CN111068117A - 脂肪萃取液、脂肪脱细胞基质及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂肪萃取液、脂肪脱细胞基质及其制备方法、应用。脂肪组织经清洗，离心，取中间层脂肪组织与PBS混合并转移至注射器(一)中，所述中间层脂肪组织与缓冲盐溶液的体积比为(1±0.2)：1；将注射器(一)与注射器(二)通过接头对接，推动注射器(一)的活塞，连续往返推注，得浆液，离心，得脂肪萃取液和中层脂肪组织；中层脂肪组织经冷冻‑解冻循环处理，酶处理，消毒液处理，得到脂肪脱细胞基质。本发明提供一种脂肪萃取液和脂肪脱细胞基质的制备方法，该方法快速、高效，可制备得到含生长因子的脂肪萃取液及一种高度保留天然细胞外基质成分和结构的脂肪脱细胞基质。

Description

脂肪萃取液、脂肪脱细胞基质及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物材料领域，特别是涉及脂肪萃取液、脂肪脱细胞基质及其制备方法、应用。
背景技术
由天然的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)组成的脱细胞生物支架具有诱导缺损组织再生的潜能，其在组织工程学领域得到了广泛的兴趣和关注。由于脂肪组织可通过脂肪抽吸这一简单的方式大量获取，脂肪脱细胞基质(Decellularized adiposetissue，DAT)逐渐成为软组织扩张和修复的一种十分有前景的选择。
相比于人工合成支架，天然的DAT具有以下几点优势：(1)DAT保留了ECM的天然显微结构和成分，能模拟天然细胞微环境的组织特异性生物化学特性及生物力学特性；(2)无细胞成分，不引起异体的免疫排斥反应；(3)其制备原材料为脂肪组织，来源广泛，获取容易。
然而，传统方法制备的DAT体内成脂性较差，且新生的构建物无法在体内长期维持。目前认为，这主要是由于传统DAT制备过程中存在的不利因素降低了DAT的质量：(1)制备时间长(120-156小时)，且其中近半时间用于油脂成分去除；(2)油脂的疏水性限制了细胞外基质与胰酶的充分接触，延长了胰酶作用时间；(3)脱油的化学试剂易引起ECM成分及超微结构发生改变。因此，想要使得DAT能够进行临床应用，急需一种方法缩短酶消化及有机溶剂的作用时间，提高DAT制备效率，减少ECM的破坏。
与此同时，血管化缺乏导致的营养不足亦可以限制组织工程移植物的再生结果。近年来，脂肪组织已被证实为一种具有内分泌功能的结构，含有大量生物活性因子，多种脂肪组织来源的生长因子和细胞因子且上述因子能够刺激血管化，促进毛细血管网形成。目前已通过体外培养组织或细胞的方式获取含有脂肪组织来源的细胞因子的提取液，并证实了其对诱导血管化的作用。
然而，常规上述方法制备的提取液需要体外实验室培养技术及相关设备，增加了操作难度及生物污染的可能，因此，需要寻求一种更加简便、经济、安全的方法获取生物活性因子。
发明内容
基于此，本发明提供一种全新的对脂肪组织的物理处理方式，其可制备得到含生长因子的脂肪萃取液(ALE，Adipose liquid extract)及一种高度保留天然细胞外基质成分和结构的脂肪脱细胞基质(M-DAT,Mechanical processing DAT)。
具体技术方案如下：
脂肪萃取液的制备方法，包括以下步骤：
(S1)取颗粒脂肪组织，缓冲液清洗，离心，取中间层组织；
(S2)将所述中间层组织与PBS混合并转移至注射器(一)中，所述中间层脂肪组织与缓冲盐溶液的体积比为(1±0.2)：1；将注射器(一)与注射器(二)通过接头对接，推动注射器(一)的活塞，连续往返推注，所述连续往返推注的速度为4ml/s-20ml/s；所述连续往返推注时间为0.2min-5min，得浆液；
(S3)将所述浆液离心，得底层的脂肪萃取液和中层脱油脂肪。
在其中一个实施例中，步骤(S2)中，所述接头的口径为1.2mm-1.6mm；所述连续往返推注的速度为8ml/s-12ml/s，所述连续往返推注时间为0.5min-2.5min。
在其中一个实施例中，步骤(S1)中，所述离心的转速为800g/min-1200g/min，所述离心的时间为2min-5min；步骤(S3)中，所述离心的转速为2000g/min-2200g/min，所述离心的时间为3min-7min。
