以具有不同的厚度、密度或其组合。在一些实施方案中，真皮层或其至少部分地去细胞化的部分可以具有乳头状真皮层、网状真皮层、这些中的任一者的至少部分地去细胞化的部分或其任何组合。在一些实施方案中，乳头状真皮层或其至少部分地去细胞化的部分可以包含疏松的网形结缔组织、松散排列的纤维、这些的至少部分地去细胞化的部分或其任何组合。在一些实施方案中，松散排列的纤维可以包括胶原纤维。在一些实施方案中，网状真皮层可以包含致密的不规则结缔组织，包括胶原纤维和真皮弹性纤维。
在一些实施方案中，真皮层或其至少部分地去细胞化的部分可以包含游离胶原基质或网格，其可以在所有方向上可收缩并且均质。在一些实施方案中，成纤维细胞(例如，永生化牛成纤维细胞)，以及真皮的其他类型细胞(在适当的情况下)，可以分布在连续的胶原凝胶中。在一些实施方案中，真皮等同物可以包含至少一种I型胶原基质，其中可以分布成纤维细胞。在一些实施方案中，真皮等同物还可以包含其他细胞外基质成分。在一些实施方案中，细胞外基质成分可以包括胶原，例如胶原IV、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖或透明质酸。在一些实施方案中，真皮层可以含有IV型胶原以及层粘连蛋白、巢蛋白或其组合。在一些实施方案中，可以调节这些各种成分的浓度。例如，在一些实施方案中，层粘连蛋白的浓度可以为最终体积的约1％至约15％。在一些实施方案中，胶原IV的浓度可以为最终体积的约0.3％至约4.5％。在一些实施方案中，巢蛋白的浓度可以为最终体积的约0.05％至约1％。在一些实施方案中，胶原可以是牛源、大鼠源、鱼源、天然胶原或通过遗传工程化(其允许在存在成纤维细胞的情况下收缩)产生的胶原的任何其他来源或其任何组合的胶原。在一些实施方案中，胶原可以来自非天然来源。在一些实施方案中，基质可以是通过水平和竖直收缩获得的可能不紧绷的胶原凝胶，其不会强制实行成纤维细胞的优先组织。在一些实施方案中，也称为“游离质”的基质，可以不黏附到载体，并且其体积可以无限制地改变，从而赋予其不同的厚度和直径。在一些实施方案中，真皮等同物的厚度可以为至少0.05cm，并且在一些实施方案中，大约0.05至2cm。在一些实施方案中，在不损害皮肤等同物或合成皮革的有利性质的情况下，厚度也可以增加。在一些实施方案中，厚度可以为约3mm至约20cm或更大。在一些实施方案中，合成皮革可以仅包含真皮层。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含表皮层(例如，人造表皮层)。在一些实施方案中，表皮层可以是经工程化的表皮等同物，例如体外形成的人造表皮层。
在一些实施方案中，表皮层可以包含一种或多种类型的细胞，包括角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔(Merkel)细胞和炎性细胞。在一些实施方案中，表皮层可以包含角质形成细胞。在一些实施方案中，表皮层中的角质形成细胞可以包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，表皮层可以包含经工程化的细胞。在一些实施方案中，表皮层可以包含永生化细胞。
在一些实施方案中，表皮层可以至少包含基底角质形成细胞，例如可能未分化的角质形成细胞。在一些实施方案中，表皮层可以进一步包含部分分化的角质形成细胞以及完全分化的角质形成细胞。在一些实施方案中，合成皮革中的一个或多个表皮层可以是从真皮-表皮接合处开始的从未分化的基底角质形成细胞向完全分化的角质形成细胞的过渡，基底角质形成细胞可以位于真皮-表皮接合处。
在一些实施方案中，基底角质形成细胞可以表达半桥粒，其可以用于帮助将表皮层和真皮层固定在一起。在一些实施方案中，基底角质形成细胞也可以用于再生皮肤。在一些实施方案中，本文的合成皮革中的表皮层可以具有提供这些功能的基底角质形成细胞。在一些实施方案中，包含此类基底角质形成细胞的合成皮革能够再生。在一些实施方案中，合成皮革的一个或多个表皮层中的基底角质形成细胞和分化角质形成细胞之间的区别可以是，E-钙黏蛋白和P-钙黏蛋白都可能存在于沿基底膜区(BMZ)的表皮角质形成细胞中，但可以分化并远离BMZ定位的角质形成细胞可能仅表达E-钙黏蛋白。
在一些实施方案中，表皮层的基底角质形成细胞可以对齐排列成与真皮层直接接触的层，作为分化角质形成细胞和成纤维细胞之间的边界。在替代情况下，在基底角质形成细胞和真皮层之间可能存在间隙。此外，在基底角质形成细胞和其他基底角质形成细胞之间可能存在间隙，从而在分化角质形成细胞和真皮层之间留下间隙。在基底或分化角质形成细胞和真皮层之间可能存在间隙的后者情况下，真皮层和表皮层可能不会均匀地相互接触，但可能彼此相邻。在一些实施方案中，真皮层和表皮层可以是相邻的，因为在真皮层和表皮层之间通常可能存在流体，但是基本上没有其他的中间材料，诸如细胞层、胶原、基质或其他载体。
在一些实施方案中，表皮层中的角质形成细胞可以表达一种或多种标志物。在一些实施方案中，标志物可以包括但不限于角蛋白14(KRT14)、肿瘤蛋白p63(p63)、桥粒芯糖蛋白3(DSG3)、整合素β4(ITGB4)、层粘连蛋白α5(LAMA5)、角蛋白5(KRT5)、肿瘤蛋白p63的异构体(例如，TAp63)、层粘连蛋白β3(LAMB3)和角蛋白18(KRT18)。
在一些实施方案中，表皮层的厚度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.001mm至约10mm的厚度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.005mm至约10mm、约0.005mm至约5mm、约0.005mm至约2mm、约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约0.01mm至约0.8mm、约0.01mm至约0.4mm、约0.01mm至约0.2mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.05mm至约0.4mm、约0.05mm至约0.2mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm至约0.4mm、约0.1mm至约0.2mm、约0.08mm至约1mm或约0.05mm至约1.5mm的厚度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.01mm至约2mm的厚度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.1mm至约0.22mm的厚度。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，本文描述的厚度值可以是表皮层和基底膜替代物的厚度。
在一些实施方案中，表皮层的长度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.01mm至约50m的长度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的长度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.02mm至5mm的长度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.1mm至0.5mm的长度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些实施方案中，表皮层的长度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，表皮层的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，表皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，表皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，表皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
在一些实施方案中，表皮层的宽度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.01mm至约50m的宽度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的宽度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.02mm至5mm的宽度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.1mm至0.5mm的宽度。在一些实施方案中，表皮层可以具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些实施方案中，表皮层的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，表皮层的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，表皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，表皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，表皮层可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含一个或多个表皮层。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、40、60、80或100个表皮层。在一些实施方案中，当合成皮革可以包含多于一个表皮层时，一个表皮层可以放置在另一个表皮层上。在一些实施方案中，合成皮革可以包含两个表皮层，例如第一表皮层和第二表皮层。在一些实施方案中，第一表皮层可以放置在第二表皮层上。
在一些实施方案中，表皮层可以分层，例如具有多个子层。在一些实施方案中，子层可以具有不同的细胞组成，例如不同类型的角质形成细胞。在一些实施方案中，子层可以包含经工程化的细胞。在一些实施方案中，表皮层的子层可以具有不同的厚度和/或密度。在一些实施方案中，表皮层可以具有角质化层(角质层)、透明/半透明层(透明层)、粒层(颗粒层)、有棘层(棘层)、基底层/生发层中的一者或多者或其任何组合。在一些实施方案中，表皮层可以包含功能性表皮渗透屏障(例如，角质层中的组织化的脂质双层)。在一些实施方案中，角质层、透明层、颗粒层、棘层或基底层/生发层可以具有约0.0001mm至约5mm的厚度。在一些实施方案中，角质层、透明层、颗粒层、棘层或基底层/生发层可以具有至少约0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm的厚度。在一些实施方案中，角质层、透明层、颗粒层、棘层或基底层/生发层可以具有至多约50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.15mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm的厚度。
在一些实施方案中，表皮层可以进一步包含产生色素(例如，黑素)的细胞。在一些实施方案中，此类产生色素的细胞可以是黑素细胞。在一些实施方案中，表皮层中的黑素细胞可以表达一种或多种标志物。在一些实施方案中，此类标志物可以包括但不限于含SRY盒基因10(Sox-10)、小眼相关转录因子(MITF-M)、前黑素体蛋白(gp-100)、多巴色素互变异构酶(DCT)、酪氨酸酶(TYR)和Melan-A(MLANA)。在一些实施方案中，合成皮革可以不包含表皮层。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含胶原和由本文公开的真皮层和/或表皮层中的细胞产生的细胞外基质组分。在一些实施方案中，合成皮革可以包含至少部分地去细胞化的真皮层和/或表皮层，如本文所公开。在一些实施方案中，合成皮革不包含表皮层。在一些实施方案中，合成皮革还可以包含毛囊细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、真皮乳头细胞、免疫系统细胞(诸如淋巴细胞、树突细胞、肥大细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞)、脂肪细胞、神经细胞、许旺(Schwann)细胞及其混合物的至少一部分。在一些实施方案中，合成皮革可以包含经工程化的细胞(例如，包含分子开关的细胞)的至少一部分。合成皮革可以包含永生化细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含分离的细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含细胞系。
合成皮革可以包含原核细胞、真核细胞或其组合的至少一部分。在一些实施方案中，合成皮革可以包含细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)的至少一部分。在一些实施方案中，合成皮革可以包含真核细胞(例如，牛细胞、猪细胞、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))的至少一部分。
在一些实施方案中，合成皮革中的一个或多个细胞的至少一部分可以是经遗传工程化的细胞。术语“经遗传工程化的”可以指对细胞的核酸含量的人为改变。因此，经遗传工程化的细胞可以包括在细胞的基因组中含有一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或取代以及改变(包括将插入的自我复制的染色体外核酸引入到细胞中)的细胞。经遗传工程化的细胞还包括其中一个或多个基因的转录已被改变(例如，增加或减少)的那些细胞。
在一些实施方案中，细胞可以包含分子开关。在一些实施方案中，细胞可以不具有分子开关。在一些实施方案中，细胞可以是真核细胞(例如，动物细胞)或原核细胞。在一些实施方案中，细胞可以是经遗传工程化的细胞。在一些实施方案中，细胞可以是分离的细胞。在一些实施方案中，细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，细胞可以包括、成纤维细胞、干细胞或其任何组合。细胞可以是脂肪组织衍生细胞(例如，脂肪细胞)、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、肌成纤维细胞、卫星细胞、成肌细胞、肌细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、平滑肌细胞、脐带细胞、多能干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞或其任何组合。在一些实施方案中，细胞可以选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞和兔形动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以是经遗传工程化的细胞。细胞可以包括具有多种细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞可以产生细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，与不包含分子开关的其他方面可比较的野生型细胞相比，细胞可以具有增强的细胞外基质产生。在一些实施方案中，细胞外基质蛋白可以包括胶原、I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其任何组合。在一些实施方案中，经工程化的组织可以包含本文描述的细胞。
在一些实施方案中，细胞可以包含一个或多个分子开关。在一些实施方案中，细胞可以不具有分子开关。在一些实施方案中，开关的激活或去激活可以在经工程化的细胞内生成分子作用的级联。在一些实施方案中，级联可以包括基因/蛋白质表达的增加的调节。在一些实施方案中，级联可以包括基因/蛋白质表达的减少的调节。在一些实施方案中，分子开关可以是可逆的分子开关。在一些实施方案中，分子开关可以被部分地激活。在一些实施方案中，部分激活可以由低水平或低浓度的刺激产生，诸如驱动基因的表达的抗生素。例如，部分激活可以包括相较于完全激活的开关的减少的表达(例如，Tet-on系统)。在另一个实例中，部分激活可以包括相较于完全激活的开关的增加的表达(例如，Tet-off系统)。在一些实施方案中，分子开关可以在细胞的一部分中激活。在一些实施方案中，细胞的一部分可以包含所激活的细胞的超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，细胞的一部分可以包含所激活的细胞的少于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，细胞的一部分可以包含所激活的细胞的约5％至约99％、10％至约30％、20％至约50％、40％至约70％或约50％至约95％。在一些实施方案中，开关可以是一个基因、多个基因、多核苷酸或其任何组合。在一些实施方案中，多核苷酸可以是DNA、RNA或其组合。在一些实施方案中，分子开关可以包含DNA、cDNA、RNA、siRNA、mRNA、miRNA或其任何组合。在与刺激直接或间接相互作用之后，分子开关可以增加或减少基因表达。分子开关可以是密码子优化的。在一些实施方案中，分子开关可以整合到基因组中、在染色体外或两者的组合。在一些实施方案中，基因可以是整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、CDK4、p53介导的凋亡途径中的基因或其任何组合。基因可以来自哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、无脊椎动物、病毒、细菌或其任何组合。在一些实施方案中，基因可以是可以包含一个或多个基因的融合基因。在一些实施方案中，基因可以编码温度敏感开关，例如tsA58。在一些实施方案中，基因可以编码Cre-LoxP重组酶系统、CRISPR系统、FLP-FRT系统、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指、甲基化系统或其任何组合。在一些实施方案中，开关可以是四环素转录单位、地塞米松控制的转录单位、强力霉素控制的转录单位、C-mycR控制的转录单位、抗生素控制的转录单位、代谢物控制的转录单位或其任何组合。在一些实施方案中，分子开关可以包含Tet-on、Tet-off系统或其任何组合。在一些实施方案中，分子开关可以包含T-REx系统。在一些实施方案中，在Tet-on系统中，当四环素、其衍生物、其盐或其任何组合可以被引入到细胞的环境中时，可以诱导系统来表达基因。在一些实施方案中，在Tet-off系统中，当四环素、其衍生物、其盐或其任何组合可以被引入到细胞的环境中时，可以诱导系统来阻遏基因。在一些实施方案中，分子开关可以是雌激素受体(ER)系统。在一些实施方案中，分子开关可以包含诱导型系统的混合物，例如雌激素受体系统和Tet-off系统的混合物。在一些实施方案中，开关可以是启动子、操纵子或其组合。在某些情况下，启动子或操纵子可以改变基因的表达。在一些实施方案中，启动子、操纵子或其任何组合可以被配置成激活或阻遏基因中的表达。在一些实施方案中，开关可以包含基因、启动子、多核苷酸序列或其任何组合。在一些实施方案中，分子开关可以基于刺激而至少部分地导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地导致贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，分子开关的表达的变化(例如，增加或减少的表达)可以至少部分地导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地导致贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，分子开关可以在增殖期间至少部分地开启。在一些实施方案中，分子开关可以在增殖期间至少部分地关闭。
在一些实施方案中，细胞可以包含可选择标志物(例如，报道基因构建体)。在一些实施方案中，开关可以包含可选择标志物。在一些实施方案中，可选择标志物可以包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、EGFP、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、编码这些中的任一者的基因或其任何组合。在一些实施方案中，可选择标志物可以包括抗生素抗性基因(例如，杀稻瘟菌素、遗传霉素、霉酚酸、嘌呤霉素、吉欧霉素(zeocin)、潮霉素b、其盐或其任何组合)、荧光团、生物合成基因、营养缺陷型标志物或其任何组合。在一些实施方案中，可选择标志物可以是反义RNA。在一些实施方案中，可选择标志物可以用于选择或筛选经工程化的细胞。
在一些实施方案中，开关可以包含表观遗传修饰。在一些实施方案中，表观遗传修饰可以传递给子细胞。在一些实施方案中，表观遗传修饰可以维持单个世代。在一些实施方案中，表观遗传修饰可以是核苷酸碱基、糖或其任何组合。在一些实施方案中，表观遗传修饰可以包含嘧啶、嘌呤或其任何组合。在一些实施方案中，表观遗传修饰可以包含核糖、脱氧核糖或其任何组合。在一些实施方案中，表观遗传修饰可以在胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、苏氨酸、尿嘧啶或其任何组合上。表观遗传修饰的碱基可以包括甲基化碱基、羟甲基化碱基、甲酰化碱基、含羧酸碱基或其任何组合。在一些实施方案中，表观遗传修饰的碱基可以是5-甲基化碱基、5-羟甲基化碱基、5-甲酰化碱基、5-羧基化碱基、5-羟甲基胞嘧啶或其任何组合。
在一些实施方案中，可以通过转染、转化、转导或注射将分子开关引入到细胞中。在一些实施方案中，转染或转化可以包括电穿孔、生物弹道颗粒递送、声穿孔或其组合。在一些实施方案中，编码分子开关的多核苷酸可以位于基因组中或在染色体外。在一些实施方案中，分子开关可以通过载体递送至细胞。在一些实施方案中，载体可以是呈质粒形式的多核苷酸。在一些实施方案中，载体可以包括脂质体、纳米颗粒或其任何组合。脂质体可以包括但不限于单层脂质体、多层脂质体、古细菌脂质体(archaeosome)、非离子表面活性剂脂质体(noisome)、非磷脂基脂质体(novasome)、隐密脂质体(cryptosome)、乳脂体(emulsome)、囊泡体(vesosome)、或这些中的任一者的衍生物或其任何组合。纳米颗粒可以包括但不限于生物聚合物纳米颗粒、藻酸盐纳米颗粒、黄原胶纳米颗粒、纤维素纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合胶束、聚络合物(polyplex)、无机纳米颗粒、纳米晶体、金属纳米颗粒、量子点、蛋白质纳米颗粒、多糖纳米颗粒、或这些中的任一者的衍生物或其任何组合。在一些实施方案中，载体可以是RNA病毒载体，其可以包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、冠状病毒、甲病毒、黄病毒、弹状病毒、麻疹病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒或小核糖核酸病毒、或这些中的任一者的部分、或这些中的任一者的片段或其任何组合。在一些实施方案中，载体可以是DNA病毒载体，其可以包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒、杂合腺病毒系统、嗜肝DNA病毒、细小病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、疱疹病毒、痘病毒、这些中的任一者的一部分、这些中的任一者的片段或其任何组合。
在一些实施方案中，分子开关可以由刺激来控制。在一些实施方案中，刺激可以是直接刺激、间接刺激或其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以是梯度。梯度刺激可以在细胞混合物中部分地使得分子开关激活。在一些实施方案中，梯度刺激不能激活细胞培养物的一部分细胞中的分子开关。在一些实施方案中，梯度刺激可以激活细胞培养物的一部分细胞中的分子开关。在一些实施方案中，随着梯度增大或减小，分子开关可以更多或更少地被激活。在一些实施方案中，细胞增殖、细胞接种或其任何组合可以在存在刺激的情况下进行。在一些实施方案中，细胞增殖、细胞接种或其任何组合可以在缺少刺激的情况下进行。在一些实施方案中，细胞(例如，具有开关的永生化细胞)可以与刺激接触。在一些实施方案中，刺激可以使得细胞至少部分地非贴壁依赖性地增殖。在一些实施方案中，刺激可以使得细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。在一些实施方案中，刺激的缺失可以使得细胞至少部分地非贴壁依赖地增殖。在一些实施方案中，刺激的缺失可以使得细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。细胞可以暴露于一种刺激或多种刺激(例如，第二刺激)。刺激可以是环境刺激。在一些实施方案中，环境刺激可以包括温度、磁场、pH、光、电流、微环境、离子、声音、气压、湿度、物理刺激(例如，机械刺激)或其任何组合的存在、缺失或水平。在一些实施方案中，刺激可以是培养基的变化。在一些实施方案中，培养基可以包括培养介质。在一些实施方案中，培养介质可以包括杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’smodified eagle’s medium，DMEM)、RPMI-1640、伊格尔氏最小必需培养基(Eagle’s Minimal EssentialMedium)、哈姆氏营养混合物(Ham’snutrient mixture)、伊斯科氏改良培养基(Iscove’smodified)、杜尔贝科氏培养基(Dulbecco’s medium)或其任何组合。在一些实施方案中，可以向培养介质中添加补充剂。在一些实施方案中，补充剂可以包括盐、缓冲剂、酚红、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、氨基酸、碳水化合物、脂质、蛋白质、肽、脂肪酸、维生素、元素、抗生素、血清、细胞培养介质补充剂或其任何组合。在一些实施方案中，刺激可以是碳水化合物、脂质、核酸、蛋白质、抗生素、有机化学品、无机化学品、人工化学品、代谢物或其任何组合的存在、缺失或水平。在一些实施方案中，细胞(例如，本文描述的经工程化的细胞)可以在增殖期间暴露于约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃的温度。在一些实施方案中，细胞(例如，本文描述的经工程化的细胞)可以在接种期间暴露于约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃的温度。在一些实施方案中，温度可以是增殖和接种之间的温度差，可以为约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。在一些情况下，温度刺激可以为从约28℃至约36℃、28℃至约37℃、28℃至约38℃、28℃至约39℃、28℃至约40℃、28℃至约41℃、29℃至约36℃、29℃至约37℃、29℃至约38℃、29℃至约39℃、29℃至约40℃、29℃至约41℃、30℃至约36℃、30℃至约37℃、30℃至约38℃、30℃至约39℃、30℃至约40℃、30℃至约41℃、31℃至约36℃、31℃至约37℃、31℃至约38℃、31℃至约39℃、31℃至约40℃、31℃至约41℃、32℃至约36℃、32℃至约37℃、32℃至约38℃、32℃至约39℃、32℃至约40℃、32℃至约41℃、33℃至约36℃、33℃至约37℃、33℃至约38℃、33℃至约39℃、33℃至约40℃、33℃至约41℃、34℃至约36℃、34℃至约37℃、34℃至约38℃、34℃至约39℃、34℃至约40℃、34℃至约41℃、35℃至约36℃、35℃至约37℃、35℃至约38℃、35℃至约39℃、35℃至约40℃或35℃至约41℃的温度变化。在一些情况下，温度刺激可以为从约41℃至约28℃、41℃至约29℃、41℃至约30℃、41℃至约31℃、41℃至约32℃、41℃至约33℃、41℃至约34℃、41℃至约35℃、40℃至约28℃、40℃至约29℃、40℃至约30℃、40℃至约31℃、40℃至约32℃、40℃至约33℃、40℃至约34℃、40℃至约35℃、39℃至约28℃、39℃至约29℃、39℃至约30℃、39℃至约31℃、39℃至约32℃、39℃至约33℃、39℃至约34℃、39℃至约35℃、38℃至约28℃、38℃至约29℃、38℃至约30℃、38℃至约31℃、38℃至约32℃、38℃至约33℃、38℃至约34℃、38℃至约35℃、37℃至约28℃、37℃至约29℃、37℃至约30℃、37℃至约31℃、37℃至约32℃、37℃至约33℃、37℃至约34℃、37℃至约35℃、36℃至约28℃、36℃至约29℃、36℃至约30℃、36℃至约31℃、36℃至约32℃、36℃至约33℃、36℃至约34℃或36℃至约35℃的温度变化。在一些实施方案中，分子开关可以是基于温度刺激可逆的。
在一些实施方案中，经遗传工程化的细胞可以包含用于胶原产生的基因。在一些实施方案中，胶原基因可以是P4HA、P4HB、COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1或其任何组合。在一些实施方案中，胶原基因可以具有改变的启动子，该启动子可以改变(例如增加或减少)胶原基因的表达。在一些实施方案中，胶原基因可以来自动物、哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、无脊椎动物或其任何组合。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含永生化细胞、由其发育的组织或其任何组合。在一些实施方案中，外源多核苷酸可以编码：(i)与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用并可以改变肿瘤抑制蛋白或其片段的活性的多肽，(ii)可以编码与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用的多肽的多核苷酸，或(iii)(i)和(ii)的组合。在一些实施方案中，肿瘤抑制蛋白或其片段的活性可以通过体外测定来测量。在一些实施方案中，永生化细胞可以包含分子开关。在一些实施方案中，合成皮革可以来自非永生化细胞、由其发育的组织或其任何组合。永生化细胞可以包括成纤维细胞、脂肪组织衍生细胞、脐带细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞或其任何组合。在一些实施方案中，永生化细胞可以包括或衍生自多能干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有与本文描述的任何细胞类型相似的特性。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有突变。在一些实施方案中，永生化细胞可以包含外源基因。在一些实施方案中，一个外源基因或多个外源基因可以导致永生化。在一些实施方案中，外源基因可以包括hTERT、TERT、Bmi1、CcnD1、Cdk4的突变体、Cdk4、TAg(SV40大T)、SV40、c-myc、H-ras、Ela、c-mMycERTAM、E6、E7、HER-2、SRC、EGFR、Abl、Atk02、Aml1、Axl、Bcl、Dbl、EGFR、ERBB、Ets-1、Fms、Fos、Fps、Gli、Gsp、Her2、Hox11、Hst、Il-3、Int-2、Jun、Kit、KS3、K-SAM、Lbc、Lck、L-myc、Lyl-1、Lyt-10、Mas、MDM-2、Mll、Mos、Myb、Neu、N-Myc、Ost、Pax-5、Pim-1、PRAD-1、Ras-K、Ras-N、Ret、Ros、Ski、Sis、Set、Src、Tal1、Tan1、Tiam1、Tsc2、Trk或其任何组合。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有外源基因，其可以是包含一个或多个基因的融合基因。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有可以诱导永生化的蛋白质产物或其生物活性片段。在一些实施方案中，永生化细胞可以在细胞分裂之后去除外源基因(例如，通过Cre-LoxP系统或CRISPR系统)。在一些实施方案中，外源基因可以来自哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、无脊椎动物、病毒、细菌或其任何组合。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有随机突变或多个突变。在一些实施方案中，突变可以通过UV诱变、化学诱变或其任何组合生成。在某些情况下，永生化细胞可以具有靶向突变，例如，可以通过CRISPR系统进行靶向突变。在一些实施方案中，突变可以在细胞周期基因、癌基因、代谢基因或其任何组合中。在一些实施方案中，永生化细胞可以在基因、启动子区、基因内区、基因间区或其任何组合中具有突变。在一些实施方案中，基因可以包括癌基因、细胞周期基因或其组合。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有癌基因或参与细胞增殖调节的基因的增加或减少的表达。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有分子开关。在一些实施方案中，永生化细胞可以是条件性永生化细胞。在一些实施方案中，条件性永生化细胞可以在某种环境刺激下展现永生化细胞表型或在不同的环境刺激下展现分化细胞表型。在一些实施方案中，永生化细胞能够生长超过约30次细胞分裂、约40次细胞分裂、约50次细胞分裂、约60次细胞分裂、约70次细胞分裂、约80次细胞分裂、约90次细胞分裂、约100次细胞分裂、约150次细胞分裂、约200次细胞分裂、约250次细胞分裂、约300次细胞分裂、约350次细胞分裂、约400次细胞分裂、约450次细胞分裂、约500次细胞分裂、约550次细胞分裂、约600次细胞分裂、约650次细胞分裂、约700次细胞分裂、约750次细胞分裂、约800次细胞分裂、约850次细胞分裂、约900次细胞分裂、约950次细胞分裂、约1000次细胞分裂、约5,000次细胞分裂、约10,000次细胞分裂、约50,000次分裂或约100,000次细胞分裂。
在一些实施方案中，本文描述的方法可以包括在第一环境中增殖永生化细胞，其中永生化细胞可以包含可逆的外源分子开关，其可以通过刺激的存在或缺失而至少部分地激活或部分地沉默；并将永生化细胞接种到支架上。在一些实施方案中，环境可以包括生物反应器、温育箱、器皿、支架、生长条件(例如，生长培养基、温度、通气、在悬浮液中)或其任何组合。
