KR102363065B1 - 조작된 피부 등가물, 그의 제조 방법 및 그로부터 유래된 산물 - Google Patents

조작된 피부 등가물, 그의 제조 방법 및 그로부터 유래된 산물 Download PDF

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Abstract

본원에는 합성 가죽, 인공 표피 층, 인공 진피 층, 층상 구조물, 그로부터 생산된 산물 및 그의 생산 방법이 개시된다.

Description

조작된 피부 등가물, 그의 제조 방법 및 그로부터 유래된 산물
상호 참조
본 출원은 2016년 4월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 62/325,819를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원 (NIH) 보조금 번호 R21 ARO61583 및 R01 AR051930, 영국 의학 연구 협의회 보조금 번호 G0801061, 재향 군인회 및 이영양성 수포성 표피박리증 연구 협회의 연구 서비스의 지원으로 이루어졌다.
본원에는 합성 가죽을 제조하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 섬유모세포를 포함하는 인공 진피 층을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 진피 층의 적어도 일부분을 태닝함으로써, 합성 가죽을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 인공 표피 층을 형성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표피 층을 진피 층 상에 위치시킴으로써 층상 구조물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 포유동물 케라틴세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 안료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 포유동물 멜라닌세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 비-포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱은 보존처리, 침지, 효해, 침산, 탈침산, 시닝, 리태닝, 윤활, 크러스팅, 습윤화, 새밍, 쉐이빙, 리크로밍, 중화, 염색, 유화가지, 필링, 스트리핑, 스터핑, 화이트닝, 고착, 세팅, 건조, 컨디셔닝, 밀링, 스테이킹, 버핑, 피니싱, 오일링, 브러싱, 패딩, 함침, 분무, 롤러 코팅, 커튼 코팅, 폴리싱, 플레이팅, 엠보싱, 아이어닝, 글레이징, 텀블링 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 생산 세포에 의해 적어도 부분적으로 생산될 수 있거나, 별도로 부가될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포, 케라틴세포, 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 상피 세포는 편평 세포, 입방 세포, 원주 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 케라틴세포를 포함할 수 있으며, 여기서 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 평활근 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 진피 층 및 제2 진피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 진피 층은 제2 진피 층 상에 위치시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 표피 층 및 제2 표피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 기저 막 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 표피 층과 진피 층 사이에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 조직 접착제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 조직 접착제는 피브린 글루를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 합성 가죽에 부분적으로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층 또는 표피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 보충물과 함께 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 콜라겐, 피브린, 성장 인자, 아스코르브산, 덱스트란 술페이트, 또는 카라기난 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 천연 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 합성 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 다능성 줄기 세포은 성체 체세포에서의 Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 또는 그의 조합의 유도된 유전자 발현을 통하여 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품의 적어도 일부분은 본원에 개시된 방법으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 시계줄, 벨트, 패키징, 구두, 부츠, 신발류, 장갑, 의류, 러기지, 백, 클러치, 퍼스, 백팩, 월렛, 안장, 마구, 채찍, 인테리어, 익스테리어, 업홀스터리, 북 바인딩, 가구, 램프, 램프 쉐이드, 테이블 커버링, 벽 커버링, 바닥 커버링, 천장 커버링, 자동차 인테리어, 자동차 익스테리어, 보트 인테리어, 보트 익스테리어, 비행기 인테리어, 요트 인테리어, 요트 익스테리어, 베개 커버, 시트, 이불 커버, 보석류, 액세서리, 안경, 선글라스, 또는 소비자 전자제품 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 시계줄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 벨트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 백일 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 합성 가죽을 제조하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 인공 표피 층을 인공 진피 층 상에 위치시킴으로써 층상 구조물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 포함할 수 있고 진피 층은 섬유모세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 층상 구조물의 적어도 일부분을 태닝함으로써 합성 가죽을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포 또는 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 포유동물 케라틴세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 안료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 포유동물 멜라닌세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 비-포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱은 보존처리, 침지, 효해, 침산, 탈침산, 시닝, 리태닝, 윤활, 크러스팅, 습윤화, 새밍, 쉐이빙, 리크로밍, 중화, 염색, 유화가지, 필링, 스트리핑, 스터핑, 화이트닝, 고착, 세팅, 건조, 컨디셔닝, 밀링, 스테이킹, 버핑, 피니싱, 오일링, 브러싱, 패딩, 함침, 분무, 롤러 코팅, 커튼 코팅, 폴리싱, 플레이팅, 엠보싱, 아이어닝, 글레이징, 텀블링 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 생산 세포에 의해 적어도 부분적으로 생산될 수 있거나, 별도로 부가될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포, 케라틴세포, 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 상피 세포는 편평 세포, 입방 세포, 원주 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 케라틴세포를 포함할 수 있으며, 여기서 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 평활근 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 진피 층 및 제2 진피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 진피 층은 제2 진피 층 상에 위치시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 표피 층 및 제2 표피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 기저 막 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 표피 층과 진피 층 사이에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 조직 접착제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 조직 접착제는 피브린 글루를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 합성 가죽에 부분적으로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층 또는 표피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 보충물과 함께 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 콜라겐, 피브린, 성장 인자, 아스코르브산, 덱스트란 술페이트, 또는 카라기난 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 천연 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 합성 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 다능성 줄기 세포는 성체 체세포에서의 Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 또는 그의 조합의 유도된 유전자 발현을 통하여 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품의 적어도 일부분은 본원에 개시된 방법으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 시계줄, 벨트, 패키징, 구두, 부츠, 신발류, 장갑, 의류, 러기지, 백, 클러치, 퍼스, 백팩, 월렛, 안장, 마구, 채찍, 인테리어, 익스테리어, 업홀스터리, 북 바인딩, 가구, 램프, 램프 쉐이드, 테이블 커버링, 벽 커버링, 바닥 커버링, 천장 커버링, 자동차 인테리어, 자동차 익스테리어, 보트 인테리어, 보트 익스테리어, 비행기 인테리어, 요트 인테리어, 요트 익스테리어, 베개 커버, 시트, 이불 커버, 보석류, 액세서리, 안경, 선글라스, 또는 소비자 전자제품 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 시계줄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 벨트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 백일 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 합성 가죽을 제조하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 인공 표피 층을 인공 진피 층 상에 위치시킴으로써 층상 구조물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 포함할 수 있고 진피 층은 섬유모세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표피 층의 적어도 일부분을 층상 구조물로부터 제거하여 제거된 산물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 제거된 산물의 적어도 일부분을 태닝함으로써 합성 가죽을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포 또는 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 포유동물 케라틴세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 안료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 포유동물 멜라닌세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제거된 산물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제거된 산물은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 비-포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 추가 프로세싱에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱은 보존처리, 침지, 효해, 침산, 탈침산, 시닝, 리태닝, 윤활, 크러스팅, 습윤화, 새밍, 쉐이빙, 리크로밍, 중화, 염색, 유화가지, 필링, 스트리핑, 스터핑, 화이트닝, 고착, 세팅, 건조, 컨디셔닝, 밀링, 스테이킹, 버핑, 피니싱, 오일링, 브러싱, 패딩, 함침, 분무, 롤러 코팅, 커튼 코팅, 폴리싱, 플레이팅, 엠보싱, 아이어닝, 글레이징, 텀블링 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 생산 세포에 의해 적어도 부분적으로 생산될 수 있거나, 별도로 부가될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포, 케라틴세포, 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 상피 세포는 편평 세포, 입방 세포, 원주 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 케라틴세포를 포함할 수 있으며, 여기서 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 평활근 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 진피 층 및 제2 진피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 진피 층은 제2 진피 층 상에 위치시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 표피 층 및 제2 표피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 기저 막 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 표피 층과 진피 층 사이에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 조직 접착제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 조직 접착제는 피브린 글루를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 합성 가죽에 부분적으로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층 또는 표피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 보충물과 함께 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 콜라겐, 피브린, 성장 인자, 아스코르브산, 덱스트란 술페이트, 또는 카라기난 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 천연 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 합성 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 다능성 줄기 세포는 성체 체세포에서의 Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 또는 그의 조합의 유도된 유전자 발현을 통하여 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품의 적어도 일부분은 본원에 개시된 방법으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 시계줄, 벨트, 패키징, 구두, 부츠, 신발류, 장갑, 의류, 러기지, 백, 클러치, 퍼스, 백팩, 월렛, 안장, 마구, 채찍, 인테리어, 익스테리어, 업홀스터리, 북 바인딩, 가구, 램프, 램프 쉐이드, 테이블 커버링, 벽 커버링, 바닥 커버링, 천장 커버링, 자동차 인테리어, 자동차 익스테리어, 보트 인테리어, 보트 익스테리어, 비행기 인테리어, 요트 인테리어, 요트 익스테리어, 베개 커버, 시트, 이불 커버, 보석류, 액세서리, 안경, 선글라스, 또는 소비자 전자제품 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 시계줄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 벨트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가죽 제품은 백일 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 태닝된 합성 가죽이 개시된다. 일부 실시양태에서, 태닝하기 전에, 태닝된 합성 가죽은 섬유모세포를 포함하는 인공 진피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝하기 전에, 태닝된 합성 가죽은 인공 표피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 진피 층 상에 있음으로써 층상 구조물을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 포유동물 케라틴세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 안료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 포유동물 멜라닌세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 비-포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 생산 세포에 의해 적어도 부분적으로 생산될 수 있거나, 별도로 부가될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포, 케라틴세포, 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 상피 세포는 편평 세포, 입방 세포, 원주 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 케라틴세포를 포함할 수 있으며, 여기서 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 평활근 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 진피 층 및 제2 진피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 진피 층은 제2 진피 층 상에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 표피 층 및 제2 표피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 기저 막 대체물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 표피 층과 진피 층 사이에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 조직 접착제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 조직 접착제는 피브린 글루를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 태닝된 합성 가죽에 부분적으로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층 또는 표피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 시계줄, 벨트, 패키징, 구두, 부츠, 신발류, 장갑, 의류, 러기지, 백, 클러치, 퍼스, 백팩, 월렛, 안장, 마구, 채찍, 인테리어, 익스테리어, 업홀스터리, 북 바인딩, 가구, 램프, 램프 쉐이드, 테이블 커버링, 벽 커버링, 바닥 커버링, 천장 커버링, 자동차 인테리어, 자동차 익스테리어, 보트 인테리어, 보트 익스테리어, 비행기 인테리어, 요트 인테리어, 요트 익스테리어, 베개 커버, 시트, 이불 커버, 보석류, 액세서리, 안경, 선글라스, 또는 소비자 전자제품 중 하나 이상에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 시계줄에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 벨트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 백에 포함될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 태닝된 합성 가죽이 개시된다. 일부 실시양태에서, 태닝하기 전에, 태닝된 합성 가죽은 층상 구조물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 진피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 섬유모세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 표피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 표피 층은 케라틴세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포 또는 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 포유동물 케라틴세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 안료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 포유동물 멜라닌세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 비-포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 생산 세포에 의해 적어도 부분적으로 생산될 수 있거나, 별도로 부가될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포, 케라틴세포, 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 상피 세포는 편평 세포, 입방 세포, 원주 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 케라틴세포를 포함할 수 있으며, 여기서 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 평활근 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 진피 층 및 제2 진피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 진피 층은 제2 진피 층 상에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 표피 층 및 제2 표피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 기저 막 대체물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 표피 층과 진피 층 사이에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 조직 접착제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 조직 접착제는 피브린 글루를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 태닝된 합성 가죽에 부분적으로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층 또는 표피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 시계줄, 벨트, 패키징, 구두, 부츠, 신발류, 장갑, 의류, 러기지, 백, 클러치, 퍼스, 백팩, 월렛, 안장, 마구, 채찍, 인테리어, 익스테리어, 업홀스터리, 북 바인딩, 가구, 램프, 램프 쉐이드, 테이블 커버링, 벽 커버링, 바닥 커버링, 천장 커버링, 자동차 인테리어, 자동차 익스테리어, 보트 인테리어, 보트 익스테리어, 비행기 인테리어, 요트 인테리어, 요트 익스테리어, 베개 커버, 시트, 이불 커버, 보석류, 액세서리, 안경, 선글라스, 또는 소비자 전자제품 중 하나 이상에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 시계줄에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 벨트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 백에 포함될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 태닝된 합성 가죽이 개시된다. 일부 실시양태에서, 태닝하기 전에, 태닝된 합성 가죽은 층상 구조물을 포함하는 제거된 산물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 진피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 섬유모세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 표피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 일부분이 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포 또는 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제거된 산물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 포유동물 케라틴세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 안료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 포유동물 멜라닌세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 비-포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 콜라겐 생산 세포에 의해 적어도 부분적으로 생산될 수 있거나, 별도로 부가될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포, 케라틴세포, 섬유모세포, 각질세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 상피 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 상피 세포는 편평 세포, 입방 세포, 원주 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 케라틴세포를 포함할 수 있으며, 여기서 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜라겐 생산 세포는 평활근 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 진피 층 및 제2 진피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 진피 층은 제2 진피 층 상에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 제1 표피 층 및 제2 표피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 기저 막 대체물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 표피 층과 진피 층 사이에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에서 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 조직 접착제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 조직 접착제는 피브린 글루를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 태닝된 합성 가죽에 부분적으로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층 또는 표피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 시계줄, 벨트, 패키징, 구두, 부츠, 신발류, 장갑, 의류, 러기지, 백, 클러치, 퍼스, 백팩, 월렛, 안장, 마구, 채찍, 인테리어, 익스테리어, 업홀스터리, 북 바인딩, 가구, 램프, 램프 쉐이드, 테이블 커버링, 벽 커버링, 바닥 커버링, 천장 커버링, 자동차 인테리어, 자동차 익스테리어, 보트 인테리어, 보트 익스테리어, 비행기 인테리어, 요트 인테리어, 요트 익스테리어, 베개 커버, 시트, 이불 커버, 보석류, 액세서리, 안경, 선글라스, 또는 소비자 전자제품 중 하나 이상에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 시계줄에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 벨트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 백에 포함될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 태닝된 합성 가죽에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 인공 표피 층이 개시된다. 일부 실시양태에서, 인공 표피 층은 모낭 세포 및 멜라닌세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 표피 층은 모낭 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 표피 층은 멜라닌세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모낭 세포는 진피 유두 세포, 외근초 세포 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 포유동물 멜라닌세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 포유동물 케라틴세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인간 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목 중 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 비-포유동물 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 모낭을 포함할 수 있다. 인공 표피 층에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 인공 표피 층에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 인공 표피 층에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 층상 구조물이 개시된다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 표피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 모낭 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 진피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 섬유모세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모낭 세포는 진피 유두 세포, 외근초 세포 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 안료처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 층화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 기저 막 대체물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 표피 층과 진피 층 사이에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 스캐폴드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 2개 이상의 진피 층을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 모낭을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 모피를 추가로 포함할 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 층상 구조물을 제조하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 모낭 세포를 포함하는 인공 표피 층을 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포를 포함하는 인공 진피 층 상에 위치시킴으로써 층상 구조물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포는 섬유모세포, 멜라닌세포, 케라틴세포 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포는 섬유모세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모낭 세포는 진피 유두 세포, 외근초 세포 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 멜라닌세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 보충물과 함께 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 콜라겐, 피브린, 성장 인자, 아스코르브산, 덱스트란 술페이트, 카라기난 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 천연 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충물은 합성 보충물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 천연 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 스캐폴드 상에 위치시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 층화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 제2 진피 층 상에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 생체 내에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 콜라겐 매트릭스 상에서 배양되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 층상 구조물이 개시된다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 모낭 세포 및 케라틴세포 또는 멜라닌세포를 포함하는 인공 표피 층; 섬유모세포를 포함하는 인공 진피 층을 포함할 수 있으며, 여기서 섬유모세포, 케라틴세포 또는 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있고, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현하고, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현하며, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현한다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 표피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 모낭 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 케라틴세포 또는 멜라닌세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 인공 진피 층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 섬유모세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포, 케라틴세포 또는 멜라닌세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌세포는 Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포는 CD10, CD73, CD44, CD90, 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 프롤릴-4-히드록실라제 베타, 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포는 KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 또는 그의 조합을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .02 mm 내지 약 5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .5 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층의 두께는 약 .1 mm 내지 약 .2 mm의 범위일 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 층상 구조물에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
본원에는 인공 표피 층이 개시된다. 인공 표피 층은 각질층을 포함할 수 있다. 인공 표피 층은 과립층을 포함할 수 있다. 인공 표피 층은 유극층을 포함할 수 있다. 인공 표피 층은 기저층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 각질층, 과립층, 유극층, 또는 기저층은 도 6A, 또는 도 8A에 도시된 바와 같이 조직화될 수 있다. 각질층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 .05 mm의 범위일 수 있다. 과립층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 .15 mm의 범위일 수 있다. 유극층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 .15 mm의 범위일 수 있다. 상기 기저층의 두께는 약 .01 mm 내지 약 .15 mm의 범위일 수 있다. 각질층의 두께는 인공 표피 층의 약 4% 내지 약 20%의 범위일 수 있다. 과립층의 두께는 인공 표피 층의 약 4% 내지 약 60%의 범위일 수 있다. 유극층의 두께는 인공 표피 층의 약 4% 내지 약 40%의 범위일 수 있다. 기저층의 두께는 인공 표피 층의 약 4% 내지 약 40%의 범위일 수 있다. 인공 표피 층에 포함된 세포의 적어도 약 2%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 인공 표피 층에 포함된 세포의 적어도 약 10%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 인공 표피 층에 포함된 세포의 적어도 약 50%는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
참조로 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고도 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 신규 특징은 첨부된 청구 범위에 특별히 제시되어 있다. 본원에 기재된 특징 및 이러한 특징의 이점에 대한 더 나은 이해는 본원에 기재된 특징의 원리가 활용되는 예시적인 예를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 수득될 것이다:
도 1은 합성 가죽 생산 도식을 예시한다.
도 2A-2F는 층상 구조물을 예시한다. 도 2A는 스캐폴드 상에 표피 층 및 진피 층을 포함하는 층상 구조물을 도시한다. 도 2B는 스캐폴드 상에 표피 층, 기저 막 대체물 및 진피 층을 포함하는 층상 구조물을 도시한다. 도 2C는 스캐폴드 상에 표피 층 및 다수의 진피 층을 포함하는 층상 구조물을 도시한다. 도 2D는 스캐폴드 상에 표피 층, 기저 막 대체물 및 다수의 진피 층을 포함하는 층상 구조물을 도시한다. 도 2E는 표피 층, 기저 막 대체물 및 다수의 진피 층을 포함하는 층상 구조물을 도시한다. 도 2F는 표피 층 및 다수의 진피 층을 포함하는 층상 구조물을 도시한다.
도 3은 층상 구조물 발달을 예시한다.
도 4A-4C는 가죽 (도 4A), 천연 피부 (도 4B) 및 표피 등가물 (도 4C)의 비교 분석을 예시한다.
도 5A-5C는 천연 피부 및 표피 등가물의 각질층의 비교 분석을 예시한다. 도 5A는 표피 표면 영상을 도시한다. 도 5B는 코르네오-데스모솜 영상을 도시한다. 도 5C는 CDSN/훽스트(Hoechst) 영상을 도시한다.
도 6A-6E는 천연 피부 및 표피 등가물의 과립층의 비교 분석을 예시한다. 도 6A는 로리크린 (LOR) 염색을 도시한다. 도 6B는 전자 밀도가 높은 침전물로서 투과 전자 현미경 검사시 포획된 표피 Ca++ 구배를 도시한다. 도 6C는 란타넘 관류에 의한 투과 장벽 무결성의 평가를 도시한다. 도 6D는 밀착 연결 단백질 1/폐쇄 소대-1 (TJP1/ZO-1)이, 지질 이중층 내의 원섬유 유사 구조일 수 있는 밀착 연결 가닥 단백질을 액틴 세포 골격에 고정시킨다는 것을 예시한다. 도 6E는 프로필라그린으로서 공지된 350 kDa의 큰 단백질 전구체로 뭉쳐진 필라그린 (FLG) 단량체가 SG의 세포 내 케라토히알린 과립에 존재한다는 것을 예시한다.
도 7A-7C는 TEM으로 평가된 천연 피부 및 표피 등가물에서의 지질 이중층 형성을 예시한다. 도 7A는 SC와 SG의 경계에서의 정상 지질 분비를 도시하다. 도 7B는 SG에서의 라멜라체를 도시한다. 도 7C는 천연 피부의 정상 지질 이중층 (LB) 형태를 도시한다.
도 8A-8C는 기저상부 층의 마커인 케라틴 10 (KRT10; 도 8A), 케라틴 1 (KRT1; 도 8B), 데스모콜린 1 (DCL1; 도 8C)을 포함한, 천연 피부 및 표피 등가물의 기저상부 층의 마커의 비교 분석을 예시한다. 도 8D는 생체내 천연 피부와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 둘 다 내에서의 데스모솜을 도시한다.
도 9A-9C는 천연 피부 및 표피 등가물의 기저층의 비교 분석을 예시한다. 증식의 마커인 MKI67 (도 9A), 케라틴 14 (KRT14; 도 9B), 및 전사 인자 TP63 (도 9C)은 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 둘 다에서의 전형적인 기저 층 분포를 나타낸다. 도 9D는 생체내 천연 피부와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 둘 다에서의 헤미-데스모솜을 도시한다.
도 10A-10F는 기저 막의 세포외 매트릭스 성분의 비교 분석을 예시한다. 도 10A는 인테그린 β1 발현을 도시한다. 도 10B는 피브로넥틴 발현을 도시한다. 도 10C는 콜라겐 IV 발현을 도시한다. 도 10D는 콜라겐 VI 발현을 도시한다. 도 10E는 콜라겐 VII 발현을 도시한다. 도 10F는 라미닌 5 발현을 도시한다.