本发明的另一目的是提供一种脂肪脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：
(D1)根据上述方法制备得到脂肪萃取液和中层脱油脂肪；
(D2)在中层脱油脂肪中加入缓冲液，冷冻-融化循环处理，所述冷冻-融化循环处理的次数为2-5次，温度为-80℃-37℃，每次冷冻和融化的时间各为0.5h-3h，得冻融后组织；
(D3)在所述冻融后组织中加入胰蛋白酶溶液，搅拌，缓冲液清洗，有机溶剂提取油脂，缓冲液清洗；
(D4)在步骤(D3)所得组织中加入核酸酶消化液，振荡，缓冲液清洗，有机溶剂提取油脂，缓冲液清洗，离心，取沉淀；
(D5))在步骤(D4)所得组织中加入消毒液消毒，离心，取沉淀，缓冲液清洗，离心，取沉淀，得脂肪脱细胞基质。
在其中一个实施例中，步骤(D3)中，所述胰蛋白酶溶液的体积浓度为0.02％-0.07％，所述搅拌的时间为14h-20h。
在其中一个实施例中，步骤(D4)中，所述核酸酶消化液的体积浓度为400U/mL-600U/mL，所述振荡的时间为8h-20h。
在其中一个实施例中，步骤(D5)中，所述消毒液含有0.05-0.2％(v/v)过氧乙酸和3-5％(v/v)乙醇，所述消毒的时间为3h-6h。
在其中一个实施例中，所述缓冲液为PBS缓冲液；所述缓冲液为PBS，所述缓冲液清洗的次数为2-4次，清洗的时间为(20min-40min)/次。
在其中一个实施例中，所述有机溶剂为异丙醇。
在其中一个实施例中，步骤(D3)中，所述有机溶剂提取油脂的方法为：在清洗后的组织中加入有机溶剂，连续搅动16h-20h提取油脂，弃去液体部分。
在其中一个实施例中，步骤(D4)中，所述有机溶剂提取油脂的方法为：在清洗后的组织中加入异丙醇，连续振荡1h-3h，离心后弃去液体部分。
本发明的另一目的是提供一种脂肪萃取液。
本发明的另一目的是提供一种脂肪脱细胞基质。
本发明的另一目的是提供一种脂肪萃取液在工程化组织的构建中的应用。
本发明的又一目的是提供一种脂肪脱细胞基质在工程化组织的构建中的应用。
本发明的再一目的是提供一种脂肪萃取液与脂肪脱细胞基质联合应用在工程化组织构建中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的发明人创造性地采用注射器往返推注的物理去油方式，利用推注过程中的流体剪切力原理，将脂肪组织中绝大多数成熟脂肪细胞破坏并释放出大量油脂；本发明的注射器推注和冷冻-融化结合脱细胞是一种新型物理方式脱细胞过程，其操作简单，可快速、高效地去除油脂，同时不破坏脂肪组织细胞外基质的微观结构，还避免了传统化学处理的试剂残留对细胞外基质的破坏，使所制备的M-DAT拥有更高的生物安全性。
(2)本发明利用注射往返推注和冷冻-融解循环相结合的物理脱细胞过程可以将脂肪组织中的大部分油脂去除，避免了油脂的疏水性限制细胞外基质与胰酶的接触，缩短了胰蛋白酶的处理时间，同时也缩短了有机溶剂提取油脂的时间。脂肪组织在注射器往返推注的物理脱细胞的基础上，进一步结合冷冻-融化循环处理，胰蛋白酶处理，核酸酶处理，最终制备得到了一种高度保留天然细胞外基质成分和结构的脂肪脱细胞基质，其油脂、DNA残留低，关键蛋白ColⅠ(人Ⅰ型胶原蛋白)、ColⅡ(人Ⅱ型胶原蛋白)和Laminin(层粘连蛋白)保留高。
(3)本发明物理处理脂肪的过程所收集的脂肪萃取液(Adipose liquid extract,ALE)含有大量成血管因子，并能够在体内外诱导血管化。脂肪萃取液不含有细胞成分，并且其获取过程不需要额外添加任何生物及化学成分，具有异体应用的潜能。此外，本发明的脂肪萃取液与M-DAT结合能够有效诱导脂肪再生，可成为新型可异体应用的工程化脂肪组织构建的新策略。
附图说明
图1为M-DAT,ALE制备流程图；
图2为M-DAT，传统DAT脱细胞结果及关键蛋白保留检测；
图3为ALE体外血管诱导生成能力检测；
图4为ALE体内血管诱导生成能力检测；
图5为M-DAT联合ALE进行体内脂肪组织构建。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1：脂肪萃取液(Adipose liquid extract,ALE)和脂肪脱细胞基质M-DAT(Mechanical processing DAT:物理方法制备的DAT)的制备