在一些实施方案中，本文描述的细胞可以包含在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒可以包含生长培养基、使用说明、包装或其任何组合。
在一些实施方案中，合成皮革可以具有天然皮肤的至少一种组分，诸如黑素细胞、毛囊、汗腺和神经末梢。在某些情况下，合成皮革可以通过缺乏这些组分中的至少一者来区别于正常的天然皮肤。在一些实施方案中，展现异常表型或具有至少一个基因型改变的细胞，合成皮革可以包含所有这些组分。
在一些实施方案中，可以向合成皮革中添加额外的组分。此类额外的组分可以包括肌上皮细胞、导管细胞、分泌细胞、肺泡细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、粘连、乳腺或其任何混合物。在一些实施方案中，合成皮革可以包含以下中的一者或多者：神经细胞、结缔组织(包括骨、软骨、分化成骨形成细胞和软骨细胞的细胞和淋巴组织)、上皮细胞(包括在腔和血管或通道中形成内层(lining)的内皮细胞、外分泌上皮细胞、上皮吸收细胞、角质化上皮细胞和细胞外基质分泌细胞)和未分化细胞(诸如胚胎细胞、干细胞和其他前体细胞)。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含毛囊。毛囊可以包含一种或多种结构，包括乳头、基质、根鞘、隆突部、漏斗部、立毛肌、皮脂腺、顶泌汗腺或其任何组合。毛囊可以包含一种或多种毛囊细胞，包括真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其任何组合。在一些实施方案中，毛囊可以在表皮层中。在一些实施方案中，毛囊可以在真皮层中。在一些实施方案中，毛囊细胞可以从祖代分化，例如从干细胞分化。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的毛囊细胞可以从诱导多能干细胞分化。
在一些实施方案中，合成皮革可以没有毛发、血管、皮脂腺、毛囊、油腺、神经或其任何组合。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含毛发。在一些实施方案中，合成皮革可以在一个或多个层状结构中包含毛发。在一些实施方案中，合成皮革可以包含毛皮。在一些实施方案中，毛发(例如，毛皮)可以是天然的、合成的或其组合。在一些实施方案中，毛发(例如，毛皮)可以从合成皮革中的细胞生长，或者从外源来源添加到合成皮革中。在一些实施方案中，合成皮革可以不具有任何毛发。
在一些实施方案中，合成皮革中的一个或多个细胞的至少一部分可以从祖细胞分化，诸如从干细胞分化。在一些实施方案中，合成皮革可以由如本文所公开经工程化的细胞或包含经工程化的细胞的组织生成。在一些实施方案中，合成皮革中的成纤维细胞可以从干细胞分化。在一些实施方案中，合成皮革中的角质形成细胞可以从干细胞分化。在一些实施方案中，合成皮革中的黑素细胞可以从干细胞分化。
在一些实施方案中，干细胞可以包括胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)或其任何组合。在一些实施方案中，干细胞可以是全能的、多能的(pluripotent)或多潜能的(multipotent)。在一些实施方案中，干细胞可以包括成体干细胞、脐带血干细胞或其组合。胚胎干细胞可以衍生自可能不到一周大的受精胚胎。诱导多能干细胞可以通过在任何体细胞中诱导Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、TERT、Bmi1、CcnD1、Cdk4、SV40大T抗原、c-Myc、这些基因中的任一者的片段中的一者或多者的表达来获得。在一些实施方案中，体细胞可以包括成体体细胞。在一些实施方案中，体细胞可以包括成纤维细胞。在一些实施方案中，外源载体可以包含或编码诱导多能性的基因。在一些实施方案中，外源载体可以包括质粒。在一些实施方案中，诱导多能干细胞可以通过活性蛋白质产物或其生物活性片段获得。在一些实施方案中，还可以诱导一种或多种其他基因，以用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞。在一些实施方案中，用于诱导多能性的基因可以包括NANOG、UTF1、LIN28、SALL4、NR5A2、TBX3、ESSRB、DPPA4、SV40LT、REM2、MDM2和细胞周期素D1。在一些实施方案中，基因可以来自哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、无脊椎动物或其任何组合。
在一些实施方案中，可以使用各种递送方法来调节基因的表达，以将体细胞重编程为iPSC。在一些实施方案中，示例性递送方法可以包括裸DNA递送、腺病毒载体、电递送、化学递送、机械递送、基于聚合物的系统、显微注射、逆转录病毒载体(例如，MMLV衍生逆转录病毒)、慢病毒载体(例如，可切除的慢病毒)或其任何组合。在一些实施方案中，体细胞可以包括成体体细胞。在一些实施方案中，可以用载体转染体细胞，以用于递送诱导多能性的基因。在一些实施方案中，载体可以包括病毒载体。在一些实施方案中，载体可以包括逆转录病毒载体。在一些实施方案中，诱导多能性的基因可以包括Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、TERT、Bmi1、CcnD1、Cdk4、SV40大T抗原、c-Myc、这些中的任一者的片段或其任何组合。在一些实施方案中，仙台病毒可以用作递送系统。在一些实施方案中，体细胞可以包括成体体细胞。在一些实施方案中，可以用染色体外载体转染体细胞。在一些实施方案中，染色体外载体可以包括质粒。在一些实施方案中，染色体外载体可以递送Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、TERT、Bmi1、CcnD1、Cdk4、SV40大T抗原、c-Myc、这些中的任一者的片段或其任何组合。
本文在一些实施方案中公开了包含细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，细胞可以包括衍生自动物的细胞。在一些实施方案中，细胞可以衍生自哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、无脊椎动物或其任何组合。在一些实施方案中，细胞可以获自活检。在一些实施方案中，细胞可以被永生化。在一些实施方案中，合成皮革可以包含来自本文描述的任何细胞类型的经工程化的细胞并且可以包含分子开关。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含衍生自动物的细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含衍生自哺乳动物的细胞。在一些实施方案中，衍生自哺乳动物的细胞可以包括哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以包括非人哺乳动物。在一些实施方案中，动物可以包括爬行动物。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含衍生自其他物种的细胞。在一些实施方案中，细胞可以衍生自鸟。在一些实施方案中，细胞可以衍生自爬行动物。在一些实施方案中，细胞可以衍生自两栖动物。在一些实施方案中，细胞可以衍生自鱼。
在一些实施方案中，合成皮革中的细胞可以衍生自相同的物种。在一些实施方案中，合成皮革中的所有细胞可以是牛细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含衍生自多个物种的细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含衍生自至少2、3、4、5、6、7、8或10个物种的细胞。
在一些实施方案中，合成皮革中的细胞的祖代也可以衍生自本文描述的来源。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以包含分子开关，体细胞、合成细胞中使用的原代细胞、真皮层细胞、表皮层细胞或合成细胞中的任何细胞及其祖代可以衍生自本文描述的来源。在一些实施方案中，体细胞可以被重编程为iPSC。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含一个或多个层状结构。在一些实施方案中，层状结构可以通过将第一类型的层放置在第二类型的层上来形成。在一些实施方案中，第一类型的层和第二类型的层可以相同或不同。在一些实施方案中，层状结构可以通过将表皮层放置在真皮层上来形成。在一些实施方案中，层状结构可以通过将表皮层放置在真皮层上并在其间放置基底膜替代物来形成。在一些实施方案中，层状结构可以包含多层真皮。
在一些实施方案中，层状结构可以包含两个或更多个层。在一些实施方案中，层状结构可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000个层。在一些实施方案中，层状结构可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000个第一类型的层和至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个第二类型的层。在一些实施方案中，层状结构可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000个真皮层和至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000个表皮层。
在一些实施方案中，层状结构可以包含本文描述的一种或多种类型的细胞。在一些实施方案中，层状结构可以包含真皮层中的细胞(诸如成纤维细胞)、表皮层中的细胞或其任何组合。在一些实施方案中，表皮层中的细胞可以包括角质形成细胞。在一些实施方案中，层状结构可以包含具有开关的经工程化的细胞。在一些实施方案中，层状结构可以包含具有外源分子开关的永生化细胞。
在一些实施方案中，层状结构可以具有约0.001mm至约100mm的厚度。在一些实施方案中，层状结构可以具有约0.005mm至约50mm、约0.005mm至约10mm、约0.01mm至约10mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm或约0.1至约0.5mm的厚度。在一些实施方案中，层状结构的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm、10mm、20mm、40mm、60mm、80mm或100mm。在一些实施方案中，层状结构的厚度可以为至多100mm、50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，层状结构可以具有至少约100、200、300、400、500、600、700、800mm的厚度。
在一些实施方案中，层状结构的长度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。在一些实施方案中，层状结构可以具有约0.01mm至约50m的长度。在一些实施方案中，层状结构可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的长度。在一些实施方案中，层状结构可以具有约0.02mm至5mm的长度。在一些实施方案中，层状结构可以具有约0.1mm至0.5mm的长度。在一些实施方案中，层状结构可以具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些实施方案中，层状结构的长度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，层状结构的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，层状结构可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，层状结构可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，层状结构可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
在一些实施方案中，层状结构的宽度可以经工程化以适合合成皮革的功能或用途。层状结构可以具有约0.01mm至约50m的宽度。例如，层状结构可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的宽度。例如，层状结构可以具有约0.02mm至5mm的宽度。例如，层状结构可以具有约0.1mm至0.5mm的宽度。例如，层状结构可以具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些实施方案中，层状结构的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，层状结构的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，层状结构可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，层状结构可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，层状结构可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
层状结构可以包含至少约50:1、40:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:10或1:100中的任何比率的成纤维细胞和角质形成细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞与角质形成细胞的比率可以为约20:1至约3:1、约20:1至约4:1、约20:1至约5:1、约20:1至约10:1或约20:1至约15:1。在一些实施方案中，层状结构可以包含本文公开的任何细胞。在一些实施方案中，层状结构可以包含本文公开的任何经工程化的细胞。
层状结构可以包含至少约50:1、40:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:10或1:100中的任何比率的成纤维细胞和黑素细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞与黑素细胞的比率可以为约20:1至约3:1、约20:1至约4:1、约20:1至约5:1、约20:1至约10:1或约20:1至约15:1。
层状结构可以包含至少约50:1、40:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:10或1:100中的任何比率的角质形成细胞和黑素细胞。在一些实施方案中，角质形成细胞与黑素细胞的比率可以为约20:1至约3:1、约20:1至约4:1、约20:1至约5:1、约20:1至约10:1或约20:1至约15:1。
层状结构中的一种类型的细胞可以占层状结构中的总细胞群的至多99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、10％、5％或1％。层状结构中的一种类型的细胞可以占层状结构中的总细胞群的约至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。例如，层状结构中的成纤维细胞可以占层状结构中的总细胞群的约至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
本文在一些实施方案中公开了一种合成皮革。本文在一些实施方案中公开了形成合成皮革的方法。在一些实施方案中，合成皮革可以包含细胞层、至少部分地去细胞化的细胞层、一个或多个层状结构、一个或多个至少部分地去细胞化的层状结构或其任何组合的至少一部分。在一些实施方案中，合成皮革可以由一个或多个层状结构、真皮或表皮形成。在一些实施方案中，合成皮革可以由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个层状结构形成。
在一些实施方案中，合成皮革可以具有各种厚度。在一些实施方案中，合成皮革可以具有类似于天然皮革的厚度。在一些实施方案中，合成皮革可以具有约0.001mm至约100mm的厚度。例如，层状结构可以具有约0.005mm至约50mm、约0.005至约10、约0.01mm至约10mm、约0.1至约5mm、约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约3mm、约0.8mm至约3mm、约0.8mm至约2mm、约0.8mm至约1.8mm、约0.8mm至约1.6mm、约0.9mm至约1.4mm、约1mm至约1.5mm、约1mm至约1.4mm或约1mm至约1.3mm的厚度。在一些实施方案中，合成皮革的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm、10mm、20mm、40mm、60mm、80mm或100mm。在一些实施方案中，合成皮革的厚度可以为至多100mm、50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，合成皮革的厚度可以为约1.2mm。
合成皮革可以具有约0.01mm至约50m的长度。例如，合成皮革可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的长度。例如，合成皮革可以具有约0.02mm至5mm的长度。例如，合成皮革可以具有约0.1mm至0.5mm的长度。例如，合成皮革可以具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些实施方案中，合成皮革的长度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，合成皮革的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
合成皮革可以具有约0.01mm至约50m的宽度。例如，合成皮革可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm或约0.1至约0.5mm的宽度。例如，合成皮革可以具有约0.02mm至5mm的宽度。例如，合成皮革可以具有约0.1mm至0.5mm的宽度。例如，合成皮革可以具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些实施方案中，合成皮革的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些实施方案中，合成皮革的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，合成皮革可以具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含生物制造材料。在一些实施方案中，皮革可以包含生物制造材料。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含本文公开的细胞、经工程化的细胞或组织。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含本文描述的经工程化的细胞。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含区域性质。区域性质可以包括生物制造材料中的一个或多个区域。在一些实施方案中，一个区域可以拥有不同于与其相邻的一个或多个区域的一种或多种性质。在一些实施方案中，可以随区域而变化的性质包括：颜色、透气性、拉伸性、撕裂强度、柔软性、刚性、耐磨性、能够实现加热或冷却的热传递、电磁性、发光性、反射性、抗微生物性、抗真菌性、抗细菌性、强度、香味及其组合。
合成皮革可以进一步包含基底膜替代物。基底膜替代物可以介于两个细胞层之间，例如介于真皮层和表皮层之间。从结构角度和/或从生物化学角度来看，基底膜替代物可以是类似于体内存在的真皮-表皮接合处。从生物化学角度来看，基底膜替代物可以包含基底膜、致密层、透明层和基底下区的组分，诸如胶原IV、胶原VII、层粘连蛋白5、巢蛋白纤连蛋白或其任何组合。
合成皮革中的基底膜替代物可以是尿基底膜(UBM)、肝基底膜(LBM)、羊膜、绒毛膜、同种异体心包、同种异体无细胞真皮、羊膜、华通氏胶或其任何组合。例如，基底膜替代物可以是干燥的无细胞羊膜。在某些情况下，基底膜替代物可以是聚合物，例如纳米聚合物。例如，基底膜替代物可以是纳米纤维羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)，如Bye等人,Journal of Biomaterials and Tissue Engineering第4卷,1–7,2014所描述。
在一些实施方案中，可以将细胞、细胞层、层状结构或合成皮革接种到支架上。在一些实施方案中，支架可以包含基底。在一些实施方案中，支架可以提供一定的坚固性(例如，抗撕裂性)、弹性或两者。在一些实施方案中，合成皮革可以包含支架的一部分或整个支架。在一些实施方案中，合成皮革可以不包含支架。在一些实施方案中，在帮助合成皮革中的层的形成之后，可以从最终的合成皮革产品去除支架。在一些实施方案中，合成皮革中包含的支架可以在一段时间之后降解。在一些实施方案中，支架可以是可降解的、可生物降解的、可生物吸收的、可再吸收的或其任何组合。
在一些实施方案中，支架可以由天然材料、合成材料或其任何组合制成。在一些实施方案中，支架可以包含基底。在一些实施方案中，基底可以包括用于细胞生长的基底。在一些实施方案中，支架可以使用由可生物吸收的合成聚合物制成的网来形成。在一些实施方案中，支架可以通过将尼龙网附着到硅膜上来形成。在一些实施方案中，支架可以包含胶原海绵和硅片的双层结构。在一些实施方案中，支架可以使用去端胶原海绵来形成。在一些实施方案中，支架可以制成片状。在一些实施方案中，支架可以通过匹配具有不同孔大小的胶原海绵来形成。在一些实施方案中，无细胞真皮基质(ADM)可以使用至少部分地去细胞化的纤维蛋白胶、同种异体皮肤或其组合来形成。
在一些实施方案中，支架可以包含天然物质，诸如胶原(例如，胶原基质)、天然黏合剂(例如，纤维蛋白胶、冷胶、动物胶、血白蛋白胶、酪蛋白胶或植物胶，诸如淀粉和糊精胶)。在一些实施方案中，支架可以包含聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、水凝胶或其任何组合。在一些实施方案中，支架可以包含丝。在一些实施方案中，支架可以由丝制成。在一些实施方案中，支架可以包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其组合。在一些实施方案中，支架可以包含纤维。在一些实施方案中，纤维可以是以下的纤维：丝、棉、羊毛、亚麻布、特别是从木材、植物、海藻提取的纤维素、聚酰胺、改性纤维素、聚对苯二甲酰对苯二胺、丙烯酸纤维(例如聚甲基丙烯酸甲酯或聚甲基丙烯酸2-羟乙酯纤维)、聚烯烃纤维(例如聚乙烯或聚丙烯纤维)、玻璃、二氧化硅、芳族聚酰胺、碳(例如，呈石墨形式)、聚(四氟乙烯)、不溶性胶原、聚酯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯腈、壳聚糖、聚氨酯、聚(氨酯-脲)、聚邻苯二甲酸乙二醇酯、以及由诸如上述那些聚合物的掺混物形成的纤维(诸如聚酰胺/聚酯纤维)、或其任何组合。在一些实施方案中，改性纤维素可以包括人造丝、黏胶、乙酸酯、乙酸人造丝或其任何组合。
在一些实施方案中，支架可以包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以包括生物聚合物。在一些实施方案中，生物聚合物可以包括但不限于甲壳质、壳聚糖、弹性蛋白、胶原、角蛋白或聚羟基链烷酸酯。在一些实施方案中，聚合物可以是可生物降解的、生物稳定的或其组合。在一些实施方案中，支架中的聚合物可以是天然聚合物。在一些实施方案中，示例性天然聚合物可以包括多糖，诸如藻酸盐、纤维素、葡聚糖、普鲁兰多糖、聚透明质酸、甲壳质、聚(3-羟基链烷酸酯)、聚(3-羟基辛酸酯)、聚(3-羟基脂肪酸)或其任何组合。在一些实施方案中，聚合物可以包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺6,6(PA 6,6)、聚酰胺11(PA 11)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚呋喃甲酸乙二醇酯(PEF)、聚氨酯(PU)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚(乙醇)酸(PGA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PVOH)、藻酸盐、PEG化纤维蛋白共聚物(P-纤维蛋白)、聚(癸二酸甘油酯)(PGS)、聚(L-乳酸)(PLLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚-D,L-乳酸/聚乙二醇/聚-D,L-乳酸(PDLLA-PEG)、透明质酸(HA)或其任何组合。在一些实施方案中，支架还可以包含天然聚合物的化学衍生物。在一些实施方案中，化学衍生物可以包括诸如烷基、亚烷基等化学基团的取代和/或添加、羟基化、氧化、另一种化学修饰或其任何组合。在一些实施方案中，天然聚合物也可以选自蛋白质，诸如胶原、玉米醇溶蛋白、酪蛋白、明胶、谷蛋白和血清白蛋白。在一些实施方案中，支架中的聚合物可以是可生物降解的合成聚合物，包括聚α-羟基酸，诸如聚L-乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或其共聚物(例如，聚D,L-乳酸共乙醇酸(PLGA))和透明质酸。
在一些实施方案中，支架可以是可生物吸收的。在一些实施方案中，可生物吸收支架可以是无细胞毒性的结构或物质，其能够含有或承载活细胞并使它们在一段时间内保持期望配置。在一些实施方案中，术语“可生物吸收的”可以指主体可以被分解成可以从身体排出或在其中代谢的无毒副产物的任何材料。在一些实施方案中，用于支架的示例性可生物吸收材料可以包括聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(二甲基三亚甲基碳酸酯)、聚(氨基酸)、酪氨酸衍生的聚(碳酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(己内酯)、聚(对二氧环己酮)、聚(酯)、聚(酯-酰胺)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、胶原、明胶、血清白蛋白、蛋白质、多糖、黏多糖、碳水化合物、糖胺聚糖、聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇)、透明质酸、硫酸软骨素、肝素、硫酸皮肤素、多能蛋白聚糖、共聚物、聚合物掺混物、聚合物混合物、含有可生物吸收键的低聚物或其任何组合。
在一些实施方案中，支架可以是网。在一些实施方案中，网可以是可以通过编织或其他方式连接的材料(例如，线、绳、束、纤维或其任何组合)的网络。在一些实施方案中，网可以包含可以是人造的、生物的或其任何组合的材料。在一些实施方案中，网可以具有大小规则或不规则、形状规则或不规则、图案规则或不规则的孔或其任何组合。在一些实施方案中，网可以是二维或三维的。在一些实施方案中，网可以具有直径、间距或其任何组合为约10nm至10cm的孔。在一些实施方案中，孔大小通常可以为约10nm、20nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、12mm、15mm、2cm、2.5cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或10cm。网可以具有约20nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、12mm、15mm、2cm、2.5cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或10cm的直径。在一些实施方案中，形成网的束(例如，纤维、线、网状物等)或材料可以具有直径为约50nm至约10mm的直径。在一些实施方案中，网可以不是支架。
在一些实施方案中，支架可以是细胞增殖的承载结构。在一些实施方案中，支架可以渗透流体、营养物，使得细胞培养介质可以接触细胞层的表面。
在一些实施方案中，支架可以包含三维结构。在一些实施方案中，支架可以是多孔的。在一些实施方案中，细胞可以接种在支架内。在一些实施方案中，支架可以具有各种厚度。在一些实施方案中，支架可以具有可以适合于形成细胞层的厚度。在一些实施方案中，支架可以具有约0.1mm至约10mm，诸如约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约4mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约2mm、至约0.1mm至约1mm、约0.2mm至约1mm、约0.3mm至约1mm、约0.4mm至约1mm、约0.5mm至约1mm、0.3mm至约1.5mm、约0.4mm至约1.2mm、约0.6mm至约1.2mm或约0.7mm至约1.5mm的厚度。在一些实施方案中，支架可以具有约0.5mm至1mm的厚度。在一些实施方案中，支架可以为至少0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm、1mm、2mm、3mm、4mm或5mm厚。在一些实施方案中，支架可以为至多0.5mm、0.8mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm厚。在一些实施方案中，支架可以具有待放置和/或生长在支架上的细胞层的长度和/或宽度。在一些实施方案中，支架可以具有本文描述的细胞层的长度和/或宽度。在一些实施方案中，支架可以包含小于1纳米的孔大小。在一些实施方案中，支架可以包含大于1纳米的孔大小。在一些实施方案中，支架可以包含10μm与900μm之间的孔大小。
在一些实施方案中，细胞层可以不在支架上形成。在一些实施方案中，真皮层可以不在支架(例如，胶原基质)上形成。在一些实施方案中，合成皮革不包含支架。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含一种或多种色素。在一些实施方案中，合成皮革的一个或多个层结构可以被着色。在一些实施方案中，合成皮革中的色素可以是在形成合成皮革的细胞中产生的天然色素。在一些实施方案中，色素可以包括黑素，包括真黑素(例如，棕色真黑素和黑色真黑素)、褐黑素、神经黑素或其任何组合。在一些实施方案中，合成皮革中的色素可以是外源色素，诸如皮革色素染料。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含胶原。在一些实施方案中，胶原可以指至少28种不同胶原类型的家族的任何成员。在一些实施方案中，胶原通过氨基酸的重复三联体-(Gly-X-Y)n-表征，因此胶原中大约三分之一的氨基酸残基可以是甘氨酸。在一些实施方案中，X可以是脯氨酸，并且Y可以是羟脯氨酸。在一些实施方案中，胶原的结构可以具有不同长度的缠绕三单元肽链。在一些实施方案中，合成皮革可以包含来自一个或多个物种的胶原。在一些实施方案中，合成皮革可以包含来自不同动物的胶原。在一些实施方案中，不同的动物可以产生胶原的不同氨基酸组成，这可以导致不同的性质(以及所得皮革的差异)。在一些实施方案中，胶原纤维单体可以由约1050个氨基酸长的α链产生，使得三螺旋呈约300nm长、直径约1.5nm的杆状。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含一种或多种类型的胶原。在一些实施方案中，本文描述的经工程化的细胞可以分泌胶原。在一些实施方案中，合成皮革中包含的胶原可以包括纤维性胶原、非纤维性胶原或其组合。在一些实施方案中，纤维性胶原可以包括I型、II型、III型、V型、XI型胶原或其任何组合。在一些实施方案中，非纤维性胶原可以包括具有间断三螺旋的原纤维相关胶原、短链胶原、基底膜胶原、多重蛋白(Multiplexin)(具有间断的多个三螺旋结构域)、MACIT胶原(具有间断三螺旋的膜相关胶原)或其任何组合。在一些实施方案中，具有间断三螺旋的原纤维相关胶原可以包括IX型、XII型、XIV型、XVI型、XIX型胶原或其任何组合。在一些实施方案中，短链胶原可以包括VIII型、X型胶原或其任何组合。在一些实施方案中，基底膜胶原可以包括IV型胶原。在一些实施方案中，多重蛋白可以包括XV型、XVIII型胶原或其组合。在一些实施方案中，MACIT胶原可以包括XIII型、XVII型胶原或其组合。
在一些实施方案中，胶原可以包含在合成皮革的一个或多个部分中。在一些实施方案中，一个或多个真皮层、一个或多个表皮层或其组合可以包含如本文所公开的胶原。在一些实施方案中，合成皮革中的一个或多个层状结构可以包含如本文所公开的胶原。在一些实施方案中，当在过程期间去除一部分合成皮革时，胶原也可能包含在去除的产品中。
在一些实施方案中，合成皮革中的胶原可以来自一个或多个来源。在一些实施方案中，胶原可以由合成皮革中的胶原产生细胞产生。在一些实施方案中，胶原可以单独添加到皮革中。在一些实施方案中，合成皮革可以包含由胶原产生细胞产生的胶原和单独添加的胶原。
在一些实施方案中，合成皮革中的至少一部分胶原可以由胶原产生细胞产生。在一些实施方案中，形成合成皮革的方法可以包括使用胶原产生细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以包含胶原产生细胞。在一些实施方案中，胶原产生细胞可以包括经工程化的细胞、永生化细胞、上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、平滑肌细胞或其组合。在一些实施方案中，上皮细胞可以包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其任何组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可以包括真皮成纤维细胞。在一些实施方案中，角质形成细胞可以包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其任何组合。在一些实施方案中，合成皮革中的胶原可以由一种或多种类型的胶原产生细胞产生。
在一些实施方案中，可以通过添加浓度为约1mM(毫摩尔)至约5M的抗坏血酸、抗坏血酸类似物、其盐或其任何组合来在细胞中诱导胶原的产生。在一些实施方案中，可以通过添加盐或盐的组合来诱导胶原原纤化，例如，盐或盐的组合可以包括Na3PO4、K3PO4、KC1和NaCl。在一些实施方案中，每种盐的盐浓度可以为约10mM至约5M。
