CN106474547A - 一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法。该支架材料制备方法为：选用屠宰场经过脱毛设备脱毛的哺乳动物皮为原料，经过剖层，然后浸水、化学脱脂、碱消蚀法脱细胞、松散纤维、冷冻干燥、钴60辐照灭菌包装。所制备的生物支架材料具有三维多孔结构、良好的亲水性、高强度的机械性能、生物相容性，适合细胞黏附生长。可用于制备细胞培养支架、组织填充材料、烧伤辅料、人工皮肤、人工脑膜、神经鞘管。
Description
技术领域
本发明涉及了一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法，属于组织工程支架材料制备领域。
背景技术
以动物皮为原料制备的脱细胞真皮基质，保留了胶原的特有性质并具有三维的网状结构，并具备胶原的特殊性能，如细胞相容性良好及易于结合所需的细胞因子等。(Henson F,Getgood A.The use of scaffolds in musculoskeletal tissue engineering[J].Open OrthopJ,2011,5Suppl 2:261-266.)。有文献记载的脱细胞猪真皮基质在临床中应用主要是作为体表修复材料，如人工皮肤、创伤敷料等；亦应用于组织填充材料以及组织工程支架材料(陈斌,郭永章.组织工程皮肤支架材料的研究与应用[J].中国临床康复.2005,9(42):105-107.吴林波,丁建东,组织工程三维多孔支架的制备方法和技术进展[J].功能高分子学报,2003,16(1):91-95.)。早期，动物皮被研究应用于烧伤修复材料，这类材料主要通过简单的消毒，以及通过简单改性的辐照猪皮、氟银猪皮等，虽然能减低创面渗出，控制感染和减少水分蒸发等效果，但是生物敷料处理方法简单，存在免疫性、携带病毒等缺点，应用风险大。
动物皮原料制备的脱细胞真皮基质不仅可以作为体表修复材料应用于皮肤烧伤治疗中，其作为组织工程支架材料在医学各个领域应用中也有不错的结果。脱细胞真皮基质可用于腹壁缺损修补、软硬组织充填、硬脑膜修复等方面(Kim H,Bruen K,Vargo D.Acellular dermalmatrix in the management of high risk abdominal wall defects[J].Am J Surg,2006,192(6):705-709.Warren WL,Medary MB,Dureza CD,et al.Dural repair using acellularhuman dermis:experience with 200cases technique assessment[J].Neurosurgery,2000,46:1391-1396.)。国内，高长华等研究了脱细胞真皮材料作为结膜生长支架移植材料修复兔结膜损伤的效果，结果显示其是一种理想的结膜损伤修复材料(高长华,张向荣,周琼,等.异种脱细胞真皮基质修复结膜缺损的实验研究[J].眼科新进展,2013,33(3):210-214.)。2002年，马来祥等采用脱细胞异种(猪)真皮基质作为填充材料，对患者体表组织缺损凹陷的地方进行修复。这样既克服了传统填充整形的不足，且身体本身没有出现不良反应，使得脱细胞真皮基质应用有了更广泛的空间。此外，脱细胞真皮基质还被应用于乳房再造手术中，甚至用来修复腹壁缺损和鼓膜(马来祥,胡寅,陈光华.脱细胞异种(猪)真皮基质修复体表组织缺损凹陷的临床作用[J].河北医学,2004,8(10):764-767.Immediate breastreconstruction using porcine acellular dermal matrix(StratticeTM):Long-termoutcomes and complications[J].JPRAS,2013,3(66):323-328.)。