1)用磷酸盐缓冲盐水缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)对获得的颗粒脂肪进行清洗，以1000g/min离心3min，将离心后上层油脂及底层液体弃去，收集中层脂肪组织。
2)将步骤1)所得的脂肪组织与等体积PBS混合，转移至10ml螺口注射器中。
3)将装有步骤2)所得含脂肪的注射器与一枚新的10ml螺口注射器通过2.4mm口径的鲁尔接头密封对接，推动含有脂肪的注射器活塞，将脂肪推注至对侧注射器中，推注速度为10ml/s，如此连续往返推注1min。
4)将步骤3)所得的推注后的产物以2000g/min离心5min，将上层油脂弃去，收集底层液体部分即为脂肪萃取液(Adipose liquid extract,ALE)并储藏于-20℃备用，将中层脱油后的脂肪组织转移至离心管中并加入PBS。
5)将步骤4)所得脱油后的脂肪组织进行3个循环冻融，温度为-80℃到37℃，每次冰冻和融化时间各为2h。
6)将步骤5)所得冻融后组织加入等体积0.05％胰蛋白酶于37℃连续搅动16h，弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
7)将步骤6)所得清洗后组织加入99.9％异丙醇连续搅动18h提取油脂成分，弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
8)将步骤7)所得清洗后的组织中加入核酸酶消化液(500U/mL；cat.#E1014；Sigma,St.Louis,MO,USA)，连续振荡16h，离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
9)往步骤8)所得的清洗后组织加入99.99％异丙醇，并连续振荡2h以萃取油脂成分；离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，离心后弃去液体部分。
10)将步骤9)所得清洗后组织加入消毒液(0.15％过氧乙酸，5％乙醇)消毒4h,离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，离心后弃去液体部分。
11)经步骤10)处理后剩余的组织即为M-DAT，将M-DAT浸泡于含1％青-链霉素的PBS中，储存于-20℃，以待进行脂肪脱细胞基质的效果测定。
实施例2：脂肪萃取液ALE和脂肪脱细胞基质M-DAT的制备
1)用缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)对获得的颗粒脂肪进行清洗，以800g/min离心2min，将离心后上层油脂及底层液体弃去，收集中层脂肪组织。
2)将步骤1)所得的脂肪组织与等体积PBS混合，转移至10ml螺口注射器中。
3)将装有步骤2)所得含脂肪的注射器与一枚新的10ml螺口注射器通过1.4mm口径的鲁尔接头密封对接，推动含有脂肪的注射器活塞，将脂肪推注至对侧注射器中，推注速度为8ml/s，如此连续往返推注0.5min。
4)将步骤3)所得的推注后的产物以1500g/min离心3min，将上层油脂弃去，收集底层液体部分即为ALE并储藏于-20℃备用，将中层推注后脱油的脂肪组织转移至离心管中并加入PBS。
5)将步骤4)所得萃取后保留的组织进行3个循环冻融，温度为-80℃到37℃，每次冰冻和融化时间各为0.5h。
6)将步骤5)所得冻融后组织加入等体积0.02％胰蛋白酶于37℃连续搅动14h，弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
7)将步骤6)所得清洗后组织加入99％异丙醇连续搅动16h提取油脂成分，弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
8)将步骤7)所得清洗后的组织中加入核酸酶消化液(500U/mL；cat.#E1014；Sigma,St.Louis,MO,USA)于37℃连续振荡16h，离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