在一些实施方案中，细胞可以经遗传工程化以包含一个胶原的一个基因或多个胶原的多个基因。在一些实施方案中，经遗传工程化的细胞可以包括上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、平滑肌细胞、永生化细胞、具有分子开关的细胞或其组合。在一些实施方案中，上皮细胞可以包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可以包括真皮成纤维细胞。在一些实施方案中，角质形成细胞可以包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原基因可以包括P4HA、P4HB、COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1或其任何组合。在一些实施方案中，胶原基因可以具有改变的启动子，该启动子可以改变(例如增加或减少)胶原基因的表达。在一些实施方案中，胶原基因可以位于经工程化的表达系统的下游。胶原基因可以来自哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、无脊椎动物或其任何组合。
在一些实施方案中，合成皮革可以进一步包含一种或多种添加剂。此类添加剂可以增强商业吸引力(例如，外观、颜色或气味)。在一些实施方案中，示例性添加剂可以包括矿物质、纤维、脂肪酸、氨基酸、蛋白质或其任何组合。在一些实施方案中，添加剂可以是气味剂、染料、着色剂、树脂、聚合物或其任何组合。
在一些实施方案中，添加剂可以包括基质蛋白、蛋白聚糖、抗氧化剂、全氟化碳、激素、生长因子或其任何组合。在一些实施方案中，生长因子可以是蛋白质、多肽或多肽复合物，包括细胞因子(例如，可以由细胞产生并可以影响其自身和/或多种其他邻近或远处细胞的细胞因子)。在一些实施方案中，生长因子可以发育性地或响应于多种生理或环境刺激而影响特定类型的细胞的生长和/或分化。在一些实施方案中，生长因子可以包括激素。在一些实施方案中，生长因子可以包括胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性FGF(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、PDGF-AA、PDGF-AB、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、TGFpi、TGFP3、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8或其任何组合。在一些实施方案中，多肽或分子(例如，愈合剂；酶，诸如基质降解酶、以及基质降解酶抑制剂(例如，TIMP)、抗生素和抗真菌剂)也可以添加到合成皮革中。
在一些实施方案中，添加剂可以包括防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂可以包括抗微生物防腐剂，诸如丙酸钙、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸盐(例如，二氧化硫、硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、抗氧化剂，诸如丁基化羟基茴香醚(BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)。
在一些实施方案中，合成皮革可以包含细胞外基质或结缔组织。在一些实施方案中，合成皮革可以进一步包含胶原、角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其任何组合。
在一些实施方案中，合成皮革可以图案化。例如，合成皮革可以根据选自以下的动物的皮肤图案进行图案化：羚羊、熊、河狸、野牛、野猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、加拿大马鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、猞猁、水貂、驼鹿、公牛、西貒、猪、兔、海豹、绵羊、松鼠、虎、鲸、狼、牦牛、斑马、海龟、蛇、鳄鱼、短吻鳄、恐龙、青蛙、蟾蜍、蝾螈、肋突螈、鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、雉鸡、鸽子、鹌鹑、火鸡、凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鬼头刀鱼、蝠鲼、青枪鱼、橙连鳍鲑、河鲈、狗鱼、狭鳕鱼、鲑鱼、沙丁鱼、鲨鱼、笛鲷、鳎鱼、黄貂鱼、箭鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、碧古鱼及其组合。在一些实施方案中，图案可以是选自以下的幻想动物的皮肤图案：龙、独角兽、狮鹫、塞壬、不死鸟、斯芬克斯、独眼巨人(Cyclops)、萨蒂尔(satyr)、美杜莎、天马、刻耳柏洛斯、堤福俄斯(Typhoeus)、戈尔贡、卡律布狄斯(Charybdis)、恩浦萨(empusa)、奇美拉、弥诺陶洛斯、塞特斯(Cetus)、海德拉(hydra)、半人马、仙女、美人鱼、尼斯湖水怪、大脚野人(Sasquatch)、雷鸟、雪人、卓柏卡布拉(chupacabra)及其组合。
在一些实施方案中，可以将合成皮革制成类似于传统的动物皮肤、生皮或皮革产品并设计参数(例如，细胞类型、添加剂、大小、形状)。在一些实施方案中，合成皮革可以包含细胞层，其特征在于组成可以基本上类似于传统的动物皮肤、生皮或皮革产品。例如，此类层的特征可以在于其组成基本上为约60％至80％水性流体、约14％-35％蛋白质、约1％-25％脂肪。在一些实施方案中，细胞层的角质形成细胞可以对齐排列。在一些实施方案中，角质形成细胞可以通过施加电场来对齐排列。例如，角质形成细胞可以通过施加机械刺激(诸如对基底进行周期性拉伸和松弛)来对齐排列。在一些实施方案中，对齐排列的(例如，电取向的和机械取向的)角质形成细胞可以具有彼此基本上相同的取向，如在许多动物皮肤组织中可见。
在一些实施方案中，本文中的合成皮革可以是皮革制品的至少一部分。例如，合成皮革可以用作皮革制品中的天然皮革的替代品。示例性的皮革制品包括表带、腰带、背带、包装、鞋子、靴子、鞋类、手套、衣服(例如，上装、下装和外套)、行李、包袋(例如，带或不带肩带的手提包)、手拿包、钱包、零钱包、钱夹、钥匙包、信用卡包、笔袋、背包、箱包、皮夹、鞍具、挽具、鞭子、旅行用品(例如，行李箱、手提箱、旅行包、化妆箱或梳妆包)、帆布背包、公文包、文件袋、公文袋、手提公文包、宠物物品(例如，栓带或项圈)、狩猎和捕鱼物品(例如，枪盒、餐具盒或固定武器套)、固定物品(例如，书写板、书皮、相机包、眼镜盒、香烟盒、雪茄盒、珠宝盒或手机套)或运动物品(例如，诸如篮球、足球或橄榄球等球)。例如，皮革制品可以是表带。例如，皮革制品可以是腰带。例如，皮革制品可以是包袋。
在一些实施方案中，合成皮革或其部分也可以用作皮肤移植物，例如用于移植至对象的同种异体移植物或异种移植物。例如，合成皮革、真皮层、表皮层和/或层状结构可以是用于同种异体移植或异种移植的皮肤移植物的来源。在一些实施方案中，可以用经遗传修饰的细胞产生合成皮革、真皮层、表皮层和/或层状结构，以减少移植物受体的免疫排斥。
本文在一些实施方案中公开了用于发育包含分子开关的经工程化的细胞的方法。在一些实施方案中，制造合成皮革可以包括形成人造真皮层、形成人造表皮层、形成组织或其组合。在一些实施方案中，人造真皮层、人造表皮层、组织或其组合可以至少部分地去细胞化。在一些实施方案中，至少部分地去细胞化可以包括与盐溶液接触。在一些实施方案中，方法可以进一步包括鞣制人造真皮层、人造表皮层、人造组织或其任何组合的至少一部分。在一些实施方案中，合成皮革中的细胞，例如组织中的细胞，可以包括具有分子开关的永生化细胞。在某些情况下，方法可以包括将第一细胞层(例如，表皮层)放置在第二细胞层(例如，真皮层)上，从而形成层状结构，并且鞣制层状结构的至少一部分。在一些实施方案中，方法可以进一步包括去除细胞层(例如，表皮层)的至少一部分。在一些实施方案中，细胞层的至少一部分可以在鞣制之前去除。在一些实施方案中，本文的方法可以进一步包括产生分子开关和永生化细胞。
本文在一些实施方案中公开了制备分子开关的方法。在一些实施方案中，分子开关可通过对细胞进行遗传工程化以含有外源DNA来形成，该外源DNA可以被编程以在暴露于刺激之后引发表型。在一些实施方案中，细胞可以是动物细胞，例如牛细胞。在一些实施方案中，细胞可以是成纤维细胞或干细胞。在一些实施方案中，细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，可以通过转染、转导、电穿孔或其任何组合将分子开关引入到细胞中。在一些实施方案中，可以通过电穿孔或通过病毒载体将外源DNA引入到宿主细胞中。在一些实施方案中，分子开关或编码分子开关的多核苷酸可以通过载体引入，其中载体可以是病毒、病毒样颗粒、腺相关病毒载体、脂质体、纳米颗粒、质粒、线性dsDNA及其组合。在一些实施方案中，分子开关可以在基因组中，或者分子开关可以在染色体外，例如质粒。
在一些实施方案中，形成分子开关可以包括向细胞中添加基因、启动子、多核苷酸序列或其任何组合，以驱动对刺激的期望响应。在一些实施方案中，响应可以是增殖表型修饰(例如，永生化)、报道信号(例如，荧光团的表达)、表达变化、转录变化或其任何组合。在一些实施方案中，响应可以是基因表达的增加或减少。在一些实施方案中，刺激可以是环境刺激(例如，温度)。在一些实施方案中，刺激可以是抗生素(例如，四环素)。在一些实施方案中，分子开关可以被配置成使得细胞非贴壁依赖性地生长，贴壁依赖性地生长，或其任何组合。在一些实施方案中，可以添加刺激以引发从非贴壁依赖性增殖到贴壁依赖性增殖的变化，或者可以添加刺激以引发从贴壁依赖性增殖到非贴壁依赖性增殖的变化。在一些实施方案中，刺激可以通过Cre-Lox系统、CRISPR系统或其任何组合引发基因的去除或添加。在一些实施方案中，非贴壁依赖性增殖可以是整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合的表达变化(例如，增加或减少)的结果。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖可以是P53介导的凋亡途径中的基因表达变化的结果。在一些实施方案中，非贴壁依赖性生长可以通过调节整合素信号传导、细胞周期、凋亡途径(例如，将细胞周期基因克隆到分子开关中)或其任何组合来实现。
在一些实施方案中，永生化细胞可以包括任何细胞。在一些实施方案中，永生化细胞可以由成纤维细胞、脂肪组织衍生细胞、脐带细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞或其任何组合制成。在一些实施方案中，永生化细胞可以由任何细胞制成。在一些实施方案中，永生化细胞可以由灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞、兔形动物细胞或其任何组合制成。在一些实施方案中，永生化细胞可以由多能干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或胚胎干细胞制成。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有与本文描述的任何细胞类型相似的特性。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有突变。在一些实施方案中，永生化细胞可以通过一个或多个外源基因的转染、转导、电穿孔或其任何组合来制备。在一些实施方案中，载体可以携带外源基因。在一些实施方案中，载体可以是病毒、病毒样颗粒、腺相关病毒载体、脂质体、纳米颗粒、质粒、线性dsDNA及其组合。在一些实施方案中，载体可以包括质粒。在一些实施方案中，外源基因可以包括hTERT、TERT、Bmi1、CcnD1、Cdk4的突变体、Cdk4、TAg(SV40大T)、SV40、c-myc、H-ras、Ela、c-mMycERTAM、E6、E7、HER-2、SRC、EGFR、Abl、Atk02、Aml1、Axl、Bcl、Dbl、EGFR、ERBB、Ets-1、Fms、Fos、Fps、Gli、Gsp、Her2、Hox11、Hst、Il-3、Int-2、Jun、Kit、KS3、K-SAM、Lbc、Lck、L-myc、Lyl-1、Lyt-10、Mas、MDM-2、Mll、Mos、Myb、Neu、N-Myc、Ost、Pax-5、Pim-1、PRAD-1、Ras-K、Ras-N、Ret、Ros、Ski、Sis、Set、Src、Tal1、Tan1、Tiam1、Tsc2、Trk或其任何组合。在一些实施方案中，永生化可以来自外源基因，其可以是包含一个或多个基因的融合基因。外源基因可以整合到染色体中或在染色体外。在一些实施方案中，永生化可以来自能够诱导永生化的蛋白质产物或其生物活性片段。在一些实施方案中，永生化细胞可以在细胞分裂之后去除外源基因(例如，通过Cre-LoxP系统或CRISPR系统)。在一些实施方案中，外源基因可以来自哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、无脊椎动物、病毒、细菌或其任何组合。在一些实施方案中，永生化可以来自随机突变或多个突变。在一些实施方案中，突变可以通过UV诱变、化学诱变或其任何组合生成。在某些情况下，永生化可以来自靶向突变，例如，可以通过CRISPR系统进行靶向突变。在一些实施方案中，突变可以在细胞周期基因、癌基因、代谢基因或其任何组合中。在一些实施方案中，永生化可以来自癌基因、细胞周期基因、基因、启动子区、基因内区、基因间区或其任何组合中的突变。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有癌基因或参与细胞增殖调节的基因的增加或减少的表达。在一些实施方案中，永生化细胞可以包含通过竞争性抑制起作用的蛋白质。在一些实施方案中，竞争性抑制可以包括改变肿瘤抑制基因、细胞周期基因或其组合的活性。在一些实施方案中，海弗利克极限或海弗利克次数可以包括原代细胞能够生长到的有限细胞倍增次数。在一些实施方案中，永生化细胞能够生长超过海弗利克极限。在一些实施方案中，永生化细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂、约60次细胞分裂、约70次细胞分裂、约80次细胞分裂、约90次细胞分裂、约100次细胞分裂、约200次细胞分裂、约300次细胞分裂、约400次细胞分裂、约500次细胞分裂、约600次细胞分裂、约700次细胞分裂、约800次细胞分裂、约900次细胞分裂、约1000次细胞分裂、约10,000次细胞分裂或约100,000次细胞分裂。在一些实施方案中，永生化细胞系能够生长到足以生成每年至少1百万平方英尺的合成皮革。在一些实施方案中，永生化细胞可以具有分子开关。在一些实施方案中，永生化细胞可以是条件性永生化细胞。条件性永生化细胞可以在某种环境刺激下展现永生化细胞表型或在不同的环境刺激下展现分化细胞表型。
细胞层可以通过制备包含一种或多种类型的细胞的多个多细胞体并排列此类多细胞体以形成细胞层来形成。例如，细胞层可以通过相邻地排列多个多细胞体来形成，其中多个多细胞体可以融合以形成平面层。在一些实施方案中，细胞可以三维地生长。在一些实施方案中，细胞可以在悬浮液中生长。
在一些实施方案中，形成细胞层可以包括使用支架。在一些实施方案中，细胞层可以通过将多个多细胞体排列在支架上来形成。在一些实施方案中，形成步骤可以包括将多细胞体排列或放置在承载基底上，该承载基底允许多细胞体融合以形成层(例如，基本上平面的层)。在一些实施方案中，多细胞体或层可以彼此水平和/或竖直相邻地排列。在一些实施方案中，形成细胞层可以不需要支架。
在一些实施方案中，细胞层可以通过将细胞嵌入在培养基或凝胶中来形成。在一些实施方案中，真皮层可以使用胶原I或纤维蛋白凝胶中嵌入的成纤维细胞来形成。在一些实施方案中，也可以使用其他类型的培养基。在一些实施方案中，培养基可以促进成纤维细胞分泌足够量的细胞外基质，以能够在不需要胶原凝胶的情况下延长表皮的维持。
在一些实施方案中，可以存在制备具有本文描述的特性的多细胞体的多种方法，例如包含本文公开的一个或多个经工程化的细胞。在一些实施方案中，多细胞体可以由含有多个细胞制成，例如由具有期望的细胞密度和黏度的细胞糊制成。在一些实施方案中，多细胞体可以包含经工程化的细胞。在另外的情况下，可以将细胞糊成形为期望的形状，并通过成熟(例如，温育)形成多细胞体。在一些实施方案中，细长多细胞体可以通过将包含多个细胞的细胞糊成形为细长形状(例如，圆柱体)来产生。在另外的情况下，可以在受控环境中温育细胞糊，以允许细胞彼此黏附和/或黏合，从而形成细长多细胞体。在一些实施方案中，多细胞体可以通过在以三维形状保持细胞糊的装置中使包含多个活细胞的细胞糊成形来产生。在一些实施方案中，细胞糊可以在受控环境中温育，同时它可以保持三维形状足够长的时间，以产生具有足够黏合力以在平坦表面上支撑自身的主体，如本文所述。
在一些实施方案中，可以通过以下提供细胞糊：(A)将(一种或多种细胞类型的)细胞或细胞团块和细胞培养介质(例如，以预定比率)混合以得到细胞悬浮液，并且(B)压缩细胞悬浮液以产生具有期望细胞密度和黏度的细胞糊。压缩可以通过多种方法来实现，诸如通过浓缩由细胞培养物得到的特定细胞悬浮液，以获得细胞糊所需的期望细胞浓度(密度)、黏度和稠度。在一些实施方案中，可以将来自细胞培养物的相对稀释的细胞悬浮液离心一段确定的时间，以获得允许在模具中成形的沉淀中的细胞浓度。切向流过滤(“TFF”)可以是浓缩或压缩细胞的另一种合适的方法。在一些实施方案中，化合物可以与细胞悬浮液组合，以提供所需的挤压性质。合适的化合物包括胶原、水凝胶、基质胶、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶和纤维蛋白原。还可以通过将细胞沉淀重悬于含有ECM组分(或ECM组分的衍生物)的一种或多种生理上可接受的缓冲液中来包含一种或多种ECM组分(或ECM组分的衍生物)，并且将所得细胞悬浮液再次离心以形成细胞糊。
在一些实施方案中，可以使用各种方法使细胞糊成形。例如，在一个特定实施方案中，可以手工模制或压制(例如，在浓缩/压缩之后)细胞糊，以获得期望形状。作为另一个实例，细胞糊可以被吸收(例如，抽吸)到预成型的仪器中，诸如微量移液管(例如，毛细移液管)，其使细胞糊成形以符合仪器的内表面。在一些实施方案中，微量移液管(例如，毛细移液管)的横截面形状可以是圆形、正方形、矩形、三角形或其他非圆形横截面形状。在一些实施方案中，细胞糊可以通过将其沉积到预成型的模具中而成形，该模具为诸如塑料模具、金属模具或凝胶模具。在一些实施方案中，可以使用离心浇铸或连续浇铸使细胞糊成形。
在一些实施方案中，细胞糊可以进一步成熟。在一些实施方案中，细胞糊可以在约37℃下温育一段时间(这可以取决于细胞类型)以促进黏附和/或黏合。可替代地或另外地，细胞糊可以在存在含有因子和/或离子的细胞培养介质的情况下保存，以促进黏附和/或黏合。
可以将多细胞体排列在承载基底上，以产生期望的三维结构(例如，基本上平面的层)。例如，多细胞体可以被手工放置成彼此接触，通过从移液管、喷嘴或针挤出而被沉积到位，或被诸如生物制造机等自动机器放置接触。
承载基底能够渗透流体、气体和营养物，并允许细胞培养介质在排列和随后的融合期间接触多细胞体和/或层的所有表面。在一些实施方案中，承载基底可以由天然生物材料制成，诸如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和其他细胞外基质。在一些实施方案中，承载基底可以由合成生物材料制成，诸如羟基磷灰石、藻酸盐、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸及其共聚物。在一些实施方案中，承载基底可以是固体、半固体或固体和半固体承载元件的组合。在一些实施方案中，承载基底可以是平面的，以便于平面层的产生。在一些实施方案中，可以将承载基底升高或抬高到非渗透性表面，诸如细胞培养环境(例如，皮氏培养皿(Petridish)、细胞培养瓶等)或生物反应器的一部分之上。可渗透的、升高的承载基底可以有助于防止过早的细胞死亡，有助于增强细胞生长，并促进多细胞体融合以形成层。
一旦层的组装可以完成，可以将组织培养介质倾倒在构建体的顶部。在一些实施方案中，组织培养介质可以进入多细胞体之间的空间，以承载多细胞体中的细胞。在一些实施方案中，可以允许三维构建体中的多细胞体彼此融合，以产生用于形成合成皮革的层(例如，基本上平面的层)。“融合”或“融合的”可以意指邻接的多细胞体的细胞直接通过细胞表面蛋白之间的相互作用或间接通过细胞与ECM组分或ECM组分的衍生物的相互作用而彼此黏附和/或黏合。在一些实施方案中，融合层可以完全融合，并且多细胞体可以变得基本上邻接。可替代地，融合层可以基本上融合或部分地融合，并且多细胞体的细胞已经黏附和/或黏合到允许完整地移动和操纵层所必需的程度。
多细胞体可以在细胞培养环境(例如，皮氏培养皿、细胞培养瓶或生物反应器)中融合以形成层。在一些实施方案中，多细胞体在具有适合于促进多细胞体中包含的细胞类型的生长的条件的环境中融合以形成层。在一些实施方案中，融合发生在约15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟以及其中的增量内。在其他情况下，融合发生在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48小时以及其中的增量内。在又其他情况下，融合发生在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12和14天以及其中的增量内。在另外的情况下，融合发生在约2小时至约24小时内。与融合时间相关的因素可以包括细胞类型、细胞类型比率、培养条件和诸如生长因子等添加剂的存在。
一旦层的融合可以完成，层和承载基底可以分离。在一些实施方案中，当层的融合可以基本上完成或部分地完成时，层和承载基底可以分离，但是层的细胞可以彼此黏附、黏合或其任何组合到允许移动、操纵和堆叠层而不将其分开所必需的程度。可以经由熔化、溶解或降解承载基底的标准程序来分离层和承载基底。在一些实施方案中，承载基底可以例如通过温度变化、光或不会不利地影响层的其他刺激被溶解。在某些情况下，承载基底可以由柔性材料制成并从层上剥离。分离的层可以转移到生物反应器以进行进一步成熟。在一些实施方案中，在并入到经工程化的动物皮肤、生皮或皮革产品中之后，分离的层成熟并进一步融合。
可替代地，层和承载基底可以不分离。承载基底在组装的经工程化的动物皮肤、生皮或皮革产品的包装、冷冻、销售或消费之前降解或生物降解。
细胞层可以在一段时间内形成。在一些实施方案中，细胞层，例如表皮层或真皮层，可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、120、300天内形成。在一些实施方案中，真皮层可以在约1至15天，例如5至10天或10至12天内形成。在一些实施方案中，真皮层可以在约5至25天，例如14至15天形成。
本公开内容提供了用于制造具有改进的屏障功能的合成皮革的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括提供角质形成细胞和包含抗坏血酸和亚油酸的培养介质；和在一定条件下培养角质形成细胞，使得可以形成具有改善的屏障功能的合成皮革。在一些实施方案中，培养条件包括在约50至95％湿度，例如约75％湿度下培养。在一些实施方案中，抗坏血酸可以以约10至100微克/ml的浓度提供。在又另外的情况下，亚油酸可以以约5至80微摩尔的浓度提供。本公开内容可以不限于由特定角质形成细胞来源形成的合成皮革。事实上，合成皮革可以由多种原代和永生角质形成细胞形成，包括但不限于近二倍体永生化角质形成细胞(NIKS)细胞。在一些实施方案中，合成皮革可以由包含分子开关的经工程化的细胞形成。在一些实施方案中，经工程化的细胞可以是永生细胞(例如，永生化牛成纤维细胞)。在又另外的情况下，角质形成细胞表达外源野生型或变体Kruppel样因子(GKLF)。在又另外的情况下，角质形成细胞可以衍生自两种不同的来源。在其他情况下，合成皮革具有约40至约240pF的表面电容。在一些优选的情况下，皮肤等同物具有约80至约120pF的表面电容。在其他优选的情况下，皮肤等同物中的神经酰胺5、6和7的含量可以为总神经酰胺含量的约20至约50％。在又其他优选的情况下，皮肤等同物中的神经酰胺2的含量可以为总神经酰胺含量的约10至约40％。在又另外的情况下，本公开内容提供了通过刚刚描述的方法制备的皮肤等同物。
可以排列多个细胞层以形成层结构，从而产生本文描述的合成皮革。在一些实施方案中，真皮层和表皮层可以分别形成，并且通过将表皮层放置在真皮层的顶部来组装(例如，当表皮层和真皮层都可以完全地形成时)。在一些实施方案中，表皮层可以生长在真皮层的顶部。在某些情况下，基底膜或基底膜替代物可以放置在真皮层和表皮层之间。例如，可以将细胞层手动放置成彼此接触，或者通过自动的计算机辅助机器，诸如生物制造机，根据计算机脚本将细胞层沉积到位。
在组装多个细胞层之前，可以进行一个或多个质量控制步骤。例如，在放置在真皮上之前(例如，0天)，可以在表皮上进行跨上皮电阻(TEER)测量，随后进行组织学分析(例如，最少3～5天)。使用本文提供的方法，不正确地形成的层状结构或全厚度皮肤等同物的风险可以很低。
多个细胞层可以以各种方式组装。在一些实施方案中，表皮层和真皮层(有或没有基底膜替代物)可以放置在支架(例如，丝)上，例如以实现天然皮革的厚度和拉伸强度。在一些实施方案中，表皮层和多个真皮层(有或没有基底膜替代物)可以在不使用支架的情况下组装。此类组装可以获得类似于天然皮革的厚度和拉伸强度。在一些实施方案中，表皮层和多个真皮层(有或没有基底膜替代物)可以放置在支架(例如，丝)上，以获得类似于天然皮革的厚度和拉伸强度。在一些实施方案中，皮革具有至少约10、20、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250或300kgf/cm2的拉伸强度。在一些实施方案中，皮革具有小于约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250或300kgf/cm2的拉伸强度。在某些实施方案中，拉伸强度测试可以根据美国试验与材料协会(American Society for Testing andMaterials，ASTM)标准进行。
可以将多个细胞层组装以形成合成皮革(例如，全厚度皮肤等同物)。合成皮革可以包括顶部部分、中间部分和底部部分。顶部部分可以包含表皮层。例如，顶部部分可以是单层表皮层。中间部分可以包含基底膜替代物。在一些实施方案中，中间部分不具有基底膜替代物。例如，中间部分可以具有可忽略厚度的层。底部部分可以具有一个或多个真皮层。在一些实施方案中，底部部分具有放置在支架(例如，丝)上的单个真皮层。在一些实施方案中，底部部分具有多个真皮层(例如，多达5层)而没有任何支架。在一些实施方案中，底部部分具有多个相互堆叠并放置在支架(例如，丝)上的真皮层。
表皮层和真皮层之间的黏附性可以足够强以抵抗层分裂。在一些实施方案中，细胞层可以通过黏附到支架上来组装。天然或合成黏合剂可以用于组装。天然黏合剂可以是纤维蛋白胶、冷胶、动物胶(例如，骨胶、鱼胶、皮胶、蹄胶、兔皮胶、肉胶)、血白蛋白胶、酪蛋白胶、植物胶(例如，淀粉、糊精胶、加拿大香脂、松香基胶、cocconia、阿拉伯胶、邮票胶、胶乳、图书馆浆糊、甲基纤维素、黏液、间苯二酚树脂或脲醛树脂)或其任何组合。合成黏合剂可以是丙烯腈、氰基丙烯酸酯(例如，正丁基-2-氰基丙烯酸酯胶)、丙烯酸、间苯二酚胶、环氧树脂、环氧油灰、乙烯-乙酸乙烯酯、酚醛树脂、聚酰胺、聚酯树脂、聚乙烯、聚丙烯、聚硫化物、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯(包括白胶(例如，Elmer’s胶)和黄木工胶(脂肪族树脂))、聚乙烯醇、聚氯乙烯(PVC)、聚氯乙烯乳液(PVCE)、聚乙烯吡咯烷酮、橡胶胶水、硅氧烷和苯乙烯丙烯酸共聚物。例如，可以使用纤维蛋白胶进行组装。例如，可以使用正丁基-2-氰基丙烯酸酯胶进行组装。
在一些实施方案中，可以堆叠细胞层(例如，基本上平面的层)以形成合成皮革。细胞层可以具有由多细胞体的放置、图案或取向限定的取向。在一些实施方案中，每一层可以相对于承载基底和/或一个或多个其他层以特定取向堆叠。例如，一个或多个层可以以某一取向进行堆叠，该取向包括相对于承载基底和/或下面的层的旋转，其中旋转可以介于0.1和180度之间，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175和180度或其中的增量。在其他情况下，所有层可以基本上相似地取向。
一旦层的堆叠可以完成，三维构建体中的层可以被允许彼此融合以产生合成皮革。在一些实施方案中，层在细胞培养环境(例如，皮氏培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中融合。在一些实施方案中，融合发生在约15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟以及其中的增量内。在其他情况下，融合发生在1至48小时之间内，例如在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48小时以及其中的增量内。例如，融合可以发生在约2小时至约24小时内。
在一些实施方案中，细胞或细胞层可以在各种细胞培养条件下培养。在一些实施方案中，细胞和细胞层可以在培养基、生物反应器、温育箱或其任何组合中温育。在一些实施方案中，培养基可以包括多种培养基。在一些实施方案中，可以在体外培养细胞或细胞层。例如，可以在体外培养真皮层和/或表皮层。可替代地，可以在体内培养细胞或细胞层。例如，可以在体内培养真皮层和/或表皮层。在一些实施方案中，培养基可以包括如本文所公开的培养介质。在一些实施方案中，培养介质可以包括生长培养基、组织形成培养基或其组合，如本文所公开。在一些实施方案中，细胞、细胞层、其部分或其任何组合可以在培养基中培养。在一些实施方案中，培养基可以包含补充剂。在一些实施方案中，补充剂可以是天然补充剂、合成补充剂或其组合。在一些实施方案中，补充剂可以是添加剂。在一些实施方案中，补充剂中的一种或多种可以诱导细胞外基质自经工程化的细胞的产生和组装，从而增强合成皮革的天然外观。在一些实施方案中，补充剂可以包含ECM组分，诸如胶原、纤维蛋白、生长因子、小分子、大分子、硫酸盐、角叉菜胶或其任何组合。在一些实施方案中，小分子可以包括抗坏血酸。在一些实施方案中，大分子可以包括葡聚糖。在一些实施方案中，细胞可以在细胞培养介质中生长。在一些实施方案中，细胞培养介质可以包括生长培养基、组织形成培养基或其组合。在一些实施方案中，培养介质可以包括杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、RPMI-1640、伊格尔氏最小必需培养基、哈姆氏营养混合物、伊斯科氏改良培养基、杜尔贝科氏培养基或其任何组合。在一些实施方案中，可以向培养介质中添加补充剂，诸如盐、缓冲试剂、酚红、HEPES、氨基酸、碳水化合物、脂质、蛋白质、肽、脂肪酸、维生素、元素、培养基补充剂、抗生素、血清、血清替代物或其任何组合。在一些实施方案中，培养基可以包含约0％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％的血清、血清替代物或其组合。在一些实施方案中，培养基可以包含约0.1％至约10％、约10％至约20％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％的血清、血清替代物或其组合。
在一些实施方案中，培养基可以包括生长培养基、组织形成培养基或其组合。在一些实施方案中，在接种之后，可以使转染或转导的分离的细胞与组织形成培养基接触。在一些实施方案中，生长培养基可以包含生长因子、缓冲液、盐、糖、氨基酸、脂质、矿物质、ECM蛋白或其组合。在一些实施方案中，盐可以包括无机盐。在一些实施方案中，无机盐可以包括氯化钙、硝酸铁、硫酸镁(无水)、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸二氢钠(无水)或其任何组合。在一些实施方案中，氨基酸可以包括L-精氨酸·HCl、L-胱氨酸·2HCl、甘氨酸、L-组氨酸·HCl·H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸·HCl、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸·2Na·2H2O、L-缬氨酸、L-谷氨酰胺、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，维生素可以包括氯化胆碱、叶酸、myo-肌醇、烟酰胺、D-泛酸(半钙)、吡哆醛·HCl、吡哆醇·HCl、核黄素、硫胺素·HCl、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，糖可以包括D-葡萄糖、其立体异构体、其盐或其任何组合。在一些实施方案中，pH指示剂可以包括酚红·Na、丙酮酸·Na、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，生长培养基可以包含氨基酸、维生素、无机盐、胎牛血清、抗生素、抗真菌剂或其任何组合。在一些实施方案中，组织形成培养基可以包含生长因子、缓冲液、盐、糖、氨基酸、脂质、矿物质、ECM蛋白、人血小板裂解液、酸式柠檬酸右旋糖、肝素、抗坏血酸、TGF-β1、normocin、血清、血清替代物、非必需氨基酸、抗生素、抗真菌剂或其任何组合。在一些实施方案中，组织形成培养基进一步可以包括血清、血清替代物或其组合。在一些实施方案中，氨基酸可以包括甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H2O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐-H2O、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，维生素可以包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、i-肌醇、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，无机盐可以包括氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，培养基进一步可以包括D-葡萄糖(右旋糖)、次黄嘌呤Na、亚油酸、硫辛酸、酚红、腐胺2HCl、丙酮酸钠、胸苷、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。在一些实施方案中，血清替代物可以基本上不含动物衍生产品，可以无异种成分，或其组合。在一些实施方案中，血清替代物可以包括生长因子、胰岛素转铁蛋白、细胞因子、必需氨基酸、非必需氨基酸、蛋白质、细胞外基质蛋白(ECM)、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、细胞黏附肽、RGD、细胞外基质片段、激素、胶原、白蛋白、脂质、糖蛋白、蛋白质片段或其任何组合。在一些实施方案中，血清可以包括胎牛血清(FBS)、马血清、胎小牛血清或其任何组合。在一些实施方案中，培养基不包含TGFβ。在一些实施方案中，在接种之后，可以使转染或转导的分离的细胞与组织形成培养基接触。在一些实施方案中，使细胞与组织形成培养基接触可以至少部分地使得细胞分化或形成另一种细胞或组织类型。在一些实施方案中，当存在于组织形成培养基中时，相对于未与组织形成培养基接触的其他方面可比较的转染或转导的分离的细胞，转染或转导的分离的细胞(a)至少部分地增加胶原的产生，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以在与组织形成培养基接触时至少部分地分化。在一些实施方案中，在接种之后，可以使转染或转导的分离的细胞与包含L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)、其盐、其生物活性片段或这些中的任一者的组合的培养基接触。在一些实施方案中，当存在于包含AA2P、其盐、TGFB1、其生物活性片段或组合的培养基中时，相对于缺乏AA2P、其盐、TGFB1、其生物活性片段或其组合的其他方面可比较的培养基，转染或转导的分离的细胞(a)至少部分地增加胶原的产生，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者。在一些实施方案中，转染或转导的分离的细胞可以在与培养基接触时至少部分地分化。