도 11A-11I는 전층 피부 등가물 (FSE)의 구조 분석을 예시한다. 도 11A 및 11B는 FSE의 단면이 2600x 배율 (도 11A) 및 5200x 배율 (도 11B) 하에 표피의 별개의 세포 층을 표시한다는 것을 도시한다. 도 11C는 900x 배율 하에서의 FSE의 표면을 도시한다. 도 11D - 11F는 91x 배율 (도 11D), 162x 배율 (도 11E) 및 405x 배율 (도 11F) 하에서의 상주하는 진피 섬유모세포 및 풍부한 세포외 매트릭스를 수반한 진피 스캐폴드의 종단면을 도시한다. 도 11G - 11I는 80x 배율 (도 11G), 695x 배율 (도 11H) 및 2700x 배율 (도 11I) 하에서의 상주하는 진피 섬유모세포 및 풍부한 세포외 매트릭스를 수반한 진피 스캐폴드를 도시한다.
도 12A-12R은 진피 등가물 조작의 시간 경과를 예시한다. 도 12A-12I는 36x 배율 (도 12A), 695x 배율 (도 12B), 1470x 배율 (도 12C), 7750x 배율 (도 12D), 2320x 배율 (도 12E), 2420x 배율 (도 12F), 6560x 배율 (도 12G), 17000x 배율 (도 12H) 및 22000x 배율 (도 12I) 하에서 진피 섬유모세포를 스캐폴드 상에 시딩한 후 제2일을 도시한다. 도 12J-12R은 64x 배율 (도 12J), 100x 배율 (도 12K), 364x 배율 (도 12L), 82x 배율 (도 12M), 253x 배율 (도 12N), 3940x 배율 (도 12O), 5550x 배율 (도 12P), 9440x 배율 (도 12Q) 및 21680 배율 (도 12R) 하에서 진피 섬유모세포를 스캐폴드 상에 시딩한 후 제7일을 도시한다.
예시를 위해 예시적인 적용을 참조하여 몇 가지 측면이 아래에 기재된다. 본원에 기재된 특징을 완전히 이해하기 위해 수많은 구체적 세부 사항, 관계 및 방법이 제시되어 있다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 특징이 구체적 세부 사항 중 하나 이상 없이도 또는 다른 방법으로도 실시될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기재된 특징은 달리 구체적으로 명시되지 않는 한 일부 행위가 상이한 순서로 및/또는 다른 행위 또는 사건과 동시에 발생할 수 있기 때문에, 행위 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 더욱이, 예시된 모든 행위 또는 사건이, 본원에 기재된 특징에 따라 방법을 구현하는데 필요하지 않다.
본원에 사용된 용어는 특별한 경우만을 기재하기 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하고자 한다. 더욱이, 용어 "포함한", "포함한다", "갖는", "갖는다", "수반하는" 또는 이들의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구 범위에서 사용되는 한도 내에서, 상기 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본 개시내용에서 용어 "약" 또는 "대략"은 소정의 값의 10% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 본 개시내용에서 용어 "실질적으로"는 큰 정도로 행해질 수 있는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "다능성 줄기 세포"는 임의의 성체 세포를 형성할 수 있는 능력이 있는 임의의 전구 세포를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "배아 줄기 세포" 또는 "ES 세포" 또는 "ESC"는 임의의 성체 세포를 형성할 수 있는 능력이 있는 전구 세포를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도된 다능성 줄기 세포" 또는 "iPS 세포" 또는 "iPSC"는 비-다능성 세포 (예를 들어, 성체 체세포)로부터 인공적으로 유래된 특정 유형의 다능성 줄기 세포를 지칭할 수 있다. 유도된 다능성 줄기 세포는 임의의 성체 세포를 형성할 수 있는 능력 면에서는 배아 줄기 세포와 동일할 수 있지만, 이는 배아로부터 유래되지 않는다. 일부 경우에, 본원에 개시된 IPSC 세포는 IPSC 세포일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "합성 가죽"은 본원에 기재된 피부 등가물이 임의의 포유동물 또는 비-포유동물에 대한 피부 등가물로서 제공될 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 인간 및 비-인간 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류 및 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이 종의 구성원 뿐만 아니라 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니아 피그, 토끼목 과의 구성원 (토끼 포함); 및 비-포유동물, 예컨대 상어 및 가오리를 포함한 어류, 타조를 포함한 조류 및 도마뱀, 뱀 및 악어를 포함한 파충류를 이용한 실시양태를 실시할 수 있다. 형성될 특별한 포유동물 합성 가죽은 본원에 기재된 실시양태에 사용된 세포, 예를 들어 케라틴세포 및 섬유모세포의 공급원에 의존적일 수 있으며, 예를 들어, 소의 케라틴세포 및 섬유모세포가 피부 등가물을 형성하기 위해 사용되는 경우에는, 소의 합성 가죽이 형성될 수 있다.
개요
본원에는 합성 가죽, 인공 표피 층, 인공 진피 층, 층상 구조물, 이들로 만든 산물 및 그의 생산 방법이 개시된다. 특정 경우에, 본원에는 합성 가죽이 개시된다. 일부 경우에, 합성 가죽는 1개 또는 복수 개의 층을 포함한다. 일부 경우에, 1개 또는 복수 개의 층은 세포를 포함하며, 여기서 이러한 세포는 시험관 내에서 배양된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법은 합성 가죽의 생산을 상업적 수준까지 확실하고, 정확하며 재현 가능하게 스케일 업 해주는 고-처리량의 방법을 제공한다. 본원에 개시된 합성 가죽, 조작된 표피 등가물, 조작된 전층 피부 등가물 및 그를 제조하는 방법의 이점은 매력적인 외관, 질감, 두께 및 내구성을 지닌 재현 가능하고 고 처리량 및 용이하게 확장 가능한 방식으로 맞춤형 조직을 생산하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 전층 피부 등가물은 적어도 1개의 진피 층 및 적어도 1개의 표피 층을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 전층 피부 등가물 및 전체 피부 등가물은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 개시된 합성 가죽은 섬유모세포를 포함하는 인공 진피 층 및 케라틴세포를 포함하는 인공 표피 층의 층을 포함할 수 있다. 이러한 진피 층 및 표피 층은 층상 구조물을 형성할 수 있다. 합성 가죽은 1개 이상의 층상 구조물을 포함할 수 있다. 합성 가죽은 태닝될 수 있고 추가로 프로세싱될 수 있다. 상기 합성 층을 형성하는 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)로부터 분화될 수 있다. 진피 층은 천연 가죽 두께 및 질감을 달성하기 위해 스캐폴드, 예컨대 실크 상에 위치시킬 수 있다.
또한 본원에는 합성 가죽을 제조하는 방법이 개시된다. 이러한 방법은 인공 진피 층 및 인공 표피 층을 포함하는 층상 구조물을 형성하고, 이러한 층상 구조물을 태닝하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한, 예를 들어, 천연 가죽 두께 및 질감을 달성하기 위해 인공 진피 층 및 표피 층을 추가로 프로세싱하는 것을 포함할 수 있다.
합성 가죽
합성 가죽은 1개 이상의 세포 층을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 진피 층, 표피 층, 및 기저 막 또는 기저 막 대체물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 합성 가죽은 피하조직, 비늘, 순판, 골진피, 또는 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 합성 층은 전층 피부 등가물을 포함한다. 이러한 전층 피부 등가물은 본원에 개시된 층 중 임의의 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 합성 가죽 내의 1개 이상의 세포 층의 일부분이, 예를 들어, 쉐이빙에 의해 제거될 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 태닝될 수 있다. 태닝은 세포 층 또는 층상 구조물 중 하나 이상의 형성 후에 수행될 수 있다. 태닝은 세포 층의 적어도 일부분이 합성 가죽으로부터 제거된 후에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 추가로 프로세싱될 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 모낭 세포 및 멜라닌세포를 포함할 수 있다. 모낭 세포 및/또는 멜라닌세포는 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)로부터 분화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 태닝된 합성 가죽은 층상 구조물을 포함할 수 있다. 층상 구조물은 섬유모세포를 포함하는 인공 진피 층을 포함할 수 있다. 층상 구조물은 또한, 케라틴세포를 포함하는 인공 표피 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물은 섬유모세포를 포함하는 인공 진피 층 및 케라틴세포를 포함하는 인공 표피 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 섬유모세포 또는 케라틴세포는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
일부 경우에, 태닝된 합성 가죽은 진피 층의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 태닝된 합성 가죽은 진피 층을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 진피 층은 제거될 수 있다.
진피 층
합성 가죽은 진피 층 (예를 들어, 인공 진피 층)을 포함할 수 있다. 진피 층은 조작된 진피 등가물, 예를 들어, 시험관 내에서 형성된 인공 진피 층일 수 있다.
진피 층은 결합 조직의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 섬유모세포를 포함할 수 있다. 진피 층 내의 섬유모세포는 분화 클러스터 10 (CD10), 분화 클러스터 73 (CD73), 분화 클러스터 44 (CD44), 분화 클러스터 90 (CD90), 유형 I 콜라겐, 유형 III 콜라겐, 및 프롤릴-4-히드록실라제 베타 섬유모세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 일부 경우에, 진피 층은 또한, 다른 유형의 세포, 예컨대 면역 세포, 대식세포, 지방세포, 또는 그의 조합을 포함한다.
진피 층은 세포 이외에 매트릭스 성분을 추가로 포함할 수 있다. 매트릭스 성분의 예는 콜라겐, 엘라스틴; 및 주로 글리코사미노글리칸 (예를 들어, 히알루로난), 프로테오글리칸, 및 당단백질로 구성된 세포외 겔 유사 물질인 비섬유성 매트릭스 중 임의의 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
진피 층은 매트릭스 지지체를 포함할 수 있다. 매트릭스 지지체는 스캐폴드일 수 있다. 매트릭스 지지체는 수축된 콜라겐 겔을 포함할 수 있다. 순수한 콜라겐 매트릭스에 대한 대안은, 예를 들어, 문헌 [Hansbrough, et al., J. Burn Care Rehabil., 15:346-53 (1994)]에 기재된 바와 같은 폴리글리콜산 메쉬, 또는 예를 들어, 문헌 [Burke, et al., Ann. Surg., 194:413-420 (1981)]에 기재된 바와 같이, 실라스틱 막으로 덮은 콜라겐 및 글리코사미노글리칸 매트릭스 (C-GAG), 또는 예를 들어, 문헌 [Kellouche, et al., Biochem Biophys Res Commun., 363:472-478 (2007)]에 기재된 바와 같은 다양한 생체중합체, 예를 들어 키토산일 수 있다. 일부 경우에, 상기 매트릭스에는, 예를 들어, 기관형 모델을 발생시키기 위해 섬유모세포가 시딩될 수 있다. 동종이계 사체 피부로부터 천연적으로 유래된 진피가 또한, 케라틴세포 시트와 함께 사용될 수 있다. 이러한 기술의 변형은 사체 피부로부터의 동결 건조된 약화된 진피를 사용하여 케라틴세포 시트를 지지할 수 있다.
가죽 유닛의 두께는 밀리미터, 온스 또는 아이언으로 보고될 수 있다. (1 온스는 1/64 in. 또는 0.0156 in. 또는 0.396 mm와 동일하다. 1 아이언은 1/48 in. 또는 0.0208 in. 또는 0.53 mm와 동일함).
진피 층의 두께는 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 진피 층은 약 0.01 mm 내지 약 50 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 진피 층의 두께는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 진피 층의 두께는 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 적어도 약 50 mm의 두께를 가질 수 있다.
진피 층의 길이는 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 진피 층은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, 진피 층의 길이는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 진피 층의 길이는 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 길이를 가질 수 있다.
진피 층의 폭은 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 진피 층은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 경우에, 진피 층의 폭은 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 진피 층의 폭은 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 진피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 폭을 가질 수 있다.
합성 가죽은 1개 이상의 진피 층을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 40, 60, 80, 또는 100개의 진피 층을 가질 수 있다. 합성 가죽이 2개 이상의 진피 층을 포함하는 경우, 진피 층은 또 다른 진피 층 상에 위치시킬 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 2개의 진피 층, 예를 들어, 제1 진피 층 및 제2 진피 층을 포함할 수 있다. 제1 진피 층은 제2 진피 층 상에 위치시킬 수 있다.
진피 층은 층화될 수 있으며, 예를 들어, 복수 개의 하부층을 가질 수 있다. 하부층은 상이한 조성, 예를 들어, 상이한 농도의 섬유를 가질 수 있다. 진피 층의 하부층은 상이한 두께 및 밀도를 가질 수 있다. 예를 들어, 진피 층은 유두 진피 층, 망상 진피 층, 또는 그의 임의의 조합을 가질 수 있다. 유두 진피 층은 느슨한 유륜 결합 조직 및/또는 느슨하게 배열된 섬유, 예를 들어, 콜라겐 섬유를 포함할 수 있다. 망상 진피 층은 콜라겐 섬유 및 진피 탄성 섬유를 포함한, 조밀하고 불규칙한 결합 조직을 포함할 수 있다.
진피 층은 모든 방향에서 수축 가능하고 균질할 수 있는 유리 콜라겐 매트릭스 또는 격자를 포함할 수 있다. 섬유모세포, 및 적절한 경우에는 진피의 다른 유형의 세포가 연속적인 콜라겐 겔에 분포될 수 있다. 진피 등가물은 섬유모세포가 분포되어 있는 콜라겐 유형 I의 적어도 하나의 매트릭스를 포함할 수 있다. 이는 또한, 다른 세포외 매트릭스 구성분을 함유할 수 있다. 세포외 매트릭스 구성분은 콜라겐, 예를 들어, 콜라겐 IV, 라미닌, 엔탁틴, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 또는 히알루론산을 포함할 수 있다. 진피 층은 콜라겐 유형 IV 및 라미닌, 엔탁틴, 또는 그의 조합을 함유할 수 있다. 이들 다양한 구성분의 농도는 조정될 수 있다. 예를 들어, 라미닌의 농도는 최종 용적의 약 1% 내지 약 15%일 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 IV의 농도는 최종 용적의 약 0.3% 내지 약 4.5%일 수 있다. 예를 들어, 엔탁틴의 농도는 최종 용적의 약 0.05% 내지 약 1%일 수 있다. 사용된 콜라겐은 소 기원의 콜라겐; 래트 꼬리로부터 또는 어류로부터의 콜라겐; 또는 천연 콜라겐 또는 섬유모세포의 존재 하에 수축을 허용해 주는 유전 공학에 의해 생산된 콜라겐의 임의의 다른 공급원의 콜라겐일 수 있다. 일부 실시양태에서, 콜라겐은 비천연 공급원으로부터 유래될 수 있다. 매트릭스는 섬유모세포의 우선적인 조직화을 부과하지 않는, 수평과 수직 둘 다의 수축에 의해 수득된, 팽팽하지 않을 수 있는 콜라겐 겔일 수 있다. "유리"라고도 불리는 이러한 매트릭스는 지지체에 부착되지 않을 수 있고, 그의 용적은 제한 없이 변형되어 다양한 두께와 직경을 부여해줄 수 있다. 진피 등가물의 두께는 적어도 0.05 cm일 수 있고, 일부 경우에 대략 0.05 내지 2 cm일 수 있다. 그 두께는 또한, 피부 등가물 또는 합성 가죽의 유리한 특성에 해를 끼치지 않으면서 증가될 수 있다. 일부 경우에, 두께는 약 3 mm 내지 약 20 cm 이상일 수 있다.
표피 층
합성 가죽은 표피 층 (예를 들어, 인공 표피 층)을 포함할 수 있다. 표피 층은 조작된 표피 등가물, 예를 들어, 시험관 내에서 형성된 인공 표피 층일 수 있다.
표피 층은 케라틴세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 메르켈(Merkel) 세포, 및 염증 세포를 포함한, 한 가지 이상의 유형의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 케라틴세포를 포함할 수 있다. 표피 층 내의 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표피 층은 적어도 기저 케라틴세포, 예를 들어, 분화되지 않은 케라틴세포를 포함한다. 표피 층은 부분적으로 분화된 케라틴세포 뿐만 아니라 완전히 분화된 케라틴세포를 추가로 포함할 수 있다. 합성 가죽 내의 1개 이상의 표피 층에서는, 기저 케라틴세포가 국소화되어 있는 진피-표피 접합부로부터 진행함에 따라 미분화된 기저 케라틴세포로부터 완전히 분화된 케라틴세포로의 전이가 있을 수 있다.
기저 케라틴세포는 표피 층과 진피 층을 함께 확보하는데 도움을 주기 위해 제공되는 헤미데스모솜을 발현할 수 있다. 기저 케라틴세포는 또한, 피부를 재생시키기 위해 제공될 수 있다. 본원에서의 합성 가죽 내의 표피 층은 이들 기능을 제공하는 기저 케라틴세포를 가질 수 있다. 따라서, 이러한 기저 케라틴세포를 포함하는 합성 가죽은 재생될 수 있다. 합성 가죽 내의 1개 이상의 표피 층에서 기저 케라틴세포와 분화된 케라틴세포 간의 다른 뚜렷한 차이는 E-카데린과 P-카데린 둘 다가 기저 막 영역 (BMZ)을 따라 표피 케라틴세포에는 존재하지만, 분화되고 BMZ로부터 멀리 떨어져 있는 케라틴세포는 E-카데린만을 발현한다는 것일 수 있다.
표피 층의 기저 케라틴세포는 진피 층과 직접 접촉하는 층에 정렬되어, 분화된 케라틴세포와 섬유모세포 간의 경계 역할을 할 수 있다. 대체 경우에는, 기저 케라틴세포와 진피 층 사이에 갭이 있다. 또한 추가로, 기저 케라틴세포와 다른 기저 케라틴세포 사이에 갭이 있어, 분화된 케라틴세포와 진피 층 사이에 갭이 잔존할 수 있다. 기저 또는 분화된 케라틴세포와 진피 층 사이에 갭이 있는 후자의 경우에는, 진피 층과 표피 층이 서로 균일하게 접촉되지는 않지만, 서로 인접해 있다. 이들은 일반적으로는 유체일 수 있지만, 진피 층과 표피 층 사이에 다른 중간재, 예컨대 세포, 콜라겐, 매트릭스 또는 다른 지지체의 층이 실질적으로 없다는 점에서 인접해 있다.
표피 층 내의 케라틴세포는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 이러한 마커는 케라틴 14 (KRT14), 종양 단백질 p63 (p63), 데스모글레인 3 (DSG3), 인테그린, 베타 4 (ITGB4), 라미닌, 알파 5 (LAMA5), 케라틴 5 (KRT5), 종양 단백질 p63의 이소형 (예를 들어, TAp63), 라미닌, 베타 3 (LAMB3), 및 케라틴 18 (KRT18)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
표피 층의 두께는 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 표피 층은 약 0.001 mm 내지 약 10 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.005 mm 내지 약 10 mm, 약 0.005 mm 내지 약 5 mm, 약 0.005 mm 내지 약 2 mm, 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 5 mm, 약 0.01 mm 내지 약 2 mm, 약 0.01 mm 내지 약 1, 약 0.01 mm 내지 약 0.8 mm, 약 0.01 mm 내지 약 0.4 mm, 약 0.01 mm 내지 약 0.2 mm, 약 0.01 mm 내지 약 0.1 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.4 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.2 mm, 약 0.05 mm 내지 약 0.1 mm, 약 0.1 mm 내지 약 0.4 mm, 약 0.1 mm 내지 약 0.2 mm, 약 0.08 mm 내지 약 1 mm, 또는 약 0.05 mm 내지 약 1.5 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.01 mm 내지 약 2 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.1 mm 내지 약 0.22 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 표피 층의 두께는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 진피 층의 두께는 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 두께 값은 표피 층 및 기저 막 대체물의 두께일 수 있다.
표피 층의 길이는 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 표피 층은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, 표피 층의 길이는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 표피 층의 길이는 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 길이를 가질 수 있다.
표피 층의 폭은 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 표피 층은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 경우에, 표피 층의 폭은 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 표피 층의 폭은 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 폭을 가질 수 있다.
합성 가죽은 1개 이상의 표피 층을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 40, 60, 80, 또는 100개의 표피 층을 가질 수 있다. 합성 가죽이 2개 이상의 표피 층을 포함하는 경우, 하나의 표피 층은 또 다른 표피 층 상에 위치시킬 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 2개의 표피 층, 예를 들어, 제1 표피 층 및 제2 표피 층을 포함할 수 있다. 제1 표피 층은 제2 표피 층 상에 위치시킬 수 있다.
표피 층은 층화될 수 있으며, 예를 들어, 복수 개의 하부층을 가질 수 있다. 하부층은 상이한 세포 조성, 예를 들어, 상이한 유형의 케라틴세포를 가질 수 있다. 표피 층의 하부층은 상이한 두께 및/또는 밀도를 가질 수 있다. 예를 들어, 표피 층은 각질화된 층 (각질층), 투명/반투명 층 (투명층), 과립 층 (과립층), 가시층 (유극층), 기저/배아 층 (기저층/배아층), 또는 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 가질 수 있다. 일부 경우에, 표피 층은 기능적인 표피 투과 장벽 (예를 들어, 각질층 내에 조직화된 지질 이중층)을 포함한다. 일부 경우에, 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 또는 기저층/배아층은 약 0.0001 mm 내지 약 5 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 또는 기저층/배아층은 적어도 약 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.15 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 또는 기저층/배아층은 많아야 약 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.15 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm의 두께를 가질 수 있다.
표피 층은 안료, 예를 들어, 멜라닌을 생산하는 세포를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 안료 생산 세포는 멜라닌세포일 수 있다. 표피 층 내의 멜라닌세포는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 이러한 마커는 유전자 10을 함유하는 SRY-박스 (Sox-10), 소안구증 관련 전사 인자 (MITF-M), 프리멜라노솜 단백질 (gp-100), 도파크롬 타우토메라제 (DCT), 티로시나제 (TYR), 및 멜란-A (MLANA)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
합성 가죽 내의 세포
합성 가죽은 본원에 개시된 진피 층 및 표피 층 내의 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 또한, 모낭 세포, 내피 세포, 진피 유두 세포, 면역 체계 세포 (예컨대 림프구, 수지상 세포, 대식세포 또는 랑게르한스 세포), 지방세포, 신경 세포, 및 그의 혼합물을 포함한다.