9)往步骤8)所得的清洗后组织加入99％异丙醇，并连续振荡2h以萃取油脂成分；离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，离心后弃去液体部分。
10)将步骤9)所得清洗后组织加入消毒液(0.05％过氧乙酸，3％乙醇)消毒2h,离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，离心后弃去液体部分。
11)经步骤10)处理后剩余的组织即为M-DAT，将M-DAT浸泡于含1％青-链霉素的PBS中，储存于-20℃备用。
对比例1：脂肪脱细胞基质DAT的常规制备
1)用缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)对获得的颗粒脂肪进行清洗，以800g/min离心2min，将离心后上层油脂及底层液体弃去，收集中层脂肪组织并加入PBS。
2)将步骤1)收集的脂肪组织进行3个循环冻融，温度为-80℃到37℃，每次冰冻和融化时间各为2h。
3)将步骤2)所得冻融后组织加入等体积0.05％胰蛋白酶于37℃连续搅动16h，弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
4)将步骤3)所得清洗后组织加入99％异丙醇连续搅动48h提取油脂成分，弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
5)将步骤3)所得冻融后组织加入等体积0.05％胰蛋白酶于37℃连续搅动6h，弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
6)将步骤5)所得清洗后的组织中加入核酸酶消化液(500U/mL；cat.#E1014；Sigma,St.Louis,MO,USA)于37℃连续振荡16h，离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，弃去液体部分。
7)往步骤6)所得的清洗后组织加入99％异丙醇，并连续振荡8h以萃取油脂成分；离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，离心后弃去液体部分。
8)将步骤7)所得清洗后组织加入消毒液(0.05％过氧乙酸，3％乙醇)消毒2h,离心后弃去液体部分，剩余的组织用PBS清洗3遍，各30min，离心后弃去液体部分。
9)经步骤8)处理后剩余的组织即为M-DAT，将M-DAT浸泡于含1％青-链霉素的PBS中，储存于-20℃备用。
脂肪脱细胞基质的效果测定
(1)M-DAT脱细胞结果及关键蛋白保留检测
对常规方案制备的DAT及实施例1制备的M-DAT样本分别进行HE染色及Masson染色。用扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)观察DAT及M-DAT的超微结构。用扫描电镜(S-3000N；Hitachi Ltd.,Tokyo,Japan)观察，图像用数码相机(Canon Inc.,Tokyo,Japan)拍摄。
进一步地，样本称重后用DNeasy试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)按照产品说明书提取其中的残余DNA，DNA含量用酶标仪(Model 680；Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在260nm波长下进行定量，再把单位换算为ug/mg湿重。
用western blotting分别测量DAT及M-DAT中的几种关键成分的保留率：包括I型胶原(COLⅠ)、IV型胶原(COLⅣ)、层粘连蛋白(laminin)。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内源参照基因。
实验结果：
检测结果如图2所示，图2A Masson染色显示M-DAT主要由疏松堆叠、去细胞的ECM网络组成。
图2A电镜分析证实了这种疏松多孔的结构，而且在支架中没有观察到油滴。
图2A中HE染色没有发现明显的细胞核成分。
从图2B可以看出，相比自身脂肪(对照组，未经处理的脂肪组织)，每100mg含水M-DAT中仅含112.1±51.9ng残余DNA，表明上述方法能有效去除残余核酸。