在一些实施方案中，刺激可以包括碳水化合物、脂质、核酸、蛋白质、抗生素、有机化学品、无机化学品、人造化学品、代谢物或其任何组合的存在、缺失或水平。在一些实施方案中，可以用一种或多种刺激培养细胞、细胞层或其组合。在一些实施方案中，可以在增殖之前、增殖期间、增殖之后或其任何组合添加刺激。
在一些实施方案中，生长单个细胞可以在摇瓶、旋转瓶或其任何组合中进行。在一些实施方案中，组织的生长可以包括在摇动或不摇动的情况下生长。在一些实施方案中，组织的生长可以包括首先在高速摇动的情况下生长，然后在很少摇动或不摇动的情况下生长。在一些实施方案中，组织的生长可以包括首先在很少摇动或不摇动的情况下生长，然后在高速摇动的情况下生长。在一些实施方案中，很少摇动或不摇动可以为至多80、70、60、50、40、35、30、25、20、15、10、5、3、2、1或0转/分(RPM)。在一些实施方案中，很少摇动或不摇动可以持续超过约6小时、12小时、18小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。在一些实施方案中，很少摇动或不摇动可以持续少于约6小时、12小时、18小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。在一些实施方案中，很少摇动或不摇动可以持续超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20代。在一些实施方案中，很少摇动或不摇动可以持续少于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20代。在一些实施方案中，高速摇动可以为至少60、80、100、120、140、160、180、200、220或240RPM。在一些实施方案中，高速摇动可以在180-240、200-240、160-220、60-160、60-140、60-120、60-100、60-90、60-80、80-160、80-140、80-120、80-100或80-90RPM之间。在一些实施方案中，高速摇动可以持续超过约2、3、4、5、7、10、15或20代。在一些实施方案中，高速摇动可以持续少于约2、3、4、5、7、10、15或20代。在一些实施方案中，摇动可以以初始速度进行，然后增加到更高的速度。在一些实施方案中，摇动可以以初始速度进行，然后降低到更低的速度。在一些实施方案中，摇动可以是匀速。
在一些实施方案中，可以通过人工细胞计数、自动细胞计数、间接细胞计数或其任何组合来确定经工程化的细胞的增殖。在一些实施方案中，细胞计数可以包括计数室、集落形成单位计数、电阻、流式细胞术、图像分析、体视学细胞、分光光度法、阻抗微生物学、自动细胞计数、显微镜检查、库尔特计数器、自动图像细胞计数器、液滴数字聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR、代谢测量或其任何组合。
在一些实施方案中，非贴壁依赖性细胞可能能够非贴壁依赖性地生长至少1、2、3、4、5、7、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、34、35、37或40次细胞分裂。非贴壁依赖性细胞可能能够贴壁依赖地生长至少1、2、3、4、5、7、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、34、35、37或40次细胞分裂。细胞分裂在本文中也可以称为传代。在一些实施方案中，非贴壁依赖性细胞可能能够无限期地非贴壁依赖性地生长。在一些实施方案中，贴壁依赖细胞可能能够无限期地贴壁依赖性地生长。在一些实施方案中，非贴壁依赖性细胞可能能够非贴壁依赖性地生长至少1代、5代或至少35代。在一些实施方案中，贴壁依赖细胞可能能够贴壁依赖性地生长至少1代、5代或至少35代。在一些实施方案中，细胞可以在设定量的分裂之后被编程，以从非贴壁依赖性增殖转变为贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，细胞可以在设定量的分裂之后被编程，以从贴壁依赖性增殖转变为非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，刺激可以控制编程的开关。在一些实施方案中，刺激可以不控制编程的开关。例如，非贴壁依赖性增殖的细胞可以经历约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50轮分裂并转变为贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖的细胞可以经历约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50轮分裂并转变为非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，非贴壁依赖性细胞可以至少部分地不能贴壁生长。在一些实施方案中，贴壁依赖性细胞可以至少部分地不能在悬浮液中生长。在一些实施方案中，至少30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的非贴壁依赖性细胞可能不能贴壁生长。在一些实施方案中，至少30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的贴壁依赖性细胞可能不能在悬浮液中生长。
在一些实施方案中，细胞可以接种到支架上。在一些实施方案中，细胞可以不接种在支架上。在一些实施方案中，细胞可以以约100个细胞/cm2至约10,000,000个细胞/cm2、1,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2、100,000个细胞/cm2至约10,000,000个细胞/cm2、10,000个细胞/cm2至约100,000个细胞/cm2、50,000个细胞/cm2至约200,000个细胞/cm2、100,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2、100,000个细胞/cm2至约500,000个细胞/cm2或约100,000个细胞/cm2至约2,500,000个细胞/cm2的密度接种。在一些实施方案中，细胞可以以超过约10、100、10,000、50,000、75,000、90,000、100,000、125,000、150,000、175,000、200,000、1,000,000或10,000,000个细胞/cm2的密度接种。在一些实施方案中，细胞可以以小于约10、100、10,000、50,000、75,000、90,000、100,000、125,000、150,000、175,000、200,000、1,000,000或10,000,000个细胞/cm2的密度接种。在一些实施方案中，细胞可以接种在支架的一侧上。在一些实施方案中，支架可以是基底。在一些实施方案中，细胞可以接种在支架的多于一侧上，例如接种支架的顶部和底部。支架可以连续地或同时地接种。在一些实施方案中，可以在不翻转支架的情况下在支架的多于一侧上接种支架。例如，可以在不翻转支架的情况下接种支架的第二侧。在一些实施方案中，可以在一侧上接种支架，然后可以翻转支架并可以接种支架的另一侧。在一些实施方案中，接种细胞可以包含生物制造材料。在一些实施方案中，生物制造材料可以包含本文公开的细胞、经工程化的细胞或组织。
在一些实施方案中，本文描述的细胞和细胞层可以在非贴壁依赖性条件、贴壁依赖性条件或其任何组合下培养。在一些实施方案中，非贴壁依赖性增殖、贴壁依赖性增殖或两者可发生在器皿、容器或其组合中。在一些实施方案中，可以针对可能未接受刺激、可能不含开关或其任何组合的细胞来测量非贴壁依赖性或贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，可以通过人工细胞计数、自动细胞计数、间接细胞计数或其任何组合来确定贴壁依赖性增殖或非贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，与至少部分地非贴壁依赖性增殖相比，至少部分地贴壁依赖性增殖可以消耗更多、相同或更少的营养物。在一些实施方案中，器皿或容器可以是玻璃、金属、塑料或其任何组合。在一些实施方案中，容器或器皿可以含有涂层，该涂层使得细胞黏附到器皿或容器的至少一部分。在一些实施方案中，涂层可以是聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、胶原、牛纤连蛋白、明胶、细胞外基质、层粘连蛋白、巢蛋白、HSPG、牛明胶或其任何组合。在一些实施方案中，器皿或容器可以容纳至少约0.5mL、1mL、5mL、25mL、100mL、250mL、500mL、1000mL、2L、5L、10L、100L、1000L、5000L或约10,000L的总体积。在一些实施方案中，在非贴壁依赖性增殖条件下，细胞能够生长至约1e1个细胞/mL、1e2个细胞/mL、1e3个细胞/mL、1e4个细胞/mL、1e5个细胞/mL、1e6个细胞/mL、1e7个细胞/mL、1e8个细胞/mL、1e9个细胞/mL或1e10个细胞/mL。在一些实施方案中，非贴壁依赖性增殖的细胞能够生长至小于约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融汇度。在一些实施方案中，非贴壁依赖性增殖的细胞能够生长至超过约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融汇度。在一些实施方案中，非贴壁依赖性增殖的细胞可以在悬浮液中生长。在贴壁依赖性增殖条件下，细胞能够生长至约1e1个细胞/mL、1e2个细胞/mL、1e3个细胞/mL、1e4个细胞/mL、1e5个细胞/mL、1e6个细胞/mL、1e7个细胞/mL、1e8个细胞/mL、1e9个细胞/mL或1e10个细胞/mL。在一些实施方案中，当非贴壁依赖性增殖的细胞达到约1e5个细胞/mL、1e6个细胞/mL、1e7个细胞/mL、1e8个细胞/mL、1e9个细胞/mL或1e10个细胞/mL的密度时，细胞可以转变为贴壁依赖性增殖。在一些实施方案中，当贴壁依赖性增殖的细胞达到约1e5个细胞/mL、1e6个细胞/mL、1e7个细胞/mL、1e8个细胞/mL、1e9个细胞/mL或1e10个细胞/mL的密度时，细胞可以转变为贴壁依赖性增殖。在贴壁依赖性增殖条件下，细胞能够生长至基底表面积的密度为约50,000个细胞/cm2至约9,000,000个细胞/cm2、200,000个细胞/cm2至约4,500,000个细胞/cm2、250,000个细胞/cm2至约4,000,000个细胞/cm2、500,000个细胞/cm2至约2,000,000个细胞/cm2或1,000,000个细胞/cm2至约6,000,000个细胞/cm2。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖的细胞能够生长至超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融汇度。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖的细胞能够生长至小于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融汇度。贴壁依赖性增殖条件下的细胞可以至少部分地在支架之上、之中或周围生长。在一些实施方案中，贴壁依赖性增殖的细胞可以至少部分地在没有支架的情况下生长。
在一些实施方案中，本文公开的细胞和结构可以以某一空气湿度培养。例如，细胞层(例如，经工程化的细胞、真皮层或表皮层)可以在约20％至约100％的湿度下培养。例如，湿度可为约40％至约100％、约50％至约95％、约45％至约90％、约55％至约95％、约60％至约90％、约70％至约80％、约71％至约79％、约72％至约78％、约73％至约77％、约74％至约76％、约60％至约70％、约65％至约75％、约70％至约80％、约75％至约85％、约80％至约90％、约85％至约95％、或约90％至约100％、约40％至约60％、约45％至约55％、约46％至约54％、约47％至约53％、约48％至约52％、约48％至约53％、约49％至约54％或约47％至约51％。
在一些实施方案中，细胞和组织(例如，具有开关的永生化细胞)可以在生物反应器或支持生物活性环境的装置中生长。装置或生物反应器可以包括细胞堆叠(cellstack)、滚瓶、摇瓶、烧瓶、搅拌罐悬浮液生物反应器、高细胞密度固定床灌注生物反应器、温育箱或其任何组合。在一些实施方案中，生物反应器可以是来自细胞培养物的产生的可扩展的模块化系统，并且可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或超过50个容器。在一些实施方案中，生物反应器可以是可扩展系统、可堆叠系统、模块化系统或其任何组合。此外，在一些实施方案中，生物反应器可以被配置成允许容易、快速的扩展。此外，生物反应器可以包括被配置成使容器晃动或倾斜的运动控制系统，这可以在腔室内产生动态流动，这可以增加容器内的细胞培养物的活力。在一些实施方案中，生物反应器可以包括细胞可以在其中生长的容器、温度调节系统、被配置成调节容器内的气体浓度的气体入口/出口系统、被配置成混合容器内的生长培养基的搅拌器、用于流体输送的任何数量的入口和出口端口。在一些实施方案中，细胞培养物可以悬浮在生物反应器的容器中的生长培养基中。在一些实施方案中，生物反应器含有输入命令的计算机系统。在一些实施方案中，用户可以编程设置，该设置可以规定搅拌速度、期望pH、温度和/或溶解氧水平。在一些实施方案中，系统可以基于用户输入的参数来调整这些参数。在一些实施方案中，用户或本系统可以使用例如经由管或管道可操作地连接到容器中的端口的泵来手动或自动虹吸/更换培养基或其他组分。在一些实施方案中，培养基可以连续地流入和流出系统的容器。在一些实施方案中，系统可以利用静态运动(即，生物反应器通常在生长期间保持静止)。在一些实施方案中，本文描述的系统可以包括运动控制系统，该运动控制系统被配置成使容器晃动、旋转或倾斜，这可以在腔室内产生动态流动，这可以增加容器内的细胞培养物的活力。
在一些实施方案中，本文的方法可以包括鞣制合成皮革的至少一部分，例如组织的至少一部分。在一些实施方案中，组织可以包含成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、经工程化的细胞、永生化细胞或其任何组合。本文描述的任何细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，组织可以包含层状结构。在一些实施方案中，组织可以包含真皮层。在一些实施方案中，组织可以包含表皮层。鞣制可以使合成皮革类似于天然皮革，其可以是通过鞣制动物生皮和皮肤(通常是牛皮)而制成的耐用且柔韧的材料。本文中的鞣制可以指处理动物皮以生产皮革的过程。鞣制可以以各种方式进行，包括植物鞣制(例如，使用单宁)、铬鞣制(包含硫酸铬的铬盐)、醛鞣制(使用戊二醛或噁唑烷化合物)、合成鞣剂(合成单宁，使用芳族聚合物)、细菌染色等。在一些实施方案中，鞣制可以不含金属。在一些实施方案中，鞣制可以是环境友好的过程。
在一些实施方案中，可以进行鞣制以将生皮/皮肤中的蛋白质转化成不会腐烂的稳定材料，同时允许材料保持柔性。铬可以用作鞣制材料。在一些情况下，鞣制可以包含铬、铝、锆、钛、铁、硅酸铝钠、甲醛、戊二醛、噁唑烷、异氰酸酯、碳二亚胺、聚氨基甲酰硫酸酯、四羟基硫酸鏻、对-[(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]苯磺酸钠、邻苯三酚、邻苯二酚、合成鞣剂或其任何组合。在一些实施方案中，可以在支架中的经工程化的细胞上进行鞣制。在一些实施方案中，可以被鞣制的组织可以包含纤维或多种纤维(例如，聚酯纤维、合成纤维、天然纤维)。可以调节细胞层或层状结构的pH(例如，降低；例如至约2.8-3.2的pH)以增强鞣制；在鞣制之后，可以将pH升高(“碱化”至稍高的水平，例如约3.8-4.2的pH)。在一些实施方案中，本文描述的pH可以为至少1。在一些实施方案中，本文描述的pH可以为14或更小。
在一些实施方案中，鞣制可以在细胞层上进行，该细胞层例如真皮层、表皮层、经工程化的细胞、永生化细胞层、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原或其任何组合。在一些实施方案中，鞣制可以在组织(例如，来自经工程化的细胞的组织)上进行。鞣制也可以在层状结构上进行，例如包含至少一个真皮层的层状结构。在某些情况下，鞣制也可以在合成皮革上进行。例如，鞣制可以在形成细胞层之后进行，例如在形成真皮层或表皮层之后进行。例如，鞣制可以在形成层状结构之后进行。鞣制也可以在包含开关的细胞上进行。例如，鞣制可以在一层永生化细胞上进行，该永生化细胞包含用于非贴壁依赖性和贴壁依赖性增殖的分子开关。
在一些实施方案中，鞣制可以在已经脱水的细胞或细胞层上进行。脱水之后的合成皮革的水含量可以不超过约5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、50％、60％、70％或80％。在一些实施方案中，脱水可以包括使细胞去细胞化以防止收缩。在一些实施方案中，去细胞化可以用乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、甲烷、乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、碳酸亚乙酯、盐酸醚、二氯甲烷、氯乙烯、DMSO、丙酮、二乙醚、有机溶剂或其任何组合来完成。
在一些实施方案中，鞣制可以通过修饰细胞外基质(ECM)材料来进行。鞣制可以通过修饰ECM中的胶原来进行。鞣制可以使用鞣剂进行，该鞣剂例如硫酸铬(III)([Cr(H2O)6]2(SO4)3)。硫酸铬(III)可以溶解以产生六水合铬(III)阳离子[Cr(H2O)6]3+，在较高的pH下，该阳离子经历被称为羟联的过程以产生聚铬(III)化合物，该化合物在鞣制(即，胶原亚单位的交联)中具有活性。一些配体包括硫酸根阴离子、胶原的羧基、来自氨基酸的侧链的胺基以及掩蔽剂。掩蔽剂可以是羧酸，诸如乙酸，用于抑制聚铬(III)链的形成。掩蔽剂可以允许鞣制者进一步增加pH以在不抑制铬(III)络合物的渗透的情况下增加胶原的反应性。鞣制可以增加胶原中的蛋白质链之间的间距(例如，从10到)，这与由羟联和氧联产生的聚铬物种的交联是一致的。铬可以与胶原交联。铬鞣皮革可以含有约4％至5％的铬。这种效率可以由其增加的皮革的水热稳定性以及其在热水中的抗收缩性表征。可以使用其他鞣剂来鞣制层状体并修饰胶原。
在一些实施方案中，鞣制也可以使用其他矿物质进行。在一些实施方案中，鞣制可以使用基于明矾、锆、钛、铁盐或其组合的试剂进行。鞣制可以至少部分地无铬地进行。
在一些实施方案中，鞣制也可以通过植物鞣制来进行。在一些实施方案中，植物鞣制可以包括将生皮浸入植物基提取物中。在一些实施方案中，植物基提取物可以包括栗树皮、橡树皮、铁杉树皮、红树皮、金合欢树皮、诃子树皮、白坚木树皮、含羞草树皮、橄榄叶、橡树皮或其任何组合的提取物。在一些实施方案中，鞣制可以通过湿白鞣制(例如，用醛、聚氨基甲酰硫酸酯或其任何组合鞣制)来进行。在一些实施方案中，鞣制可以用包括Easy F90和ProSpreadTM的无矿物质鞣制系统进行。在一些实施方案中，复鞣可以用A、150、N、LA、NL、Soft Ap、VX、SW、TAP、HF Brown、甲酸、Terogtan、Lipsol MSG、150、Brun染料或其任何组合进行。
在一些实施方案中，本文制造的经工程化的细胞、永生化细胞、细胞层、层状结构和合成皮革可以在鞣制之后进一步加工。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括一个或多个皮革加工步骤(例如，在传统皮革形成中使用的那些步骤)。加工步骤的实例包括：防腐、浸水、浸灰、脱毛、去肉、剖层、脱灰、再浸灰、软化、脱脂、起绒、漂洗、着色、浸酸、脱酸、鞣制、复鞣(例如，如果颜色在加工期间可能会消失)、削薄、复鞣、润滑、半硝、润湿、挤水、刮削、复铬鞣、中和、染色、乳液加脂、填充、剥离、加脂、增白、固定、定型、干燥、回潮、滚软(例如，干滚)、拉软、磨革、涂饰、涂油、刷涂、揩涂、浸涂、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、熨光、压花、熨平、打光和滚光。在一些实施方案中，润滑剂可以是脂肪、生物油、矿物油、合成油、鳕鱼油、磺化油、聚合物、树脂、有机官能硅氧烷或其任何组合。在一些实施方案中，润滑剂可以包括表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阳离子聚合表面活性剂、阴离子聚合表面活性剂、两亲聚合物、脂肪酸、改性脂肪酸、非离子亲水聚合物、非离子疏水聚合物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯酸、天然橡胶、合成橡胶、树脂、两亲阴离子聚合物、两亲阴离子共聚物、两亲阳离子聚合物、两亲阳离子共聚物或其组合。在一些实施方案中，润滑剂的乳液或悬浮液可以在水、醇、酮和其他溶剂中。
在一些实施方案中，合成皮革可以通过例如控制用于构造动物皮肤、生皮或皮革的多细胞体和/或层的数量、大小和排列来成形。在其他情况下，动物皮肤、生皮或皮革可以通过例如切割、压制、模制或冲压来成形。合成皮革的形状可以制成类似于传统的动物皮肤、生皮或皮革产品。
在一些实施方案中，本文的方法可以包括去除本文生产的合成皮革的一部分。在一些实施方案中，该方法可以包括去除表皮层的至少一部分以形成去除的产品。例如，去除可以是刮削。
在一些实施方案中，本文的方法可以包括为合成皮革着色。在一些实施方案中，可以通过在合成皮革中引入色素产生细胞(例如，黑素细胞)来进行着色。在一些实施方案中，合成皮革可以包含功能性活黑素细胞。黑素细胞可以具有与人皮肤中相似的位置。在一些实施方案中，黑素可以由黑素细胞组成性地产生。在一些实施方案中，黑素可以转移到角质形成细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以在刺激(例如，UV辐射)下产生，或通过促着色活性剂，诸如α黑素细胞刺激激素(aMSH)、内皮素1(ET1)、干细胞因子(SCF)、前列腺素E2和F2α(PGE2、PGF2α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或神经生长因子(NGF)产生。
在一些实施方案中，合成皮革的不同层中的细胞(诸如角质形成细胞、黑素细胞或成纤维细胞)可以衍生自(例如分化自)祖细胞(诸如干细胞)。在其他情况下，可以使用原代细胞或衍生自原代细胞的培养细胞来形成细胞层以制造合成皮革。在一些实施方案中，可以使用包含分子开关的经工程化的细胞来形成细胞层以制造合成皮革。在一些实施方案中，可以通过使细胞与组织形成培养基接触来分化细胞。
在一些实施方案中，本文描述的方法提供了可靠、准确且可重复地将合成皮革生产扩展到商业水平的高通量方法。本文公开的合成皮革、经工程化的表皮等同物、经工程化的全厚度皮肤等同物及其制造方法的优点包括以可重复、高通量且容易扩展的方式产生具有吸引人的外观、质地、厚度和耐久性的定制组织。在一些实施方案中，本文描述的方法可以产生表皮层、真皮层、层状结构或合成皮革中的一者或多者的增加产率。在一些实施方案中，增加产率可以为可比较方法的产率的至少约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或约15倍。在一些实施方案中，本文公开的方法可以降低合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、层状结构以及由其生产的产品的制造成本。在一些实施方案中，本文公开的方法可以生产均匀厚度的合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、层状结构以及由其生产的产品。在一些实施方案中，合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、层状结构以及由其生产的产品可以具有基本上均匀的厚度、长度和/或宽度。在一些实施方案中，表皮层、真皮层、层状结构中任一者或多者中的细胞可以均匀地分布。在一些实施方案中，表皮层、真皮层、层状结构中任一者或多者中的细胞可以不均匀地分布。
实施例
实施例1.永生化牛成纤维细胞的发育。
在一些实施方案中，永生化牛成纤维细胞系可以提供一致且可持续的细胞来源，以支持工业规模皮革生产的需求。在一些实施方案中，大多数原代细胞可以具有有限的细胞倍增次数，该有限的细胞倍增次数被称为海弗利克次数，其与每次倍增之后的染色体的缩短相关。在一些实施方案中，当达到此次数时，细胞往往会经历死亡期。在一些实施方案中，非永生化或原代细胞系可以具有生成足够的细胞用于每年至少1百万平方英尺皮革的能力。在一些实施方案中，可能需要生成更多的生皮来满足市场需求。在一些实施方案中，产量的增加可以通过原代细胞的永生化来实现。在一些实施方案中，原代细胞的永生化可以允许细胞无限地繁殖。在一些实施方案中，可以进一步工程化细胞系以提高产率并降低成本。在一些实施方案中，细胞可以以2D生长。在一些实施方案中，以2D生长可以包括将细胞附着于组织培养塑料并在其上生长。在一些实施方案中，通过修饰，细胞可以在诸如悬浮培养物等3D环境中生长，以提高生产效率。在一些实施方案中，细胞可以经工程化以在不依赖于昂贵组分，诸如生长和细胞附着因子的情况下增殖或分化。
在一些实施方案中，为了生成永生化牛成纤维细胞，可以将TERT和Bmi1基因插入质粒载体中。在一些实施方案中，可以将质粒转染到成纤维细胞系中。在一些实施方案中，质粒可以含有gfp，因此可以使用荧光可选择标志物来确定成功转染。在一些实施方案中，可以纯化和扩增携带质粒的所选成纤维细胞系。在一些实施方案中，成纤维细胞系可以展现永生化表型，可以保持二倍体，可以分泌正常的细胞外基质，并且可以具有受控的增殖。在一些实施方案中，永生化细胞系可以冷冻以备将来使用。
可替代地，可以通过表达诸如SV40大T抗原(SV40-TAg)、端粒酶(TERT)、BMI1、CCND1等外源基因，或通过干预诸如CDK4、成视网膜细胞瘤蛋白(RB)和p53等细胞周期调节因子的功能来实现永生化。SV40-TAg可以是衍生自猿猴病毒40(SV40)的非结构蛋白。SV40-TAg的异位表达可以通过阻断RB和p53的功能而导致细胞转化。RB和p53可以作为负细胞周期调节因子。RB可以通过抑制细胞周期从G1至S期的进展来调节DNA复制。SV40-TAg可以阻断RB蛋白的功能，导致细胞周期的进展。p53可以参与调节G1至S期生长周期进展、凋亡或衰老。SV40-TAg和p53之间的相互作用可能干扰p53的功能，导致细胞周期进展和细胞存活。
在一些实施方案中，SV40-TAg的异位表达可以使来自多种物种和细胞类型的原代细胞永生化。在一些实施方案中，SV40-TAg的异位表达可以使来自仓鼠真皮成纤维细胞、牛胎肝细胞、牛腹膜巨噬细胞、牛牙乳头细胞、牛胚胎肺细胞或其任何组合的原代细胞永生化。本文公开了包括使用SV40-TAg使其他牛原代细胞，诸如真皮成纤维细胞、前脂肪细胞、羊水细胞、脐带干细胞及其任何组合永生化的方法。
在一些实施方案中，胶原可以包含牛真皮组织中最丰富的蛋白质。在一些实施方案中，真皮可以被分成乳头状区域和网状区域。在一些实施方案中，乳头状区域可以生成被称为粒面皮革的更高质量的皮革。在一些实施方案中，组织可以由与弹性纤维(弹性蛋白)和纤维外纤维(诸如包埋在多糖凝胶中的纤连蛋白)混合的密集胶原纤维(主要是I型和III型)组成。在一些实施方案中，鞣制过程可以包括一系列过程步骤，以在化学地交联胶原的同时去除多糖凝胶或其他组织组分。在一些实施方案中，交联的胶原然后可以被进一步加工以染色并产生皮革的结构感。在一些情况下，SV40-TAg的表达可能会影响胶原产生。在一些实施方案中，SV40-TAg在人肺成纤维细胞系WI38中的转导可能导致胶原产生的减少。在一些实施方案中，SV40-TAg的转导可能会对人韧带细胞中的I型和III型胶原产生具有有限影响。在一些实施方案中，SV40介导的转化对胶原产生的作用可能是细胞系依赖性的。在一些实施方案中，可能重要的是，证明通过使用SV40-TAg生成的细胞系可能能够生成导致皮革生产的胶原。
实施例2.稳定的牛真皮成纤维细胞(BDF)细胞系生成
在一些实施方案中，为了生成稳定的牛真皮成纤维细胞(BDF)细胞系，使用慢病毒载体在第5代(P5)转导原代BDF，以在CMV启动子下稳定表达SV40-TAg-T2A-Puror片段(Puror＝嘌呤霉素抗性基因)。为了可视化，将绿色荧光蛋白(GFP)在另一个CMV启动子下表达(图3)。在转导之后，将细胞在10％胎牛血清(FBS)培养基(表1)中培养三天，以允许转基因表达。为了选择携带SV40-TAg-T2A-Puror序列的细胞，向细胞培养物中添加0.5ug/ml的嘌呤霉素，持续两天，然后将嘌呤霉素浓度增加到0.75ug/ml，再持续7天。用SV40-TAg-T2A-Puror片段转导的BDF细胞可以在嘌呤霉素选择下存活并表达GFP(图4A、图4B、图4C和图4D)。在嘌呤霉素选择中存活的SV40-TAg-T2A-Puror转导的细胞随后被命名为VL-001细胞系，并以6000个细胞/cm2重复地传代以测试其生长潜力。
表1
未修饰的BDF能够在体外扩增约40次群体倍增(PD)，其中平均群体倍增时间(PDT)为35.5小时。发现原代BDF在多次传代中改变其PDT，其中从第0代至第11代，最小PDT为21.6小时，而最大PDT为51.5小时(图2A)。相比之下，永生化细胞系(VL-001)细胞在嘌呤霉素选择之后扩增至少超过20代，以在第25代达到100的累积PD(图1B)。该数字并不指示衰老，相反，这是扩增实验停止的时间。VL-001细胞系的平均PDT(21.2小时)比未修饰的原代BDF短40％。VL-001细胞系在连续传代中也表现出更一致的PDT。从第6代至第25代，VL-001细胞系的最小PDT为19.1小时，而最大PDT为23.7小时(图1A)。此外，在广泛传代的VL-001细胞系中没有观察到衰老细胞，而在后来传代的未修饰的原代BDF中可以识别到衰老形态(图1C—白色箭头指向衰老细胞)。
2d培养物中的胶原产生
在证明细胞能够比未修饰的成纤维细胞生长更多次PD之后，进一步的实验专注于永生化VL-001成纤维细胞系是否可以产生胶原。证明了当在组织培养塑料上2D生长时，与未修饰的原代BDF相比，VL-001细胞可以分泌相似水平的胶原(图5)。在基于人血小板裂解液(HPL)的培养基中补充TGFb1和抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)可以显著增加VL-001和未修饰的BDF的胶原产生，这表明VL-001具有类似于未修饰的BDF的胶原生产机制(图5)。
3D支架上的组织生成和胶原产生
进行实验以确定永生化VL-001成纤维细胞系是否可以类似于未修饰的原代BDF在多孔聚酯非织造支架上生成3D组织。在一些情况下，当在基于HPL的培养基中培养时，未修饰的BDF能够在4周内在多孔支架上形成一致的组织(表1)。然而，VL-001细胞系却不能；相反，当在相同的基于HPL的培养基中培养时，细胞形成团块并且不在聚酯材料上铺展(图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F)。在观察到这之后，进行第二个实验以确定含10％胎牛血清的用于VL-001的2D细胞培养的类似培养基调配物(高葡萄糖杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基-DMEM)是否可以用于组织的形成。因此，使用含20％FBS(富含生长因子和细胞附着蛋白的较高血清)并添加2X非必需氨基酸的DMEM来支持VL-001在聚酯支架上的组织形成。通过将培养介质从HPL培养基改变为20％ FBS培养基(表1)，发现VL-001细胞能够在支架上形成3D组织。类似于未修饰的BDF，VL-001细胞可以在承载纤维之间生长(图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F)。图6A示出了在HPL培养基中生长的BDF细胞的组织扫描图像。图6B示出了在HPL培养基中生长的BDF细胞的10x放大组织扫描图像。图6C示出了在HPL培养基中生长的VL-001细胞的组织扫描图像。图6D示出了在HPL培养基中生长的VL-001细胞的10X放大组织扫描图像。图6E示出了在20％ FBS培养基中生长的VL-001细胞的组织扫描图像。图6F示出了在20％ FBS培养基中生长的VL-001细胞的10x放大组织扫描图像。此外，在20％ FBS培养基中培养的VL-001细胞可以在培养介质中产生游离胶原(图7)，并在组织中沉积胶原原纤维(图8)，这类似于在基于HPL的培养基中培养的未修饰的BDF。
悬浮培养
使VL-001细胞系在2D培养条件下快速繁殖。这里，示出了VL-001细胞系能够在3D悬浮培养物中生长为团块。细胞团聚仍然依赖于细胞/细胞或细胞/蛋白质接触。将VL-001细胞以1000个细胞/cm2接种在超低附着平板上。在悬浮培养一周之后，观察到清晰的团块形成。团块的数量和大小在3周内增加(图9A、图9B、图9C和图9D)。
实施例3.具有用于非贴壁依赖性增殖和贴壁依赖性增殖的分子开关的细胞的发育
为了发育分子开关，将整合素连接激酶(Ilk)插入受温度敏感启动子控制的质粒载体中。当细胞在33℃下生长时，温度敏感启动子允许Ilk的表达，而当细胞在37℃至39℃下生长时，抑制表达。将质粒转染到牛真皮成纤维细胞中。当Ilk表达时，牛真皮成纤维细胞展现非贴壁依赖性增殖表型。细胞在33℃的温度下在非贴壁依赖性增殖条件下生长，以支持细胞增殖。一旦细胞达到期望密度(例如，5e7个细胞/mL)，将温度改变为39℃以减弱Ilk在真皮成纤维细胞中的表达。温度变化使得细胞变为贴壁依赖性增殖，并且黏附到支架并开始形成组织。将温度降低到37℃以支持正常的细胞增殖，同时仍然减少转染的Ilk的表达。组织的产生用于合成皮革的生成。
实施例4.具有用于永生化的分子开关的细胞的发育
为了生成分子开关，在Cre-LoxP系统控制下将hTERT和SV40基因插入质粒载体中。当细胞在表达Cre蛋白的条件下生长时，Cre-LoxP系统允许切除hTERT和SV40基因。将质粒转染到牛真皮成纤维细胞中。在未诱导的条件下，hTERT和SV40被表达，并且牛真皮成纤维细胞展现永生化细胞表型。在未诱导的条件下，细胞在非贴壁依赖性增殖条件下生长。一旦细胞达到期望密度(例如，5e7个细胞/mL)，添加诱导物以表达Cre重组酶蛋白，并且从真皮成纤维细胞切除hTERT和SV40基因。hTERT和SV40的切除使得细胞黏附到支架并开始形成组织。组织的产生用于合成皮革的生成。