합성 가죽 내의 하나 이상의 세포는 유전적으로 조작된 세포일 수 있다. 용어 "유전적으로 조작된"은 세포의 핵산 함량을 인공적으로 변경시키는 것을 지칭할 수 있다. 따라서, 유전적으로 조작된 세포는 세포의 게놈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 및/또는 치환 뿐만 아니라 세포 내로 삽입된 자기 복제 염색체외 핵산의 도입을 포함한 변경을 함유하는 세포를 포함할 수 있다. 유전적으로 조작된 세포는 또한, 하나 이상의 유전자의 전사가 변경된, 예를 들어, 증가되거나 또는 감소된 세포를 포함한다.
일부 경우에, 합성 가죽은 천연 피부의 성분, 예컨대 멜라닌세포, 모낭, 땀샘 및 신경 말단 중 적어도 하나를 갖는다. 특정 경우에, 합성 가죽은 이들 성분 중 적어도 하나가 결여됨으로써 정상적인 천연 피부와 구별될 수 있다. 일부 경우에, 비정상적인 표현형을 표시하거나 또는 변경된 유전자형을 수반한 적어도 하나의 세포를 갖기 때문에, 합성 가죽은 이들 성분 모두를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 부가의 성분이 합성 가죽에 부가될 수 있다. 이러한 부가의 성분은 근상피 세포, 관 세포, 분비 세포, 폐포 세포, 랑게르한스 세포, 메르켈 세포, 유착물, 유선, 또는 그의 임의의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 신경 세포, 결합 조직 (뼈, 연골, 뼈 형성 세포 및 연골세포로 분화되는 세포, 및 림프 조직 포함), 상피 세포 (공동 및 혈관 또는 채널에 내벽을 형성하는 내피 세포, 외분비의 분비성 상피 세포, 상피 흡수 세포, 케라틴화 상피 세포, 및 세포외 매트릭스 분비 세포 포함), 및 미분화 세포 (예컨대 배아 세포, 줄기 세포, 및 다른 전구 세포) 중 하나 이상을 포함한다.
합성 가죽은 모낭을 포함할 수 있다. 모낭은 유두, 매트릭스, 모근초, 벌지, 누두를 포함한 하나 이상의 구조, 입모근, 피지선, 및 아포크린 땀샘을 포함할 수 있다. 모낭은 진피 유두 세포, 외근초 세포, 또는 그의 임의의 조합을 포함한 하나 이상의 모낭 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 모낭은 표피 층 내에 있을 수 있다. 일부 경우에, 모낭은 진피 층 내에 있을 수 있다. 모낭 세포는 전구 세포, 예를 들어, 줄기 세포, 예컨대 iPSC로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모낭 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%가 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 가죽에는 모발, 혈관, 피지선, 모낭, 지방 분비선, 신경, 또는 그의 조합이 결여될 수 있다.
일부 경우에, 합성 가죽은, 예를 들어, 1개 이상의 층상 구조물에 모발을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 모피를 포함할 수 있다. 모발 (예를 들어, 모피)은 천연, 합성, 또는 그의 조합일 수 있다. 모발 (예를 들어, 모피)은 합성 가죽 내에서 세포로부터 성장될 수 있거나, 또는 외인성 공급원으로부터 합성 가죽에 부가될 수 있다. 다른 경우에, 합성 가죽은 어떠한 모발도 가지지 않을 수 있다.
줄기 세포
합성 가죽 내의 하나 이상의 세포는 전구 세포, 예컨대 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽 내의 섬유모세포는 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽 내의 케라틴세포는 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽 내의 멜라닌세포는 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%가 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유모세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%가 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 케라틴세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%가 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서,멜라닌세포의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%가 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
줄기 세포는 배아 줄기 세포 (ESC), 성체 줄기 세포 (즉, 체세포 줄기 세포) 또는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 전능성, 다능성 또는 다분화능, 예를 들어 성체 줄기 세포 및 제대혈 줄기 세포일 수 있다. 배아 줄기 세포는 1주 미만생인 수정된 배아로부터 유래될 수 있다. 유도된 다능성 줄기 세포는 임의의 체세포 (예를 들어, 성체 체세포), 예컨대 섬유모세포에서의 Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc 유전자 중 하나 이상의 유도된 발현을 통하여 수득될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 다른 유전자가 또한, 체세포를 유도된 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위하여 유도될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 NANOG, UTF1, LIN28, SALL4, NR5A2, TBX3, ESSRB, DPPA4, SV40LT, REM2, MDM2, 및 시클린 D1을 포함한다.
다양한 전달 방법을 사용하여 체세포를 iPSC로 재프로그래밍하기 위해 유전자의 발현을 조정할 수 있다. 예시적인 전달 방법은 있는 그대로의 DNA 전달, 아데노바이러스, 전기적 전달, 화학적 전달, 기계적 전달, 중합체 기반 시스템, 미세주사, 레트로바이러스 (예를 들어, MMLV-유래 레트로바이러스), 및 렌티바이러스 (예를 들어, 절제 가능한 렌티바이러스)를 포함한다. 일부 경우에, 유도된 다능성 줄기 세포는 문헌 ([Takahashi et al., Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72 (2007)], 또는 [Yu et al., Science 318, 1917 - 1920 (2007)])에 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라서 수득될 수 있다. 일부 경우에, 체세포 (예를 들어, 성체 체세포)는 Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc 유전자를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터로 형질감염된다. 일부 경우에, 센다이 바이러스, 예를 들어, ID 파마 캄파니, 리미티드 (ID Pharma Co., Ltd.; 일본)에 의해 생산된 센다이 바이러스가 전달 시스템으로서 사용된다.
세포의 공급원
합성 가죽은 한 가지 이상의 종의 동물로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽 내의 세포는 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 무척추동물, 또는 그의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다.
합성 가죽은 포유동물로부터 유래된 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 또는 비-포유동물로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 포유동물은 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 영양, 곰, 비버, 들소, 수퇘지, 낙타, 카리부, 고양이, 소, 사슴, 개, 코끼리, 엘크, 여우, 기린, 염소, 산토끼, 말, 아이벡스, 캥거루, 사자, 라마, 스라소니, 밍크, 무스, 황소, 펫카리, 돼지, 토끼, 코뿔소, 물개, 양, 다람쥐, 호랑이, 고래, 늑대, 야크 또는 얼룩말일 수 있다. 일부 경우에, 포유동물은 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 설치류, 또는 토끼목일 수 있다. 비-포유동물은 어류, 조류 또는 파충류일 수 있다. 일부 경우에, 포유동물은 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서 인간은 유명 인사일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유명 인사"는 이전 활동의 악명이나 일반적인 명성으로 커뮤니티에 관심을 갖게 된 사람으로서 정의될 수 있다. "유명 인사"는 전문 및 아마추어 스포츠, 엔터테인먼트, 음악, 영화, 비즈니스, 인쇄 및 전자 미디어, 정치 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 산업과 관련될 수 있다.
합성 가죽은 다른 종으로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 세포는 조류, 예컨대 치킨, 오리, 에뮤, 거위, 뇌조, 타조, 꿩, 비둘기, 메추라기, 또는 칠면조로부터 유래된다. 일부 경우에, 상기 세포는 파충류, 예컨대 바다거북, 뱀, 악어, 또는 앨리게이터로부터 유래된다. 일부 경우에, 상기 세포는 양서류, 예컨대, 개구리, 두꺼비, 도롱뇽, 또는 영원으로부터 유래된다. 일부 경우에, 상기 세포는 어류, 예컨대 멸치, 농어, 메기, 잉어, 대구, 장어, 넙치, 복어, 그루퍼, 해덕, 넙치, 청어, 고등어, 마히 마히, 만타 레이, 청새치, 오렌지 러피, 농어, 파이크, 폴락, 연어, 정어리, 상어, 도미, 가자미, 가오리, 황새치, 틸라피아, 송어, 참치, 또는 명태로부터 유래된다.
일부 경우에, 합성 가죽 내의 모든 세포는 동일한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 합성 가죽 내의 모든 세포는 소의 세포일 수 있다. 다른 경우에, 합성 가죽은 다수의 종으로부터 유래된 세포를 포함한다. 예를 들어, 합성 가죽은 소의 세포 및 앨리게이터 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 10가지 종으로부터 유래된 세포를 포함한다.
합성 가죽 내의 세포의 전구 세포는 또한, 본원에 기재된 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포 (예를 들어, iPSC), 체세포 (예를 들어, iPSC로 재프로그래밍될 체세포), 합성 세포에 사용된 1차 세포, 진피 층 세포, 표피 층 세포, 또는 그의 합성 및 그의 전구 세포에서의 임의의 세포는 본원에 기재된 공급원으로부터 유래될 수 있다.
임의의 세포는 살아있는 세포 또는 죽은 세포일 수 있다. 다수의 세포가 존재하는 경우, 세포는 살아있는 세포일 수 있거나, 죽은 세포일 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
층상 구조물
합성 가죽은 1개 이상의 층상 구조물을 포함할 수 있다. 층상 구조물은 제1 유형의 층을 제2 유형의 층 상에 위치시킴으로써 형성될 수 있다. 제1 유형의 층과 제2 유형의 층은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물은 표피 층을 진피 층 상에 위치시킴으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 표피 층을 진피 층 상에 위치시키고 그 사이에 기저 막 대체물을 수반함으로써 형성될 수 있다.
층상 구조물은 2개 이상의 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000개의 층을 포함한다. 일부 경우에, 층상 구조물은 적어도 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000개의 제1 유형의 층, 및 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50개의 제2 유형의 층을 포함한다. 예를 들어, 층상 구조물은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000개의 진피 층, 및 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 또는 1000개의 표피 층을 포함할 수 있다.
층상 구조물은 본원에 기재된 세포의 한 가지 이상의 유형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 진피 층 내의 세포, 예컨대 섬유모세포, 표피 층 내의 세포, 예컨대 케라틴세포, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물은 섬유모세포 및 케라틴세포 이외의 세포를 추가로 포함한다. 예를 들어, 층상 구조물은 멜라닌세포를 포함할 수 있다.
층상 구조물은 약 0.001 mm 내지 약 100 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.005 mm 내지 약 50 mm, 약 0.005 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물의 두께는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 10 mm, 20 mm, 40 mm, 60 mm, 80 mm, 또는 100 mm일 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물의 두께는 많아야 100 mm, 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 mm의 두께를 가질 수 있다.
층상 구조물의 길이는 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 층상 구조물은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물의 길이는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물의 길이는 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 길이를 가질 수 있다.
층상 구조물의 폭은 합성 가죽의 기능 또는 용도에 맞도록 조작될 수 있다. 층상 구조물은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물의 폭은 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 층상 구조물의 폭은 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 층상 구조물은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 폭을 가질 수 있다.
층상 구조물은 섬유모세포와 케라틴세포를 적어도 약 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10, 또는 1:100의 임의의 비 하에 포함할 수 있다. 일부 경우에, 섬유모세포 대 케라틴세포의 비는 약 20:1 내지 약 3:1, 약 20:1 내지 약 4:1, 약 20:1 내지 약 5:1, 약 20:1 내지 약 10:1, 또는 약 20:1 내지 약 15:1일 수 있다.
층상 구조물은 섬유모세포와 멜라닌세포를 적어도 약 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10, 또는 1:100의 임의의 비 하에 포함할 수 있다. 일부 경우에, 섬유모세포 대 멜라닌세포의 비는 약 20:1 내지 약 3:1, 약 20:1 내지 약 4:1, 약 20:1 내지 약 5:1, 약 20:1 내지 약 10:1, 또는 약 20:1 내지 약 15:1일 수 있다.
층상 구조물은 케라틴세포와 멜라닌세포를 적어도 약 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10, 또는 1:100의 임의의 비 하에 포함할 수 있다. 일부 경우에, 케라틴세포 대 멜라닌세포의 비는 약 20:1 내지 약 3:1, 약 20:1 내지 약 4:1, 약 20:1 내지 약 5:1, 약 20:1 내지 약 10:1, 또는 약 20:1 내지 약 15:1일 수 있다.
층상 구조물 내의 세포의 한 가지 유형은 층상 구조물 내의 전체 세포 집단의 많아야 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%를 차지할 수 있다. 층상 구조물 내의 세포의 한 가지 유형은 층상 구조물 내의 전체 세포 집단의 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 차지할 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물 내의 섬유모세포는 층상 구조물 내의 전체 세포 집단의 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 차지할 수 있다.
합성 가죽
합성 가죽은 1개 이상의 층상 구조물에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 층상 구조물에 의해 형성될 수 있다.
합성 가죽은 다양한 두께일 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 천연 가죽과 유사한 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 약 0.001 mm 내지 약 100 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 층상 구조물은 약 0.005 mm 내지 약 50 mm, 약 0.005 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.5 mm 내지 약 5 mm, 약 0.5 mm 내지 약 3 mm, 약 0.8 mm 내지 약 3 mm, 약 0.8 mm 내지 약 2 mm, 약 0.8 mm 내지 약 1.8 mm, 약 0.8 mm 내지 약 1.6 mm, 약 0.9 mm 내지 약 1.4 mm, 약 1 mm 내지 약 1.5 mm, 약 1 mm 내지 약 1.4 mm, 또는 약 1 mm 내지 약 1.3 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 두께는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 10 mm, 20 mm, 40 mm, 60 mm, 80 mm, 또는 100 mm일 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 두께는 많아야 100 mm, 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 두께는 약 1.2 mm일 수 있다.
합성 가죽은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 길이는 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 길이는 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 길이를 가질 수 있다.
합성 가죽은 약 0.01 mm 내지 약 50 m의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.01 mm 내지 약 10 mm, 약 0.01 mm 내지 약 8 mm, 약 0.01 내지 약 5 mm, 약 0.02 내지 약 5 mm, 약 0.05 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 5 mm, 약 0.1 내지 약 2 mm, 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.8 mm, 또는 약 0.1 내지 약 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.02 mm 내지 5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.1 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 약 0.2 mm 내지 0.5 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 폭은 적어도 0.001 mm, 0.01 mm, 0.02 mm, 0.04 mm, 0.08 mm, 0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 8 mm, 또는 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 폭은 많아야 50 mm, 40 mm, 20 mm, 10 mm, 8 mm, 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0.8 mm, 0.4 mm, 0.2 mm, 0.1 mm, 0.08 mm, 0.04 mm, 0.02 mm, 또는 0.01 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 cm의 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 m의 폭을 가질 수 있다.
기저 막 대체물
합성 가죽은 기저 막 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 기저 막 대체물은 2개의 세포 층 사이에 있을 수 있으며, 예를 들어, 진피 층과 표피 층 사이에 있을 수 있다. 기저 막 대체물은 구조적 관점 및/또는 생화학적 관점에서 볼 때, 생체 내에 존재하는 것과 유사한 진피-표피 접합부일 수 있다. 생화학적 관점에서 볼 때, 기저 막 대체물은 기저 막의 성분, 치밀판의 성분, 투명판의 성분 및 기저층 아래 구역의 성분, 예컨대, 콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 라미닌 5, 엔탁틴 피브로넥틴, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
합성 가죽 내의 기저 막 대체물은 뇨 기저 막 (UBM), 간 기저 막 (LBM), 양막, 융모막, 동종 이식편 심막, 동종 이식편 무세포성 진피, 양막, 와튼 젤리 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 기저 막 대체물은 건조된 무세포성 양막일 수 있다. 특정 경우에, 기저 막 대체물은 중합체, 예를 들어, 나노 중합체일 수 있다. 예를 들어, 기저 막 대체물은 문헌 [Bye et al., Journal of Biomaterials and Tissue Engineering Vol. 4, 1-7, 2014]에 기재된 바와 같은 나노-섬유성 폴리 히드록시부티레이트-코히드록시발레레이트 (PHBV)일 수 있다.
스캐폴드
세포 층 (예를 들어, 진피 층), 층상 구조물, 또는 합성 가죽은 스캐폴드 상에 위치시킬 수 있다. 스캐폴드는 특정의 견고성 (예를 들어, 내인열성), 탄성 또는 둘 다를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드의 일부 또는 전체가 합성 가죽에 포함될 수 있다. 다른 경우에, 스캐폴드는 합성 가죽에 포함되지 않을 수 있다. 합성 가죽 내에서의 특정 층의 형성을 도와준 후, 스캐폴드는 최종 합성 가죽 산물로부터 제거될 수 있다. 특정 경우에, 합성 가죽에 포함된 스캐폴드는 일정 기간 후에 분해될 수 있다. 본원에 기재된 스캐폴드는 섬유주 패턴을 포함할 수 있다.
스캐폴드는 천연 재료, 합성 재료, 또는 그의 조합으로 만들어질 수 있다. 스캐폴드의 예는 생체흡수성 합성 중합체로 만들어진 네트를 이용하여 형성된 스캐폴드, 실리콘 필름에 나일론 네트를 부착시킴으로써 형성된 스캐폴드, 콜라겐 스펀지와 실리콘 시트의 2-층상 구조물을 갖는 스캐폴드, 시트로 만들어진 아테로콜라겐 스펀지를 사용하여 형성된 스캐폴드, 상이한 공극 크기를 갖는 콜라겐 스펀지를 매칭시킴으로써 형성된 스캐폴드, 및 세포가 없는 피브린 글루 또는 동종이계 피부를 사용하여 형성된 무세포성 진피 매트릭스 (ADM)를 포함한다.
스캐폴드는 천연 물질, 예컨대 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 매트릭스), 천연 접착제 (예를 들어, 피브린 글루, 콜드 글루, 동물성 글루, 혈액 알부민 글루, 카세인 글루, 또는 식물성 글루, 예컨대 전분 및 덱스트린 글루)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 실크를 포함한다. 예를 들어, 스캐폴드는 실크로 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 실크 피브로인, 셀룰로스, 면, 아세테이트, 아크릴, 라텍스 섬유, 린넨, 나일론, 레이온, 벨벳, 모다크릴, 올레핀 폴리에스테르, 새란, 비니온, 양모, 황마, 대마, 대나무, 아마 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 섬유를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 섬유는 실크, 면, 양모, 린넨, 특히 목재, 야채류 또는 조류로부터 추출된 셀룰로스, 폴리아미드, 변형된 셀룰로스 (레이온, 비스코스, 아세테이트, 특히 레이온 아세테이트), 폴리-p-페닐렌테레프탈아미드의 섬유; 아크릴 섬유, 예를 들어 폴리메틸 메타크릴레이트 또는 폴리-2-히드록시에틸 메타크릴레이트의 섬유; 폴리올레핀의 섬유, 예를 들어 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌, 유리, 실리카, 아라미드, 탄소, 예를 들어 흑연 형태의 탄소, 폴리(테트라플루오로에틸렌), 불용성 콜라겐, 폴리에스테르, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴로니트릴, 키토산, 폴리우레탄, 폴리(우레탄-우레아) 또는 폴리에틸렌 프탈레이트의 섬유; 및 상기 언급된 바와 같은 중합체의 블렌드로부터 형성된 섬유, 예컨대 폴리아미드/폴리에스테르 섬유 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
스캐폴드는 중합체를 포함할 수 있다. 중합체는 생체중합체일 수 있다. 생체중합체는 키틴, 키토산, 엘라스틴, 콜라겐, 케라틴 또는 폴리히드록시알카노에이트를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 중합체는 생분해성, 생체안정성, 또는 그의 조합일 수 있다. 스캐폴드 내의 중합체는 천연 중합체일 수 있다. 예시적인 천연 중합체는 폴리사카라이드, 예컨대 알지네이트, 셀룰로스, 덱스트란, 풀란, 폴리히알루론산, 키틴, 폴리(3-히드록시알카노에이트), 폴리(3-히드록시옥타노에이트) 또는 폴리(3-히드록시지방산)를 포함한다. 일부 경우에, 스캐폴드는 또한, 천연 중합체의 화학적 유도체를 포함한다. 이러한 화학적 유도체는 화학 기, 예컨대 알킬, 알킬렌, 히드록실화물, 산화물의 치환 및/또는 부가 뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙한 다른 변형을 포함할 수 있다. 천연 중합체는 또한, 단백질, 예컨대 콜라겐, 제인, 카세인, 젤라틴, 글루텐, 및 혈청 알부민으로부터 선택될 수 있다. 스캐폴드 내의 중합체는 생분해성 합성 중합체일 수 있으며, 이는 폴리 알파-히드록시산, 예컨대 폴리 L-락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 또는 그의 공중합체 (예를 들어, 폴리 D,L-락트산-공-글리콜산 (PLGA)), 및 히알루론산을 포함한다.
스캐폴드는 생체흡수성일 수 있다. 생체흡수성 스캐폴드는 살아있는 세포를 함유하거나 또는 지지할 수 있고, 이들을 일정 기간 동안 목적하는 입체 배치로 유지할 수 있는 비-세포독성 구조 또는 물질일 수 있다. 용어 "생체흡수성"은 신체로부터 배출되거나 또는 그 내부에서 대사되는 비-독성 부산물로 신체가 분해할 수 있는 임의의 재료를 지칭할 수 있다. 스캐폴드에 대한 예시적인 생체흡수성 재료는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(트리메틸렌 카르보네이트), 폴리(디메틸트리메틸렌 카르보네이트), 폴리(아미노산), 티로신 유래 폴리(카르보네이트), 폴리(카르보네이트), 폴리(카프롤락톤), 폴리(파라-디옥산온), 폴리(에스테르), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(무수물), 폴리(오르토 에스테르), 콜라겐, 젤라틴, 혈청 알부민, 단백질, 폴리사카라이드, 뮤코폴리사카라이드, 탄수화물, 글리코사미노글리칸, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(아크릴레이트 에스테르), 폴리(메타크릴레이트 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린, 더마탄 술페이트, 베르시칸, 공중합체, 중합체의 블렌드 및 혼합물, 및 생체흡수성 연쇄를 함유하는 올리고머를 포함한다.
