CN115103696A - 用于构建组织再生贴片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于构建组织再生贴片的方法，该方法包括以下步骤：A)制备微粉化脂肪组织提取物；B)将所述微粉化脂肪组织提取物注入具有预定形状的模具中；C)在‑25℃(包含端点)至‑10℃(包含端点)的温度范围冷却向其中注入了脂肪组织提取物的所述模具；和D)去除所述模具以获得组织再生贴片。

Description

用于构建组织再生贴片的方法

技术领域

本说明书要求于2020年12月24日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2020-0183901的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。

本发明涉及一种用于制造组织再生贴片的方法。具体地，其涉及一种制造为受损或丢失的组织定制的组织再生贴片的方法。

背景技术

特别地，糖尿病足病是指由糖尿病患者足部的皮肤伤口引起皮肤组织撕裂而引起的足部溃疡。这是当糖尿病引起的神经病变或外周血管疾病导致糖尿病患者足部的溃疡或伤口感染恶化时发生的现象。约20％的糖尿病患者会发生至少一次糖尿病足病，其中约1-3％会接受手术切除部分腿。此外，据了解，半数以上的腿截肢病例(除外伤引起的病例外)均由糖尿病足病所致。

皮肤烧伤可以定义为对皮肤的热攻击。皮肤烧伤会导致皮肤、软组织、耳朵和眼睛、头发和体毛、指甲和甚至骨骼的部分或全部破坏。大多数烧伤只影响皮肤，即表皮和真皮。然而，在三度烧伤的情况下，它会导致表皮和真皮的完全破坏或玻璃化，并且这种烧伤往往会损伤皮下组织，例如血管、肌肉和神经。为了治疗这种类型的烧伤，通常会进行皮肤移植，因为理论上可能不会形成表皮疤痕。此外，四度烧伤会影响肌肉，并且甚至会延伸到骨骼。在这种情况下，皮肤的外观被称为碳化，并且推荐的治疗方法可能是截肢。

因此，糖尿病足病或烧伤引起的皮肤损伤是可能降低患者生活质量的非常重要的原因，并且需要进行大量研究以找到使坏死皮肤组织再生并恢复患者正常生活的方法。

现有技术文献

专利文献

(专利文献1)韩国专利登记号10-1710615

发明内容

[技术问题]

本发明的目的是提供一种用于制造能够治疗受损或丢失的组织的组织再生贴片的方法。具体地，其涉及一种制造为受损或丢失的组织、特别是由于糖尿病足病和烧伤导致的受损或丢失的皮肤组织定制的组织再生贴片的方法。

[技术方案]

本发明的一个实施方案描述了一种制造组织再生贴片的方法，包括：A)制备微粉化脂肪组织提取物；B)将所述微粉化脂肪组织提取物注入预定形状的模具中；C)在-25℃至-10℃的温度冷却向其中注入了脂肪组织提取物的所述模具；和D)去除所述模具以获得组织再生贴片。

本发明的另一个实施方案描述了直接提供使用上述制造方法制造的组织再生贴片。

[有利效果]

根据本发明的用于制造组织再生贴片的方法产生了能够简单且快速地进行组织治疗的组织再生贴片。特别地，根据本发明的用于制造组织再生贴片的方法可以在临床介入的现场快速制造定制的组织再生贴片。此外，通过根据本发明的制造方法生产的组织再生贴片可以促进有效的皮肤再生，特别是在糖尿病足病或烧伤患者的受损或丢失的皮肤区域。

附图说明

图1是依次示出了根据实施方案的组织再生贴片的制造方法和将组织再生贴片施用到受影响区域的照片。

图2是分别在实施例1、比较例1和2的敷料处理后的第3天、第7天、第12天测量受影响区域尺寸的图。

图3分别示出了实施例1、比较例1和2的恢复的受影响区域中新生血管的结果。

图4是图3的结果图。

图5是使用扫描型电子显微镜观察到的参考例的组织再生片的图像。

具体实施方式

在整个说明书中，当一部分被称为“包括”一个组件时，这意味着可以进一步包括而不是排除其他组件，除非有相反的特别说明。

在本说明书中，当一个构件被称为位于另一构件“上”时，这不仅包括构件与另一构件接触的情况，还包括其中另一构件存在于两个构件之间的情况。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明的一个实施方案提供了一种用于制造组织再生贴片的方法，包括：A)制备微粉化脂肪组织提取物；

B)将所述微粉化脂肪组织提取物注入预定形状的模具中；

C)在-25℃至-10℃的温度冷却向其中注入了脂肪组织提取物的所述模具；和

D)去除所述模具以获得组织再生贴片。

根据本发明的组织再生贴片具有可以通过简单的方法制造的优点。特别地，可以通过使用受影响区域的2D或3D扫描数据容易地提供患者特异性的组织再生贴片，并且此外，可以直接在临床干预的现场快速执行从脂肪组织提取到组织再生贴片制造的步骤。

步骤A)：制备微粉化脂肪组织提取物

根据本发明的一个实施方案，可以使用提取的脂肪组织制备微粉化脂肪组织提取物。具体地，可以通过使用一般的脂肪抽吸技术提取脂肪组织然后将其微粉化来获得微粉化脂肪组织提取物。