实施例5.具有分子开关的永生化细胞的发育
为了生成永生化牛成纤维细胞，将TERT和CCND1以及CDK4基因的突变体形式插入质粒载体中并转染到牛成纤维细胞中。质粒含有neo基因(抗生素可选择标志物)以确定成功转染。使细胞暴露于遗传霉素，并选择存活者。纯化并扩增携带质粒的所选成纤维细胞系。成纤维细胞系展现永生化表型，保持二倍体，分泌正常的细胞外基质，并且具有受控的增殖。第二，为了产生用于在悬浮液中增殖的永生化细胞的分子开关，用Tet诱导型启动子克隆细胞周期素D1基因。构建体含在整合型病毒载体中并被转染到永生化细胞中，其在永生化细胞中整合到染色体中。使含有分子开关的永生化细胞在含四环素的培养介质中生长，四环素驱动细胞周期素D1基因的表达并因此诱导非贴壁依赖性生长。在细胞已经达到约5e7个细胞/mL的密度之后，收集细胞，并将培养基替换为不含四环素的培养基。诱导物的缺失导致细胞周期素D1的减少的表达和支架上的贴壁依赖性生长。细胞开始形成用于生成皮革的组织。
实施例6.由携带分子开关的永生化牛成纤维细胞制备表皮层
使携带分子开关的永生化牛成纤维细胞在补充有人角质形成细胞生长补充剂的0.07mM Ca2+154CF培养基(Life Technologies)中生长。根据制造商的方案，将永生化牛成纤维细胞(2.21X 105/cm2插入皿)的悬浮液接种在CnT-07培养基(CELLnTEC)或CnT-Prime培养基(CELLnTEC)中的Cellstart CTS(Life Technologies)(或其他ECM基底)包被的PET0.4mm插入皿(EMD Millipore)上。
接种后第3天(D3)，将培养基换成CnT-02-3D(CELLnTEC)或CnT-3D Barrier(CELLnTEC)。在第4天，通过用CnT-02-3D或CnT-3DBarrier饲喂插入皿的底部，使永生化牛成纤维细胞暴露于空气。从第4天开始，每天用CnT-02-3D或CnT-3D Barrier饲喂永生化牛成纤维细胞，直到收获。永生化牛成纤维细胞在37℃和5％ CO2下的潮湿(100％ RH)或干燥(50％ RH)温育箱中生长。使用刻度盘式比重计(Fisher Scientific)测量温育箱湿度。通过去除水盘来保持较低的温育箱湿度。
为了控制渗透压的可能变化，每天更新培养基。使用此方案没有检测到渗透压的显著变化，如通过微渗透压计(Precision Systems)测量。十二孔插入皿用于经上皮电阻(TEER)测量、光学显微镜检查和电子显微镜检查，而六孔插入皿用于经表皮失水(TEWL)测量和免疫印迹。
实施例7.培养表皮层
将携带分子开关的永生化牛成纤维细胞以2.0-2.5x105个细胞/cm2的密度接种在CnT-07培养基(CELLnTEC)或CnT-Prime培养基(CELLnTEC)中的0.4μm孔聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜插入皿(EMD Millipore；目录号：MCHT12H48)上。
接种后第3天(D3)，将培养基换成CnT-02-3D(CELLnTEC)或CnT-3D Barrier(CELLnTEC)。在第4天，通过用CnT-02-3D CnT-3D Barrier饲喂插入皿的底部，使细胞暴露于空气。从第4天开始，每天用CnT-02-3D或CnT-3D Barrier饲喂表皮层，直到在第14天收获。
实施例8.制备承载基底
为了制备2％琼脂糖溶液，将2g超纯低熔点(LMP)琼脂糖溶解在100mL超纯水/缓冲溶液(1:1，v/v)中。缓冲溶液可以任选地是PBS(杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水1×)或HBSS(汉克斯平衡盐溶液1×)。可以将琼脂糖溶液放入含有温水(超过80℃)的烧杯中，并保持在热板上，直到琼脂糖完全溶解。只要温度高于36℃，琼脂糖溶液就保持液态。低于36℃时，就会发生相变，黏度增加，并且最终琼脂糖形成凝胶。
为了制备琼脂糖承载基底，可以将10mL液体2％琼脂糖(温度>40℃)沉积在10cm直径的皮氏培养皿中，并均匀铺开以形成均匀的层。允许琼脂糖在冰箱中在4℃下形成凝胶。
实施例9.生产包含携带分子开关的永生化牛成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞的合成皮革
方案可以概述如下：a)使携带分子开关的永生化牛成纤维细胞与胶原溶液接触，然后温育足够长的时间，以获得其中分布有永生化牛成纤维细胞的收缩胶原基质，构成真皮等同物，b)用角质形成细胞和黑素细胞的混合物接种a)中获得的真皮等同物，并在液体培养基中浸没培养，c)将b)中获得的整个培养物(接种在真皮等同物上的角质形成细胞和黑素细胞)浸没，并在气-液界面处继续培养，直到在胶原基质中含有成纤维细胞的真皮等同物上获得含有黑素细胞的多层表皮等同物，构成皮肤等同物。
步骤a)可以用I型胶原，特别是牛来源的，或胶原I和III的混合物(相对于网格的最终体积的大约30％)在均匀的悬浮液中进行。有利地，向其中添加其他成分，诸如层粘连蛋白(具体地，相对于最终体积的1％至15％)、胶原IV(具体地，相对于最终体积的0.3％至4.5％)和/或巢蛋白(具体地，相对于最终体积的0.05％至1％)，以获得均匀的悬浮液。永生化牛成纤维细胞由本文描述的方法获得。将它们在合适的培养基中培养，然后悬浮，随后再与胶原和生长因子的悬浮液混合。将混合物在大约37℃，通常36℃至37.5℃的温度下温育1至6天，例如4或5天。有利地，将混合物在不允许其黏附(特别是防止混合物黏附到载体的边缘)的载体上温育；此载体可以具体通过对其表面的预先处理而获得，例如通过用牛白蛋白或血清包被所述表面。由此获得胶原凝胶，胶原凝胶在排出营养培养基的同时在几个方向上自由收缩，并且成纤维细胞包埋在胶原凝胶中。
为了进行步骤b)，可以使用来源于皮肤的角质形成细胞。扩增角质形成细胞，然后根据Rheinwald和Green的技术(Cell,第6卷,331-344,1975)，通过在存在生长因子(特别是氨基酸、血清、霍乱毒素、胰岛素、三碘甲腺原氨酸和pH缓冲溶液)的情况下在合适的培养基中在由3T3成纤维细胞构成的饲喂载体上培养来进行接种。具体地，此培养介质可以特别含有至少一种角质形成细胞的促有丝分裂生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)和/或角质形成细胞生长因子(KGF)，特别是KGF)、胰岛素、氢化可的松并且任选地含有抗生素(例如：庆大霉素、两性霉素B)。
黑素细胞可以是来源于幼年或成年动物皮肤的黑素细胞。通过在不存在佛波酯的情况下在合适的培养基中培养来将它们扩增，该培养基由诸如DMEM/F12或MCDB153等基础培养基构成并补充有黑素细胞特异性生长因子(诸如，例如bFGF、SCF、ET-1、ET3或αMSH)，以及特别地在M2培养基(Promocell)或在诸如M254(Cascades BiologicsTM)等其他培养基中培养来将它们扩增。
由这些培养物制备黑素细胞和角质形成细胞的细胞悬浮液，并将其混合以获得混合的角质形成细胞/黑素细胞悬浮液。黑素细胞/角质形成细胞的比率可以为1:10至2:1，并且通常为大约1:1。这种混合悬浮液沉积在真皮等同物上。真皮等同物有利地经由诸如胶原等生物材料附着到载体。将黑素细胞/角质形成细胞悬浮液沉积在环或任何等同的装置中，以将其保持在限定的表面部分上。液体营养培养基的添加应足以覆盖细胞混合物。此培养基含有生长因子，特别是EGF和/或KGF。培养基将定期更换，并且继续浸没培养，通常持续2至10天，特别是5至8天，大约7天的时间段。从浸没的第2天开始，并且理想地从浸没的第4天开始，培养基含有KGF。
随后以本身已知的方式将皮肤浸没，以获得角质形成细胞的分化和分层表皮等同物的形成。此步骤c)对应于继续气-液界面处的浸没培养，直到获得分化的结构，通常大约7天。然而，步骤c)可以持续更长的时间段，例如大约28天，同时保存具有上文所述有利特性的皮肤等同物。营养培养介质将定期更新。随后去除皮肤等同物以进行所需的测试。
实施例10.培养皮肤标本中的毛囊形成的诱导
将扩增的真皮乳头(DP)细胞与培养的外根鞘(ORS)细胞混合，洗涤，并以合适的细胞密度小心地重悬于20ml无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，Sigma)中。每个实验中使用的培养的DP和ORS细胞获自不同的供体，因为DP和ORS细胞的不同培养持续时间不允许两种细胞类型由同一供体制备。在建立培养后1天，将细胞悬浮液缓慢注射到培养的皮肤片的真皮中。
实施例11.培养毛囊细胞群
毛囊获自枕区。真皮乳头(DP)细胞的制备和培养如Randall等人,A comparisonof the culture and growth of dermal papilla cells from hair follicles fromnon-balding and balding(androgenetic alopecia)scalp.Br JDermatol 1996:134:437–444中所述。
简而言之，在解剖显微镜下分离毛囊的DP，并单独转移到24孔组织培养板(Sarstedt)。细胞培养在补充有15％ FCS(Sigma)的DMEM中进行。在细胞增殖开始之后，将细胞培养至融汇并扩增两代。为了分离外根鞘(ORS)细胞，切下含有隆突区的毛囊的中间部分，并进行温和的胰蛋白酶消化。每次培养至少使用10个毛囊的细胞。将获得的细胞在RPMI-1640培养基(Sigma)中洗涤两次，并在标准角质形成细胞培养基(Epilife，Sigma)中进行细胞培养。培养1周后收获细胞。
实施例12.鞣制全厚度皮肤等同物
全厚度皮肤等同物通过铬鞣进行鞣制。第一步是冰和硫酸处理。这会打开组织，使得其可以接收铬。然后将铬连同氧化镁一起添加。
该过程将全厚度皮肤等同物的pH水平降低至约3。在铬已对全厚度皮肤等同物进行处理之后，然后引入鞣制液，这使pH水平升高至约4。接下来是温水浴，然后辊压以去除多余的液体。最后的阶段是在必要时进行表面处理，然后在拉伸的同时干燥全厚度皮肤等同物，完成后再次压平。
实施例13.鞣制人造皮革
对于下面的方案，使用如下定义：
·转鼓—丙烯酸或金属鞣制转鼓
·滚棒—用于使鞣制转鼓旋转的滚棒设备
·室—加热室，能够将环境温度控制在25℃至50℃之间，在操作过程中，滚棒和转鼓将放于此处。
·生皮—将进行鞣制转化的所收获的牛皮肤
·塞子：密封鞣制转鼓的孔的橡胶塞或石蜡膜覆盖物。
·X％off—基于生皮批次的重量的百分数
·所需的个人防护装备(PPE)：防化学品飞溅眼罩、N-95面罩、丁腈手套以及棉质或一次性实验服。
方案
穿戴个人防护装备。所有装备都用70％乙醇喷雾或家用清洁剂清洗。如果使用家用清洁剂，彻底冲洗装备。收集所有待鞣制的生皮，并在实验秤上称重。该重量将决定工作表中使用的水、鞣制化学品和甲酸的量。一旦所有的设备都已干燥并备好使用，鞣制过程就可以开始了。
将滚棒放在温育箱室内，并将温度调节至24℃。将1000％off水和2％offprodegreaze放到转鼓中。手动摇动转鼓，以将Prodegreaze混入水中。检查溶液的pH。
示例：
批次重量＝100g
1000％off水＝10x100＝1000mL
2％off Prodegreaze＝0.02x100＝2g
将生皮放在混合物中，并使用塞子密封转鼓。将转鼓置于滚棒的顶部，并关闭温育箱室。使混合物以19RPM旋转15min。
注意：IBI滚棒是指针式的并且由刻度盘上的位置决定。全速(19RPM)时，刻度盘将被设置到尽可能远的位置；而半速(9.5RPM)时，刻度盘将被设置到量程的一半。
将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。用自来水冲洗转鼓。
将温育箱室的温度保持在24℃。向转鼓中添加1000％off水和6％off prosoak，并手动摇动转鼓以将化学品混合在一起。向转鼓中添加生皮，密封转鼓并将其放置在温育箱室内的滚棒上。使转鼓以19RPM滚动30min。将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。向转鼓中添加1000％off水和2％off prosoak，手动摇动转鼓以将化学品混合在一起。检查溶液的pH。向转鼓中添加生皮，密封转鼓并将其放置在室内的滚棒上。使转鼓以19RPM滚动30min。将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。用自来水冲洗转鼓。
将温育箱室的温度保持在24℃。向转鼓中添加1000％off水、2％off prospread和1mL氢氧化钠浓缩液。检查转鼓的pH，其应在11-11.2之间。将生皮放入转鼓中，并用塞子密封转鼓。将转鼓放置到温育箱室内的滚棒上。使转鼓以19RPM旋转30min，然后使转鼓静置15分钟。在15min的静置期间，必须将生皮沉没在溶液中。转鼓开始以19RPM再滚动15分钟，并检查pH以确保其为10.3或更低。如果不是，则使转鼓以19RPM再旋转15分钟，并再次检查pH。重复15分钟的旋转，直到pH达到10.3或更低。
如果pH在3个15分钟时间段之后没有变化，则将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。用自来水冲洗转鼓。向转鼓中添加1000％off水，并将生皮放在转鼓内。将溶液在24℃下以19RPM混合10min。10分钟后，立即取出生皮并排水。向转鼓中添加1000％off水和2％off氯化铵，并机械混合溶液，直到充分混合。检查pH。
将生皮放置在转鼓内，并将转鼓放置在温育箱室内。使转鼓以19RPM旋转30分钟。将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。用自来水冲洗转鼓。向转鼓中添加1000％off水，并将生皮放入其内。使转鼓以19RPM旋转10分钟。同时，在化学通风橱中制备8％甲酸的本体溶液。将生皮从转鼓中取出，并将水从转鼓中排出。向转鼓中添加1000％off水，并向转鼓中缓慢添加甲酸，直到溶液的pH达到4.9。将生皮放置在转鼓内，并在温育箱室内将转鼓置于滚棒的顶部。使转鼓以19RPM旋转30分钟。
将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。用自来水冲洗转鼓。向转鼓中添加500％off水、2％off prospread和10％off Granofin F90。机械混合溶液，直到Granofin F90充分混入水中。检查溶液的pH。Granofin F90是一种黏稠的白色液体并且可能需要严格混合。
将生皮放置在转鼓内，并在温育箱室内将转鼓置于滚棒上。将转鼓设置为以19RPM旋转2小时30分钟。2个半小时后，将温育箱室的温度升至38℃，使转鼓以19RPM混合1小时。1小时后，将温育箱室的温度升至45℃，使转鼓静置过夜。在过夜温育期间，生皮必须沉没在鞣制溶液中。在过夜温育之后，检查溶液的pH。将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。用自来水冲洗转鼓。
将温育箱室内的温度保持在45℃。向转鼓中添加1000％off水、2％off Prospread和10％off Pellastol XO，并充分混合溶液。将生皮放入转鼓中，密封转鼓并将其放置在室内的滚棒上。将转鼓设置为19RPM并旋转15min。按照表2中列出的顺序和时间间隔，向转鼓中添加下列化学品。
表2
将生皮从转鼓中取出，并将化学溶液倒入适当的废物容器中。用自来水冲洗转鼓。向转鼓中添加1000％off水，并将生皮放入转鼓内。将转鼓放置在滚棒上，并使转鼓全速旋转5min。将生皮取出并干燥。
实施例14.全厚度皮肤等同物
将I型胶原基质(含有0.5x106个永生化牛成纤维细胞)沉积到聚对苯二甲酸乙二醇酯膜(BD Biosciences)上，并使其聚合。在聚合基质温育约7天之后，将1x106个角质形成细胞和0.1x106个黑素细胞接种到基质上，再温育7天。将复合培养物升至气-液界面，并从下方饲喂以诱导表皮分化。约14天后收获全厚度皮肤等同物，并将其速冻在液氮中或包埋在蜡中。黑素的定量可以通过分光光度法测量，并表达为每个细胞的黑素含量或每个培养物(面积)的黑素含量。
实施例15.非贴壁依赖性细胞生长
永生化细胞可以在悬浮液中非贴壁依赖性地生长。细胞扩增可以在约33℃下发生，然后在将细胞接种到支架上时变为约39℃。为了形成组织，温度可以降低至37℃，或者如果细胞能够忍受该较高温度，则保持在39℃。此后，可以如本文所公开的那样对组织进行修饰或鞣制。
实施例16.无血清培养基
在一些情况下，如本文所公开的永生化细胞能够在无血清的培养基中生长。在一些情况下，使用无血清培养基可能会导致较慢的细胞生长。在本文公开的一些实施方案中，可以使用不导致较慢的细胞生长的无血清培养基。在一些实施方案中，无血清培养基可以完全不含胎牛血清(FBS)、人血小板裂解液(HPL)或其任何组合。
实施例17.单个细胞悬浮液
在一些情况下，可以对细胞进行遗传修饰，以允许细胞在悬浮液中作为单个细胞生长。在一些实施方案中，悬浮液中生长的细胞能够在没有细胞-细胞或细胞-蛋白质相互作用的情况下生长。
实施例18.永生化胎牛真皮成纤维细胞系的生成
如实施例4中所述，用SV40大T抗原转染胎牛真皮成纤维细胞。所生成的细胞系(VL-001)表现出以23.7hr的倍增速率连续增殖的能力，并且已经生长到>100次倍增(实验在此次倍增时停止)。相比之下，亲本原代牛成纤维细胞倍增速率为35.5hr，并且在31次倍增后将会衰老。
永生化细胞系的发育可能会潜在地影响细胞分化的能力。特别是对于真皮成纤维细胞，当放置在正确的环境中时，它们将产生多种细胞外基质(ECM)蛋白，以产生结缔组织。对结缔组织的发育至关重要的主要ECM是胶原。这些蛋白质是鞣制过程中交联形成皮革的关键组分。
为了确定VL-001细胞是否可以分化形成皮革，进行了以下研究。这一发现的独特之处在于能够生成增殖良好的细胞系，并且该细胞系具有永生化细胞系的特性但可以分化形成结缔组织，该结缔组织可以被鞣制以生成皮革。
在TGFB1和AA2P处理后的COL1基因的表达增加在图10中示出。I型胶原是真皮组织中最丰富的胶原，并且是生成皮革所必需的。I型胶原是由2条α1链(由COL1A1基因产生)和1条α2链(由COL1A2基因产生)构成的绳状三链蛋白质。图10示出了在TGFB1和AA2P处理后的COL1基因的表达增加。在暴露于转化生长因子β1(TGFB1)和抗坏血酸-2-磷酸酯(AA2P)后，COL1A1和COL1A2基因的表达水平在原代牛真皮成纤维细胞(BDF)和永生化细胞系(VL-001)中均上调。有趣地是，与对照培养基中的BDF相比，VL-001在没有TGFB1和AA2P刺激的对照培养基中表达较少的COL1A1和COL1A2。这一结果表明，VL-001细胞在没有TGFB1和AA2P处理的情况下可能处于较少分化状态，这可能与VL-001细胞的增殖能力增加有关。在TGFB1和AA2P处理后，VL-001能够将COL1A1和COL1A2基因的表达增加到与BDF细胞相似的水平。使用Sircol红色测定法测量培养介质中的胶原水平，观察到类似的结果(参见图5)。
使用改良培养基调配物在3D支架上生长VL-001细胞以生成真皮组织
针对与亲本细胞系的可比性的下一步是确定当在3D生物材料支架上生长时，VL-001细胞是否可以用于真皮组织的形成。为了确定这一点，对VL-001细胞进行测试，以查看它们在小牛血清(BCS)包被的聚乳酸(PLA)3D多孔支架上生长时是否可以生成真皮组织。对于包被，将PLA支架浸入BCS中并在4℃下温育过夜。将细胞以1x106个细胞/cm2接种，并在改良培养基调配物(见下文)中培养4周。针对BDF细胞开发的原始组织组织形成培养基含有10％人血小板裂解液(hPL)、TGFB1和抗坏血酸-2-磷酸酯(AA2P)。改良培养基调配物仅含有5％hPL，不含TGFB1。这种新的改良培养基调配物允许VL-001细胞在PLA支架中附着和生长，并降低了至少50％的成本。原始和改良培养基调配物在表3中示出。
表3
培养4周后，VL-001细胞在PLA支架内形成连续的组织。这一过程是可重复的，由大体形态和胶原含量证明。在本实验中，两个样品在不同的生物反应器中生长，并在培养4周后表现出相似的形态(参见图11A和图11B)。图11A和图11B各自示出了从PLA支架上的永生化牛成纤维细胞系生长的人造真皮层。取自两个组织的活检样品具有相似的总胶原含量，通过Sircol红色测定法测量(参见图12)。图12示出了使用改良培养基的VL-001组织的总胶原含量与在原始培养基中培养的BDF组织相当。
如图13中所示，将组织活检物固定在塑料树脂中，生成5um的切片并用天狼猩红(PSR)染色。图13示出，VL-001细胞可以在整个PLA支架中沉积胶原，如图像中的染色所指示。
VL-001组织可以经历传统的鞣制过程并生成皮革
组织生长完成后，将经工程化的真皮组织从容器中取出，然后通过浸入盐或盐水溶液中保存，并在4℃下储存。生皮随后被运送到制革厂以转化成皮革。该过程由若干步骤组成：1)预浸水和浸水，以使生皮复水并去除盐、任何残留的蛋白质和透明质酸；2)在碱性pH下浸灰，以从组织去除硫酸化糖胺聚糖(sGAG)和其他外来组织/细胞；3)脱灰，以将pH降低至约4.0；4)鞣制，以交联组织的胶原束；5)后鞣制，以提供结构感(柔软性和防水)并为材料引入颜色；6)干燥，这可去除多余的水，但保持材料的适当湿度以保留其柔软性和可挠性；和7)涂饰，这可提供最终性质，诸如纹理、质地、外观等。
图14示出了处于半硝阶段(在干燥以去除多余的水之后)的VL-001组织的图像。将VL-001细胞接种到小牛血清(BCS)包被的聚-L-丙交酯酸(PLA)三维非织造支架上，在由5％hPL(人血小板裂解液)、肝素(2mg/L)、非必需氨基酸(1x浓度)、抗坏血酸(82ug/L)、抗生素-抗真菌剂(1x浓度；100单位/mL青霉素、100ug/mL链霉素和250ng/mL的Gibco两性霉素B)组成的细胞培养介质中生长4周。
实施方案
以下是本文的公开内容的示例性实施方案：
1.一种方法，其包括：
1)将永生化动物成纤维细胞接种到支架上以形成人造真皮层；
2)使所述人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的真皮层；以及
3)鞣制所述至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。
2.根据实施方案1所述的方法，其中在所述接种之前，使所述永生化动物成纤维细胞在培养物中扩增以形成多个永生化动物成纤维细胞。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过海弗利克极限。
4.根据实施方案3所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。
5.根据实施方案2所述的方法，其中在所述扩增之后，将所述多个永生化动物成纤维细胞在低于0℃的温度下储存。
6.根据实施方案5所述的方法，其中在所述储存之后，在所述接种到所述支架上之前，使所述多个永生化动物成纤维细胞在培养物中生长。
7.根据实施方案1或2所述的方法，其中培养所述永生化动物成纤维细胞包括扩增所述永生化动物成纤维细胞。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括所述人造真皮层中胶原的交联。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中在所述将所述永生化动物成纤维细胞接种到所述支架上之后，所述方法进一步包括在所述支架上培养所述永生化动物成纤维细胞以形成所述人造真皮层。
10.根据实施方案1所述的方法，其中所述至少部分地去细胞化包括使所述人造真皮层与盐溶液接触。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述接触包括将所述人造真皮层浸入所述盐溶液中。
12.根据实施方案10或11所述的方法，其中所述盐包括氯化钠、粗盐晶体、盐水溶液或其组合。
13.根据实施方案12所述的方法，其中所述氯化钠的浓度包括约36％至约100％。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括植物鞣制、铬鞣制、醛鞣制、合成鞣剂鞣制、细菌染色或其任何组合。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述动物细胞包括牛细胞。
16.一种方法，其包括：
1)将永生化动物成纤维细胞接种到支架上以形成人造真皮层
以及
3)鞣制所述人造真皮层以形成合成皮革。
17.根据实施方案16所述的方法，其中在所述接种之前，使所述永生化动物成纤维细胞在培养物中扩增以形成多个永生化动物成纤维细胞。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过海弗利克极限。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。
20.根据实施方案17所述的方法，其中在所述扩增之后，将所述多个永生化动物成纤维细胞在低于0℃的温度下储存。
21.根据实施方案20所述的方法，其中在所述储存之后，在所述接种到所述支架上之前，使所述多个永生化动物成纤维细胞在培养物中生长。
22.根据实施方案16或17所述的方法，其中培养所述永生化动物成纤维细胞包括扩增所述永生化动物成纤维细胞。
23.根据实施方案16-22中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括所述人造真皮层中胶原的交联。
24.根据实施方案16-23中任一项所述的方法，其中所述动物细胞包括牛细胞。
25.一种方法，其包括：将细胞接种到支架上，其中所述细胞包含外源分子；其中所述外源分子能够基于直接或间接刺激而导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地非贴壁依赖性增殖。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述细胞包括永生化细胞。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述永生化细胞包括永生化成纤维细胞。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述永生化成纤维细胞包括永生化牛成纤维细胞。
29.根据实施方案25-28中任一项所述的方法，其中所述分子包括RNA、DNA、氨基酸或蛋白质。
30.根据实施方案29所述的方法，其包含所述DNA，其中所述DNA编码蛋白质。
31.一种方法，其包括：
将细胞接种到支架上，其中所述细胞包含至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述细胞是永生化细胞。
33.根据实施方案31或32所述的方法，其进一步包括在所述接种之前，在第一环境中增殖所述细胞，其中所述细胞包含所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸或两者。
34.根据实施方案31-33中任一项所述的方法，其中所述细胞是多个细胞。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述多个细胞包含多个所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸或两者。
36.根据实施方案35所述的方法，其中多个所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸或两者在增殖期间至少部分地开启并且在所述接种期间至少部分地关闭。
37.根据实施方案35所述的方法，其中多个所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸或两者在所述增殖期间至少部分地关闭并且在所述接种期间至少部分地开启。
38.根据实施方案33所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地开启。
39.根据实施方案33所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地关闭。
40.根据实施方案31-39中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
41.根据实施方案31-39中任一项所述的方法，其中所述细胞选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞和兔形动物细胞。
42.根据实施方案31-41中任一项所述的方法，其中所述第一环境是在悬浮液中。
43.根据实施方案31-42中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关基于直接或间接刺激而至少部分地导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地贴壁依赖性增殖。
44.根据实施方案31-43中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地开启并且在所述接种期间至少部分地关闭。
45.根据实施方案31-43中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地关闭并且在所述接种期间至少部分地开启。
46.根据实施方案31-45中任一项所述的方法，其中刺激的存在使得编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸的表达增加或表达减少。
47.根据实施方案31-45中任一项所述的方法，其中刺激的缺失使得编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸的表达增加或表达减少。
48.根据实施方案31-47中任一项所述的方法，其中所述增殖在存在所述刺激的情况下进行。
49.根据实施方案31-47中任一项所述的方法，其中所述增殖在缺失所述刺激的情况下进行。
50.根据实施方案31-49中任一项所述的方法，其中所述刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、培养介质组成的变化及其任何组合。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
52.根据实施方案31-51中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关是基于温度可逆的。
53.根据实施方案31-52中任一项所述的方法，其中在所述增殖期间，使所述细胞暴露于约28℃至约34℃的温度。
54.根据实施方案31-53中任一项所述的方法，其中在所述接种之后，使所述细胞暴露于约37℃至约41℃的温度。
55.根据实施方案31-54中任一项所述的方法，其中所述支架是至少部分地天然的或合成的。
56.根据实施方案31-55中任一项所述的方法，其中所述支架包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶中的至少一者及其组合。
57.根据实施方案31-56中任一项所述的方法，其中所述细胞产生细胞外基质蛋白。
58.根据实施方案57所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白选自I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白及其组合。
59.根据实施方案31-58中任一项所述的方法，其进一步包括生成包含所述细胞或由其发育的组织的一部分的合成皮革的至少一部分。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述合成皮革包含所述组织的至少一部分。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述组织包含I型胶原。
62.根据实施方案31或32所述的方法，其进一步包括在所述接种之前，在第一环境中增殖所述细胞，然后将所述至少部分地可逆的外源分子开关直接或间接添加到所述增殖细胞中。
63.根据实施方案31-62中任一项所述的方法，其中所述细胞以约50,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2的密度接种。
64.根据实施方案31-62中任一项所述的方法，其中所述将所述细胞接种到支架上包括接种所述支架的一侧。
65.根据实施方案64所述的方法，其中在不翻转所述支架的情况下接种所述支架的第二侧。
66.根据实施方案31-63中任一项所述的方法，其中所述将所述细胞接种到支架上包括在所述支架的多于一侧上接种。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述接种是连续的或同时的。
68.根据实施方案66所述的方法，其中所述接种包括在所述支架的一侧上接种，然后翻转所述支架并接种所述支架的另一侧。
69.一种方法，其包括：
a.将细胞转化成永生化细胞；
b.向所述永生化细胞中引入至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸中的每一者或两者使得所述永生化细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地增殖或至少部分地贴壁依赖性地增殖；以及
c.使所述永生化细胞非贴壁依赖性地增殖。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述细胞选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞和兔形动物细胞。
71.根据实施方案70所述的方法，其中所述细胞是所述牛细胞。
72.根据实施方案69-71中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
73.根据实施方案72所述的方法，其中所述干细胞选自间充质干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
74.根据实施方案69-73中任一项所述的方法，其中所述细胞选自成纤维细胞、动物脂肪组织衍生细胞、脐带衍生细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞及其组合。
75.根据实施方案69-74中任一项所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
76.根据实施方案69-75中任一项所述的方法，其中所述转化包括增加或减少癌基因或参与细胞增殖调节的基因的表达。
77.根据实施方案69-76中任一项所述的方法，其中所述细胞表达由TERT、Bmi1或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
78.根据实施方案69-77中任一项所述的方法，其中所述永生化细胞表达由TERT、CcnD1、Cdk4、SV40大T抗原或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