스캐폴드는 다양한 두께일 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 세포 층을 형성하는데 적합할 수 있는 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 약 0.1 mm 내지 약 10 mm, 예컨대 약 0.1 mm 내지 약 5 mm, 약 0.1 mm 내지 약 4 mm, 약 0.1 mm 내지 약 3 mm, 약 0.1 mm 내지 약 2 mm, 약 0.1 mm 내지 약 1 mm, 약 0.2 mm 내지 약 1 mm, 약 0.3 mm 내지 약 1 mm, 약 0.4 mm 내지 약 1 mm, 약 0.5 mm 내지 약 1 mm, 0.3 mm 내지 약 1.5 mm, 약 0.4 mm 내지 약 1.2 mm, 약 0.6 mm 내지 약 1.2 mm, 또는 약 0.7 mm 내지 약 1.5 mm의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 약 0.5 mm 내지 1 mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 적어도 0.1 mm, 0.2 mm, 0.3 mm, 0.4 mm, 0.5 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 또는 5 mm 두께일 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 많아야 0.5 mm, 0.8 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm 두께일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 이러한 스캐폴드 상에 위치시키고/두거나 그 위에서 성장될 세포 층의 길이 및/또는 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 본원에 기재된 세포 층의 길이 및/또는 폭을 가질 수 있다.
스캐폴드는 합성 가죽의 표면에 특정 표면적을 가질 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 약 0.1 mm2 내지 약 100 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 95 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 90 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 85 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 80 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 75 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 70 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 65 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 60 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 55 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 50 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 45 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 40 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 35 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 30 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 25 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 20 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 15 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 10 mm2, 약 0.1 mm2 내지 약 5 mm2, 또는 약 0.1 mm2 내지 약 1 mm2의 표면적을 가질 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 약 0.1 cm2 내지 약 100 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 95 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 90 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 85 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 80 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 75 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 70 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 65 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 60 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 55 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 50 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 45 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 40 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 35 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 30 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 25 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 20 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 15 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 10 cm2, 약 0.1 cm2 내지 약 5 cm2, 또는 약 0.1 cm2 내지 약 1 cm2의 표면적을 가질 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 약 0.1 m2 내지 약 100 m2, 약 0.1 m2 내지 약 95 m2, 약 0.1 m2 내지 약 90 m2, 약 0.1 m2 내지 약 85 m2, 약 0.1 m2 내지 약 80 m2, 약 0.1 m2 내지 약 75 m2, 약 0.1 m2 내지 약 70 m2, 약 0.1 m2 내지 약 65 m2, 약 0.1 m2 내지 약 60 m2, 약 0.1 m2 내지 약 55 m2, 약 0.1 m2 내지 약 50 m2, 약 0.1 m2 내지 약 45 m2, 약 0.1 m2 내지 약 40 m2, 약 0.1 m2 내지 약 35 m2, 약 0.1 m2 내지 약 30 m2, 약 0.1 m2 내지 약 25 m2, 약 0.1 m2 내지 약 20 m2, 약 0.1 m2 내지 약 15 m2, 약 0.1 m2 내지 약 10 m2, 약 0.1 m2 내지 약 5 m2, 또는 약 0.1 m2 내지 약 1 m2의 표면적을 가질 수 있다.
일부 경우에, 스캐폴드는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75, 또는 100 mm2의 표면적을 가질 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75, 또는 100 cm2의 표면적을 가질 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75, 또는 100 m2의 표면적을 가질 수 있다.
또 다른 한편으론, 세포 층이 스캐폴드 상에서 형성되지 않을 수 있다. 예를 들어, 진피 층이 스캐폴드 (예를 들어, 콜라겐 매트릭스) 상에서 형성되지 않을 수 있다. 특정 경우에, 합성 가죽은 스캐폴드를 포함하지 않는다.
안료
합성 가죽은 하나 이상의 안료를 포함할 수 있다. 합성 가죽의 1개 이상의 층 구조가 안료처리될 수 있다. 합성 가죽 내의 안료는 이러한 합성 가죽을 형성하는 세포에서 생산된 천연 안료일 수 있다. 예를 들어, 안료는 멜라닌일 수 있으며, 이는 유멜라닌 (예를 들어, 브라운 유멜라닌 및 블랙 유멜라닌), 페오멜라닌, 신경 멜라닌, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 합성 가죽 내의 안료는 외인성 안료, 예컨대 가죽 안료 염료일 수 있다.
콜라겐
합성 가죽은 콜라겐을 포함할 수 있다. 콜라겐은 적어도 28가지 별개의 콜라겐 유형 계열의 임의의 구성원을 지칭할 수 있다. 콜라겐은 아미노산의 반복되는 삼중자 -(Gly-X-Y)n-로써 특징지을 수 있으므로, 콜라겐 내의 아미노산 잔기의 대략 1/3이 글리신이다. X는 프롤린일 수 있고 Y는 히드록시프롤린일 수 있다. 따라서, 콜라겐의 구조는 상이한 길이의 펩티드 쇄의 삼중 단위로 꼬여질 수 있다. 합성 가죽은 한 가지 이상의 종으로부터의 콜라겐을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 상이한 동물로부터의 콜라겐을 포함한다. 상이한 동물은 상이한 특성 (및 이로써 생성되는 가죽 상의 차이)을 초래할 수 있는 상이한 아미노산 조성의 콜라겐을 생산할 수 있다. 콜라겐 섬유 단량체는 약 1050개 아미노산 길이의 알파-쇄로부터 생산될 수 있으므로, 삼중 나선은 약 300 nm 길이와 약 1.5 nm 직경의 막대 형태를 취한다.
합성 가죽은 한 가지 이상의 유형의 콜라겐을 포함할 수 있다. 합성 가죽에 포함된 콜라겐은 원섬유성 콜라겐, 비-원섬유성 콜라겐, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 원섬유성 콜라겐은 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 V, 및 유형 XI 콜라겐을 포함한다. 비-원섬유성 콜라겐은 비연속성의 삼중 나선을 수반한 원섬유 관련 콜라겐 (예를 들어, 유형 IX, 유형 XII, 유형 XIV, 유형 XVI, 및 유형 XIX), 짧은 쇄 콜라겐 (예를 들어, 유형 VIII 및 유형 X), 기저 막 콜라겐 (유형 IV), 멀티플렉신 (비연속물을 수반한 다수의 삼중 나선 도메인) (예를 들어, 유형 XV 및 유형 XVIII), MACIT 콜라겐 (비연속성의 삼중 나선을 수반한 막 관련 콜라겐) (예를 들어, 유형 XIII 및 유형 XVII)을 포함한다.
콜라겐은 합성 가죽의 하나 이상의 부분에 포함될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐은 합성 가죽 내의 1개 이상의 진피 층, 1개 이상의 표피 층, 또는 그의 조합에 포함될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐은 합성 가죽 내의 1개 이상의 층상 구조물에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽의 일부가 프로세스 동안 제거될 수 있는 경우, 콜라겐은 이와 같이 제거된 산물에 포함될 수도 있다.
합성 가죽 내의 콜라겐은 하나 이상의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐은 합성 가죽 내의 콜라겐 생산 세포에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐은 가죽에 별도로 부가될 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 콜라겐 생산 세포에 의해 생산된 콜라겐 및 별도로 부가된 콜라겐을 포함한다.
합성 가죽 내의 콜라겐의 적어도 일부는 콜라겐 생산 세포에 의해 생산될 수 있다. 이러한 콜라겐 생산 세포는 합성 가죽에 포함될 수 있다. 예시적인 콜라겐 생산 세포는 상피 세포, 섬유모세포, 케라틴세포, 각질세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포, 기저 세포, 평활근 세포, 또는 그의 조합을 포함한다. 상피 세포는 편평 세포, 입방 세포, 원주 세포, 기저 세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 섬유모세포는 진피 섬유모세포를 포함할 수 있다. 케라틴세포는 상피 케라틴세포, 기저 케라틴세포, 증식성 기저 케라틴세포, 분화된 기저상부 케라틴세포, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 합성 가죽 내의 콜라겐은 한 가지 이상의 유형의 콜라겐 생산 세포에 의해 생산될 수 있다.
부가제
합성 가죽은 하나 이상의 부가제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부가제는 상업적 매력 (예를 들어, 외관, 색상, 또는 냄새)을 증강시킬 수 있다. 예시적인 부가제는 미네랄, 섬유, 지방산, 및 아미노산, 단백질을 포함한다. 부가제는 방향제일 수 있다.
부가제는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 매트릭스 단백질, 프로테오글리칸, 항산화제, 퍼플루오로카본, 및 성장 인자. 성장 인자는 단백질, 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드의 복합체 (시토카인 포함) (예를 들어, 세포에 의해 생산되고 그 자체에 영향을 미칠 수 있고/있거나 각종의 다른 이웃 또는 원거리 세포에 영향을 미칠 수 있는 것)일 수 있다. 성장 인자는 발달적으로 또는 다수의 생리학적 또는 환경적 자극에 반응하여 특이적 유형의 세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 미칠 수 있다. 전부는 아니지만 일부 성장 인자는 호르몬이다. 예시적인 성장 인자는 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 케라틴세포 성장 인자 (KGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) (염기성 FGF (bFGF) 포함), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) (PDGF-AA 및 PDGF-AB 포함), 간세포 성장 인자 (HGF), 전환 성장 인자 알파 (TGF-a), 전환 성장 인자 베타 (TGF- β) (TGFpi 및 TGFP3 포함), 표피 성장 인자 (EGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 인터류킨-6 (IL-6), IL-8 등을 포함한다. 다른 폴리펩티드 또는 분자 (예를 들어, 치유제; 효소, 예컨대 매트릭스-분해 효소 및 매트릭스-분해 효소 억제제 (예를 들어, TIMP), 항생제, 및 항진균제)가 합성 가죽에 부가될 수도 있다.
부가제는 또한, 관련 기술분야에 공지된 보존제를 포함할 수 있다. 예시적인 보존제는 항미생물 보존제, 예컨대 칼슘 프로피오네이트, 질산나트륨, 아질산나트륨, 아황산염 (예를 들어, 이산화황, 중황산나트륨, 아황산수소칼륨 등), 디소듐 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 항산화제, 예컨대 부틸화 히드록시아니솔 (BHA) 및 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT)을 포함한다.
특정 경우에, 합성 가죽은 세포외 매트릭스 또는 결합 조직을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 콜라겐, 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 및 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
합성 가죽의 패턴
합성 가죽은 패턴화될 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 영양, 곰, 비버, 들소, 수퇘지, 낙타, 카리부, 고양이, 소, 사슴, 개, 코끼리, 엘크, 여우, 기린, 염소, 산토끼, 말, 아이벡스, 캥거루, 사자, 라마, 스라소니, 밍크, 무스, 황소, 펫카리, 돼지, 토끼, 물개, 양, 다람쥐, 호랑이, 고래, 늑대, 야크, 얼룩말, 바다거북, 뱀, 악어, 앨리게이터, 공룡, 개구리, 두꺼비, 도롱뇽, 영원, 치킨, 오리, 에뮤, 거위, 뇌조, 타조, 꿩, 비둘기, 메추라기, 칠면조, 멸치, 농어, 메기, 잉어, 대구, 장어, 넙치, 복어, 그루퍼, 해덕, 넙치, 청어, 고등어, 마히 마히, 만타 레이, 청새치, 오렌지 러피, 농어, 파이크, 폴락, 연어, 정어리, 상어, 도미, 가자미, 가오리, 황새치, 틸라피아, 송어, 참치, 명태, 및 그의 조합으로부터 선택된 동물의 피부 패턴을 본 따서 패턴화될 수 있다. 이러한 패턴은 드래곤, 유니콘, 그리핀, 사이렌, 피닉스, 스핑크스, 사이클롭스, 사티르, 메두사, 페가수스, 켈베로스, 타이포우스, 고르곤, 카리브디스, 엠푸사, 키메라, 미노타우로스, 세투스, 히드라, 켄타우루스, 요정, 인어, 네스호 괴물, 새스콰치, 썬더버드, 예티, 추파카브라, 및 그의 조합으로부터 선택된 판타지 동물의 피부 패턴일 수 있다.
합성 가죽은 전통적인 동물의 피부, 가죽 또는 가죽 산물 및 디자인 파라미터 (예를 들어, 세포 유형, 부가제, 크기, 형상)와 유사하도록 만들 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 전통적인 동물의 피부, 가죽 또는 가죽 산물과 실질적으로 유사할 수 있는 조성으로써 특징지을 수 있는 세포 층을 포함한다. 예를 들어, 이러한 층은 실질적으로 약 60% 내지 80% 수성 유체, 약 14%-35% 단백질, 약 1%-25% 지방일 수 있는 조성으로써 특징지을 수 있다. 일부 경우에, 세포 층의 케라틴세포가 정렬된다. 예를 들어, 케라틴세포는 전기장의 인가에 의해 정렬될 수 있다. 예를 들어, 케라틴세포는 주기적 스트레칭 및 기저부 이완과 같은 기계적 자극의 적용에 의해 정렬될 수 있다. 일부 경우에, 정렬된 (예를 들어, 전기 배향 및 기계 배향) 케라틴세포는 많은 동물 피부 조직에서 볼 수 있는 바와 같이 서로에 대해 실질적으로 동일한 배향을 갖는다.
가죽 제품
본원에서의 합성 가죽은 가죽 제품의 적어도 일부분일 수 있다. 예를 들어, 합성 가죽은 가죽 제품에서 천연 가죽의 대체물로서 사용될 수 있다. 예시적인 가죽 제품은 시계줄, 벨트, 서스펜더, 패키징, 구두, 부츠, 신발류, 장갑, 의류 (예를 들어, 상의, 하의 및 겉옷), 러기지, 백 (예를 들어, 어깨 끈이 있거나 없는 핸드백), 클러치, 퍼스, 동전 퍼스, 빌폴드, 키 파우치, 크레디트 카드 케이스, 펜 케이스, 백팩, 케이스, 월렛, 안장, 마구, 채찍, 여행용품 (예를 들어, 트렁크, 슈트케이스, 트래블 백, 뷰티 케이스 또는 토일렛 키트), 륙색, 포트폴리오, 서류 백, 브리프케이스, 아타셰 백, 애완동물 용품 (예를 들어, 가죽끈 또는 목걸이), 사냥 및 낚시 용품 (예를 들어, 총 케이스, 커트러리 케이스 또는 단단한 무기용 홀스터), 고정 물품 (예를 들어, 라이팅 패드, 북 커버, 카메라 케이스, 안경 케이스, 담배 케이스, 시가 케이스, 보석 케이스 또는 휴대폰 홀스터), 스포츠 용품 (예를 들어, 공, 예컨대 농구공, 축구공, 또는 풋볼), 빌딩 인테리어, 빌딩 익스테리어, 업홀스터리, 북 바인딩, 가구, 램프, 램프 쉐이드, 테이블 커버링, 벽 커버링, 바닥 커버링, 천장 커버링, 자동차 인테리어, 자동차 익스테리어, 보트 인테리어, 보트 익스테리어, 비행기 인테리어, 요트 인테리어, 요트 익스테리어, 베개 커버, 시트, 이불 커버, 보석류, 액세서리, 안경, 선글라스, 또는 소비자 전자제품을 포함한다. 예를 들어, 가죽 제품은 시계줄일 수 있다. 예를 들어, 가죽 제품은 벨트일 수 있다. 예를 들어, 가죽 제품은 백일 수 있다.
피부 이식편
합성 가죽 또는 그의 일부분은 또한, 특정 대상체에게 이식하기 위한 피부 이식편, 예를 들어, 동종 이식편 또는 이종 이식편으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 합성 가죽, 진피 층, 표피 층 및/또는 층상 구조물은 동종 이식 또는 이종 이식을 위한 피부 이식편의 공급원일 수 있다. 일부 경우에, 상기 합성 가죽, 진피 층, 표피 층 및/또는 층상 구조물은 이식편의 수용자에서의 면역 거부 반응을 감소시키도록 유전적으로 변형된 세포를 이용하여 생산될 수 있다.
방법
또한 본원에는 합성 가죽을 제조하는 방법이 개시된다. 이러한 방법은 인공 진피 층을 형성하는 것, 인공 표피 층을 형성하는 것, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 상기 방법은 인공 진피 층 및/또는 인공 표피 층의 적어도 일부분을 태닝하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 합성 가죽 내의 세포, 예를 들어, 진피 층 및/또는 표피 층 내의 세포는 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)로부터 분화될 수 있다. 본원에서의 방법은 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)를 합성 가죽 내의 세포, 예를 들어, 진피 층 및/또는 표피 층 내의 세포로 분화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 경우에, 상기 방법은 제1 세포 층 (예를 들어, 표피 층)을 제2 세포 층 (예를 들어, 진피 층) 상에 위치시킴으로써 층상 구조물을 형성하고, 이러한 층상 구조물의 적어도 일부분을 태닝하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 제1 세포 층 (예를 들어, 표피 층)의 적어도 일부분을 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
세포 층를 형성함
세포 층은 한 가지 이상의 유형의 세포를 포함하는 복수 개의 다세포체를 제조하고, 세포 층을 형성하도록 상기 다세포체를 배열함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, 세포 층은 복수 개의 다세포체를 인접하게 배열함으로써 형성될 수 있으며, 여기서 상기 다세포체는 평탄한 층을 형성하도록 융합된다.
세포 층을 형성하는데 스캐폴드가 필요할 수 있다. 세포 층은 복수 개의 다세포체를 스캐폴드 상에 배열함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 형성 단계는 특정 층 (예를 들어, 실질적으로 평탄한 층)을 형성하도록 다세포체를 융합시켜줄 수 있는 지지 기판 상에 다세포체를 배열하거나 또는 위치시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 다세포체 또는 층은 서로 인접하여 수평적으로 및/또는 수직적으로 배열된다. 또 다른 한편으론, 세포 층을 형성하는데 스캐폴드가 필요하지 않을 수 있다.
세포 층은 세포를 매질 또는 겔에 포매시킴으로써 형성될 수 있다. 일부 경우에, 진피 층은 콜라겐 I 또는 피브린 겔에 포매된 섬유모세포를 사용하여 형성될 수 있다. 다른 유형의 매질이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 매질은 콜라겐 겔을 필요로 하지 않으면서도 표피의 연장된 유지를 가능하게 하기에 충분한 양의 세포 외 매트릭스를 분비시키도록 섬유모세포를 증진시킬 수 있다.
다세포체를 형성함
본원에 기재된 특징을 갖는 다세포체를 만드는 다양한 방식이 있다. 일부 경우에, 다세포체는, 예를 들어, 목적하는 세포 밀도 및 점도를 수반한 복수 개의 세포를 함유하는 세포 페이스트로부터 제작될 수 있다. 추가 경우에, 이러한 세포 페이스트는 목적하는 형상으로 성형될 수 있고 성숙 (예를 들어, 인큐베이션)을 통하여 다세포체가 형성될 수 있다. 일부 경우에, 긴 다세포체는 복수 개의 세포를 포함한 세포 페이스트가 늘어난 형상 (예를 들어, 실린더)이 되도록 성형함으로써 생산될 수 있다. 추가 경우에, 세포 페이스트는 세포가 서로 부착 및/또는 응집하여 긴 다세포체를 형성할 수 있도록 제어된 환경에서 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 다세포체는 세포 페이스트를 3차원 형상으로 유지시켜 주는 장치에서 복수 개의 살아있는 세포를 포함한 세포 페이스트를 성형시킴으로써 생산될 수 있다. 일부 경우에, 세포 페이스트는 제어된 환경에서 인큐베이션될 수 있으며, 그동안에 본원에 기재된 바와 같이 편평한 표면 상에 그 자체를 지지하기에 충분한 응집력을 갖는 몸체를 생산하기에 충분한 시간 동안 3차원 형상으로 유지될 수 있다.
세포 페이스트는 (A) 세포 또는 세포 응집체 (한 가지 이상의 세포 유형의 것)와 세포 배양 배지를 (예를 들어, 미리 결정된 비로) 혼합하여 세포 현탁액을 생산하는 단계, 및 (B) 목적하는 세포 밀도 및 점도를 수반한 세포 페이스트를 생산하기 위해 세포성 현탁액을 압축시키는 단계에 의해 제공될 수 있다. 압축은 수많은 방법에 의해, 예컨대 세포 페이스트에 요구되는 목적하는 세포 농도 (밀도), 점도, 및 점조도를 달성하기 위해 세포 배양물로부터 발생된 특별한 세포 현탁액을 농축시킴으로써 달성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 배양물로부터의 비교적 묽은 세포 현탁액은 주형 내에서의 성형을 허용해 주는 펠릿 내의 세포 농도를 달성하도록 결정된 시간 동안 원심분리시킬 수 있다. 접선 흐름 여과 ("TFF")는 세포를 농축 또는 압축하는데 적합한 또 다른 방법이다. 일부 경우에, 화합물을 세포 현탁액과 배합하여 요구되는 압출 특성을 부여한다. 적합한 화합물은 콜라겐, 히드로겔, 매트리겔, 나노 섬유, 자기 어셈블링 나노 섬유, 젤라틴, 및 피브리노겐을 포함한다. 세포 펠릿을 ECM 성분 (또는 ECM 성분의 유도체)을 함유하는 하나 이상의 생리학상 허용되는 완충제에 재현탁시킴으로써 하나 이상의 ECM 성분 (또는 ECM 성분의 유도체)을 또한 포함시킬 수 있고, 이로써 생성되는 세포 현탁액을 다시 원심분리시켜 세포 페이스트를 형성할 수 있다.
세포 페이스트를 성형하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 특별한 실시양태에서, 세포 페이스트는 목적하는 형상을 달성하기 위해 수동으로 성형 또는 압착 (예를 들어, 농축/압축 후)시킬 수 있다. 추가 예로서, 세포 페이스트는 기기의 내부 표면과 일치하도록 세포 페이스트를 성형하는 마이크로 피펫 (예를 들어, 모세관 피펫)과 같은 미리 형성된 기기 내로 취입 (예를 들어, 흡인)될 수 있다. 마이크로 피펫 (예를 들어, 모세관 피펫)의 단면 형상은 또 다른 한편으론, 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형 또는 다른 비-원형 단면 형상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 페이스트는 이를 미리 형성된 주형, 예컨대 플라스틱 주형, 금속 주형 또는 겔 주형 내로 침착시킴으로써 성형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 원심 주조 또는 연속 주조를 사용하여 세포 페이스트를 성형할 수 있다.