虽然以动物皮原料制备脱细胞真皮基质具有广泛的应用前景，但是在实现其产业化道路上还存在诸多困难，如原料来源问题，国内哺乳动物皮主要用于食品或者制革原料，做为生物原材料依然很少，并且其可追溯性问题依然没有完善的质量体系管理。这使得脱细胞真皮基质的应用得不到安全的保障，再者由于动物源材料品种、年龄及部位差等个体差异问题的存在，使得研究的工艺较难契合于较大规模的生产中；问题还体现于制备过程中，有关研究指出脱细胞真皮基质孔隙率低、孔径小，孔隙贯通性不理想。(Ng KW,Khor HL,Hutmacher DW,etal.In vitro characterization of natural and synthetic dermal Matrices cultured Withhuman dermal fibroblasts[J].Biomaterial,2004,25:2807.)这些问题的存在会使脱细胞基质渗透性差，细胞只能在支架表面生长，难以渗入真皮层，限制了其应用。基质亲水性不足对细胞生长造成不良影响，材料抑菌性差则会导致临床应用中伤口的感染等。目前对基质的改进主要通过交联改性的方法以提高材料的相关性能。人体内引起免疫排斥反应的主要是移植物中的细胞成分，因此制备脱细胞基质对细胞成分及其碎片的彻底清除非常重要。这些问题的存在不仅与制备方法有关，还与工艺条件的控制相关，制备过程中控制不当可能致使胶原水解过度、细胞去除不彻底、纯度不够等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种可产业化、效率高的制备适合细胞生长的生物支架材料的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法，该生物支架材料由猪皮、牛皮或羊皮制备而得，包括以下步骤：
(1)剖层：选取新鲜猪皮背部，使用剖层机剖层，将猪皮皮下脂肪组织去除，并将真皮部分剖层，厚度为0.4～0.8mm。
(2)浸水：称取100重量份的动物皮装入转鼓，并加入300～500体积份的纯化水，加入4～10重量份的氯化钠，转动60～120min，加入50～100体积份的95％酒精，浸泡过夜。
(3)化学脱脂：将水洗后的动物皮装入转鼓，加入1～5重量份的平平加，加入1～5重量份的碳酸钠，在室温下处理120min。水洗后，重复进行第二次脱脂。
(4)碱消蚀-表面活性剂结合法脱细胞：转鼓中加入1～3重量份的氢氧化钠，1～3重量份的表面活性剂，300～500重量份的纯化水，将脱脂后的动物皮转入转鼓，转动120min，静置过夜。次日排水，加入1～5重量份氯化铵，300～500重量份纯化水，将动物基质pH调节至6.0-7.0。
(5)松散纤维：加入300～500重量份的纯化水，设定温度32～35℃，加入活力单位1:250胰蛋白酶0.05～0.1重量份和0.5～1重量份平平加，加入十二烷基磺酸钠0.5～1重量份。转动60min，水洗。
(6)冷冻干燥：将处理后的动物基质冷冻干燥成型即得到具有三维多孔结构的支架材料。
(7)钴60辐照灭菌包装：裁切包装，经辐照灭菌，即为成品。
本发明所得的生物支架材料满足以下主要性能指标
外观：白色或淡黄色纤维状；
水分(％)：≤15；
灰分(％)：≤1；
抗拉强度(MPa)：≥6.0；
重金属含量(mg/kg)：＜30；
脂质体含量(％)：＜1；
亲水性：材料接触角小于90°，亲水性良好；
胶原酶体外降解：6小时内完全降解；
组织学观察：HE组织学染色观察，无细胞残留；
体外细胞毒性：细胞毒性反应应不大于0级；
制备的生物支架材料可用于：
1.细胞培养、营养支架；
2.组织填充材料；
3.烧伤敷料；
4.人工皮肤；
5.人工脑膜；
6.神经鞘管；
本技术与现有技术相比，优点如下：
本发明中所用的动物皮来源于具有完整质量体系文件的屠宰公司，保证了原料的安全性及均一性。