79.根据实施方案69-78中任一项所述的方法，其进一步包括使所述永生化细胞暴露于所述刺激。
80.根据实施方案79所述的方法，其中所述刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、培养介质组成的变化及其任何组合。
81.根据实施方案80所述的方法，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
82.根据实施方案81所述的方法，其中所述温度为约28℃至约34℃。
83.根据实施方案82所述的方法，其中所述刺激使得所述永生化细胞至少部分地非贴壁依赖性地增殖。
84.根据实施方案83所述的方法，其中非贴壁依赖性包括在悬浮液中增殖。
85.根据实施方案83或84中任一项所述的方法，其中所述刺激的去除使得所述永生化细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。
86.根据实施方案69-85中任一项所述的方法，其进一步包括使所述永生化细胞暴露于第二刺激。
87.根据实施方案86所述的方法，其中所述第二刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、培养介质组成的变化及其任何组合。
88.根据实施方案87所述的方法，其中所述第二刺激包括所述温度的所述变化。
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述温度为约37℃至约41℃。
90.根据实施方案86所述的方法，其中所述第二刺激使得所述永生化细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。
91.根据实施方案90所述的方法，其中所述第二刺激的去除使得所述永生化细胞至少部分地非贴壁依赖性地增殖。
92.根据实施方案91所述的方法，其中贴壁依赖性包括在基底上增殖。
93.根据实施方案92所述的方法，其进一步包括将所述永生化细胞接种在所述基底上。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述永生化细胞以约50,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2的密度接种。
95.根据实施方案93所述的方法，其中所述将所述永生化细胞接种在所述基底上包括接种所述基底的一侧。
96.根据实施方案95所述的方法，其中在不翻转所述基底的情况下接种所述基底的第二侧。
97.根据实施方案93所述的方法，其中所述将所述永生化细胞接种在所述基底上包括在所述基底的多于一侧上接种。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述接种是连续的或同时的。
99.根据实施方案97所述的方法，其中所述接种包括在所述基底的一侧上接种，然后翻转所述基底并接种所述基底的另一侧。
100.根据实施方案93所述的方法，其中所述贴壁依赖性增殖至少部分地在所述基底之上、之中或周围进行。
101.根据实施方案100所述的方法，其中所述基底包含支架。
102.根据实施方案101所述的方法，其中所述支架是至少部分地天然的或合成的。
103.根据实施方案101或102所述的方法，其中所述支架包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶或其组合。104.根据实施方案31-103中任一项所述的方法，其中与不包含所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，所述细胞或永生化细胞被修饰成具有增强的细胞外基质产生。
105.根据实施方案69-104中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。
106.根据实施方案69-105中任一项所述的方法，其进一步包括对包含所述细胞或所述永生化细胞的组织进行工程化。
107.根据实施方案106所述的方法，其进一步包括鞣制所述组织。
108.根据实施方案105所述的方法，其中所述细胞外基质包括I型胶原。
109.一种经工程化的细胞，其包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合，其中所述经工程化的细胞是永生化牛细胞。
110.根据实施方案109所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关使得所述经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地生长或至少部分地贴壁依赖性地生长。
111.根据实施方案110所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞的增殖至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。
112.一种经工程化的细胞，其包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关使得所述经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地生长或至少部分地贴壁依赖性地生长。
113.根据实施方案112所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞的增殖至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。
114.根据实施方案112所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是原核细胞或真核细胞。
115.根据实施方案112所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是动物细胞。
116.根据实施方案112所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是分离的细胞。
117.根据实施方案112-116中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是非人细胞。
119.根据实施方案112-117中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞和兔形动物细胞。120.根据实施方案119所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是所述牛细胞。
121.根据实施方案112-120中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是永生化细胞。
122.根据实施方案119-121中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞选自成纤维细胞、动物脂肪组织衍生细胞、脐带衍生细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞及其组合。
123.根据实施方案122所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
124.根据实施方案109-123中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞衍生自多能干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
125.根据实施方案109-123中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞衍生自活检。
126.根据实施方案109-125中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是来自包括多种细胞的细胞系的细胞。
127.根据实施方案109-126中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞表达外源癌基因或参与细胞增殖调节的基因。
128.根据实施方案109-127中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞表达由TERT、Bmi1或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
129.根据实施方案109-127中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞表达由TERT、CcnD1、Cdk4或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
130.根据实施方案109-129中任一项所述的经工程化的细胞，其中与不包含所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，所述经工程化的细胞被修饰成具有增强的细胞外基质产生。131.根据实施方案130所述的经工程化的细胞，其中所述细胞外基质包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。
132.根据实施方案109-131中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸被配置成响应于所述刺激而至少部分地增加或减少表达。
133.根据实施方案132所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的增加的表达导致所述至少部分地贴壁依赖性增殖。134.根据实施方案132所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的增加的表达导致所述至少部分地非贴壁依赖性增殖。
135.根据实施方案132所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的减少的表达导致所述至少部分地贴壁依赖性增殖。136.根据实施方案132所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的减少的表达导致所述至少部分地非贴壁依赖性增殖。
137.根据实施方案109-136中任一项所述的经工程化的细胞，其中与非贴壁依赖性增殖相比，所述至少部分地贴壁依赖性增殖消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。
138.根据实施方案109-136中任一项所述的经工程化的细胞，其中与所述至少部分地贴壁依赖性增殖相比，所述至少部分地非贴壁依赖性增殖消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。
139.根据实施方案109-138中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸是单个开关或多个开关。
140.根据实施方案109-139中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸编码可选择标志物。
141.根据实施方案140所述的经工程化的细胞，其中所述可选择标志物包括荧光蛋白。
142.根据实施方案109-141中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞包含重组可选择标志物。
143.根据实施方案142所述的经工程化的细胞，其中所述可选择标志物选自抗生素抗性基因、编码荧光蛋白的基因和表达营养缺陷型标志物的基因。
144.根据实施方案109-143中任一项所述的经工程化的细胞，其包含编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸，其中所述多核苷酸位于基因组中、在染色体外或其组合。
145.根据实施方案109-144中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激是环境刺激。
146.根据实施方案109-145中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、机械刺激、一种或多种离子类型的存在、培养介质组成的变化及其任何组合。
147.根据实施方案146所述的经工程化的细胞，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
148.根据实施方案147所述的经工程化的细胞，其中用于所述至少部分地非贴壁依赖性增殖的所述温度为约28℃至约34℃。
149.根据实施方案147或148所述的经工程化的细胞，其中用于所述至少部分地贴壁依赖性增殖的所述温度为约37℃至约41℃。
150.根据实施方案109-149中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的存在导致贴壁依赖性增殖。
151.根据实施方案109-149中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的缺失导致贴壁依赖性增殖。
152.根据实施方案109-149中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的存在导致非贴壁依赖性增殖。
153.根据实施方案109-149中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的缺失导致非贴壁依赖性增殖。
154.根据实施方案110-145中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激选自以下的存在、缺失或水平的变化：抗生素、蛋白质、化学化合物、这些中的任一者的盐及其任何组合。
155.根据实施方案110-154中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地非贴壁依赖性增殖至少部分地是以下的表达增加的结果：整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合。
156.根据实施方案109-155中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞在生物反应器中生长。
157.根据实施方案109-156中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地非贴壁依赖性增殖至少部分地在悬浮液中进行，并且其中所述贴壁依赖性增殖至少部分地在支架之上、之中或周围进行。
158.根据实施方案157所述的经工程化的细胞，其中所述支架是至少部分地天然的或合成的。
159.根据实施方案157或158所述的经工程化的细胞，其中所述支架包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶或其组合。
160.一种分离的组织，其包含根据实施方案109-159中任一项所述的经工程化的细胞。
161.根据实施方案160所述的分离的组织，其中所述组织包含多个聚酯纤维。
162.根据实施方案160所述的分离的组织，其中所述组织的至少一部分被鞣制。
163.根据实施方案162所述的分离的组织，其中所述组织的所述至少一部分用鞣剂鞣制，所述鞣剂包括：铬、铝、锆、钛、铁、硅酸铝钠、甲醛、戊二醛、噁唑烷、异氰酸酯、碳二亚胺、聚氨基甲酰硫酸酯、四羟基硫酸鏻、对-[(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]苯磺酸钠、邻苯三酚、邻苯二酚、合成鞣剂或其任何组合。
164.根据实施方案162所述的分离的组织，其中所述组织的至少一部分进一步包含细胞外基质。
165.一种皮革，其包含根据实施方案109-159中任一项所述的经工程化的细胞的至少一部分、其衍生物或其子代或根据实施方案160-164所述的分离的组织。
166.根据实施方案165所述的皮革，其中所述皮革呈选自以下中的任一者的形式：包袋、腰带、表带、包装、鞋子、靴子、鞋类、手套、衣服、背心、夹克、裤子、帽子、衬衫、内衣、行李、手拿包、钱包、球、背包、皮夹、鞍具、挽具、皮套裤、鞭子、家具、家具配件、室内装潢品、汽车车座、汽车内饰及其任何组合。
167.根据实施方案165所述的皮革，其中所述皮革包含生物制造材料。
168.根据实施方案167所述的皮革，其中所述生物制造材料包含区域性质。
169.根据实施方案109-159中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞包括选自c-MycER系统、Tet-on系统、Tet-off系统的任一者及其组合。
170.根据实施方案109-159或169中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞包括选自Cre-LoxP系统、TALENS、锌指、CRISPR系统或其组件的任一者及其任何组合。
171.根据实施方案109-159或169-170中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括DNA、RNA或其组合。
172.根据实施方案131所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括所述DNA。
173.根据实施方案132或171所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括cDNA。
174.根据实施方案171所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括所述RNA。
175.根据实施方案174所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括mRNA。
176.根据实施方案109-159或169-175中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括诱导型启动子或操纵子，其中所述启动子或操纵子被配置成阻遏或激活基因的表达。
177.根据实施方案176所述的经工程化的细胞，其中所述启动子或操纵子包括选自四环素控制的转录单位、地塞米松控制的转录单位、强力霉素控制的转录单位、C-mycR转录控制单位的任一者及其任何组合。
178.根据实施方案109-159或169-177中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸是密码子优化的。
179.根据实施方案109-159或169-178中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包含表观遗传修饰的碱基。
180.根据实施方案179所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括嘧啶。
181.根据实施方案180所述的经工程化的细胞，其中所述嘧啶是胞嘧啶或胸腺嘧啶。
182.根据实施方案179-181中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括选自甲基化碱基、羟甲基化碱基、甲酰化碱基和含羧酸碱基的任一者。
183.根据实施方案182所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括所述羟甲基化碱基。
184.根据实施方案182-183中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述羟甲基化碱基包括5-羟甲基化碱基。
185.根据实施方案184所述的经工程化的细胞，其中所述5-羟甲基化碱基包括5-羟甲基胞嘧啶。
186.根据实施方案182所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括所述甲基化碱基。
187.根据实施方案186所述的经工程化的细胞，其中所述甲基化碱基包括5-甲基化碱基。
188.根据实施方案187所述的经工程化的细胞，其中所述5-甲基化碱基包括5-甲基胞嘧啶。
189.一种方法，其包括使根据实施方案109-159或169-188中任一项所述的经工程化的细胞与刺激接触。
190.根据实施方案189所述的方法，其中所述刺激是环境刺激。
191.根据实施方案189-190中任一项所述的方法，其中所述刺激包括选自以下的变化的任一者：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、机械刺激的变化、离子水平、一种或多种离子类型的存在及其任何组合。
192.根据实施方案191所述的方法，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
193.根据实施方案192所述的方法，其中所述经工程化的细胞在用于所述至少部分地非贴壁依赖性增殖的约28℃至约34℃的温度下生长。
194.根据实施方案193所述的方法，其中所述刺激的去除减弱所述至少部分地非贴壁依赖性增殖。
195.根据实施方案192所述的方法，其中所述经工程化的细胞在用于所述至少部分地贴壁依赖性增殖的约37℃至约41℃的温度下生长。196.根据实施方案195所述的方法，其中所述刺激的去除减弱所述至少部分地贴壁依赖性增殖。
197.根据实施方案190-196中任一项所述的方法，其中通过转染、电穿孔或转导将所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸引入到所述经工程化的细胞中。
198.根据实施方案190-197中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸通过选自载体的任一者引入，其中所述载体是病毒、病毒样颗粒、腺相关病毒载体、脂质体、纳米颗粒、质粒、线性dsDNA及其组合。
199.根据实施方案198中任一项所述的方法，其中所述载体包括所述质粒。
200.根据实施方案189-199中任一项所述的方法，其中所述经工程化的细胞的增殖至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。
201.根据实施方案200所述的方法，其中所述经工程化的细胞的增殖通过使用选自计数室、集落形成单位计数、电阻、流式细胞术、图像分析、体视学细胞计数、分光光度法和阻抗微生物学的方法来确定。202.一种方法，其包括鞣制组织的至少一部分，其中所述组织包含根据实施方案109-159或169-188中任一项所述的经工程化的细胞。
203.根据实施方案202所述的方法，其中所述组织包含层状结构。
204.根据实施方案203所述的方法，其中所述层状结构包括选自真皮层、表皮层、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原的任一者及其组合。
205.根据实施方案202-204中任一项所述的方法，其中所述组织包括选自成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞的任一者及其组合。206.一种选择或筛选根据实施方案109-159或169-188中任一项所述的经工程化的细胞的方法。
207.一种合成皮革，其在鞣制之前包含组织的一部分，其中所述组织包含根据实施方案109-159或169-188中任一项所述的经工程化的细胞。
208.根据实施方案207所述的合成皮革，其中所述组织至少部分地经受进一步加工。
209.根据实施方案208所述的合成皮革，其中所述进一步加工选自鞣制、防腐、浸水、软化、浸酸、脱酸、削薄、复鞣、润滑、半硝、润湿、挤水、刮削、复铬鞣、中和、染色、乳液加脂、填充、剥离、加脂、增白、固定、定型、干燥、回潮、滚软、拉软、磨革、涂饰、涂油、刷涂、揩涂、浸涂、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、熨光、压花、熨平、打光、滚光及其任何组合。
210.根据实施方案207所述的合成皮革，其中所述合成皮革包含生物制造材料，其中所述生物制造材料包含所述经工程化的细胞。
211.根据实施方案210所述的合成皮革，其中所述生物制造材料包含区域性质。
212.一种培养器皿，其包含根据实施方案109-159或169-188中任一项所述的经工程化的细胞。
213.根据实施方案212所述的培养器皿，其中所述培养器皿包括选自塑料、金属、玻璃的任一者及其组合。
214.根据实施方案212所述的培养器皿，其中所述培养器皿包含导致所述经工程化的细胞黏附到所述培养器皿的至少一部分的试剂。
215.根据实施方案214所述的培养器皿，其中所述试剂包含聚-L-赖氨酸。
216.一种制造设施，其包含根据实施方案109-159或169-188中任一项所述的经工程化的细胞。
217.一种试剂盒，其包含根据实施方案109-159或169-188中任一项所述的经工程化的细胞。
218.根据实施方案217所述的试剂盒，其进一步包含生长培养基。
219.根据实施方案217或218中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含使用说明。
220.一种方法，其包括：将转染或转导的分离的细胞接种到支架上以形成人造真皮层，并使所述转染或转导的分离的细胞与培养基接触，其中所述转染或转导的分离的细胞包含外源多核苷酸，其中：
a.所述外源多核苷酸编码：
(i)与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用并改变所述肿瘤抑制蛋白或其片段的活性的多肽，其中所述肿瘤抑制蛋白或其片段的所述活性能够通过体外测定来测量，或
(ii)编码与所述肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用的所述多肽的多核苷酸；
b.当与所述培养基接触时，所述转染或转导的分离的细胞具有：
(i)相对于不与所述培养基接触的其他方面相同的细胞，增加的胶原的产生，
(ii)相对于不与所述培养基接触的其他方面相同的细胞，至少部分地增加的分化，或
(iii)(i)和(ii)的任何组合。
221.根据实施方案220所述的方法，其进一步包括使所述人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的人造真皮层。
222.根据实施方案221所述的方法，其进一步包括鞣制所述至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。
223.根据实施方案220所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码SV40大T抗原(SV40-TAg)多肽、端粒酶(TERT)蛋白、Bmi-1蛋白、细胞周期素D1蛋白、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。
224.根据实施方案223所述的方法，其中所述外源多核苷酸包含SV40-TAg基因、TERT基因、BMI1基因、CCND1基因、这些中的任一者的转录物、这些中的任一者的外显子或其任何组合。
225.根据实施方案223所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码SV40大T抗原(SV40-TAg)蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
226.根据实施方案223所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码TERT蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
227.根据实施方案223所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码Bmi-1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
228.根据实施方案223所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码细胞周期素D1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
229.根据实施方案220所述的方法，其中所述肿瘤抑制蛋白或其生物活性片段是细胞周期素依赖性激酶4、成视网膜细胞瘤、p53、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。
230.根据实施方案220-229中任一项所述的方法，其中在转染或转导之后，所述转染或转导的分离的细胞的细胞生长周期至少部分地不受抑制。
231.根据实施方案230所述的方法，其中在转染或转导之后，所述转染或转导的分离的细胞能够生长超过约50次细胞分裂、约70次细胞分裂、约90次细胞分裂或约100次细胞分裂。
232.根据实施方案220-231中任一项所述的方法，其中所述培养基包括生长培养基、组织形成培养基或其组合。
233.根据实施方案232所述的方法，其中在用所述外源多核苷酸转染或转导之后，当存在于所述生长培养基中时，所述转染或转导的分离的细胞(a)增殖，(b)避免衰老，或(c)两者。
234.根据实施方案232或233中任一项所述的方法，其中在所述接种之前，使所述转染或转导的分离的细胞在所述生长培养基中扩增以形成多个转染或转导的细胞。
235.根据实施方案233所述的方法，其中在所述接种之前，使所述转染或转导的分离的细胞在至少部分地抑制细胞黏附的容器中扩增。
236.根据实施方案232所述的方法，其中在所述接种之后，使所述转染或转导的分离的细胞与组织形成培养基接触。
237.根据实施方案232所述的方法，其中所述生长培养基包括生长因子、缓冲液、盐、糖、氨基酸、脂质、维生素、ECM蛋白、这些中的任一者的片段或其任何组合。
238.根据实施方案237所述的方法，其包含所述盐，其中所述盐包括无机盐。
239.根据实施方案238所述的方法，其中所述无机盐包括约0.2g/L氯化钙、约0.0001g/L硝酸铁·9H2O、约0.09767g/L硫酸镁(无水)、约0.4g/L氯化钾、约3.7g/L碳酸氢钠、约6.4g/L氯化钠、约0.109g/L磷酸二氢钠(无水)或其任何组合。
240.根据实施方案237所述的方法，其包含所述氨基酸，其中所述氨基酸包括约0.084g/L L-精氨酸·HCl、约0.0626g/L L-胱氨酸·2HCl、约0.03g/L甘氨酸、约0.042g/LL-组氨酸·HCl·H2O、约0.105g/L L-异亮氨酸、约0.105g/L L-亮氨酸、约1.46g/L L-赖氨酸·HCl、约0.03g/L L-甲硫氨酸、约0.066g/L L-苯丙氨酸、约0.042g/L L-丝氨酸、约0.095g/L L-苏氨酸、约0.016g/L L-色氨酸、约0.12037g/L L-酪氨酸·2Na·2H2O、约0.094g/L L-缬氨酸、约0.584g/L L-谷氨酰胺、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。
241.根据实施方案237所述的方法，其包含所述维生素，其中所述维生素包括约0.004g/L氯化胆碱、约0.004g/L叶酸、约0.0072g/Lmyo-肌醇、约0.004g/L烟酰胺、约0.004g/L D-泛酸(半钙)、约0g/L吡哆醛·HCl、约0.004g/L吡哆醇·HCl、约0.0004g/L核黄素、约0.004g/L硫胺素·HCl、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。
242.根据实施方案237所述的方法，其包含所述糖，其中所述糖包括D-葡萄糖、其立体异构体、其盐或其任何组合。
243.根据实施方案237所述的方法，其包含所述pH指示剂，其中所述pH指示剂包括约0.0159g/L酚红·Na、约0.11g/L丙酮酸·Na、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。
244.根据实施方案237所述的方法，其中所述生长培养基包括氨基酸、维生素、无机盐、胎牛血清、抗生素、抗真菌剂或其任何组合。245.根据实施方案232所述的方法，其包含所述组织形成培养基，其中所述组织形成培养基包括生长因子、缓冲液、盐、糖、维生素、氨基酸、脂质、矿物质、无机盐、ECM蛋白、人血小板裂解液、酸式柠檬酸右旋糖、肝素、抗坏血酸、TGF-β1、normocin、血清、血清替代物、非必需氨基酸、抗生素、抗真菌剂或其任何组合。
246.根据实施方案245所述的方法，其中所述组织形成培养基进一步包括约0.1％至约40％血清、血清替代物或其组合。
247.根据实施方案245所述的方法，其包含所述氨基酸，其中所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H2O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐-H2O、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。
248.根据实施方案245所述的方法，其包含所述维生素，其中所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、i-肌醇、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。
249.根据实施方案245所述的方法，其包含所述盐，其中所述盐包括氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。
250.根据实施方案245所述的方法，其中所述培养基进一步包括D-葡萄糖(右旋糖)、次黄嘌呤Na、亚油酸、硫辛酸、酚红、腐胺2HCl、丙酮酸钠、胸苷、这些中的任一者的立体异构体、这些中的任一者的盐或其任何组合。
251.根据实施方案245所述的方法，其包含所述血清替代物，其中所述血清替代物基本上不含动物衍生产品、无异种成分或其组合。
252.根据实施方案251所述的方法，其中所述血清替代物包括生长因子、胰岛素、转铁蛋白、细胞因子、必需氨基酸、非必需氨基酸、蛋白质、细胞外基质蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、细胞黏附肽、RGD、细胞外基质片段、激素、胶原、白蛋白、脂质、糖蛋白、蛋白质片段或其任何组合。
253.根据实施方案245所述的方法，其包含所述血清，其中所述血清包括胎牛血清(FBS)、马血清、胎小牛血清或其任何组合。
254.根据实施方案232-253中任一项所述的方法，其中所述培养基不包含TGFβ。
255.根据实施方案245-253中任一项所述的方法，其中在所述接种之后，使所述转染或转导的分离的细胞与所述组织形成培养基接触。
256.根据实施方案236或245-256中任一项所述的方法，其中当存在于所述组织形成培养基中时，相对于未与所述组织形成培养基接触的其他方面可比较的转染或转导的分离的细胞，所述转染或转导的分离的细胞(a)至少部分地增加胶原的产生，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者。