图2CD表明，关键蛋白ColⅠ(人Ⅰ型胶原蛋白)、ColⅡ(人Ⅱ型胶原蛋白)和Laminin(层粘连蛋白)保留在M-DAT组明显高于DAT对照组。
(2)ALE体外成血管能力检测及成血管化因子含量测定
从南方医院临床实验中心获取人脐静脉内皮细胞(Human umbilical veinendothelial cells,HUVECs)，对冰冻的基质胶(356230；Becton,Dickinson&Co.,FranklinLakes,NJ,USA)于4℃冰箱放置过夜解冻，所有室验设备使用前放置于-20℃冷冻。将基质胶(与PBS 1：1混合)转移至六孔板，于37℃放置30分钟至基质胶凝固，将HUVECs(2×104/孔)接种于基质胶上，并加入1mL ALE混合1mL完全培养基(DMEM中加入10％牛胎儿血清、100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素)进行培养。用血管原性生长因子(20ng/mL VEGF and 5ng/mLbFGF)培育HUVECs作为阳性对照，用完全培养基培育HUVECs作为阴性对照。24小时后，各组均取4个高倍镜视野，观察各组的血管形成情况。
用Quantikine高敏感性酶联免疫试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)按照产品说明书评估ALE样本中的成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达。同时，各样本中总蛋白浓度也通过BCA蛋白分析试剂盒(301001；Bioworld,Guangzhou,China)按照产品说明书进行测定。以PBS缓冲液作为对照组。
实验结果：
检测结果如图3所示，从中可以看出，ALE培养组在20h可形成较多管腔样结构，而阴性对照组中HUVECs则不能形成连接成管腔样结构。
定量检测结果表明，ALE中VEGF,bFGF,TGF-β,EGF浓度分别为38±1pg/mL,1144.6±174.5pg/mL,608.9±47.3和1757.9±477.4pg/mL,26.8±0.4pg/mL。
(3)ALE体内血管诱导形成能力检测
将4-6周大的裸鼠随机分成三组。在ALE处理组中，把250uLDAT混合等量ALE，皮下注射到裸鼠背部两侧(如图1所示)。传统M-DAT移植组和传统DAT移植组作为对照组。分别在1周、4周、8周三个时间点进行取材，一半样本用福尔马林固定，进行免疫荧光染色，另一半样本进行速冻并储存于-80℃用于RNA分析。
用CD31抗体(1:25；cat.#ab28364；Abcam,Cambridge,UK；为红色)和围脂滴蛋白(1:500；cat.#GP29；Progen,Heidelberg,Germany；为绿色)进行免疫荧光染色。对上述经福尔马林处理的DAT样本用常规方法进行石蜡包埋，切成5-μm厚切片，覆盖于载玻片，进行脱蜡和水合。随后，将载玻片放入3％过氧化氢5分钟使过氧化物酶失活，再用PBS洗三遍，持续5分钟。随后，对载玻片进行抗原修复，并在4℃下用一级抗体孵育过夜，PBS清洗三遍后，在26℃下用二级抗体孵育30分钟，用4,6二氨基-2-苯茚二酮(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；为蓝色)进行复染。
用激光共聚焦扫描显微镜(FV10i-W；Olympus,Tokyo,Japan)对切片进行观察和拍摄。每张切片观察10个视野，对CD31阳性毛细血管进行计数以评估血管化程度。
实验结果：
实验结果如图4所示,ALE处理组在三个时间点观察到的CD31阳性血管样结构最多，而在相同时间点，其余两个对照组的样本则呈现散乱分布的血管。DAT血管化定量结果显示，三个时间点ALE处理组新生血管的数量显著高于其余两个对照组。
(4)ALE联合M-DAT进行体内脂肪组织构建
实验方法同上述实验(3)，用激光共聚焦扫描显微镜(FV10i-W；Olympus,Tokyo,Japan)对切片进行观察和拍摄。每张切片观察10个视野，对围脂滴蛋白阳性脂肪细胞进行计数以评估各组的成脂程度。
实验结果：