세포 페이스트는 추가로 성숙시킬 수 있다. 일부 경우에, 세포 페이스트는 부착 및/또는 응집성을 촉진하기 위해 약 37℃에서 일정 기간 동안 (이는 세포 유형에 의존적일 수 있음) 인큐베이션될 수 있다. 또 다른 한편으론 또는 또한, 세포 페이스트는 부착 및/또는 응집성을 촉진하기 위한 인자 및/또는 이온을 함유하는 세포 배양 배지의 존재 하에 유지시킬 수 있다.
다세포체를 지지 기판 상에 배열하여 층을 형성함
다세포체는 목적하는 3차원 구조 (예를 들어, 실질적으로 평탄한 층)를 생성하도록 지지 기판 상에 배열될 수 있다. 예를 들어, 다세포체는 수동으로 서로 접촉하게 위치될 수 있거나, 피펫, 노즐 또는 바늘로부터 압출함으로써 제 위치에 침착되거나, 또는 자동화 기계, 예컨대 바이오 제작기에 의해 접촉하여 위치될 수 있다.
지지 기판은 유체, 기체 및 영양소를 투과시킬 수 있고, 배열 및 후속 융합 동안 다세포체 및/또는 층의 모든 표면에 세포 배양 배지가 접촉하게 한다. 일부 경우에, 지지 기판은 천연 생체재료, 예컨대 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 및 다른 세포외 매트릭스로부터 만들어질 수 있다. 일부 경우에, 지지 기판은 합성 생체재료, 예컨대 히드록시아파타이트, 알지네이트, 아가로스, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 및 그의 공중합체로부터 만들어질 수 있다. 일부 경우에, 지지 기판은 고체, 반고체, 또는 고체와 반고체 지지체 요소의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 지지 기판은 평탄한 층의 생성을 촉진시키기 위해 평탄할 수 있다. 일부 경우에, 지지 기판은 세포 배양 환경 (예를 들어, 페트리 디쉬, 세포 배양 플라스크 등)의 일부분 또는 바이오반응기와 같은 비-투과성 표면 위로 올리거나 들어올릴 수 있다. 들어올려진 투과성의 지지 기판은 조기 세포 사멸의 방지에 기여할 수 있고, 세포 성장의 증강에 기여할 수 있으며, 다세포체의 융합을 촉진시켜 층을 형성할 수 있다.
일단 층의 어셈블리가 완료되면, 조직 배양 배지를 구축물의 상부에 부을 수 있다. 일부 경우에, 조직 배양 배지는 다세포체 사이의 공간으로 유입되어 다세포체 내의 세포를 지지한다. 3차원 구축물 내의 다세포체는 서로 융합될 수 있어 합성 가죽의 형성에 사용하기 위한 층 (예를 들어, 실질적으로 평탄한 층)을 생성할 수 있다. 용어 "융합하다", "융합된" 또는 "융합"은 인접하는 다세포체의 세포가 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 통하여 직접적으로, 또는 세포와 ECM 성분 또는 ECM 성분의 유도체 간의 상호 작용을 통하여 간접적으로 서로 부착되고/되거나 응집된다는 것을 의미할 수 있다. 융합된 층은 완전히 융합될 수 있고 그 다세포체는 실질적으로 인접해있다. 또 다른 한편으론, 융합된 층은 실질적으로 융합될 수 있거나 또는 부분적으로 융합될 수 있고, 다세포체의 세포는 그 층을 무손상되게 움직이고 조작할 수 있는데 필요한 정도로 부착 및/또는 응집되어 있다.
다세포체는 세포 배양 환경 (예를 들어, 페트리 디쉬, 세포 배양 플라스크, 또는 바이오반응기)에서 층을 형성하도록 융합될 수 있다. 일부 경우에, 다세포체는 이러한 다세포체에 포함된 세포 유형의 성장을 촉진시키기에 적합한 조건을 수반한 환경에서 층을 형성하도록 융합된다. 일부 경우에, 융합은 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 및 60분, 및 그 안에서의 증분에 걸쳐 일어난다. 다른 경우에, 융합은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 및 48시간, 및 그 안에서의 증분에 걸쳐 일어난다. 또한 다른 경우에, 융합은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 및 14일, 및 그 안에서의 증분에 걸쳐 일어난다. 추가 경우에, 융합은 약 2시간 내지 약 24시간에 걸쳐 일어난다. 융합 시간과 관련된 요인은 세포 유형, 세포 유형 비, 배양 조건, 및 부가제, 예컨대 성장 인자의 존재를 포함할 수 있다.
일단 층의 융합이 완료되면, 이러한 층과 지지 기판은 분리될 수 있다. 다른 경우에, 층의 융합이 실질적으로 완료되거나 또는 부분적으로 완료될 때 층과 지지 기판이 분리되지만, 층의 세포는 층을 쪼개지 않고 이동, 조작 및 적층할 수 있는데 필요한 정도로 서로 부착 및/또는 응집된다. 층과 지지 기판은 지지 기판을 용융, 용해 또는 분해시키기 위한 표준 절차를 통해 분리될 수 있다. 일부 경우에, 지지 기판은, 예를 들어, 층에 불리한 영향을 미치지 않는 온도 변화, 빛 또는 다른 자극에 의해 용해될 수 있다. 특정 경우에, 지지 기판은 가요성 재료로 만들어질 수 있고 층으로부터 벗겨질 수 있다. 이와 같이 분리된 층은 추가 성숙을 위하여 바이오반응기로 옮겨질 수 있다. 일부 경우에, 분리된 층은 조작된 동물의 피부, 가죽 또는 가죽 산물 내로 혼입된 후에 성숙하고 추가로 융합된다.
또 다른 한편으론, 층과 지지 기판은 분리되지 않을 수 있다. 지지 기판은 어셈블리되고 조작된 동물의 피부, 가죽 또는 가죽 산물의 패키징, 냉동, 판매 또는 소비에 앞서 분해되거나 생분해된다.
세포 층은 일정 기간에 걸쳐 형성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 층, 예를 들어, 표피 층 또는 진피 층은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 120, 300일 이내에 형성될 수 있다. 일부 경우에, 진피 층은 약 1 내지 15일, 예를 들어, 5 내지 10일, 또는 10 내지 12일 이내에 형성될 수 있다. 일부 경우에, 진피 층은 약 5 내지 25일, 예를 들어, 14 내지 15일에 형성될 수 있다.
본 개시내용은 개선된 장벽 기능을 갖는 합성 가죽을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 이러한 방법은 케라틴세포, 및 아스코르브산과 리놀레산를 포함하는 배양 배지를 제공하고; 개선된 장벽 기능을 갖는 합성 가죽이 형성될 수 있는 조건 하에 케라틴세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 배양 조건은 약 50 내지 95% 습도, 예를 들어, 약 75% 습도에서의 배양을 포함한다. 일부 경우에, 아스코르브산은 약 10 내지 100 마이크로그램/ml의 농도로 제공될 수 있다. 또한 추가 경우에, 리놀레산은 약 5 내지 80 마이크로몰의 농도로 제공될 수 있다. 본 개시내용은 특별한 공급원의 케라틴세포로부터 형성된 합성 가죽으로 제한되지 않는다. 실제로, 합성 가죽은 근접-이배체 불멸화 케라틴세포 (NIKS) 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 각종의 1차 및 불멸 케라틴세포로부터 형성될 수 있다. 또한 추가 경우에, 케라틴세포는 외인성 야생형 또는 변이체 크루펠(Kruppel) 유사 인자 (GKLF)를 발현한다. 또한 추가 경우에, 케라틴세포는 2가지 상이한 공급원으로부터 유래된다. 다른 경우에, 합성 가죽은 약 40 내지 약 240 pF의 표면 전기 용량을 갖는다. 일부 바람직한 경우에, 피부 등가물은 약 80 내지 약 120 pF의 표면 전기 용량을 갖는다. 다른 바람직한 경우에, 피부 등가물 내의 세라미드 5, 6, 및 7의 함량은 총 세라미드 함량의 약 20 내지 약 50%일 수 있다. 또한 다른 바람직한 경우에, 피부 등가물 내의 세라미드 2의 함량은 총 세라미드 함량의 약 10 내지 약 40%일 수 있다. 또한 추가 경우에, 본 개시내용은 바로 위에 기재된 방법에 의해 만들어진 피부 등가물을 제공한다.
층상 구조물을 형성하기 위해 층을 배열함
다수의 세포 층은 층 구조를 형성하기 위해 배열되어, 본원에 기재된 합성 가죽을 생산할 수 있다. 일부 경우에, 진피 층 및 표피 층은 별도로 형성되고, (예를 들어, 표피 층과 진피 층 둘 다가 완전히 형성될 때) 표피 층을 진피 층의 맨 위에 위치시킴으로써 어셈블리된다. 일부 경우에, 표피 층은 진피 층의 맨 위에서 성장될 수 있다. 특정 경우에, 기저 막 또는 기저 막 대체물은 진피 층과 표피 층 사이에 위치시킬 수 있다. 예를 들어, 세포 층은 서로 접촉하게 수동으로 위치될 수 있거나, 또는 컴퓨터 스크립트에 따라서 자동화된 컴퓨터 이용 기계, 예컨대 바이오 제작기에 의해 제 위치에 침착될 수 있다.
다수의 세포 층을 어셈블리하기 전에, 하나 이상의 품질 관리 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 트랜스 상피 전기 저항 (TEER)은 진피 상에 위치시키기 전에 (예를 들어, 0일) 표피 상에서 수행한 다음, 조직학 분석 (예를 들어, 최소 3~5일)을 수행할 수 있다. 본원에 제공된 방법을 사용하여, 부적절하게 형성된 층상 구조물 또는 전층 피부 등가물의 위험을 낮출 수 있다.
다수의 세포 층은 다양한 방식으로 어셈블리될 수 있다. 일부 경우에, 표피 층 및 진피 층 (기저 막 대체물을 수반하거나 수반하지 않음)은, 예를 들어, 천연 가죽의 두께 및 인장 강도를 달성하기 위해 스캐폴드 (예를 들어, 실크) 상에 위치시킨다. 일부 경우에, 표피 층 및 다수의 진피 층 (기저 막 대체물을 수반하거나 수반하지 않음)은 스캐폴드를 사용하지 않으면서 어셈블리된다. 이러한 어셈블리는 천연 가죽과 유사한 두께 및 인장 강도를 달성시켜 줄 수 있다. 일부 경우에, 표피 층 및 다수의 진피 층 (기저 막 대체물을 수반하거나 수반하지 않음)은 천연 가죽과 유사한 두께 및 인장 강도를 달성하기 위해 스캐폴드 (예를 들어, 실크) 상에 위치시킨다.
일부 실시양태에서, 화학적, 기계적, 성능, 강도, 내구성, 수분, 치수 시험 또는 그의 조합이 하나 이상의 다수의 세포 층, 합성 가죽, 인공 표피 층, 인공 진피 층, 층상 구조물, 그로부터 생산된 산물 상에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적, 기계적, 성능, 강도, 내구성, 수분, 치수 시험 또는 그의 조합은 비-표준 시험을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적, 기계적, 성능, 강도, 내구성, 수분, 치수 시험 또는 그의 조합은 표준 시험을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험은 국제 표준 기구 (ISO), 유럽 표준 기구 (CEN), ASTM 국제 또는 국제 가죽 기술자 및 화학자 연합 (IULTCS)이 지시 및/또는 채택 및/또는 비준 및/또는 개발한 바와 같이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 1 - 표 11 중 임의의 하나 또는 그의 임의의 변형에서의 시험은 임의의 하나 이상의 상응하는 방법 또는 그의 임의의 변형을 사용하여 수행될 수 있다.
표 1.
Figure 112018115914734-pct00001
표 2.
Figure 112018115914734-pct00002
표 3.
Figure 112018115914734-pct00003
표 4.
Figure 112018115914734-pct00004
표 5.
Figure 112018115914734-pct00005
표 6.
Figure 112018115914734-pct00006
표 7.
Figure 112018115914734-pct00007
표 8.
Figure 112018115914734-pct00008
표 9.
Figure 112018115914734-pct00009
표 10.
Figure 112018115914734-pct00010
표 11.
Figure 112018115914734-pct00011
일부 실시양태에서, 가죽 산물은 실제 가죽과 유사한 물리적 특성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 ASTM D-2209-95에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 lb/in2의 인장 강도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 ASTM D-2209-95에 의해 측정된 바와 같이, 약 5000, 4000, 3000, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 lb/in2 미만의 인장 강도를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 ASTM-D2212-94에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 lb의 슬릿을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 ASTM-D2212-94에 의해 측정된 바와 같이, 약 200, 150, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 lb 미만의 슬릿을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 ASTM-D4705-93에 따라서 측정된 경우에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100의 스티치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 약 200, 150, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 미만의 스티치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 그들의 각각의 시험에 따라서 측정된 경우에 적어도 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 lb의 슬릿 및 스티치 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 합성 가죽 또는 그로부터 만들어진 가죽 산물은 ASTM D6182에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 약 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50,000, 55000, 60000, 65000, 70000, 80000의 발리 플렉스(Bally flex)를 가질 수 있다.
다수의 세포 층이 어셈블리되어 합성 가죽 (예를 들어, 전층 피부 등가물)을 형성할 수 있다. 합성 가죽은 윗부분, 중간 부분 및 바닥 부분을 포함할 수 있다. 윗부분은 표피 층을 포함할 수 있다. 예를 들어, 윗부분은 단일 층 표피 층일 수 있다. 중간 부분은 기저 막 대체물을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 중간 부분은 기저 막 대체물을 갖지 않는다. 예를 들어, 중간 부분은 무시할만한 두께의 층을 가질 수 있다. 바닥 부분은 1개 이상의 진피 층을 가질 수 있다. 일부 경우에, 바닥 부분은 스캐폴드 (예를 들어, 실크) 상에 위치된 단일 진피 층을 갖는다. 일부 경우에, 바닥 부분은 어떠한 스캐폴드도 없이 다수의 진피 층 (예를 들어, 5개 이하의 층)을 갖는다. 일부 경우에, 바닥 부분은 서로 맨 위에 적층되고 스캐폴드 (예를 들어, 실크) 상에 위치된 다수의 진피 층을 갖는다.
표피 층과 진피 층 간의 접착성은 층 분할에 저항할 정도로 충분히 강할 수 있다. 일부 경우에, 세포 층은 스캐폴드 상으로 접착함으로써 어셈블리될 수 있다. 천연 또는 합성 접착제가 어셈블리를 위해 사용될 수 있다. 천연 접착제는 피브린 글루, 콜드 글루, 동물성 글루 (예를 들어, 뼈 글루, 생선 글루, 가죽 글루, 발굽 글루, 토끼 피부 글루, 미트 글루), 혈액 알부민 글루, 카세인 글루, 식물성 글루 (예를 들어, 전분, 덱스트린 글루, 캐나다 발삼, 송진 기반 글루, 코코니아, 아라비아 검, 우표 검, 라텍스, 라이브러리 페이스트, 메틸 셀룰로스, 점액, 레조르시놀 수지, 또는 우레아-포름알데히드 수지), 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 합성 접착제는 아크릴로니트릴, 시아노아크릴레이트 (예를 들어, n-부틸-2-시아노아크릴레이트 글루), 아크릴, 레조르시놀 글루, 에폭시 수지, 에폭시 퍼티, 에틸렌-비닐 아세테이트, 페놀 포름알데히드 수지, 폴리아미드, 폴리에스테르 수지, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리술피드, 폴리우레탄, 폴리비닐 아세테이트 [화이트 글루 (예를 들어, 엘머 글루) 및 옐로우 카펜터의 글루 (지방족 수지) 포함], 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 클로라이드 (PVC), 폴리비닐 클로라이드 에멀션 (PVCE), 폴리비닐피롤리돈 고무 시멘트, 실리콘, 및 스티렌 아크릴 공중합체일 수 있다. 예를 들어, 어셈블리는 피브린 글루를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 어셈블리는 n-부틸-2-시아노아크릴레이트 글루를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 경우에, 세포 층 (예를 들어, 실질적으로 평탄한 층)을 적층시켜 합성 가죽을 형성한다. 세포 층은 다세포체의 위치, 패턴 또는 배향에 의해 규정된 배향을 가질 수 있다. 일부 경우에, 각각의 층은 지지 기판 및/또는 1개 이상의 다른 층과 비교하여 특별한 배향으로 적층될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 층은 지지 기판 및/또는 아래층과 비교하여 회전을 포함하는 배향으로 적층될 수 있으며, 여기서 이러한 회전은 0.1 내지 180도, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 및 180도, 또는 그 안에서의 증분일 수 있다. 다른 경우에, 모든 층은 실질적으로 유사하게 배향된다.
일단 층의 적층이 완료되면, 3차원 구축물 내의 층은 서로 융합되어 합성 가죽을 생산하도록 할 수 있다. 일부 경우에, 상기 층은 세포 배양 환경 (예를 들어, 페트리 디쉬, 세포 배양 플라스크, 바이오반응기 등)에서 융합된다. 일부 경우에, 융합은 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 및 60분, 및 그 안에서의 증분에 걸쳐 일어난다. 다른 경우에, 융합은 1 내지 48시간, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 및 48시간, 및 그 안에서의 증분에 걸쳐 일어난다. 예를 들어, 융합은 약 2시간 내지 약 24시간에 걸쳐 일어날 수 있다.
배양 조건
세포 및 세포 층은 다양한 세포 배양 조건에서 배양될 수 있다. 세포 또는 세포 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 진피 층 및/또는 표피 층은 시험관 내에서 배양될 수 있다. 또 다른 한편으론, 세포 또는 세포 층은 생체 내에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 진피 층 및/또는 표피 층은 생체 내에서 배양될 수 있다.
세포 및 세포 층은 하나 이상의 보충물과 함께 배양될 수 있다. 하나 이상의 보충물은 천연 보충물, 합성 보충물, 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 보충물은 부가제일 수 있다. 일부 경우에, 보충물 중 하나 이상은 iPSC 유래 섬유모세포로부터 세포외 매트릭스의 생산과 어셈블리를 유도하므로, 합성 가죽의 천연 겉모습을 증강시킨다. 예시적인 보충물은 ECM 성분, 예컨대 콜라겐 및 피브린, 성장 인자, 작은 분자, 예컨대 아스코르브산 등, 거대 분자, 예컨대 덱스트란 술페이트, 카라기난 등을 포함할 수 있다.
세포 층은 특정의 공기 습도 하에 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포 층 (예를 들어, 진피 층 또는 표피 층)은 약 20% 내지 약 100% 습도 하에 배양될 수 있다. 예를 들어, 습도는 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 95%, 약 45% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 80%, 약 71% 내지 약 79%, 약 72% 내지 약 78%, 약 73% 내지 약 77%, 약 74% 내지 약 76%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 75%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 또는 약 90% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 약 46% 내지 약 54%, 약 47% 내지 약 53%, 약 48% 내지 약 52%, 약 48% 내지 약 53%, 약 49% 내지 약 54%, 또는 약 47% 내지 약 51%일 수 있다.
가죽 프로세싱
태닝
본원에서의 방법은 합성 가죽의 적어도 일부분, 예를 들어, 합성 가죽 내의 진피 층 및/또는 표피 층의 적어도 일부분을 태닝하는 것을 포함할 수 있다. 태닝은 합성 가죽을 천연 가죽과 유사하게 만들 수 있으며, 이는 동물의 생가죽 및 피부 (종종 소의 가죽)의 태닝에 의해 창출된 내구성 있는 가요성 재료일 수 있다. 본원에서의 태닝은 가죽을 생산하도록 동물의 피부를 처리하는 프로세스를 지칭할 수 있다. 태닝은 식물성 태닝 (예를 들어, 탄닌을 사용함), 크롬 태닝 (황산크로뮴을 포함한 크로뮴 염), 알데히드 태닝 (글루타르알데히드 또는 옥사졸리딘 화합물을 사용함), 신탄 (방향족 중합체를 사용하는, 합성 탄닌), 박테리아 염색 등을 포함한 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
태닝은 가죽/피부 내의 단백질을 부패하지 않는 안정한 재료로 전환시키면서도, 이러한 재료가 유연하게 유지할 수 있도록 수행될 수 있다. 크로뮴이 태닝 재료로서 사용될 수 있다. 세포 층 또는 층상 구조물의 pH는 태닝을 증강시키도록 조정될 수 있고 (예를 들어, 낮아지며; 예를 들어, pH 약 2.8-3.2로 낮아짐); 태닝 후에는 pH가 상승될 수 있다 (약간 더 높은 수준, 예를 들어, pH 약 3.8-4.2로 "염기화").
태닝은 세포 층, 예를 들어, 진피 층 및 표피 층 상에서 수행될 수 있다. 태닝은 또한, 층상 구조물, 예를 들어, 적어도 진피 층 및 적어도 표피 층을 포함하는 층상 구조물 상에서 수행될 수 있다. 특정 경우에, 태닝은 또한, 합성된 가죽 상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 태닝은 세포 층, 예를 들어, 진피 층 또는 표피 층을 형성한 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 태닝은 층상 구조물을 형성한 후에 수행될 수 있다.
태닝은 세포외 매트릭스 (ECM) 재료를 변형시킴으로써 수행될 수 있다. 태닝은 ECM 중의 콜라겐을 변형시킴으로써 수행될 수 있다. 태닝은 태닝제, 예를 들어, 황산크로뮴(III) ([Cr(H2O)6]2(SO4)3)을 사용하여 수행될 수 있다. 황산크로뮴(III)은 용해되어 헥사아쿠아크로뮴(III) 양이온, 즉 [Cr(H2O)6]3+을 제공할 수 있으며, 이는 더 높은 pH에서 올화로 불리는 프로세스를 진행하여, 태닝에서 활성이어서 콜라겐 서브유닛의 가교 결합물인 폴리크로뮴(III) 화합물을 제공한다. 일부 리간드는 술페이트 음이온, 콜라겐의 카르복실 기, 아미노산의 측쇄로부터의 아민 기 뿐만 아니라 마스킹제를 포함한다. 마스킹제는 폴리크로뮴(III) 쇄의 형성을 억제하기 위해 사용된 카르복실산, 예컨대 아세트산일 수 있다. 마스킹제는 크로뮴(III) 착물의 침투를 억제하지 않으면서도 콜라겐의 반응성을 증가시키기 위해 pH를 추가로 증가시키는 태너를 허용할 수 있다. 태닝은 폴리크로뮴 종에 의한 가교 결합과 일치하여, 올화 및 옥솔화로부터 발생되는 부류의 콜라겐 (예를 들어, 10 내지 17Å) 내의 단백질 쇄 간의 간격을 증가시킬 수 있다. 크로뮴은 콜라겐과 가교 결합될 수 있다. 크로뮴-태닝된 가죽은 약 4% 내지 5%의 크로뮴을 함유할 수 있다. 이러한 효율은 가죽의 증가된 열수 안정성, 및 가열된 물에서의 수축에 대한 저항으로써 특징지을 수 있다. 다른 태닝제를 사용하여 층상체를 태닝하고 콜라겐을 변형시킬 수 있다.