257.根据实施方案236或245-256中任一项所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞在与所述组织形成培养基接触时至少部分地分化。
258.根据实施方案1所述的方法，其中在所述接种之后，使所述转染或转导的分离的细胞与包含L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)、所述TGFB1、其盐、其生物活性片段或这些中的任一者的组合的培养基接触。
259.根据实施方案258所述的方法，其中当存在于包含所述AA2P、所述TGFB1、所述其盐、所述其生物活性片段或所述组合的所述培养基中时，相对于缺乏所述AA2P、所述其盐、所述TGFB1、所述其生物活性片段或所述组合的其他方面可比较的培养基，所述转染或转导的分离的细胞(a)至少部分地增加胶原的产生，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者。
260.根据实施方案258所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞在与所述培养基接触时至少部分地分化。
261.根据实施方案220-260中任一项所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞包括分离的永生化细胞、分离的重编程细胞、分离的祖细胞、分离的间充质干细胞或其任何组合。
262.根据实施方案220-261中任一项所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞包括分离的成纤维细胞、分离的间充质细胞、分离的干细胞衍生细胞、分离的脐带干细胞、分离的羊膜组织细胞、分离的瘢痕组织细胞或其任何组合。
263.根据实施方案220-262中任一项所述的方法，其中所述细胞展现胶原产生的标志物。
264.根据实施方案220-263中任一项所述的方法，其中所述细胞可以通过流式细胞术分离。
265.根据实施方案220-264中任一项所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞分离自牛、非人哺乳动物、爬行动物、鸟、鲨鱼、袋鼠、鱼或鳗鱼。
266.根据实施方案265所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞分离自所述牛，并且其中所述转染或转导的分离的细胞包括牛成纤维细胞。
267.根据实施方案265所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞分离自所述爬行动物，并且其中所述转染或转导的分离的细胞包括海龟细胞、蛇细胞、蜥蜴细胞、两栖动物细胞、鳄鱼细胞或短吻鳄细胞。
268.根据实施方案265所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞分离自所述非人哺乳动物。
269.根据实施方案265所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞分离自所述鸟。
270.根据实施方案220-267中任一项所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞衍生自瘢痕组织、脐带或其组合。
271.根据实施方案220所述的方法，其中在所述接种之前，针对所述外源多核苷酸的所述存在选择所述转染或转导的分离的细胞。
272.根据实施方案271所述的方法，其中针对所述外源多核苷酸的所述存在的所述选择包括抗生素选择。
273.根据实施方案272所述的方法，其中所述抗生素包括嘌呤霉素。274.根据实施方案220-273中任一项所述的方法，其中所述支架包含多孔材料。
275.根据实施方案274所述的方法，其中将所述转染或转导的分离的细胞移植到所述支架。
276.根据实施方案274或275所述的方法，其中所述支架包含合成材料、非合成材料或其组合。
277.根据实施方案276所述的方法，其包含所述非合成材料，其中所述非合成材料包括丝、天然组织黏合剂、纤维蛋白胶、胶原、基底膜蛋白、细胞外基质或其组合。
278.根据实施方案276所述的方法，其包含所述合成材料，其中所述支架包含聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺6,6(PA 6,6)、聚酰胺11(PA11)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚呋喃甲酸乙二醇酯(PEF)、聚氨酯(PU)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚(乙醇)酸(PGA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PVOH)、藻酸盐、PEG化纤维蛋白共聚物(P-纤维蛋白)、聚(癸二酸甘油酯)(PGS)、聚(L-乳酸)(PLLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚-D,L-乳酸/聚乙二醇/聚-D,L-乳酸(PDLLA-PEG)、透明质酸(HA)、碳纳米管、热塑性淀粉、莱赛尔/天丝(纤维素)、棉、韧皮纤维、黏胶竹、TiO2纳米纤维、纤维素材料、水凝胶材料、藻酸盐、明胶、尼龙、聚酯、丝、与细胞黏附肽交联的材料、与生长因子交联的材料或其任何组合。
279.一种包含外源分子的经工程化的细胞，其中所述外源分子至少部分地改变pRB或P53的活性，其中所述经工程化的细胞是永生化牛细胞。
280.根据实施方案279所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地改变包括抑制。
281.根据实施方案280所述的经工程化的细胞，其中所述抑制包括竞争性抑制。
282.根据实施方案281所述的经工程化的细胞，其中所述竞争性抑制对非转化细胞不起作用。
283.根据实施方案282所述的经工程化的细胞，其中所述竞争性抑制仅对遗传修饰的细胞起作用。
284.根据实施方案279所述的经工程化的细胞，其中所述分子包括RNA、DNA、小分子、其盐、多肽、激素或其生物活性片段。
285.根据实施方案284所述的经工程化的细胞，其包含所述DNA，其中所述DNA编码多肽或其生物活性片段。
286.根据实施方案284所述的经工程化的细胞，其包含所述RNA，其中所述RNA包括mRNA、siRNA或miRNA。
287.一种方法，其包括使包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞与包含约0.1％至约40％ FBS的培养基接触，其中当存在于包含所述FBS的所述培养基中时，所述转染或转导的分离的细胞(a)产生胶原，(b)具有至少部分地阻抑的细胞生长，或(c)两者，并且其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性在所述转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变。
288.根据实施方案287所述的方法，其中所述培养基包含约20％ FBS。289.根据实施方案287所述的方法，其中所述培养基进一步包含L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)、其盐、转化生长因子β1(TGFB1)、其生物活性片段或其任何组合。
290.根据实施方案287-289中任一项所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码SV40大T抗原、hTERT、Bmi-1、细胞周期素D1、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。
291.根据实施方案287-290中任一项所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞是成纤维细胞。
292.根据实施方案287-291中任一项所述的方法，其中所述转染或转导的分离的细胞分离自牛、非人哺乳动物、爬行动物、鸟、鲨鱼、袋鼠、鱼或鳗鱼。
293.根据实施方案222所述的方法，其中所述合成皮革被制成选自以下的任一者的形式：包袋、腰带、表带、包装、鞋子、靴子、鞋类、手套、衣服、背心、夹克、裤子、帽子、衬衫、内衣、行李、手拿包、钱包、球、背包、皮夹、鞍具、挽具、皮套裤、鞭子、家具、家具配件、室内装潢品、汽车车座、汽车内饰及其任何组合。
294.一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性在所述转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变，(ii)支架，和(iii)培养基，其中所述转染或转导的分离的细胞至少部分地容纳在所述支架之上、之中或周围。
295.一种人造真皮层，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，和(ii)支架，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性在所述转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变，并且其中所述转染或转导的分离的细胞至少部分地容纳在所述支架之上、之中或周围。
296.根据实施方案295所述的人造真皮层，其中所述人造真皮层的至少一部分至少部分地去细胞化。
297.根据实施方案296所述的人造真皮层，其中所述至少部分地去细胞化的组织的至少一部分被鞣制以形成合成皮革。
298.一种包含永生化成纤维细胞和培养基的组合物，所述培养基包含有效量的FBS、L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或其盐、转化生长因子β1(TGFB1)或其生物活性片段或其任何组合，其中当包含转染或转导的多核苷酸的报道细胞存在于所述培养基中时，相对于缺乏所述有效量的所述FBS、所述L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或所述其盐、所述转化生长因子β1(TGFB1)或所述其生物活性片段或所述组合的其他方面可比较的培养基，所述有效量足以诱导所述报道细胞：
(a)增加(i)胶原的产生；(ii)胶原的分泌；或(iii)两者，并且
(b)阻抑所述报道细胞中的细胞生长，
如通过以下确定：
(a)用编码SV40大T抗原、其生物活性片段、TERT、其生物活性片段或其任何组合的多核苷酸转染或转导细胞；
(b)使所述细胞在所述培养基和所述其他方面可比较的培养基中生长；
(c)将在所述培养基中生长的所述细胞的生长率相对于所述其他方
面可比较的培养基进行比较；以及
(d)将在所述培养基中产生的胶原的产量相对于所述其他方面可比较的培养基进行比较。
299.一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性在所述转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变，和(ii)根据实施方案29所述的培养基。
300.一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性在所述转染或转导的分离的细胞中至少部分地改变，和(ii)根据实施方案29所述的培养基。
301.一种方法，其包括：
1)将永生化动物成纤维细胞接种到支架上以形成人造真皮层；
2)使所述人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的人造真皮层；以及
3)鞣制所述至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。
302.根据实施方案301所述的方法，其中在所述接种之前，使所述永生化动物成纤维细胞在培养物中扩增以形成多个永生化动物成纤维细胞。
303.根据实施方案302所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过海弗利克极限。
304.根据实施方案303所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。
305.根据实施方案302所述的方法，其中在所述扩增之后，将所述多个永生化动物成纤维细胞在低于0℃的温度下储存。
306.根据实施方案305所述的方法，其中在所述储存之后，在所述接种之前，使所述多个永生化动物成纤维细胞在培养物中生长。
307.根据实施方案301-306中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括所述人造真皮层中胶原的交联。
308.根据实施方案301-307中任一项所述的方法，其中在所述将所述永生化动物成纤维细胞接种到所述支架上之后，所述方法进一步包括在所述支架上培养所述永生化动物成纤维细胞以形成所述人造真皮层。
309.根据实施方案301所述的方法，其中所述至少部分地去细胞化包括使所述人造真皮层与盐溶液、结晶盐或其组合接触。
310.根据实施方案301-309中任一项所述的方法，其中所述动物成纤维细胞包括牛成纤维细胞。
311.根据实施方案309所述的方法，其中所述接触包括将所述人造真皮层浸入所述盐溶液中。
312.根据实施方案309或311所述的方法，其中所述盐溶液包含氯化钠。
313.根据实施方案312所述的方法，其中所述氯化钠的浓度包含约30-40％氯化钠。
314.根据实施方案301-313中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括植物鞣制、铬鞣制、醛鞣制、合成鞣剂鞣制、细菌染色或其任何组合。
315.一种方法，其包括：
1)将永生化动物成纤维细胞接种到支架上以形成人造真皮层；
以及
2)鞣制所述人造真皮层以形成合成皮革。
316.根据实施方案315所述的方法，其中在所述接种之前，使所述永生化动物成纤维细胞在培养物中扩增以形成多个永生化动物成纤维细胞。
317.根据实施方案316所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过海弗利克极限。
318.根据实施方案317所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。
319.根据实施方案316所述的方法，其中在所述扩增之后，将所述多个永生化动物成纤维细胞在低于0℃的温度下储存。
320.根据实施方案319所述的方法，其中在所述储存之后，在所述接种到所述支架上之前，使所述多个永生化动物成纤维细胞在培养物中生长。
321.根据实施方案320所述的方法，其中所述培养所述永生化动物成纤维细胞包括扩增所述永生化动物成纤维细胞。
322.根据实施方案315-321中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括所述人造真皮层中胶原的交联。
323.根据实施方案315-322中任一项所述的方法，其中所述动物成纤维细胞包括牛成纤维细胞。
324.一种方法，其包括：将细胞接种到支架上，其中所述细胞包含外源分子；其中所述外源分子能够基于直接或间接刺激而导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地非贴壁依赖性增殖。
325.根据实施方案324所述的方法，其中所述细胞包括永生化细胞。326.根据实施方案325所述的方法，其中所述永生化细胞包括永生化成纤维细胞。
327.根据实施方案326所述的方法，其中所述永生化成纤维细胞包括永生化牛成纤维细胞。
328.根据实施方案324-327中任一项所述的方法，其中所述分子包括RNA、DNA或蛋白质。
329.根据实施方案328所述的方法，其包含所述DNA，其中所述DNA编码蛋白质。
330.一种方法，其包括：
将细胞接种到支架上，其中所述细胞包含至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者。
331.根据实施方案330所述的方法，其中所述细胞是永生化细胞。
332.根据实施方案330或331所述的方法，其进一步包括在所述接种之前，在第一环境中增殖所述细胞。
333.根据实施方案330-332中任一项所述的方法，其中所述细胞是多个细胞。
334.根据实施方案333所述的方法，其中所述多个细胞包含多个所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸或两者。
335.根据实施方案334所述的方法，其中所述多个所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸或两者在增殖期间至少部分地开启并且在所述接种期间至少部分地关闭。
336.根据实施方案334所述的方法，其中多个所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸或两者在所述增殖期间至少部分地关闭并且在所述接种期间至少部分地开启。
337.根据实施方案332所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地开启。
338.根据实施方案332所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地关闭。
339.根据实施方案330-338中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
340.根据实施方案330-338中任一项所述的方法，其中所述细胞选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞和兔形动物细胞。
341.根据实施方案332-340中任一项所述的方法，其中所述第一环境是在悬浮液中。
342.根据实施方案330-341中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关基于直接或间接刺激而至少部分地导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地贴壁依赖性增殖。
343.根据实施方案330-342中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地开启并且在所述接种期间至少部分地关闭。
344.根据实施方案330-342中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关在所述增殖期间至少部分地关闭并且在所述接种期间至少部分地开启。
345.根据实施方案330-344中任一项所述的方法，其中刺激的存在使得编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸的表达增加或表达减少。
346.根据实施方案330-344中任一项所述的方法，其中刺激的缺失使得编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述外源多核苷酸的表达增加或表达减少。
347.根据实施方案330-346中任一项所述的方法，其中所述增殖在存在所述刺激的情况下进行。
348.根据实施方案340-346中任一项所述的方法，其中所述增殖在缺失所述刺激的情况下进行。
349.根据实施方案330-348中任一项所述的方法，其中所述刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、磁荷、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、小分子、抗生素、激素、培养介质组成的变化及其任何组合。
350.根据实施方案349所述的方法，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
351.根据实施方案330-350中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关是基于温度可逆的。
352.根据实施方案330-351中任一项所述的方法，其中在所述增殖期间，使所述细胞暴露于约28℃至约34℃的温度。
353.根据实施方案330-352中任一项所述的方法，其中在所述接种之后，使所述细胞暴露于约37℃至约41℃的温度。
354.根据实施方案330-353中任一项所述的方法，其中所述支架是至少部分地天然的或合成的。
355.根据实施方案330-354中任一项所述的方法，其中所述支架包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶及其任何组合中的至少一者。
356.根据实施方案330-355中任一项所述的方法，其中所述细胞产生细胞外基质蛋白。
357.根据实施方案356所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白选自I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸及其任何组合。
358.根据实施方案330-357中任一项所述的方法，其进一步包括生成包含所述细胞或由其发育的组织的一部分的合成皮革的至少一部分。359.根据实施方案358所述的方法，其中所述合成皮革包含所述组织的至少一部分。
360.根据实施方案359所述的方法，其中所述组织包含I型胶原。
361.根据实施方案330或331所述的方法，其进一步包括在所述接种之前，在第一环境中增殖所述细胞，然后将所述至少部分地可逆的外源分子开关直接或间接添加到所述增殖细胞中。
362.根据实施方案330-361中任一项所述的方法，其中所述细胞以约30,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2的密度接种。
363.根据实施方案330-362中任一项所述的方法，其中所述将所述细胞接种到支架上包括接种所述支架的一侧。
364.根据实施方案363所述的方法，其中在不翻转所述支架的情况下接种所述支架的第二侧。
365.根据实施方案330-362中任一项所述的方法，其中所述将所述细胞接种到支架上包括在所述支架的多于一侧上接种。
366.根据实施方案365所述的方法，其中所述接种是连续的或同时的。
367.根据实施方案365所述的方法，其中所述接种包括在所述支架的一侧上接种，然后翻转所述支架并接种所述支架的另一侧。
368.一种方法，其包括：
a.将细胞转化成永生化细胞；
b.向所述永生化细胞中引入至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或两者，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸中的每一者或两者使得所述永生化细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地增殖或至少部分地贴壁依赖性地增殖；以及
c.使所述永生化细胞非贴壁依赖性地增殖。
369.根据实施方案368所述的方法，其中所述细胞选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞、有袋类动物细胞、爬行动物细胞和兔形动物细胞。370.根据实施方案369所述的方法，其中所述细胞是所述牛细胞。
371.根据实施方案368-370中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
372.根据实施方案371所述的方法，其中所述干细胞选自间充质干细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
373.根据实施方案368-372中任一项所述的方法，其中所述细胞选自成纤维细胞、动物脂肪组织衍生细胞、脐带衍生细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞及其组合。
374.根据实施方案368-373中任一项所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
375.根据实施方案368-374中任一项所述的方法，其中所述转化包括增加或减少癌基因或参与细胞增殖调节的基因的表达。
376.根据实施方案368-375中任一项所述的方法，其中所述细胞表达由TERT、Bmi1或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
377.根据实施方案368-376中任一项所述的方法，其中所述永生化细胞表达由TERT、CcnD1、Cdk4或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
378.根据实施方案368-376中任一项所述的方法，其进一步包括使所述永生化细胞暴露于所述刺激。
379.根据实施方案378所述的方法，其中所述刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、培养介质组成的变化及其任何组合。
380.根据实施方案379所述的方法，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
381.根据实施方案380所述的方法，其中所述温度为约28℃至约34℃。382.根据实施方案381所述的方法，其中所述刺激使得所述永生化细胞至少部分地非贴壁依赖性地增殖。
383.根据实施方案382所述的方法，其中非贴壁依赖性包括在悬浮液中增殖。
384.根据实施方案382或383中任一项所述的方法，其中所述刺激的去除使得所述永生化细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。
385.根据实施方案368-383中任一项所述的方法，其进一步包括使所述永生化细胞暴露于第二刺激。
386.根据实施方案385所述的方法，其中所述第二刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、磁荷、离子存在与否、离子水平、一种或多种离子类型的存在、机械刺激的变化、小分子、抗生素、激素、培养介质组成的变化及其任何组合。
387.根据实施方案386所述的方法，其中所述第二刺激包括所述温度的所述变化。
388.根据实施方案387所述的方法，其中所述温度为约37℃至约41℃。389.根据实施方案381所述的方法，其中所述第二刺激使得所述永生化细胞至少部分地贴壁依赖性地增殖。
390.根据实施方案389所述的方法，其中所述第二刺激的去除使得所述永生化细胞至少部分地非贴壁依赖性地增殖。
391.根据实施方案390所述的方法，其中贴壁依赖性包括在基底上增殖。
392.根据实施方案391所述的方法，其进一步包括将所述永生化细胞接种在所述基底上。
393.根据实施方案392所述的方法，其中所述永生化细胞以约30,000个细胞/cm2至约1,000,000个细胞/cm2的密度接种。
394.根据实施方案392所述的方法，其中所述将所述永生化细胞接种在所述基底上包括接种所述基底的一侧。
395.根据实施方案394所述的方法，其中在不翻转所述基底的情况下接种所述基底的第二侧。
396.根据实施方案392所述的方法，其中所述将所述永生化细胞接种在所述基底上包括在所述基底的多于一侧上接种。
397.根据实施方案396所述的方法，其中所述接种是连续的或同时的。
398.根据实施方案396所述的方法，其中所述接种包括在所述基底的一侧上接种，然后翻转所述基底并接种所述基底的另一侧。
399.根据实施方案392所述的方法，其中所述贴壁依赖性增殖至少部分地在所述基底之上、之中或周围进行。
400.根据实施方案399所述的方法，其中所述基底包含支架。
401.根据实施方案400所述的方法，其中所述支架是至少部分地天然的或合成的。
402.根据实施方案400或301所述的方法，其中所述支架包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶或其组合。403.根据实施方案390-402中任一项所述的方法，其中与不包含所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，所述细胞或永生化细胞被修饰成具有增强的细胞外基质产生。
404.根据实施方案369-403中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。
405.根据实施方案368-404中任一项所述的方法，其进一步包括对包含所述细胞或所述永生化细胞的组织进行工程化。
406.根据实施方案405所述的方法，其进一步包括鞣制所述组织。
407.根据实施方案404所述的方法，其中所述细胞外基质包括I型胶原。
408.一种经工程化的细胞，其包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合，其中所述经工程化的细胞是永生化牛细胞。
409.根据实施方案408所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关使得所述经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地生长或至少部分地贴壁依赖性地生长。
410.根据实施方案409所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞的增殖至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。
411.一种经工程化的细胞，其包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关使得所述经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性或至少部分地贴壁依赖性地生长。
412.根据实施方案411所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞的增殖至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。
413.根据实施方案411所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是原核细胞或真核细胞。
414.根据实施方案411所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是动物细胞。
415.根据实施方案411所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是分离的细胞、富集的细胞群体、纯化的群体或其任何组合。416.根据实施方案411-415中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是非人细胞。
418.根据实施方案411-416中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞选自灵长类动物细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、马细胞、犬细胞、猫细胞、啮齿动物细胞、鸟细胞和兔形动物细胞。419.根据实施方案418所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是所述牛细胞。
420.根据实施方案411-419中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是永生化细胞。
421.根据实施方案418-420中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞选自成纤维细胞、动物脂肪组织衍生细胞、脐带衍生细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、立方细胞、柱状细胞、胶原产生细胞及其组合。
422.根据实施方案421所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
423.根据实施方案408-422中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞衍生自多能干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。
424.根据实施方案408-422中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞衍生自活检。
425.根据实施方案408-424中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是来自包括多种细胞的细胞系的细胞。
426.根据实施方案408-425中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞表达外源癌基因或参与细胞增殖调节的基因。
427.根据实施方案408-426中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞表达由TERT、Bmi1或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
428.根据实施方案408-426中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞表达由TERT、CcnD1、Cdk4或其任何组合编码的多肽或其生物活性片段。
429.根据实施方案408-428中任一项所述的经工程化的细胞，其中与不包含所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的其他方面可比较的野生型细胞相比，所述经工程化的细胞被修饰成具有增强的细胞外基质产生。430.根据实施方案429所述的经工程化的细胞，其中所述细胞外基质包括I型胶原、III型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或其组合。
431.根据实施方案408-430中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸被配置成响应于所述刺激而至少部分地增加或减少表达。
432.根据实施方案431所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的增加的表达导致所述至少部分地贴壁依赖性增殖。433.根据实施方案431所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的增加的表达导致所述至少部分地非贴壁依赖性增殖。
434.根据实施方案431所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的减少的表达导致所述至少部分地贴壁依赖性增殖。435.根据实施方案431所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸的减少的表达导致所述至少部分地非贴壁依赖性增殖。