本发明使用的剖层设备为羊皮成品革专用剖层机。
本发明技术方案中，采用物理-化学结合，反复多次脱脂，能将脂质体去除干净。使用表面活性剂十二烷基磺酸钠、平平加、脱氧胆酸钠、Triton X-100一种或一种以上，结合氢氧化钠或氢氧化钾消蚀法脱细胞，不仅能将细胞破碎去除、并能够去除纤维间质。后继工序胰蛋白的作用对纤维起到软化松散作用。
本发明制备的生物支架材料具有三维多孔结构、良好的机械强度、良好的细胞相容性。
本发明制备的生物支架材料，原料安全可靠，制备工艺简便，容易实现产业化生产。
附图说明
图1新鲜动物皮切片组织学染色图
由图1可见，红色的纤维及紫褐色细胞核，还可以观察到毛囊周围活跃的细胞群及脂肪组织。
图2经过处理后的动物皮基质切片组织学观察图
由图2可见，经过一系列工序处理后，基质纤维排列规整，松散充分，并且没有观察到细胞核及其他组织成分存在。
图3处理后的动物皮基质电竞扫描(SEM)图
由图3可见，SEM观察下基质的表面形貌和内部的微观结构：基质表面呈多孔网络状，有大小不同的孔分布，基质内部结构疏松，相互连通的孔道多而明显，符合细胞生长对支架材料结构的要求；该支架材料呈纤维状或膜状，通过多条细的纤维束组成，并且纤维束之间有更细小的纤维相连，在形貌上符合胶原微纤维的结构特征，这说明胶原纤维未受到损坏，保持了原有的天然结构并得到了适当的松散。
具体实施方式
以下通过具体实施例进行具体描述：
实施例1
(1)剖层：选取新鲜猪皮背部，使用剖层机剖层，将猪皮皮下脂肪组织去除，并将真皮部分剖层，厚度为0.4～0.8mm。
(2)浸水：称取100重量份的动物皮装入转鼓，并加入300倍体积份的纯化水，加入4重量份的氯化钠，转动60～120min，加入50体积份的95％酒精，浸泡过夜。
(3)化学脱脂：将水洗后的动物皮装入转鼓，加入1重量份的平平加，加入1重量份的碳酸钠，在室温下处理120min。水洗后，重复进行第二次脱脂。
(4)碱消蚀-表面活性剂结合法脱细胞：转鼓中加入1重量份的氢氧化钠，3重量份的平平加，300重量份的纯化水，将脱脂后的动物皮转入转鼓，转动120min，静置过夜。次日排水，加入1重量份氯化铵，300重量份纯化水，将动物基质pH调节至6.0-7.0。
(5)松散纤维：加入300重量份的纯化水，设定温度32～35℃，加入活力单位1:250胰蛋白酶0.05重量份和0.5重量份平平加，加入十二烷基磺酸钠0.5重量份。转动60min，水洗。
(6)冷冻干燥：将处理后的动物基质冷冻干燥成型即得到具有三维多孔结构的支架材料。
(7)钴60辐照灭菌包装：裁切包装，经辐照灭菌，即为成品。
实施例2
(1)剖层：选取新鲜猪皮背部，使用剖层机剖层，将猪皮皮下脂肪组织去除，并将真皮部分剖层，厚度为0.4～0.8mm。
(2)浸水：称取100重量份的动物皮装入转鼓，并加入400体积份的纯化水，加入5重量份的氯化钠，转动60～120min，加入50体积份的95％酒精，浸泡过夜。
(3)化学脱脂：将水洗后的动物皮装入转鼓，加入2重量份的平平加，加入1重量份的碳酸钠，在室温下处理120min。水洗后，重复进行第二次脱脂。
(4)碱消蚀-表面活性剂结合法脱细胞：转鼓中加入1.5重量份的氢氧化钠，2重量份的平平加，400重量份的纯化水，将脱脂后的动物皮转入转鼓，转动120min，静置过夜。次日排水，加入5重量份氯化铵，400重量份纯化水，将动物基质pH调节至6.0-7.0。
(5)松散纤维：加入400重量份的纯化水，设定温度32～35℃，加入活力单位1:250胰蛋白酶0.05重量份和0.5重量份平平加，加入十二烷基磺酸钠0.5重量份。转动60min，水洗。
(6)冷冻干燥：将处理后的动物基质冷冻干燥成型即得到具有三维多孔结构的支架材料。
(7)钴60辐照灭菌包装：裁切包装，经辐照灭菌，即为成品。
实施例3
(1)剖层：选取新鲜猪皮背部，使用剖层机剖层，将猪皮皮下脂肪组织去除，并将真皮部分剖层，厚度为0.4～0.8mm。