태닝은 또한, 다른 미네랄을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우에, 태닝은 백반, 지르코늄, 티타늄, 철 염, 또는 그의 조합에 근거한 작용제를 사용하여 수행될 수 있다.
추가 프로세싱
본원에서 만든 세포 층, 층상 구조물, 및 합성 가죽은 태닝 후에 추가로 프로세싱될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 가죽 프로세싱 단계 (예를 들어, 전통적인 가죽 형성에 사용된 것)를 추가로 포함한다. 프로세싱 단계의 예는 다음을 포함한다: 보존처리, 침지, 석회처리, 탈모, 플레싱, 스플리팅, 탈회, 재석회처리, 효해, 탈지, 프리징, 표백, 착색, 침산, 탈침산, 태닝, 재태닝 (예를 들어, 프로세싱 동안 색이 없어지는 경우), 시닝, 리태닝, 윤활, 크러스팅, 습윤화, 새밍, 쉐이빙, 리크로밍, 중화, 염색, 유화가지, 필링, 스트리핑, 스터핑, 화이트닝, 고착, 세팅, 건조, 컨디셔닝, 밀링 (예를 들어, 건식 밀링), 스테이킹, 버핑, 피니싱, 오일링, 브러싱, 패딩, 함침, 분무, 롤러 코팅, 커튼 코팅, 폴리싱, 플레이팅, 엠보싱, 아이어닝, 글레이징, 및 텀블링.
합성 가죽은, 예를 들어, 동물의 피부, 가죽, 또는 가죽을 구축하는데 사용된 층 및/또는 다세포체의 수, 크기, 및 배열을 제어함으로써 성형될 수 있다. 다른 경우에, 동물의 피부, 가죽, 또는 가죽은, 예를 들어, 커팅, 프레싱, 몰딩, 또는 스탬핑에 의해 성형될 수 있다. 합성 가죽의 형상은 전통적인 동물의 피부, 가죽, 또는 가죽 산물과 유사하도록 만들 수 있다.
본원에서의 방법은 본원에서 생산된 합성 가죽의 일부분을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 방법은 표피 층의 적어도 일부분을 제거하여 제거된 산물을 형성하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 제거는 쉐이빙일 수 있다.
안료처리
본원에서의 방법은 합성 가죽을 안료처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 안료처리는 안료 생산 세포 (예를 들어, 멜라닌세포)를 합성 가죽에 도입함으로써 수행될 수 있다. 일부 경우에, 합성 가죽은 기능적으로 살아있는 멜라닌세포를 포함한다. 멜라닌세포는 인간 피부 내에서의 위치와 유사한 위치를 가질 수 있다. 일부 경우에, 멜라닌은 멜라닌세포에 의해 구성적으로 생산될 수 있다. 일부 경우에, 멜라닌은 케라틴세포로 전이될 수 있다. 일부 경우에, 멜라닌세포는 자극시, 예를 들어, UV 복사시 또는 안료처리 증진 활성제, 예컨대 알파 멜라닌세포 자극 호르몬 (aMSH), 엔도텔린 1 (ET1), 줄기 세포 인자 (SCF), 프로스타글란딘 E2 및 F2α (PGE2, PGF2α), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 또는 신경 성장 인자 (NGF)에 의해 생산된다.
합성 가죽 내에서 전구 세포가 세포로 분화됨
표피 층 내의 세포, 예컨대 케라틴세포 및 멜라닌세포 뿐만 아니라 진피 층 내의 세포, 예컨대 섬유모세포는 전구 세포, 예컨대 iPSC로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 이로부터 분화될 수 있다. 다른 경우에, 1차 세포, 또는 1차 세포로부터 유래된 배양된 세포를 사용하여 세포 층을 형성하여 합성 가죽을 만들 수 있다.
합성 가죽 내에서 iPSC를 세포, 예를 들어, 케라틴세포, 멜라닌세포, 또는 섬유모세포로 분화시키는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 경우에, iPSC를 케라틴세포로 분화시키고 iPSC 유래 케라틴세포로부터 3D 표피를 구축하는 것은 문헌 [Petrova et al., 3D In vitro model of a functional epidermal permeability barrier from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2014 Apr 24;2(5):675-89]에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 다른 경우에, 세포 층은 1차 세포를 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 1차 케라틴세포로부터 3D 표피를 구축하는 것은 문헌 [Sun R et al., Lowered humidity produces human epidermal equivalents with enhanced barrier properties. Tissue Eng Part C Methods. 2015 Jan;21(1):15-22]에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 방법은 합성 가죽의 생산을 상업적 수준까지 확실하고, 정확하며 재현 가능하게 스케일 업 해주는 고-처리량의 방법을 제공한다. 본원에 개시된 합성 가죽, 조작된 표피 등가물, 조작된 전층 피부 등가물 및 그를 제조하는 방법의 이점은 매력적인 외관, 질감, 두께 및 내구성을 지닌 재현 가능하고 고 처리량 및 용이하게 확장 가능한 방식으로 맞춤형 조직을 생산하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 표피 층, 진피 층, 층상 구조물 또는 합성 가죽 중 하나 이상의 증가 산출량을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증가 산출량은 비교 가능한 방법과 비교해서 적어도 약 .5, .6, .7, .8, .9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 약 15배 산출량일 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 합성 가죽, 인공 표피 층, 인공 진피 층, 층상 구조물, 및 그로부터 생산된 산물의 제작 비용을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 균일한 두께의 합성 가죽, 인공 표피 층, 인공 진피 층, 층상 구조물, 및 그로부터 생산된 산물을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 가죽, 인공 표피 층, 인공 진피 층, 층상 구조물, 및 그로부터 생산된 산물은 실질적으로 균일한 두께, 길이 및/또는 폭을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층, 진피 층, 층상 구조물 중 임의의 하나 이상 내의 세포는 균질하게 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표피 층, 진피 층, 층상 구조물 중 임의의 하나 이상 내의 세포는 불균질하게 분포될 수 있다.
표피 등가물의 비교 분석
도 4A-4C는 고급 가죽, 천연 피부 및 표피 등가물의 비교 분석을 예시한다. 도 4A는 천연 피부 및 고급 가죽의 종단면의 FESEM을 예시한다. 도 4A는 표피 (e) 및 진피 (d)의 별개의 형태학적 구조를 보여준다. 태닝은 피부의 구조를 영구적으로 변경시켰다. 표피 내의 개별 세포 간의 경계는 구별할 수 없게 되었다. 수분을 제거하면 진피 내의 콜라겐 번들이 더 치밀하고 내구성있게 되었다. 배율: 1000x.
도 4B는 FESEM 영상을 도시한다. 한 경우에, 도 4B는 고급 가죽의 표면과 표피 등가물의 표면 둘 다가 유사한 매끄러운 외관을 갖고 있다는 것을 도시하며, 이는 그들이 아마도 거의 동등한 수준의 촉각 (촉감) 경험을 유도할 것이란 사실을 표시한다. 배율: 2000x.
도 4C는 고급 가죽 및 표피 등가물의 종단면의 FESEM을 도시한다. 태닝이 일어나기 전에는, 천연 피부 도 4A의 표피와 유사하게, 개별 세포 층이 표피 등가물에서 구별 가능하다. 진피 내의 콜라겐이 피부의 인장 강도에 크게 영향을 줄 수 있기 때문에, 콜라겐 번들은 가죽에 두께와 내구성을 부여할 수 있지만 (삽입된 도면), 표피의 바깥 층에 전적으로 의존할 수 있는 감각 경험은 제공하지 못할 수 있다.
도 5A-5C는 천연 피부 및 표피 등가물의 각질층 (SC; 각질화된 층)의 비교 분석을 예시한다. 도 5A는 표피 등가물의 표면이 천연 피부의 표면보다 더 매끄러운 것으로 보인다는 것을 나타내는 FESEM 영상을 도시하며, 이는 세포 배양물의 제어 환경에 기인할 수 있다. 도 5B는 TEM 코르네오데스모솜 (화살표)을 사용하여, SC의 주요 "기계적" 접합부가 표피 등가물 내에서 전자 밀도가 더 높은 영역으로서 검출될 수 있었다는 것을 예시한다. 도 5C는 코르네오데스모신 (CDSN)이 각질화가 발생하기 직전에 SG 내의 세포에 의해 세포외 공간으로 합성 및 배출될 수 있다는 것을 예시한다. CDSN은 카데린에 의해 점유된 SG 데스모솜의 세포 간 부분 내에 포매될 수 있고, 이러한 방식으로 코르네오데스모솜을 형성할 수 있다. 화살표는 천연 피부 및 표피 등가물의 SC 내의 CDSN의 유사하게 정렬된 점 모양의 축적을 나타내며, 이는 코르네오데스모솜을 나타내는 것으로 보인다. SC, 각질층; SG, 과립층; SS, 유극층.
도 6A-6E는 천연 피부 및 표피 등가물의 과립층 (SG; 과립 층)의 비교 분석을 예시한다. 도 6A는 로리크린 (LOR) 염색을 예시한다. LOR은 각질화된 세포 외피의 주요 단백질 성분이며 케라틴화 상피의 과립 층에서 발현될 수 있다. SG에서의 유사한 LOR 발현 패턴 (화살표로써 나타낸 H&E-염색된 조직 절편 상의 암갈색 안료)이 천연 피부의 표피 (패널의 좌측)와 표피 등가물 (패널의 우측) 둘 다에서 검출되었다. d, 진피; H&E, 헤마톡실린 & 에오신; SB, 기저층; SC, 각질층; SG, 과립층; SS, 유극층; *, 트랜스웰 필터 막. 도 6B에서는, 표피 Ca++ 구배가 전자 밀도가 높은 침전물로서 투과 전자 현미경 검사시 포획될 수 있다. Ca++ 침착물은 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측) 둘 다에서 SG에는 존재하였고 SC로부터는 부재하였다. SG, 과립층; SS, 유극층. 도 6C에서는, 투과 장벽 무결성이 란타넘 관류에 의해 평가되었다. 란타넘은 생존 가능한 SG의 세포외 공간에서 전자 밀도가 높은 침착물로서 시각화되었으며, 이는 그러한 란타넘과, 더 나아가 물 및 다른 작은 이온이 이러한 층 내의 케라틴세포 사이를 통과할 수 있다는 것을 입증해 준다. 반대로, 란타넘은 기능성 지질 장벽이 그것의 움직임을 위쪽으로 차단하기 때문에 SC 내로 더 침투할 수 없다. 시험관 내에서 생성된 표피 등가물은 천연 피부와 동등하게 기능적인 투과 장벽을 명확하게 보여주었다. SG, 과립층; SS, 유극층. 도 6D는 밀착 연결 단백질 1/폐쇄 소대-1 (TJP1/ZO-1)이 지질 이중층 내의 원섬유 유사 구조인 밀착 연결 가닥 단백질을 액틴 세포 골격에 고정하는 것을 예시한다. 화살표는 생체내 천연 피부 (패널의 좌측) 및 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)의 SG 내에서의 TJP1/ZO-1의 유사하게 정렬된 밝은 녹색 세포막 관련 축적을 나타낸다. SC, 각질층; SG, 과립층; SS, 유극층. 도 6E는 프로필라그린으로서 공지된 350 kDa의 큰 단백질 전구체로 뭉쳐진 필라그린 (FLG) 단량체가 SG의 세포 내 케라토히알린 과립에 존재한다는 것을 예시한다. 화살표는 생체내 천연 피부 (패널의 좌측) 및 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)의 SG 내에서의 FLG의 유사하게 정렬된 밝은 적색 과립 및 세포막 관련 축적을 나타낸다. SC, 각질층; SG, 과립층; SS, 유극층.
도 7A-7C는 TEM으로 평가된 천연 피부 및 표피 등가물에서의 지질 이중층 형성을 예시한다. 도 7A에서는 백색 화살표가 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측) 둘 다에서 SC와 SG의 경계에서의 정상 지질 분비를 나타낸다. 도 7B에서는, 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측) 둘 다의 SG에서 라멜라체 (백색 화살촉)가 관찰된다. 도 7C는 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)의 정상 지질 이중층 (LB) 형태를 도시한다. 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측) 내의 지질 이중층은 유사한 외관을 가졌다. SC, 각질층.
도 8A-8D는 천연 피부 및 표피 등가물의 기저상부 층의 마커의 비교 분석을 예시한다. 도 8A, 도 8B 및 도 8C에서, 기저상부 층, 유극층 (SS) 및 과립층 (SG)의 마커인 케라틴 10 (KRT10), 케라틴 1 (KRT1), 데스모콜린 1 (DCL1)은 면역조직화학 (KRT10; 화살표로써 나타낸 H&E-염색된 조직 절편 상의 암갈색 안료) 및 면역형광 (화살표로써 표시된 적색 세포질 /KRT1/ 및 적혈구 막 /DCL1/ 염색)에 의해 입증된 바와 같이, 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)에서 유사한 발현 패턴을 갖는다. d, 진피; H&E, 헤마톡실린 & 에오신; SB, 기저층; SC, 각질층; SG, 과립층; SS, 유극층; *, 트랜스웰 필터 막. 도 8D에서, 데스모솜 (화살표)은 생체내 천연 피부와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 둘 다에서 명확하게 규정된다. SS, 유극층.
도 9A-9D는 천연 피부 및 표피 등가물의 기저층 (SB; 기저 층)의 비교 분석을 예시한다. 도 9A, 도 9B, 도 9C, 및 도 9D와 관련하여, 증식의 마커인 MKI67, 케라틴 14 (KRT14), 및 전사 인자 TP63은 면역조직화학 (MKI67; 화살표로써 나타낸 H&E-염색된 조직 절편 상의 암갈색 안료) 및 면역형광 (화살표로써 표시된 녹색 세포질 /KRT14/ 및 백색 핵 /TP63/ 염색)에 의해 입증된 바와 같이, 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측) 둘 다에서 전형적인 기저 층 분포를 나타낸다. 헤미데스모솜 (화살표)은 생체내 천연 피부와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 둘 다에서 명확하게 규정된다. BM, 기저 막; Cy, 세포질; d, 진피; H&E, 헤마톡실린 & 에오신; SB, 기저층; SS, 유극층; TM, 트랜스웰 필터 막.
도 10A-10F는 기저 막의 세포외 매트릭스 성분의 비교 분석을 예시한다. 기저 막 (BM)은 진피-표피 접합부 상의 필수 구조적 스캐폴드를 제공할 수 있는 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질의 응축된 네트워크로부터 형성될 수 있다. 인테그린 β1은 세포를 ECM과 연결함으로써 다수의 상피 세포 기능을 조절하며, 진피-표피 접합부에서 BM의 유지에 결정적일 수 있다. 도 10A에서, 인테그린 β1은 화살표 (세포 막 관련 염색) 및 화살촉 (트랜스웰 막 상의 구멍을 통하여 돌출하는 세포의 끝 부분에 있음)으로써 표시된 바와 같이, 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)와 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측) 둘 다에서 전형적인 기저 층 분포를 나타낸다. BM, 기저 막; d, 진피; SB, 기저층; SS, 유극층; SG, 과립층; TM, 트랜스웰 막.
피브로넥틴은 세포성 부착에 일정 역할을 할 수 있다. 도 10B는 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)에서는 피브로넥틴이 주로 진피에서 발현될 수 있고 BM 영역에서는 상대적으로 거의 검출될 수 없다는 것을 예시한다. 유사하게, 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)에서는, 피브로넥틴이 트랜스웰 막 (적색 화살촉) 상의 구멍을 통하여 돌출하는 세포의 끝 부분에서 검출될 수 있다. d, 진피; SB, 기저층; SS, 유극층; SG, 과립층; TM, 트랜스웰 막.
BM에 의해 제공된 기계적 지지체는 콜라겐 IV에 의해 결정될 수 있거나, 또는 표피 등가물의 경우에는 스캐폴드에 의해 결정될 수 있다. 도 10C에서는, 화살촉으로 표시된 바와 같이, 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)에서의 콜라겐 IV 발현이 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)과 유사한 패치 패턴을 갖는다. BM, 기저 막; d, 진피; SB, 기저층; SS, 유극층; SG, 과립층; TM, 트랜스웰 막.
콜라겐 VI는 세포성 부착에 일정 역할을 할 수 있고, 피브로넥틴과 연합될 수 있다. 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)에서는, 콜라겐 VI가 도 10D에서와 같이, 주로 진피에서 발현될 수 있고 BM 영역에서는 상대적으로 거의 검출될 수 없다. 유사하게, 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)에서는, 콜라겐 VI가 도 10D에서와 같이, 트랜스웰 막 (화살촉) 내의 구멍을 통하여 돌출하는 세포의 끝 부분에서 검출될 수 있다. BM, 기저 막; d, 진피; SB, 기저층; SS, 유극층; SG, 과립층; TM, 트랜스웰 막.
콜라겐 VII는 진피 내의 콜라겐 I 및 III 원섬유에 대한 기저 막을 고정시킬 수 있다. 도 10E에서는, 화살촉으로 나타낸 바와 같이, 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)에서의 콜라겐 VII 발현이 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)과 유사한 패치 패턴을 갖는다. BM, 기저 막; d, 진피; SB, 기저층; SS, 유극층; SG, 과립층; TM, 트랜스웰 막.
라미닌 5 (쇄 조성 α3β3γ2)는 필라멘트를 고정시키는 주요 성분일 수 있고, 생체 내에서 BM의 초기 어셈블리에 필수적일 수 있다. 도 10F에서 화살촉으로 표시된 바와 같이, 생체내 천연 피부 (패널의 좌측)에서의 라미닌 5 발현이 시험관 내에서 생성된 표피 등가물 (패널의 우측)과 유사한 패턴을 갖는다. 표피 등가물에서의 그의 여분의 존재량 이외에도, 미량의 라미닌 5가 기저 층 세포의 세포 막에서 관찰될 수 있다 (화살표). BM, 기저 막; d, 진피; SB, 기저층; SS, 유극층; SG, 과립층; TM, 트랜스웰 막.
도 11A-11I는 전층 피부 등가물 (FSE)의 구조 분석을 예시한다. 도 11A 및 11B는 FSE의 단면이 2600x 배율 (도 11A) 및 5200x 배율 (도 11B) 하에 표피의 별개의 세포 층을 표시한다는 것을 도시한다. 도 11C는 고급 가죽과 유사한 매끄러운 외관을 갖는 900x 배율 하에서의 FSE의 표면을 도시하며, 이는 FSE가 거의 동등한 수준의 촉각 (촉감) 경험을 유도할 수 있다는 것을 표시한다. 도 11D - 11F는 91x 배율 (도 11D), 162x 배율 (도 11E) 및 405x 배율 (도 11F) 하에서의 상주하는 진피 섬유모세포 및 풍부한 세포외 매트릭스를 수반한 진피 스캐폴드의 종단면을 도시한다. 도 11G - 11I는 80x 배율 (도 11G), 695x 배율 (도 11H) 및 2700x 배율 (도 11I) 하에서의 상주하는 진피 섬유모세포 및 풍부한 세포외 매트릭스를 수반한 진피 스캐폴드를 도시한다.
도 12A-12R은 진피 등가물 조작의 시간 경과를 예시한다. 도 12A-12I는 36x 배율 (도 12A), 695x 배율 (도 12B), 1470x 배율 (도 12C), 7750x 배율 (도 12D), 2320x 배율 (도 12E), 2420x 배율 (도 12F), 6560x 배율 (도 12G), 17000x 배율 (도 12H) 및 22000x 배율 (도 12I) 하에서 진피 섬유모세포를 스캐폴드 상에 시딩한 후 제2일을 도시한다. 세포는 스캐폴드의 속이 빈 구조 내로 이동하고 세포외 매트릭스를 분비하기 시작할 수 있다. 도 12J-12R은 64x 배율 (도 12J), 100x 배율 (도 12K), 364x 배율 (도 12L), 82x 배율 (도 12M), 253x 배율 (도 12N), 3940x 배율 (도 12O), 5550x 배율 (도 12P), 9440x 배율 (도 12Q) 및 21680 배율 (도 12R) 하에서 진피 섬유모세포를 스캐폴드 상에 시딩한 후 제7일을 도시한다. 종단면 (도 12J - 도 12L) 및 횡단면 (도 12M - 12R)은 더 조밀한 세포 및 더 풍부한 세포외 매트릭스를 나타낼 수 있으며, 일부 영역은 스캐폴드의 속이 빈 구조를 거의 완전히 차단한다 (도 12M - 12P).
실시예
실시예 1. iPSC의 케라틴세포로의 분화
분화를 유도하기 위해, 미분화된 iPSC를 20% O2 대기 환경에 옮기고, 이를 7일 동안 (유도) mTESR1로 처리하거나 또는 1 mM ATRA [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)] 및 25 ng/ml BMP4 (R&D)로 보충시킨 다른 다능성 줄기 세포 기저 배지로 처리하였다.
외배엽 운명의 조기 획득을 가진 세포를 선택하기 위해, 1 cm2당 5~10 X 103개 세포의 밀도로 세포를 수거하고 이를 신선하게 제조된 3D HDF ECM 또는 다른 유형의 ECM 상으로 재플레이팅하며, 이를 7일 더 (선택) 둘벡코 변형 이글 배지/햄 F12 [3:1; 라이프 테크놀로지(Life Technologies)]에서 성장시키거나 또는 혈청 대체물, 예컨대 인간 혈소판 용해물로 보충되고 1 mM ATRA 및 25 ng/ml BMP4로 보충된 케라틴세포 배지에서 성장시킨다.