结果如图5所示。从图5A可以看出，在第8周，ALE处理组的M-DAT中间区域可观察到大量成熟脂肪细胞。然而，在传统M-DAT移植组中，M-DAT中间区域仅可观察到少量脂肪细胞，而control组(传统DAT移植组)中DAT的对应区域则观察不到脂肪组织及细胞核。
从中图5B可以看出，脂肪细胞定量分析显示从第1周到第8周三组的细胞数目都成上升状态。在第四周，ALE处理组的M-DAT中脂肪细胞数量明显高于control组(传统DAT移植组)，在第8周，ALE处理组的M-DAT中脂肪细胞数量明显高于传统M-DAT移植组和control组。而在相同时期，传统M-DAT移植组的脂肪细胞数量也明显高于control组。成脂基因表达结果表明，从第1周到第8周，ALE处理组的M-DAT中成脂因子PPARγ的表达逐渐下降，并且在第4周，其PPARγ的表达高于传统M-DAT移植组和control组。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.脂肪萃取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(S1)取新鲜抽脂获得的颗粒脂肪，缓冲液清洗，离心，取中间层脂肪组织；
(S2)将所述中间层脂肪组织与PBS混合并转移至注射器(一)中，所述中间层脂肪组织与缓冲盐溶液的体积比为(1±0.2)：1；将注射器(一)与注射器(二)通过接头对接，推动注射器(一)的活塞，连续往返推注，所述连续往返推注的速度为4ml/s-20ml/s；所述连续往返推注时间为0.2min-5min，得浆液；
(S3)将所述浆液离心，得底层的脂肪萃取液和中层脱油脂肪。
2.根据权利要求1所述的脂肪萃取液的制备方法，其特征在于，步骤(S2)中，所述接头的口径为1.2mm-1.6mm；所述连续往返推注的速度为8ml/s-12ml/s，所述连续往返推注时间为0.5min-2.5min。
3.根据权利要求1所述的脂肪萃取液的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中，所述离心的转速为800g/min-1200g/min，所述离心的时间为2min-5min；步骤(S3)中，所述离心的转速为2000g/min-2200g/min，所述离心的时间为3min-7min。
4.一种脂肪脱细胞基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(D1)根据权利要求1-3任一项所述方法制备得到脂肪萃取液和中层脱油脂肪；
(D2)在中层脱油脂肪中加入缓冲液，冷冻-融化循环处理，所述冷冻-融化循环处理的次数为2-5次，温度为-80℃-37℃，每次冷冻和融化的时间各为0.5h-3h，得冻融后组织；
(D3)在冻融后组织中加入胰蛋白酶溶液，搅拌，缓冲液清洗，有机溶剂提取油脂，缓冲液清洗；
(D4)在步骤(D3)所得组织中加入核酸酶消化液，振荡，缓冲液清洗，有机溶剂提取油脂，缓冲液清洗，离心，取沉淀；
(D5))在步骤(D4)所得组织中加入消毒液消毒，离心，取沉淀，缓冲液清洗，离心，取沉淀，得脂肪脱细胞基质。
5.根据权利要求4所述的脂肪脱细胞基质的制备方法，其特征在于，步骤(D3)中，所述胰蛋白酶溶液的体积浓度为0.02％-0.07％，所述搅拌的时间为14h-20h；步骤(D4)中,所述核酸酶消化液的体积浓度为400U/mL-600U/mL，所述振荡的时间为8h-20h；步骤(D5)中，所述消毒液含有0.05-0.2％(v/v)过氧乙酸和3-5％(v/v)乙醇，所述消毒的时间为3h-6h。
6.根据权利要求4所述的脂肪脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS；所述缓冲液清洗的次数为2-4次，清洗的时间为(20min-40min)/次；所述有机溶剂为异丙醇。
7.一种权利要求1-3任一项所述方法制备得到的脂肪萃取液。
8.一种权利要求4-6任一项所述方法制备得到的脂肪脱细胞基质。
9.一种权利要求7所述的脂肪萃取液在工程化组织的构建中的应用。
10.一种权利要求8所述的脂肪脱细胞基质在工程化组织的构建中的应用。
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