(2)浸水：称取100重量份的动物皮装入转鼓，并加入500体积份的纯化水，加入10重量份的氯化钠，转动60～120min，加入50体积份的95％酒精，浸泡过夜。
(3)化学脱脂：将水洗后的动物皮装入转鼓，加入1重量份的平平加，加入2重量份的碳酸钠，在室温下处理120min。水洗后，重复进行第二次脱脂。
(4)碱消蚀-表面活性剂结合法脱细胞：转鼓中加入3重量份的氢氧化钾，1重量份TritonX-100,500重量份的纯化水，将脱脂后的动物皮转入转鼓，转动120min，静置过夜。次日排水，加入5重量份氯化铵，500重量份纯化水，将动物基质pH调节至6.0-7.0。
(5)松散纤维：加入500重量份的纯化水，设定温度32～35℃，加入活力单位1:250胰蛋白酶0.1重量份和1重量份平平加，加入十二烷基磺酸钠0.5重量份。转动60min，水洗。
(6)冷冻干燥：将处理后的动物基质冷冻干燥成型即得到具有三维多孔结构的支架材料。
(7)钴60辐照灭菌包装：裁切包装，经辐照灭菌，即为成品。
Claims (5)
1.一种适合细胞生长的生物支架材料，该材料主要成分为动物皮胶原纤维，主要技术性能指标如下：
外观：白色或淡黄色纤维状；
水分(％)：≤15；
灰分(％)：≤1；
抗拉强度(MPa)：≥6.0；
重金属含量(mg/kg)：＜30；
脂质体含量(％)：＜1；
亲水性：材料接触角小于90°，亲水性良好；
胶原酶体外降解：6小时内完全降解；
组织学观察：HE组织学染色观察，无细胞残留；
体外细胞毒性：细胞毒性反应应不大于0级。
2.按照专利要求1所述的一种适合细胞生长的生物支架材料，其特征在于包含以下步骤：
(1)剖层：选取新鲜食用猪皮背部，使用剖层机剖层，将猪皮皮下脂肪组织去除，并将真皮部分剖层，厚度为0.4～0.8mm。
(2)浸水：称取100重量份的动物皮装入转鼓，并加入300～500体积份的纯化水，加入1～10重量份的氯化钠，转动60～120min，加入50～100体积份的95％酒精，浸泡过夜。
(3)化学脱脂：将水洗后的动物皮装入转鼓，加入1～5重量份的平平加，加入1～5重量份的碳酸钠，在室温下处理120min。水洗后，重复进行第二次脱脂。
(4)碱消蚀-表面活性剂结合法脱细胞：转鼓中加入1～3重量份的强碱，1～3重量份的表面活性剂，300～500重量份的纯化水，将脱脂后的动物皮基质转入转鼓，转动120min，静置过夜。次日排水，加入1～5重量份氯化铵，300～500重量份纯化水，将动物皮基质pH调节至6.0-7.0。
(5)松散纤维：加入300～500重量份的纯化水，设定温度32～35℃，加入活力单位1:250胰蛋白酶0.05～0.1重量份和0.5～1重量份平平加，加入十二烷基磺酸钠0.5～1重量份。转动60min，水洗。
(6)冷冻干燥：将处理后的动物基质冷冻干燥成型即得到具有三维多孔结构的支架材料。
(7)钴60辐照灭菌包装：裁切包装，经辐照灭菌，即为成品。
3.按照专利要求2所述一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法，其特征在于所述的动物皮为具有完整质量体系文件的食用级或生物医用级新鲜动物皮，可以是猪、牛、羊等哺乳动物皮。
4.按照专利要求2所述一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法，其特征在于所述的碱是氢氧化钠、氢氧化钾中一种或一种以上试剂表面活性剂为十二烷基磺酸钠、平平加、脱氧胆酸钠、Triton X-100等其中一种或一种以上表面活性剂。
5.按照专利要求2所述一种适合细胞生长的生物支架材料及其制备方法，其特征在于所述剖层机为羊皮成品革专用剖层机。
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