추정상의 표피 전구 세포를 강화시키기 위해, 유형 IV 콜라겐 코팅된 디쉬에 신속히 부착시킬 수 있고, 이와 같이 신속하게 부착되는 세포를 7일 동안 (강화) 규정된 케라틴세포-SFM에서 배양하거나 또는 1 mM ATRA로 보충된 다른 케라틴세포 배지에서 배양한다. 그 후, 최종적으로 수거하고 분석하기 전에, 세포를 7일 더 (확장) 에피라이프(EpiLife) 배지 (라이프 테크놀로지) 또는 다른 케라틴세포 배지에서 배양한다.
실시예 2. 유도된 다능성 줄기 세포의 케라틴세포 계통으로의 분화
조직 배양 디쉬를 겔트렉스 ( Geltrex ) 및 Col로 코팅함
상기 절차는 무균 기술을 사용하여 생물학적 안전 캐비닛에서 수행될 수 있다. 매트리겔(Matrigel)과 유사한 겔트렉스 매트릭스는 실온 (RT)에서 신속하게 고형화된다. 도입시 매트릭스의 각각의 새로운 배치를 등분하고, 시약으로 작업하면서 미리 냉각된 피펫 팁, 랙 및 튜브를 사용한다. 50, 100 및 200 μL 분취액을 만들고, -80℃ 하에 저장한다. 겔트렉스를 1:100 희석 하에 사용한다.
아래 코팅 절차는 60 mm 조직 배양 디쉬에 대해 기재될 수 있다. 더 큰 디쉬를 사용해야 하는 경우에는, 그에 따라 코팅 용액의 용적을 조정한다. 1. 겔트렉스의 50 μL 분취액을 -80℃ 냉동고로부터 꺼내고, 이를 생물학적 안전 캐비닛 내에 있는 얼음 위에 위치시킨다. 2. 5 mL의 저온 멸균성 DMEM/F12를 15 mL 원추형 튜브에 부가한다. 3. 1 mL 유리 피펫을 사용하고, 단계 2에서 제조된 15 mL 원추형 튜브로부터 1 mL 찬 DMEM/F12를 취하며, 이를 동결된 겔트렉스에 부가한다. 온화하게 위 아래로 피펫팅하여 겔트렉스를 해동시키고 용해시킨다. 이와 같이 용해된 겔트렉스를 단계 2에서 제조된 15 mL 원추형 튜브 내의 나머지 DMEM/F12에 옮긴다. 희석된 겔트렉스를 혼합하기 위해 피펫팅한다. 4. 50 μL의 3 mg/mL ColI 스톡 용액을 단계 3으로부터의 희석된 겔트렉스 내로 부가한다. 희석된 겔트렉스를 ColI과 혼합하도록 피펫팅한다. 4 mL의 코팅 용액을 60 mm 디쉬 내로 부가한다. 전체 표면이 반드시 코팅되도록 플레이트를 태핑시키거나 와동시킨다. 5. 상기 디쉬를 적어도 1시간 동안 조직 배양 인큐베이터 내에서 37℃ 하에 겔트렉스/ColI 코팅 용액과 함께 인큐베이션한다. 6. 일단 코팅이 완료되면, 코팅 용액을 디쉬에 남겨두고 다음 서브섹션에 기재된 바와 같이 iPSC의 플레이팅을 계속한다. 또 다른 한편으론, 코팅 용액을 흡인하고 2 mL의 신선한 DMEM/F12를 상기 코팅된 디쉬 내로 부가하여, 세포를 플레이팅하기 전에 상기 디쉬가 건조되지 못하게 한다.
분화를 위해 iPSC를 플레이팅함
~ 70%의 전면생장률로 성장시킨 피더 무함유 iPSC의 1개의 60 mm 조직 배양 디쉬를 제조한다. 오염의 부재 및 그의 미분화된 표현형의 유지를 확증하기 위해 세포를 현미경으로 검사한다. 세포가 스트레스를 받거나 죽는다면, 그들은 분화하기 시작하여 더 큰 다형성 세포를 가진 "조약돌" 영역으로서 제시되며, 케라틴세포로의 분화에 사용되지 않아야 한다.
케라틴세포로의 iPSC 분화의 경우, iPSC의 1:8 분할 비. 1. N2B27 배지 및 디스파제를 37℃ 수욕에서 미리 가온시킨다. 2. 현미경을 사용하여, 그 콜로니이 계대접종할 준비가 되었는지를 확증한다. 배지를 상기 디쉬로부터 온화하게 흡인시킨다. 2 mL의 1 x PBS를 부가하고, 플레이트를 와동시켜 세포를 세척하며, PBS를 온화하게 흡인시킨다. 3. 1 mL의 디스파제를 부가하고, 플레이트를 3 내지 5분 동안 37℃ 조직 배양 인큐베이터로 돌려 보낸다. 4. 세포가 디스파제와 함께 인큐베이션되는 동안, 겔트렉스/ColI 코팅 절차에서 단계 6으로부터의 겔트렉스/ColI 코팅 용액 (또는 DMEM/F12)을 온화하게 흡인시키고, 4 mL의 완전한 N2B27 배지를 상기 코팅된 디쉬 내로 부가한다. 5. 디스파제와 함께 3~5분 동안 인큐베이션한 후, 세포가 콜로니 주변의 말려지거나 또는 접힌 모서리를 찾아서 채집될 준비가 되었다는 것을 확증한다. 6. 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛에 옮기고 디스파제를 조심스럽게 흡인시킨다. 디스파제로 처리한 후, 콜로니은 디쉬의 표면에 매우 느슨하게 부착되어 있고 너무 많은 힘이 사용되면 벗겨질 수 있다. 7. 2 mL의 플레인 DMEM/F12를 온화하게 부가한다. 배지를 흡인 제거하고, 세척을 3회 반복한다. 8. 2 mL의 완전 N2B27을 디쉬에 부가하고, 플레이트에서 콜로니을 온화하게 긁어낸다. 세포를 디쉬로부터 15 mL 원추형 튜브 내로 옮기고, 6 mL의 완전 N2B27을 부가하여 세포 현탁액의 총 용적이 8 mL가 되도록 한다. 9. 세포 현탁액을 온화하게 혼합하여 큰 덩어리의 세포를 파괴한다. 1 mL의 세포 현탁액을 현재 서브섹션의 단계 3에서 제조된 코팅된 디쉬에 옮긴다. 제공된 실험실에 대해 확립된 조건을 사용하여 남은 세포를 폐기하거나 또는 다시 플레이팅한다. 10. 이와 같이 새롭게 플레이팅된 세포를 인큐베이터로 옮기고, 플레이트를 앞뒤로 및 좌우로 온화하게 진탕시켜 세포를 균일하게 분포시킨다. 세포를 37℃ 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
RA 및 BMP4를 사용하여 iPSC를 분화시킴
iPSC 유래 케라틴세포의 분화 및 계대배양은 무균 기술을 사용하여 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 한다. iPSC의 성공적인 부착을 확증하기 위해 계대접종 후 하루 동안 새로운 플레이트를 검사한다. iPSC가 콜로니을 형성하기 시작하면, 아래 분화 프로토콜을 진행한다.
1. 완전 DKSFM (항생제 및 DKSFM 보충물을 수반함)을 37℃ 수욕에서 미리 가온시킨다. 2. 이전 단계로부터의 5 mL의 미리 가온된 DKSFM을 15 mL 원추형 튜브에 부가하고, 5 μL의 1 mM RA를 부가하여 1 μM 최종 작동 농도를 달성하며 5 μL의 25 μg/mL BMP4를 부가하여 25 ng/mL 최종 작동 농도를 달성하고, 잘 혼합한다. 3. 플레이팅된 iPSC를 수반한 디쉬로부터 N2B27 배지를 흡인 제거하고, 4 mL의 1 x PBS로 1회 세척하며, 상기 단계로부터의 1 μM RA 및 25 ng/mL BMP4를 함유하는 4 mL의 DKSFM을 부가한다. 이것이 분화 절차의 제1일이다. 4. 세포를 인큐베이터에 옮기고 48시간 동안 인큐베이션한다. 5. 48시간 인큐베이션 후에 배지를 1 μM RA 및 25 ng/mL BMP4를 함유하는 신선한 DKSFM으로 대체시킨다. 세포를 48시간 더 인큐베이터에 옮긴다. 6. 제2 라운드의 48시간 유도 (분화 제4일) 후, 배지를 RA 및 BMP4를 수반하지 않은 완전 DKSFM으로 대체시킨다. 세포를 완전 DKSFM 중에서 10일 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하며, 배지를 격일로 변화시킨다. 7. 분화 제14일에는, 항생제와 공급된 보충물을 부가함으로써 완전 CnT-07 배지를 제조하고, 배지를 미리 가온시킨다. 이 날까지, 자라난 iPSC 콜로니에서의 세포의 대부분이 상피 유사 표현형을 나타내기 시작한다. 8. 분화된 세포로부터 DKSFM을 흡인 제거하고, 4 mL의 완전 CnT-07로 대체한다. 세포를 조직 배양 인큐베이터에서 10일 더 인큐베이션하며, 완전 CnT-07을 격일로 변화시킨다.
iPSC 유래 케라틴세포의 신속한 부착 및 배양
분화 제24일에는, 자라난 iPSC 콜로니으로부터 멀리 이동하는 많은 세포가 케라틴세포 유사 표현형을 나타내며, 케라틴세포의 운명에 대한 외배엽의 투입에 필요한 마스터 조절인자인 p63, 및 Krt14를 발현하기 시작한다. 이 날까지, iPSC 분화를 위해 사용된 60 mm 디쉬는 완전히 융합되고 계대접종될 필요가 있다. 계대접종 동안 iPSC 유래 케라틴세포를 강화시키기 위해, 분화된 iPSC 배양물을 ColI/ColIV 코팅된 플레이트에 신속하게 부착시킨다. 4개 이하의 100 mm ColI/ColIV-코팅된 조직 배양 디쉬를 사용하여, 분화된 iPSC를 함유하는 1개의 60 mm 디쉬로부터의 신속한 부착 절차를 수행한다. 단 하나의 100 mm 디쉬가 사용되어야 하는 경우에는, 신속한 부착 절차를 위해 상기 분화된 iPSC 배양물의 1/4을 플레이팅한다.
플레이트를 ColI 및 ColIV로 코팅함
본 절차는 무균 기술을 사용하여 생물학적 안전 캐비닛에서 수행될 수 있다. 1. ColIV 분말이 멸균성 0.25% 빙초산 중의 2 mg/mL의 농도가 되도록 재구성한다. 때때로 와동시키면서 2~8℃에서 수 시간 동안 용해시킨다. 분취액을 만들고, 이를 -20℃ 하에 저장한다. 2. 바이알을 얼음 바구니에 위치시키고 수 시간 동안 4℃ 하에 유지시킴으로써 ColIV 스톡 용액의 분취액 (2 mg/mL)을 매우 느리게 해동시킨다. 3. ColIV 스톡 용액을 적절한 용적 (각각의 100 mm 디쉬당 5 mL)의 멸균성 0.25% 빙초산에 재현탁시켜 7 μg/mL의 최종 작동 농도가 되도록 한다. 적절한 용적의 ColI 스톡 용액을 부가하여 30 μg/mL의 최종 작동 ColI 농도를 달성한다. 100 mm 디쉬를 덮기 위해 5 mL의 작동 용액을 사용함으로써 플레이트를 코팅한다. 상기 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛에서 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션한다. 4. 상기 코팅된 플레이트로부터 액체를 흡인시키고, 디쉬를 5 mL의 멸균성 1 x PBS로 1회 세정하며 5 mL의 ddH2O로 1회 세정한다. 5. 세척된 디쉬를 생물학적 안전 캐비닛에서 공기 건조시킨다. 플레이트를 직접적으로 사용하거나 또는 파라필름으로 이를 밀봉시키고, 4℃ 하에 6개월 이하 동안 저장한다. 이전에 저장된 ColIV-코팅된 플레이트를 사용하기 위해서는, 세포를 플레이팅하기 이전에 적어도 1시간 동안 상기 플레이트를 생물학적 안전 캐비닛에서 실온 하에 가온시킬 수 있다.
iPSC 유래 케라틴세포의 신속한 부착
1. 분화 제24일에, 완전 CnT-07, 아큐타제(Accutase), 및 ColI/ ColIV-코팅된 디쉬(들)를 미리 가온시킨다. 2. 세포를 1 x PBS로 세척하고, 2 mL의 아큐타제를 부가하며, 조직 배양 인큐베이터에서 5분 동안 인큐베이션한다. 세포가 분리되기 시작하는 것을 현미경으로 확증한다. 3. 3 mL의 완전 Cnt-07을 부가하고, 위 아래로 피펫팅하여 세포를 이동시키며 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브 내로 수집한다. 세포를 5분 동안 260 x g 하에 아래로 회전시키며 상등액을 흡인하다. 펠릿을 10 mL의 완전 Cnt-07 배지에 재현탁시키고, 260 x g 하에 5분 동안 회전을 반복하며, 상등액을 흡인한다. 4. 펠릿을 4 mL의 완전 CnT-07에 재현탁시키고, 위 아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 파쇄시켜 단일 세포가 되도록 한다. 5. 9 mL의 완전 CnT-07 배지를 각각의 ColI/ColIV-코팅된 디쉬 내로 부가하고, 상기 단계 4로부터의 1 mL의 세포 현탁액을 각각의 ColI/ColIV-코팅된 디쉬 내로 옮긴다. 세포가 실온 하에 15 내지 30분 동안 상기 코팅된 디쉬에 부착될 수 있게 한다. 6. 부유 세포 (이들은 미분화되거나 또는 부분적으로 분화된 iPSC임)를 수반한 배지를 조심스럽게 흡인시킨다. 부착된 세포 (이들은 iPSC 유래 Krt14 양성 세포임)를 방해하지 않는다. 10 mL의 신선한 완전 CnT-07 배지를, 상기 부착된 세포를 수반한 플레이트 내로 부가한다. 세포를 37℃ 조직 배양 인큐베이터에서 확장시켜 두며, 배지를 격일로 변화시킨다. ColI-코팅된 디쉬 상에서 CnT-07 또는 에피라이프 (EDGS 보충물을 수반함) 중의 아큐타제와 함께 세포를 필요에 따라 계대접종한다. 2 또는 3회 계대 후 및 신속한 부착 단계 후, 배양물은 케라틴세포 유사 표현형을 나타내는 ~90%의 Krt14 양성 세포로 이루어져야 한다. 상기 수득된 배양물의 케라틴세포 유사 표현형은 Krt14 발현을 알아보기 위한 표준 면역형광 분석에 의해 및 기관형 배양물에서 정상적인 층화 표피를 재구성할 수 있는 능력에 의해 검증될 수 있다.
실시예 3. 1차 케라틴세포로부터 표피 층을 제조함
1차 케라틴세포를 단일 신생아 포피로부터 단리하고, 인간 케라틴세포 성장 보충물로 보충된 0.07 mM Ca2+ 154CF 배지 (라이프 테크놀로지)에서 성장시킨다. 제1 계대 케라틴세포 (2.21 X 105/cm2 삽입물)의 현탁액을 제조업자의 프로토콜에 따라서 CnT-07 배지 (CELLnTEC) 또는 CnT-프라임 배지 (CELLnTEC) 내의 셀스타트(Cellstart) CTS (라이프 테크놀로지) (또는 다른 ECM 기질) 코팅된 PET, 0.4-mm 삽입물 [EMD 밀리포어(Millipore)] 상에 시딩한다.
시딩 후 제3일 (D3)에, 배지를 CnT-02-3D (CELLnTEC) 또는 CnT-3D 장벽 (CELLnTEC)으로 전환시킨다. 제4일에는, 삽입물의 바닥에 CnT-02-3D 또는 CnT-3D 장벽을 공급함으로써 HEE를 공기 노출시킨다. 제4일부터는, 수거될 때까지 HEE에 CnT-02-3D 또는 CnT-3D 장벽을 매일 공급한다. HEE를 37℃ 및 5% CO2 하에 습식 (100% RH) 또는 건식 인큐베이터 (50% RH)에서 성장시킨다. 다이얼 비중계 [피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)]를 사용하여 인큐베이터 습도를 측정한다. 물 팬을 제거함으로써 낮은 인큐베이터 습도를 유지한다.
삼투압에서의 가능한 변화를 제어하기 위해, 배지를 매일 다시 새롭게한다. 삼투압의 현저한 변화는 마이크로 오스모미터 [프리시젼 시스템즈(Precision Systems)]에 의해 측정된 바와 같이 이러한 프로토콜을 사용해서는 검출되지 않는다. 12-웰 삽입물은 경상피 전기 저항 (TEER) 측정, 광학 현미경 검사 및 전자 현미경 검사에 사용되는 반면, 6-웰 삽입물은 경표피 수분 손실 (TEWL) 측정 및 면역블롯팅에 사용된다.
실시예 4. 표피 층을 배양함
케라틴세포를 CnT-07 배지 (CELLnTEC) 또는 CnT-프라임 배지 (CELLnTEC) 중에서 0.4 μm 공극 삽입물 (EMD 밀리포어; Cat. No.: MCHT12H48)을 수반한 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막의 2.0 내지 2.5 x 105개 세포/cm2의 밀도로 시딩한다.
시딩 후 제3일 (D3)에, 배지를 CnT-02-3D (CELLnTEC) 또는 CnT-3D 장벽 (CELLnTEC)으로 전환시킨다. 제4일에는, 삽입물의 바닥에 CnT-02-3D 또는 CnT-3D 장벽을 공급함으로써 세포를 공기 노출시킨다. 제4일부터는, 제14일에 수거될 때까지 표피 층에 CnT-02-3D 또는 CnT-3D 장벽을 매일 공급한다.
실시예 5. 지지 기판을 제조함
2% 아가로스 용액을 제조하기 위해, 2 g의 초순수 저 융점 (LMP) 아가로스를 100 mL의 초순수 물/완충제 용액 (1:1, v/v)에 용해시킨다. 완충제 용액은 임의로 PBS (둘벡코 인산염 완충 식염수 1x) 또는 HBSS (행크의 균형잡힌 염 용액 1x)일 수 있다. 아가로스 용액을, 온수 (80℃ 초과)를 함유하는 비커에 위치시키고, 아가로스가 완전히 용해될 때까지 핫 플레이트 위에 유지시킬 수 있다. 아가로스 용액은 온도가 36℃ 위인 한은 액체로 유지된다. 상 전이가 발생하는 36℃ 아래에서는, 점도가 증가하고, 최종적으로 아가로스가 겔을 형성한다.
아가로스 지지 기판을 제조하기 위해, 10 mL의 액상 2% 아가로스 (온도 >40℃)를 10 cm 직경 페트리 디쉬에 침착시키고 균일하게 확산시켜 균일한 층을 형성할 수 있다. 아가로스는 냉장고에서 4℃ 하에 겔을 형성할 수 있다.
실시예 6. 섬유모세포, 케라틴세포, 및 멜라닌세포를 포함하는 합성 가죽을 생산함
프로토콜의 개요는 다음과 같을 수 있다: a) 섬유모세포와 콜라겐의 용액을 접촉시키게 한 다음, 진피 등가물을 구성하는, 섬유모세포가 분포되는 수축된 콜라겐 매트릭스를 수득하기에 충분한 기간 동안 인큐베이션하는 단계, b) a)에서 수득된 진피 등가물에 케라틴세포와 멜라닌세포의 혼합물을 시딩하고, 배양물을 액상 배지에 담금하는 단계, c) b)에서 수득된 전체 배양물 (진피 등가물 상에 시딩된 케라틴세포 및 멜라닌세포)을 담금하고, 피부 등가물을 구성하는 콜라겐 매트릭스 내에 섬유아세포를 함유하는 진피 등가물 상에, 멜라닌세포를 함유하는 많은 층이 형성된 표피 등가물이 수득될 때까지 공기-액체 계면에서 배양을 지속하는 단계.
단계 a)는 균질한 현탁액 중의, 특히 소의 기원의 콜라겐 유형 I, 또는 콜라겐 I과 III의 혼합물 (격자의 최종 용적과 비교해서 대략 30%)을 이용하여 수행될 수 있다. 유리하게는, 균질한 현탁액을 수득하도록 다른 구성분, 예컨대 라미닌 (특히, 최종 용적과 비교해서 1% 내지 15%), 콜라겐 IV (특히, 최종 용적과 비교해서 0.3% 내지 4.5%) 및/또는 엔탁틴 (특히, 최종 용적과 비교해서 0.05% 내지 1%)을 그에 부가한다. 섬유모세포를 피부로부터 수득한다. 이들을 적합한 배지에서 배양한 다음, 콜라겐과 성장 인자의 현탁액과 혼합하기 전에 현탁시킨다. 이러한 혼합물을 대략 37℃의 온도, 일반적으로 36℃ 내지 37.5℃에서 1 내지 6일, 바람직하게 4일 또는 5일 동안 인큐베이션한다. 유리하게는, 상기 혼합물은 그의 부착을 허용하지 않는, 특히 혼합물이 지지체의 가장자리에 부착되는 것을 방지시켜 주는 지지체 상에서 인큐베이션되며; 이러한 지지체는 특히, 예를 들어 그의 표면을 소의 알부민 또는 혈청으로 코팅함으로써, 상기 표면을 미리 처리함으로써 수득될 수 있다. 이로써, 영양 배지를 방출시키는 동안 여러 방향으로 자유롭게 수축되고 섬유모세포가 포매되는 콜라겐 겔을 수득한다.
단계 b)를 수행하기 위해, 피부, 바람직하게 성체 피부로부터 유래되는 케라틴세포를 사용할 수 있다. 케라틴세포는 성장 인자, 특히 아미노산, 혈청, 콜레라 독소, 인슐린, 트리아이오도티로닌 및 pH 완충제 용액의 존재 하에, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적합한 배지 중에서 3T3 섬유모세포로 구성된 피더 지지체 상에서 배양함으로써 문헌 [Rheinwald and Green, Cell, vol. 6, 331-344, 1975]의 기술에 따라서 시딩 전에 증폭시킨다. 특히, 이러한 배양 배지는 케라틴세포에 대한 적어도 하나의 분열촉진 성장 인자 (예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF) 및/또는 케라틴세포 성장 인자 (KGF), 특히 KGF), 인슐린, 히드로코르티손, 및 임의로 항생제 (예를 들어: 젠타마이신, 암포테리신 B)를 특별히 함유할 수 있다.