436.根据实施方案408-435中任一项所述的经工程化的细胞，其中与非贴壁依赖性增殖相比，所述至少部分地贴壁依赖性增殖消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。
437.根据实施方案408-435中任一项所述的经工程化的细胞，其中与所述至少部分地贴壁依赖性增殖相比，所述至少部分地非贴壁依赖性增殖消耗更多、相同或更少的营养物或生长因子。
438.根据实施方案408-437中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸是单个开关或多个开关。
439.根据实施方案408-438中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸编码可选择标志物。
440.根据实施方案439所述的经工程化的细胞，其中所述可选择标志物包括荧光蛋白。
441.根据实施方案408-438中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞包含重组可选择标志物。
442.根据实施方案441所述的经工程化的细胞，其中所述可选择标志物选自抗生素抗性基因、编码荧光蛋白的基因和表达营养缺陷型标志物的基因。
443.根据实施方案408-442中任一项所述的经工程化的细胞，其包含编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸，其中所述多核苷酸位于基因组中、在染色体外或其组合。
444.根据实施方案409-443中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激是环境刺激。
445.根据实施方案409-444中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激选自以下的变化：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、离子水平、机械刺激、一种或多种离子类型的存在、培养介质组成的变化及其任何组合。
446.根据实施方案445所述的经工程化的细胞，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
447.根据实施方案446所述的经工程化的细胞，其中用于所述至少部分地非贴壁依赖性增殖的所述温度为约28℃至约34℃。
448.根据实施方案446或447所述的经工程化的细胞，其中用于所述至少部分地贴壁依赖性增殖的所述温度为约37℃至约41℃。
449.根据实施方案408-448中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的存在导致贴壁依赖性增殖。
450.根据实施方案408-448中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的缺失导致贴壁依赖性增殖。
451.根据实施方案408-448中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的存在导致非贴壁依赖性增殖。
452.根据实施方案408-448中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激的缺失导致非贴壁依赖性增殖。
453.根据实施方案409-444中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述刺激选自以下的存在、缺失或水平的变化：抗生素、蛋白质、化学化合物、这些中的任一者的盐及其任何组合。
454.根据实施方案409-453中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地非贴壁依赖性增殖至少部分地是以下的表达增加的结果：整合素连接激酶(ILK)、细胞周期素D1、Cdk4、ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶5(ST6GALNAC5)或其组合。
455.根据实施方案408-454中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞在生物反应器中生长。
456.根据实施方案409-455中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述至少部分地非贴壁依赖性增殖至少部分地在悬浮液中进行，并且其中所述贴壁依赖性增殖至少部分地在支架之上、之中或周围进行。
457.根据实施方案456所述的经工程化的细胞，其中所述支架是至少部分地天然的或合成的。
458.根据实施方案456或457所述的经工程化的细胞，其中所述支架包含丝、聚丙交酯、聚乙交酯、聚酯、聚己内酯、壳聚糖、水凝胶或其组合。
459.一种分离的组织，其包含根据实施方案408-458中任一项所述的经工程化的细胞。
460.根据实施方案459所述的分离的组织，其中所述组织包含多个聚酯纤维。
461.根据实施方案459所述的分离的组织，其中所述组织的至少一部分被鞣制。
462.根据实施方案462所述的分离的组织，其中所述组织的所述至少一部分用鞣剂鞣制，所述鞣剂包括：铬、铝、锆、钛、铁、硅酸铝钠、甲醛、戊二醛、噁唑烷、异氰酸酯、碳二亚胺、聚氨基甲酰硫酸酯、四羟基硫酸鏻、对-[(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]苯磺酸钠、邻苯三酚、邻苯二酚、合成鞣剂或其任何组合。
463.根据实施方案461所述的分离的组织，其中所述组织的至少一部分进一步包含细胞外基质。
464.一种皮革，其包含根据实施方案408-458中任一项所述的经工程化的细胞的至少一部分、其衍生物或其子代或根据实施方案459-463所述的分离的组织。
465.根据实施方案464所述的皮革，其中所述皮革呈选自以下中的任一者的形式：包袋、腰带、表带、包装、鞋子、靴子、鞋类、手套、衣服、背心、夹克、裤子、帽子、衬衫、内衣、行李、手拿包、钱包、球、背包、皮夹、鞍具、挽具、皮套裤、鞭子、家具、家具配件、室内装潢品、汽车车座、汽车内饰及其任何组合。
466.根据实施方案464所述的皮革，其中所述皮革包含生物制造材料。
467.根据实施方案466所述的皮革，其中所述生物制造材料包含区域性质。
468.根据实施方案408-458中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞包括选自c-MycER系统、Tet-on系统、Tet-off系统的任一者及其组合。
469.根据实施方案408-458或468中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞包括选自Cre-LoxP系统、TALENS、锌指、CRISPR系统或其组件的任一者及其任何组合。
470.根据实施方案408-458或468-469中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括DNA、RNA或其组合。
471.根据实施方案470所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括所述DNA。
472.根据实施方案471或470所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括cDNA。
473.根据实施方案470所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括所述RNA。
474.根据实施方案473所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括mRNA。
475.根据实施方案408-458或468-474中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包括诱导型启动子或操纵子，其中所述启动子或操纵子被配置成阻遏或激活基因的表达。
476.根据实施方案475所述的经工程化的细胞，其中所述启动子或操纵子包括选自四环素控制的转录单位、地塞米松控制的转录单位、强力霉素控制的转录单位、C-mycR转录控制单位的任一者及其任何组合。
477.根据实施方案408-458或468-476中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸是密码子优化的。
478.根据实施方案408-458或468-476中任一项所述的经工程化的细胞，其中编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸包含表观遗传修饰的碱基。
479.根据实施方案478所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括嘧啶。
480.根据实施方案479所述的经工程化的细胞，其中所述嘧啶是胞嘧啶或胸腺嘧啶。
481.根据实施方案478-480中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括选自甲基化碱基、羟甲基化碱基、甲酰化碱基和含羧酸碱基的任一者。
482.根据实施方案481所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括所述羟甲基化碱基。
483.根据实施方案481-482中任一项所述的经工程化的细胞，其中所述羟甲基化碱基包括5-羟甲基化碱基。
484.根据实施方案483所述的经工程化的细胞，其中所述5-羟甲基化碱基包括5-羟甲基胞嘧啶。
485.根据实施方案481所述的经工程化的细胞，其中所述表观遗传修饰的碱基包括所述甲基化碱基。
486.根据实施方案485所述的经工程化的细胞，其中所述甲基化碱基包括5-甲基化碱基。
487.根据实施方案486所述的经工程化的细胞，其中所述5-甲基化碱基包括5-甲基胞嘧啶。
488.一种方法，其包括使根据实施方案408-458或468-487中任一项所述的经工程化的细胞与刺激接触。
489.根据实施方案488所述的方法，其中所述刺激是环境刺激。
490.根据实施方案488-489中任一项所述的方法，其中所述刺激包括选自以下的变化的任一者：pH、光、温度、电流、微环境、离子存在与否、机械刺激的变化、离子水平、一种或多种离子类型的存在及其任何组合。
491.根据实施方案490所述的方法，其中所述刺激包括所述温度的所述变化。
492.根据实施方案491所述的方法，其中所述经工程化的细胞在用于所述至少部分地非贴壁依赖性增殖的约28℃至约34℃的温度下生长。
493.根据实施方案492所述的方法，其中所述刺激的去除减弱所述至少部分地非贴壁依赖性增殖。
494.根据实施方案491所述的方法，其中所述经工程化的细胞在用于所述至少部分地贴壁依赖性增殖的约37℃至约41℃的温度下生长。495.根据实施方案494所述的方法，其中所述刺激的去除减弱所述至少部分地贴壁依赖性增殖。
496.根据实施方案489-495中任一项所述的方法，其中通过转染、电穿孔或转导将所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸引入到所述经工程化的细胞中。
497.根据实施方案489-496中任一项所述的方法，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的所述多核苷酸通过选自载体的任一者引入，其中所述载体是病毒、病毒样颗粒、腺相关病毒载体、脂质体、纳米颗粒、质粒、线性dsDNA及其组合。
498.根据实施方案497中任一项所述的方法，其中所述载体包括所述质粒。
499.根据实施方案488-498中任一项所述的方法，其中所述经工程化的细胞的增殖至少部分地通过选自人工细胞计数、自动细胞计数和间接细胞计数的方法来确定。
500.根据实施方案399所述的方法，其中所述经工程化的细胞的增殖通过使用选自计数室、集落形成单位计数、电阻、流式细胞术、图像分析、体视学细胞计数、分光光度法和阻抗微生物学的方法来确定。501.一种方法，其包括鞣制组织的至少一部分，其中所述组织包含根据实施方案408-458或468-487中任一项所述的经工程化的细胞。
502.根据实施方案501所述的方法，其中所述组织包含层状结构。
503.根据实施方案502所述的方法，其中所述层状结构包括选自真皮层、表皮层、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原的任一者及其组合。
504.根据实施方案501-503中任一项所述的方法，其中所述组织包括选自成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、上皮细胞的任一者及其组合。505.一种选择或筛选根据实施方案408-458或468-487中任一项所述的经工程化的细胞的方法。
506.一种合成皮革，其在鞣制之前包含组织的一部分，其中所述组织包含根据实施方案408-458或468-487中任一项所述的经工程化的细胞。
507.根据实施方案506所述的合成皮革，其中所述组织至少部分地经受进一步加工。
508.根据实施方案507所述的合成皮革，其中所述进一步加工选自鞣制、防腐、浸水、软化、浸酸、脱酸、削薄、复鞣、润滑、半硝、润湿、挤水、刮削、复铬鞣、中和、染色、乳液加脂、填充、剥离、加脂、增白、固定、定型、干燥、回潮、滚软、拉软、磨革、涂饰、涂油、刷涂、揩涂、浸涂、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、熨光、压花、熨平、打光、滚光及其任何组合。
509.根据实施方案506所述的合成皮革，其中所述合成皮革包含生物制造材料，其中所述生物制造材料包含所述经工程化的细胞。
510.根据实施方案509所述的合成皮革，其中所述生物制造材料包含区域性质。
511.一种培养器皿，其包含根据实施方案109-159、169-188、279-286、408-458或468-487中任一项所述的经工程化的细胞。
512.根据实施方案511所述的培养器皿，其中所述培养器皿包括选自塑料、金属、玻璃的任一者及其组合。
513.根据实施方案511所述的培养器皿，其中所述培养器皿包含导致所述经工程化的细胞黏附到所述培养器皿的至少一部分的试剂。
514.根据实施方案513所述的培养器皿，其中所述试剂包含聚-L-赖氨酸。
515.一种制造设施，其包含根据实施方案408-458或468-487中任一项所述的经工程化的细胞。
516.一种试剂盒，其包含根据实施方案408-458或468-487中任一项所述的经工程化的细胞。
517.根据实施方案516所述的试剂盒，其进一步包含生长培养基。
518.根据实施方案516或517中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含使用说明。
尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变型、变化和替换。应当理解，在实施本发明时，可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

Claims (75)

1.一种方法，其包括：将转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到支架上以形成人造真皮层，并使所述转染或转导的分离的细胞与培养基接触，其中所述转染或转导的分离的细胞包含外源多核苷酸，其中：
a.所述外源多核苷酸编码：
(i)与肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用并改变所述肿瘤抑制蛋白或其片段的活性的多肽，其中所述肿瘤抑制蛋白或其片段的所述活性能够通过体外测定来测量，或
(ii)编码与所述肿瘤抑制蛋白或其片段相互作用的所述多肽的多核苷酸；
b.当与所述培养基接触时，所述转染或转导的分离的细胞具有：
(i)相对于不与所述培养基接触的其他方面相同的细胞，增加的胶原的产生，
(ii)相对于不与所述培养基接触的其他方面相同的细胞，至少部分地增加的分化，或
(iii)(i)和(ii)的任何组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的人造真皮层。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括鞣制所述至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码SV40大T抗原(SV40-TAg)多肽、端粒酶(TERT)蛋白、Bmi-1蛋白、细胞周期素D1蛋白、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述外源多核苷酸包含SV40-TAg基因、TERT基因、BMI1基因、CCND1基因、这些中的任一者的转录物、这些中的任一者的外显子或其任何组合。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码SV40大T抗原(SV40-TAg)蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码TERT蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码Bmi-1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述外源多核苷酸编码细胞周期素D1蛋白、其生物活性片段或其任何组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤抑制蛋白或其生物活性片段是细胞周期素依赖性激酶4、成视网膜细胞瘤、p53、这些中的任一者的生物活性片段或其任何组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在转染或转导之后，所述转染或转导的分离的细胞的细胞生长周期至少部分地不受抑制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在转染或转导之后，所述转染或转导的分离的细胞能够生长超过约50次细胞分裂、约70次细胞分裂、约90次细胞分裂或约100次细胞分裂。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述培养基包括生长培养基、组织形成培养基或其组合。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在用所述外源多核苷酸转染或转导之后，当存在于所述生长培养基中时，所述转染或转导的分离的细胞(a)增殖，(b)避免衰老，或(c)两者。
15.根据权利要求13所述的方法，其中在所述接种之前，使所述转染或转导的分离的细胞在所述生长培养基中扩增以形成多个转染或转导的细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在所述接种之前，使所述转染或转导的分离的细胞在至少部分地抑制细胞黏附的容器中扩增。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在所述接种之后，使所述转染或转导的分离的细胞与组织形成培养基接触。
18.根据权利要求14所述的方法，或根据包括所述生长培养基的权利要求13所述的方法，其中所述生长培养基包括生长因子、缓冲液、盐、糖、氨基酸、脂质、维生素、ECM蛋白、这些中的任一者的片段或其任何组合。
19.一种包含外源分子的分离的经工程化的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中所述外源分子至少部分地改变pRB或P53的活性，其中所述分离的经工程化的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞是分离的永生化牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
20.根据权利要求19所述的分离的经工程化的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中所述细胞与支架接触。
21.根据权利要求20所述的经工程化的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中所述支架包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其组合。
22.一种组合物，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性在所述转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞中至少部分地改变，(ii)支架，和(iii)培养基，其中所述转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞至少部分地容纳在所述支架之上、之中或周围。
23.根据权利要求22所述的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中所述细胞与支架接触。
24.根据权利要求23所述的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中所述支架包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。
25.一种人造真皮层，其包含：(i)包含外源多核苷酸的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，和(ii)支架，其中在转染或转导之后，pRB或P53中至少一者的活性在所述转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞中至少部分地改变，并且其中所述转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞至少部分地容纳在所述支架之上、之中或周围。
26.一种方法，其包括使根据权利要求25所述的人造真皮层至少部分地去细胞化以产生至少部分地去细胞化的人造真皮层。
27.一种方法，其包括鞣制根据权利要求26所述的至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。
28.根据权利要求25所述的人造真皮层，其中所述支架包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。
29.一种包含分离的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞和培养基的组合物，所述培养基包含有效量的FBS、L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或其盐、转化生长因子β1(TGFB1)或其生物活性片段或其任何组合，其中当包含转染或转导的多核苷酸的报道细胞存在于所述培养基中时，相对于缺乏所述有效量的所述FBS、所述L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA2P)或所述其盐、所述转化生长因子β1(TGFB1)或所述其生物活性片段或所述组合的其他方面可比较的培养基，所述有效量足以诱导所述报道细胞：
(a)增加(i)胶原的产生；(ii)胶原的分泌；或(iii)两者，并且
(b)阻抑所述报道细胞中的细胞生长，如通过以下所确定：
(c)用编码SV40大T抗原、SV40大T抗原的生物活性片段、TERT、TERT的生物活性片段或其任何组合的多核苷酸转染或转导细胞；
(d)使所述细胞在所述培养基和所述其他方面可比较的培养基中生长；
(e)将在所述培养基中生长的所述细胞的生长率相对于所述其他方面可比较的培养基进行比较；以及
(f)将在所述培养基中产生的胶原的产量相对于所述其他方面可比较的培养基进行比较。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述细胞与支架接触。
31.根据权利要求30所述的转染或转导的分离的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞，其中所述支架包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。
32.一种方法，其包括：
1)将分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到支架上以形成人造真皮层；
2)使所述人造真皮层至少部分地去细胞化以形成至少部分地去细胞化的人造真皮层；以及
3)鞣制所述至少部分地去细胞化的人造真皮层以形成合成皮革。
33.根据权利要求32所述的方法，其中在所述接种之前，使所述分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中扩增以形成多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过海弗利克极限。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中在所述扩增之后，将所述多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在低于0℃的温度下储存。
37.根据权利要求36所述的方法，其中在所述储存之后，在所述接种之前，使所述多个分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中生长。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述支架包含丝心蛋白、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳纤维、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、烯烃聚酯、聚乳酸(PLA)、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻或其任何组合。
39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括所述人造真皮层中胶原的交联。
40.根据权利要求32-39中任一项所述的方法，其中在所述将所述分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到所述支架上之后，所述方法进一步包括在所述支架上培养所述分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞以形成所述人造真皮层。
41.根据权利要求32所述的方法，其中所述至少部分地去细胞化包括使所述人造真皮层与盐溶液、结晶盐或其组合接触。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述接触包括将所述人造真皮层浸入所述盐溶液中。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述盐溶液包含氯化钠。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述氯化钠的浓度包含约30-40％氯化钠。
45.根据权利要求32-44中任一项所述的方法，其中所述动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞包括牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
46.根据权利要求32-45中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括植物鞣制、铬鞣制、醛鞣制、合成鞣剂鞣制、细菌染色或其任何组合。
47.一种方法，其包括：
1)将分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞接种到支架上以形成人造真皮层；
2)从所述人造真皮层去除细胞层的至少一部分；以及
3)鞣制所述人造真皮层以形成合成皮革。
48.根据权利要求47所述的方法，其中在所述接种之前，使所述分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中扩增以形成多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过海弗利克极限。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞能够生长超过约40次细胞分裂、约50次细胞分裂或约60次细胞分裂。
51.根据权利要求50所述的方法，其中在所述扩增之后，将所述多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在低于0℃的温度下储存。
52.根据权利要求51所述的方法，其中在所述储存之后，在所述接种到所述支架上之前，使所述多个永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞在培养物中生长。
53.根据权利要求52所述的方法，其中培养所述分离的永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞包括扩增所述永生化动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
54.根据权利要求47-53中任一项所述的方法，其中所述鞣制包括所述人造真皮层中胶原的交联。
55.根据权利要求47-54中任一项所述的方法，其中所述动物成纤维细胞或成纤维细胞样细胞包括牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
56.一种方法，其包括：将分离的细胞接种到支架上，其中所述分离的细胞包含外源分子；其中所述外源分子能够基于直接或间接刺激而导致非贴壁依赖性增殖或至少部分地非贴壁依赖性增殖。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述细胞包括永生化细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述永生化细胞包括永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞包括永生化牛成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的方法，其中所述分子包括RNA、DNA或蛋白质。
61.根据权利要求60所述的方法，其包含所述DNA，其中所述DNA编码蛋白质。
62.一种方法，其包括：
将分离的细胞接种到支架上，其中所述细胞包含至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或这两者。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述分离的细胞是分离的永生化细胞。
64.一种方法，其包括：
a.将分离的成纤维细胞转化成分离的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞；
b.向所述分离的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞中引入至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸或这两者，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关、编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的外源多核苷酸中的每一者或两者使得所述永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地增殖或至少部分地贴壁依赖性地增殖；以及
c.使所述永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞非贴壁依赖性地增殖。
65.一种经工程化的细胞，其包含至少部分地可逆的外源分子开关或编码所述至少部分地可逆的外源分子开关的多核苷酸或其组合，其中所述至少部分地可逆的外源分子开关使得所述经工程化的细胞基于直接或间接刺激而至少部分地非贴壁依赖性地生长或至少部分地贴壁依赖性地生长。
66.一种组合物，其包含：包含体外培养的永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞的分离的人造真皮层，和支架，其中所述永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞至少部分地与所述支架接触。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述分离的人造真皮层的细胞层的至少一部分已被去除。
68.根据权利要求66所述的组合物，其中所述支架包括天然支架、合成支架或其组合。
69.根据权利要求68所述的组合物，其包含所述合成支架。
70.根据权利要求68所述的组合物，其包含所述天然支架。
71.根据权利要求66所述的组合物，其中所述支架包括至少部分地中空的结构。
72.根据权利要求66所述的组合物，其中所述支架包含胶原、纤维素、棉、乙酸酯、丙烯酸、胶乳、亚麻布、尼龙、人造丝、天鹅绒、变性聚丙烯腈纤维、莎纶、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹、亚麻、藻酸盐、纤连蛋白、聚对苯二甲酰对苯二胺、聚乙烯、聚丙烯、角叉菜胶、琼脂糖、纤维蛋白、玻璃、二氧化硅、芳族聚酰胺、碳、聚(四氟乙烯)、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯腈、壳聚糖、聚氨酯、聚(氨酯-脲)、聚邻苯二甲酸乙二醇酯、甲壳质、弹性蛋白、角蛋白、聚羟基链烷酸酯、葡聚糖、普鲁兰多糖、聚透明质酸、聚(3-羟基链烷酸酯)、聚(3-羟基辛酸酯)、聚(3-羟基脂肪酸)、聚(己内酯)、聚(对二氧环己酮)、层粘连蛋白、玉米醇溶蛋白、酪蛋白、明胶、谷蛋白、白蛋白、聚L-乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或其任何组合。
73.根据权利要求66所述的组合物，其中所述永生化成纤维细胞或成纤维细胞样细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原、III型胶原、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。
74.根据权利要求66所述的组合物，其中所述人造真皮层包含胶原。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述胶原至少部分地由胶原产生细胞产生，是单独添加的，或其任何组合。
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