멜라닌세포는 어린 또는 성체 동물의 피부로부터 유래되는 멜라닌세포일 수 있다. 이는 기본 배지, 예컨대 DMEM/F12 또는 MCDB153으로 구성되고 멜라닌세포-특이적 성장 인자 (예컨대, 예를 들어, bFGF, SCF, ET-1, ET3 또는 αMSH)로 보충된, 포르볼 에스테르의 부재 하의 적합한 배지에서, 및 특히 M2 배지 [프로모셀(Promocell)]에서 또는 다른 배지, 예컨대 M254 [캐스케이드 바이오로직스(Cascades Biologics)™]에서 배양함으로써 증폭된다.
멜라닌세포의 세포 현탁액 및 케라틴세포의 세포 현탁액을 이들 배양물로부터 제조하고, 혼합된 케라틴세포/멜라닌세포 현탁액을 수득하도록 이들을 혼합한다. 멜라닌세포/케라틴세포 비는 1:10 내지 2:1일 수 있고, 일반적으로 대략 1:1이다. 이러한 혼합된 현탁액을 진피 등가물 상에 침착시킨다. 진피 등가물은 생물학적 재료, 예컨대 콜라겐을 통하여 지지체에 부착시키는 것이 유리하다. 멜라닌세포/케라틴세포 현탁액은 링에 침착시키거나 또는 한계가 정해진 표면 부분 상에 이를 유지시키기 위한 임의의 등가 수단에 침착시킨다. 액상 영양 배지는 세포의 혼합물을 커버하는 방식으로 부가된다. 이러한 배지는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 성장 인자, 특히 EGF 및/또는 KGF를 함유한다. 상기 배지는 규칙적으로 대체될 것이고, 배양은 담금으로서, 일반적으로 2 내지 10일, 특히 5 내지 8일, 및 대략 7일의 기간 동안 지속될 것이다. 상기 배지는 담금 제2일부터 시작하여, 이상적으로는 담금 제4일부터 시작하여 KGF를 함유한다.
피부는 연속적으로, 케라틴세포의 분화와 층화 표피 등가물의 형성을 수득하도록 자체 공지된 방법으로 담금된다. 공기-액체 계면에서의 담금으로서의 배양에 상응하는 이러한 단계 c)는 분화된 구조가 수득될 때까지, 일반적으로 대략 7일 동안 지속된다. 그러나, 단계 c)는 상기 텍스트에 명시된 유리한 특징을 갖는 피부 등가물을 동시에 보존하면서도, 보다 오랜 기간, 예를 들어 대략 28일 동안 지속될 수 있다. 영양 배양 배지는 규칙적으로 다시 새롭게 될 것이다. 요구되는 시험을 수행하도록 피부 등가물을 후속 제거한다.
실시예 7. 배양된 피부 표본에서의 모낭 형성의 유도
확장된 DP 세포를 배양된 ORS 세포와 혼합하고, 세척하며, 20 mL의 멸균성 인산염 완충 식염수 (PBS, 시그마)에 적합한 세포 밀도로 조심스럽게 재현탁시킨다. 각각의 실험에 사용된 배양된 DP 및 ORS 세포는 상이한 공여자로부터 수득하며, 이는 DP 및 ORS 세포에 대한 상이한 배양 지속 기간으로 인해 동일한 공여자로부터의 두 가지 세포 유형이 제조될 수 없기 때문이다. 배양을 확립한 후 1일에 배양된 피부 조각의 진피 내로 세포 현탁액을 서서히 주사한다.
실시예 8. 모낭 세포 집단을 배양함
모낭을 후두부로부터 수득한다. 진피 유두 (DP) 세포를 문헌 [Randall et al., A comparison of the culture and growth of dermal papilla cells from hair follicles from non-balding and balding (androgenetic alopecia) scalp. Br J Dermatol 1996: 134: 437-444]에 기재된 바와 같이 제조 및 배양한다.
간략하게 언급하면, 모낭의 DP를 해부 현미경 하에 단리하고, 24-웰 조직 배양 플레이트 [사르스테츠(Sarstedt)]에 개별적으로 옮긴다. 15% FCS (시그마)로 보충된 DMEM에서 세포 배양을 수행한다. 세포 증식을 개시한 후, 세포가 융합되도록 이를 배양하고, 2회 계대를 위해 확장시킨다. 외근초 (ORS) 세포의 단리를 위해, 벌지 영역을 함유하는 모낭의 중간 부분을 절제하고, 가벼운 트립신처리에 적용시켰다. 각각의 배양을 위하여 적어도 10개 모낭의 세포를 사용한다. 이와 같이 수득된 세포를 RPMI-1640 배지 (시그마)에서 2회 세척하고, 표준 케라틴세포 배지 (에피라이프, 시그마)에서 세포 배양에 적용시켰다. 배양 1주 후에 세포를 수거한다.
실시예 9. 전층 피부 등가물을 태닝함
전층 피부 등가물을 크롬 태닝에 의해 태닝시킨다. 제1 단계는 얼음 및 황산 처리이다. 이로써 조직이 열리므로, 크로뮴을 받아들일 수 있다. 이어서, 크로뮴을 산화마그네슘과 함께 부가한다.
상기 프로세스는 전층 피부 등가물의 pH 수준을 약 3 정도로 떨어뜨린다. 크로뮴이 전층 피부 등가물을 통과한 후, pH 수준을 약 4 정도로 끌어 올리는 태닝액을 도입한다. 이어서, 따뜻한 수욕을 도입한 다음, 롤 프레싱하여 과도한 액체를 제거한다. 이어서, 최종 단계는 필요한 경우에 표면 처리를 적용한 다음, 스트레치 아웃한 상태에서 전층 피부 등가물을 건조시킨 다음 완료되면 다시 프레싱한다.
실시예 10. X-탠 태닝 프로토콜
X-탠 절차를 이용하여 전층 피부 등가물을 태닝할 수 있다. 태닝하기 전에, 전층 피부 등가물을 석회처리하였으며, 이는 피부 등가물을 침지하는 단계, 기판을 부가하는 단계, pH를 조정하는 단계 및 세척 단계를 포함한다. 이어서, 피부 등가물을 세척하고, 미리-탈회된 완충제를 부가하며, 피부 등가물을 탈회시키고 세척함으로써 피부 등가물을 탈회시켰다. 이어서, 다시 습윤화시키고, 태닝 기질을 부가하며, pH를 태닝에 도움이 되는 pH로 조정하며, 고정 및 고정 주기를 수행하고, 태닝된 피부 등가물을 수득하기 위해 유화가지함으로써 피부 등가물을 태닝시켰다.
실시예 11. 전층 피부 등가물
유형 I 콜라겐 매트릭스 (0.5 x 106개의 iPSC 유래 섬유모세포를 함유함)를 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막 [BD 바이오사이언스(Biosciences)] 상으로 침착시키고, 중합시킬 수 있다. 이와 같이 중합된 매트릭스를 약 7일 동안 인큐베이션한 후, 1 x106개의 iPSC 유래 케라틴세포 및 0.1 x 106개의 iPSC 유래 멜라닌세포를 매트릭스 상으로 시딩하고 7일 더 인큐베이션할 수 있다. 복합 배양물을 공기-액체 계면으로 상승시키고, 아래로부터 공급하여 표피 분화를 유도할 수 있다. 전층 피부 등가물을 약 14일 후에 수거하고 LN2에 순간 동결시키거나 또는 왁스에 포매시킬 수 있다. 멜라닌 정량화를 위함.
실시예 12. 동결된 절편의 면역염색
고정: 조직을 30분 동안 3.8% 파라포름알데히드/인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.2-7.6에 고정시킬 수 있다. 샘플을 PBS에서 5분 동안 3회 세척할 수 있다. 조직 샘플을 4℃에서 회전시키면서 일련의 멸균성 수크로스 구배 (10% 수크로스에서 밤새, 15% 수크로스에서 6 내지 8시간 동안, 30% 수크로스에서 밤새, 및 최종적으로 최적의 커팅 온도 (OCT) 화합물과 1:1로 혼합된 30% 수크로스에서 밤새)로 침윤시킬 수 있다. 샘플을 OCT에 포매시키고 액체 질소 증기에서 동결시킬 수 있다. 저온 블록을 -80℃에서 저장할 수 있다.
절편 커팅: 커팅하기 전날, 상기 저온 블록을 -20℃로 밤새 전이시킬 수 있다. 표준 저온 유지장치를 사용하여 절편 (10 μm)을 제조할 수 있다. 이 절편을 프로세싱할 때까지 -20℃ 하에 유지시킬 수 있다.
프로세싱: 대조군 인큐베이션이 포함될 수 있다. 면역이전 혈청 또는 이소형 매칭된 비면역 항체가 1차 항체 대신 사용될 수 있다. 상기 절편을 90% 찬 아세톤에 10분 동안 침수시거나 또는 0.2% 트리톤 X-100/PBS에서 5분 동안 침수시켜 항원을 노출시킬 수 있다. 샘플을 PBS에서 5분 동안 3회 세척할 수 있다. 1시간 동안 상기 절편을 .1% 트리톤 X-100을 수반한 5% BSA 내로 침수시킴으로써 비특이적 항체 반응성을 차단시켰다. 이어서, 상기 절편을 다음 두 항체의 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션할 수 있다: i) 2.5 μg/mL의 크롬퓨어(ChromPure) 당나귀 전체 IgG (차단 목적을 위함; 모든 2차 항체는 당나귀에서 만들 수 있음); ii) 1 μg/mL의 적절한 1차 항체. 상기 절편을 PBS에서 5분 동안 3회 세정할 수 있다. 이 절편을 당나귀에서 만들어진 적절한 종-특이적 2차 항체와 함께 실온 하에 30 내지 60분 동안 인큐베이션하고, 적색 또는 녹색 형광단과 접합시킬 수 있다. 상기 절편을 PBS에서 5분 동안 3회 세척할 수 있다. 이어서, 이 절편을 실온 하에 10 μg/ml 훽스트 33342와 함께 10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 상기 절편을 PBS로 5분 동안 3회 세척할 수 있다.
시각화: 샘플을 벡타쉴드(Vectashield) 배지 [벡터(Vector)]에 배치할 수 있고, 적절한 필터가 장착된 표면형광 현미경 [차이스(Zeiss)]으로 시각화할 수 있다.
실시예 13. 파라핀 포매된 절편의 면역염색
고정: 조직을 30분 동안 3.8% 파라포름알데히드/인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.2-7.6에 고정시킬 수 있다. 샘플을 PBS에서 5분 동안 3회 세척할 수 있다. 조직 샘플을 오름차순 에탄올 시리즈 (50%, 70%, 2 x 100%; 각각 20분) 및 제거제 (크실렌, 2 x 20분)에서 탈수시킬 수 있다. 상기 샘플을 65℃에서 2x 1시간 동안 파라핀 왁스로 관류시키고 파라핀 블록에 포매시킬 수 있다. 이러한 파라핀 블록을 추가 사용시까지 실온에서 저장할 수 있다.
절편 커팅: 표준 마이크로톰을 사용하여 조직을 5 μm 두께로 절단한다. 이 절편을 프로세싱할 때까지 실온에서 유지시킬 수 있다.
프로세싱: 대조군 인큐베이션이 포함될 수 있다. 면역이전 혈청 또는 이소형 매칭된 비면역 항체가 1차 항체 대신 사용될 수 있다. 절편을 오름차순 시리즈 크실렌/에탄올 시리즈 2x 크실렌, 2x 100% 에탄올, 및 1x 70% 및 50% (각각 10분)에서 재수화시킬 수 있다. 이어서, 상기 절편을 수돗물로 간단하게 세정시킬 수 있다. 이어서, 이 절편을 헤마톡실린으로 5분 동안 염색시킬 수 있다. 그 다음, 용액이 청정해질 때까지 상기 절편을 dH2O로 세척할 수 있다. 절편을 .5% 에오신으로 10분 동안 염색할 수 있다. 이어서, 절편을 수돗물로 간단하게 세정할 수 있다. 상기 절편을 1시간 동안 5% BSA 내로 침수시킴으로써 비특이적 항체 반응성을 차단시켰다. 이어서, 상기 절편을 다음 두 항체의 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션할 수 있다: i) 2.5 μg/mL의 크롬퓨어 당나귀 전체 IgG (차단 목적을 위함; 모든 2차 항체는 당나귀에서 만들어질 수 있음); ii) 1 μg/mL의 적절한 1차 항체. 상기 절편을 PBS에서 5분 동안 3회 세정할 수 있다. 이 절편을 당나귀에서 만들어진 적절한 종-특이적 2차 항체와 함께 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합시킬 수 있다. 상기 절편을 PBS에서 5분 동안 3회 세척할 수 있다.
시각화: 샘플을 제조업자의 프로토콜에 따라서 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 기질 키트 [벡터래보러토리즈(VectorLaboratories)]와 함께 인큐베이션할 수 있다. DAB는 갈색 얼룩을 산출시킨다. 염화니켈이 상기 기질 용액에 부가되는 경우, 회색-흑색 얼룩이 생길 수 있다. 샘플을 오름차순 에탄올 시리즈 (50%, 70%, 2 x 100%; 각각 10분) 및 제거제 (크실렌, 2 x 10분)에서 탈수시킬 수 있다. 샘플을 봉입제에 배치시킬 수 있고, 디지털 카메라가 장착된 위상차 현미경 (차이스)으로 시각화할 수 있다.
실시예 14. 전계 방출 주사 전자 현미경 검사 ( FESEM )
고정: 샘플을 4℃ 하에 24시간 동안 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충제 (pH 7.4) 중의 2% 글루타르알데히드 및 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충제에 위치시킬 수 있으며, 추가의 프로세싱에 앞서 4℃로 유지시킬 수 있다.
프로세싱: 샘플을 1% 수성 OsO4로 1시간 동안 나중에 고정시킬 수 있다. 오름차순 에탄올 시리즈 (50%, 70%, 2 x 100%; 각각 10분)에서 탈수시킨 후, 샘플은 토우시미스 오토삼드리(Tousimis Autosamdri)-815B 장치에서 액체 CO2로 건조시키고, 15 mm 알루미늄 마운트 상으로 양면 구리 테이프가 장착되며, 덴톤 데스크(Denton Desk)II 스퍼터 코터를 사용하여 40Å의 금-팔라듐으로 스퍼터 코팅된 임계점일 수 있다.
시각화: 중복 샘플의 단면을, 내부 형상의 분석을 위해 로우 프로파일 45/90도 SEM 마운트 상에 배치시킬 수 있다. 인렌즈 2차 전자 (SE) 검출 뿐만 아니라 작업 거리 3 내지 5 mm에서 혼합 시그널 인렌즈/SE2 (75/25 %) 검출을 사용하여, 2 내지 3 kV에서 작동된 차이스 시그마 FESEM [칼 차이스 마이크로스코피 (Carl Zeiss Microscopy; 미국 뉴욕주 쏜우드)]으로 시각화를 수행할 수 있다. 저장 해상도 2048x1536 및 회선 평균 노이즈 감소 알고리즘을 사용하여 TIFF로 영상을 캡처할 수 있다.
프로세싱: 이전에 건조시킨 샘플 (즉, 가죽)을 일정 크기로 커팅할 수 있고, 덴톤 데스크II 스퍼터 코터를 사용하여 40Å의 금-팔라듐으로 스퍼터 코팅할 수 있다.
시각화: 중복 샘플의 단면을, 내부 형상의 분석을 위해 로우 프로파일 45/90도 SEM 마운트 상에 배치시킬 수 있다. 인렌즈 2차 전자 (SE) 검출 뿐만 아니라 작업 거리 3 내지 5 mm에서 혼합 시그널 인렌즈/SE2 (75/25 %) 검출을 사용하여, 2 내지 3 kV에서 작동된 차이스 시그마 FESEM (칼 차이스 마이크로스코피; 미국 뉴욕주 쏜우드)으로 시각화를 수행할 수 있다. 저장 해상도 2048x1536 및 회선 평균 노이즈 감소 알고리즘을 사용하여 TIFF로 영상을 캡처할 수 있다.
실시예 15. 투과 전자 현미경 검사 ( TEM )
고정: 샘플을 4℃ 하에 30분 동안 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충제, pH 7.4 중의 0.06% 염화칼슘을 수반한 2% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드에 고정시킬 수 있다. 이어서, 샘플을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충제에 위치시키고, 추가의 프로세싱에 앞서 4℃ 하에 유지시킬 수 있다.
프로세싱: 이어서, 샘플을 세척하고, 암실에서 45분 동안 실온 하에 0.1 M 소듐 카코딜레이트, pH 7.4 중에서, 1.5% 페로시안화칼륨을 수반한 1.5% 사산화오스뮴 또는 0.2% 사산화루테늄 (지질 이중층의 시각화를 위함)에 위치시킬 수 있다. 완충제에서 세정한 후, 샘플을 등급별 에탄올 시리즈 (50%, 70%, 2 x 100%; 각각 10분)에서 탈수시키고, 연속해서 저 점도 에폭시 수지에 포매시킨다.
시각화: 반초박 절편을 1% 붕사 용액 중의 1% 아주레(azure) II을 수반한 1% 톨루이딘 블루로 염색하고, 위상차 현미경 (차이스)으로 볼 수 있다. 초박막 절편을 수집하고, 이를 수 포화된 3% 우라닐 아세테이트로 염색하고/하거나 코팅되지 않은 니켈 그리드 상의 2.5% 납 시트레이트에서 대비할 수 있다. 초박막 절편은 60 kV에서 작동된 차이스 10 A 전자 현미경으로 볼 수 있다. TIFF로 영상을 캡처할 수 있다.
이온 포획 세포화학 (Ca ++ 구배):
고정: 초미세 구조 Ca++ 국재화를 위하여, 샘플을 0.04 M 수크로스를 함유하는, 2% 파라포름알데히드, 2% 글루타르알데히드, 0.09 M 포타슘 옥살레이트에 고정시킬 수 있다. 샘플을 연속해서 4℃ 하에 밤새 고정시킬 수 있다.
프로세싱: 샘플을 암실에서 4℃ 하에 2시간 동안 2% 포타슘 피로안티모네이트, pH 7.4를 함유하는 1% 사산화오스뮴에서 나중에 고정시킬 수 있다. 이어서, 조직 샘플을 알칼리화된 물 (pH 10)에서 세척하고, 이를 탈수 및 저 점도 에폭시 수지에서의 포매를 위하여 에탄올 용액 (50%, 70%, 2 x 100%; 각각 10분)으로 옮겼다.
시각화: 초박막 절편을 수집하고, 이를 수 포화된 3% 우라닐 아세테이트로 염색하고/하거나 코팅되지 않은 니켈 그리드 상의 2.5% 납 시트레이트에서 대비할 수 있다. 초박막 절편은 60 kV에서 작동된 차이스 10 A 전자 현미경으로 볼 수 있다. TIFF로 영상을 캡처할 수 있다.
란타넘 관류:
고정: 상기 관류 경로는 실온 하에 1시간 동안 2% 글루타르알데히드, 1% 파라포름알데히드, pH 7.4를 함유하는 0.05 M 트리스 완충제 중의 4% 질산란타넘에의 샘플의 담금에 의해 모든 대상체에게서 평가되었다.
프로세싱: 샘플을 세척하고, 암실에서 45분 동안 실온 하에 0.1 M 소듐 카코딜레이트, pH 7.4 중에서, 1.5% 페로시안화칼륨을 수반한 1.5% 사산화오스뮴에 위치시킬 수 있다. 카코딜레이트 완충제에서 세정한 후, 샘플을 등급별 에탄올 시리즈 (50%, 70%, 2 x 100%; 각각 10분)에서 탈수시키고, 연속해서 저 점도 에폭시 수지에 포매시킨다.
시각화: 초박막 절편을 수집하고, 이를 수 포화된 3% 우라닐 아세테이트로 염색하고/하거나 코팅되지 않은 니켈 그리드 상의 2.5% 납 시트레이트에서 대비할 수 있다. 초박막 절편은 60 kV에서 작동된 차이스 10 A 전자 현미경으로 볼 수 있다. TIFF로 영상을 캡처할 수 있다.
일부 실시양태가 본원에 제시되고 기재되긴 하였지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다. 수많은 변동, 변화, 및 치환이 본원에 제공된 개시내용으로부터 벗어나지 않고서도 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 실시양태에 대한 다양한 대안을 이용할 수 있는 것으로 이해해야 한다.

Claims (198)

  1. 합성 가죽을 제조하는 방법이며,
    a. 스캐폴드 상에서 시험관 내 배양된, 섬유모세포를 포함하는 인공 진피 층을 형성하고;
    b. 상기 인공 진피 층의 적어도 일부분을 태닝함으로써, 상기 합성 가죽을 형성하는 것
    을 포함하며,
    여기서 상기 섬유모세포는 줄기 세포로부터 분화되는 것인
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인공 진피 층이 모낭 세포를 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 표피 층을 상기 인공 진피 층 상에 위치시킴으로써 층상 구조물을 형성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인공 표피 층이 줄기 세포로부터 분화된 케라틴세포를 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 층상 구조물이 줄기 세포로부터 분화된 멜라닌세포를 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 인공 표피 층, 상기 층상 구조물 또는 상기 인공 진피 층이 콜라겐을 추가로 포함하며, 여기서 상기 콜라겐은 콜라겐 생산 세포에 의해 적어도 부분적으로 생산되거나, 별도로 부가되거나, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 가죽이 케라틴, 엘라스틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 더마탄 술페이트 프로테오글리칸, 글리코소아미노글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 더마토폰틴, 지질, 지방산, 탄수화물, 또는 그의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 진피 층의 두께가 0.02 mm 내지 5 mm의 범위인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 합성 가죽이 기저 막 대체물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 태닝이 인공 진피 층의 일부분을 황산, 크로뮴 또는 태닝액으로 처리하는 것을 포함하는 것인 방법.
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