根据本发明的一个实施方案，脂肪组织可以是自体脂肪组织。具体地，脂肪组织可以是患者的自体脂肪，其可以通过脂肪抽吸术提取。此外，可以通过使用脂肪抽吸术提取脂肪组织然后去除与脂肪组织混合的生理盐水和血液的至少一部分来获得脂肪组织。具体地，可以通过将使用脂肪抽吸术获得的提取物放置预定时间以去除从脂肪层分离的血液和生理盐水层来获得脂肪组织。这样，当生理盐水和血液被去除时，可以更有效地提取以下脂肪组织提取物，并且制备的脂肪组织提取物可以更有效地包含适合治疗的生长因子和活性细胞。

根据本发明的一个实施方案，步骤A)可以包括依次使用a1)孔径为2mm至5mm的第一过滤器、孔径为400μm至800μm的第二过滤器和孔径为150μm至250μm的第三过滤器分阶段粉碎脂肪组织的步骤。

根据本发明的一个实施方案，第一至第三过滤器可以是超微粉粉碎机。另外，第一至第三过滤器是注射器过滤器，并且可以通过使脂肪组织通过注射器中的过滤器来粉碎脂肪组织。注射器过滤器可以由不锈钢材料制成，并且可以通过确保足够的强度来有效地粉碎脂肪组织。此外，第一至第三过滤器中的每一个可以是过滤袋，其为由柔性塑料材料制成的密闭袋状过滤器套件，可以是其中在一侧设置入口并且在另一侧设置出口并且划分内部空间的形式。在使用过滤袋的情况下，可以通过将脂肪组织注入过滤袋中并通过施加外部压力(例如，使用诸如硅胶刮刀的工具的压力)使脂肪组织通过过滤器来粉碎脂肪组织。

根据本发明的一个实施方案，步骤a1)可以是通过使脂肪组织通过每个过滤器至少两次来粉碎脂肪组织。具体地，第一至第三过滤器为注射器过滤器，并且在两端安装注射器后，重复注射器的活塞运动以粉碎提取的脂肪组织。

根据本发明的一个实施方案，步骤a1)可以包括使提取的脂肪组织来回至少两次通过孔径为2mm至5mm，具体为2mm至4mm或2mm至3mm的第一过滤器的第一粉碎步骤。在第一粉碎步骤中，提取的脂肪组织可以通过使其通过第一过滤器2至7次或2至3次进行粉碎。此外，第一粉碎步骤可以包括去除未通过第一过滤器的残留物。在第一粉碎步骤中去除的残留物可以是脂肪组织中的纤维。纤维可能会干扰使用第二和第三过滤器粉碎脂肪组织，并且还可能抑制组织再生贴片的活性，因此优选将它们去除。

根据本发明的一个实施方案，步骤a1)可以包括使已经通过第一过滤器的脂肪组织来回至少两次通过孔径为400μm至800μm的第二过滤器的第二粉碎步骤。在第二粉碎步骤中，通过第一过滤器粉碎的脂肪组织可以通过使其通过第二过滤器2至7次或2至3次进行粉碎。此外，第二粉碎步骤可以包括去除未通过第二过滤器的残留物。

根据本发明的一个实施方案，步骤a1)可以包括使已经通过第二过滤器粉碎的脂肪组织来回至少两次通过孔径为150μm至250μm的第三过滤器的第三粉碎步骤。在第三粉碎步骤中，通过第二过滤器粉碎的脂肪组织可以通过使其通过第三过滤器2至7次或2至3次进行粉碎。此外，第三粉碎步骤可以包括去除未通过第三过滤器的残留物。

根据本发明的一个实施方案，步骤a1)可以使用如上所述的具有小孔径的过滤器逐步粉碎脂肪组织，大大缩短了精细粉碎脂肪组织的时间，并保持了脂肪组织提取物中细胞的高细胞活性。具体地，当使用步骤a1)时，优点在于尽管通过物理方法对脂肪组织进行了精细粉碎，但仍可以确保大量的脂肪组织和对有效治疗有效的活性细胞和活性蛋白质。此外，当使用步骤a1)时，可以收集处于最佳活性状态的细胞外基质和生长因子，并且还具有能够进行(3D)生物打印的物理特性。

根据本发明的一个实施方案，步骤A)还可以包括步骤a2)将通过第三过滤器微粉化的脂肪组织与生理盐水混合并静置以允许相分离成水相层和有机相层，然后除去水层。由此，可以去除可能会干扰本发明所期望的最终组织再生贴片的活性的被过度微细粉碎且细胞活性差的细胞、脂肪组织、血液、生理盐水等。由此，可以获得包含大量可有效帮助细胞分化的因子的脂肪组织来源的细胞外基质。

根据本发明的一个实施方案，步骤A)还可以包括a3)使通过第三过滤器微粉化的脂肪组织通过孔径为25μm至125μm的第四过滤器，然后去除滤液并收集第四过滤器中收集的残留物。特别地，在通过第四过滤器过滤通过第三过滤器微粉化的脂肪组织后，可以将过滤掉的材料丢弃以获得收集在过滤器中的材料。具体地，步骤a3)可以是将通过步骤a1)微粉化的脂肪组织与生理盐水混合，然后使用第四过滤器过滤以分离和去除待过滤掉的材料，然后将收集在第四过滤器中的材料用作微粉化脂肪组织提取物。待过滤掉并去除的材料可能包括被过度微细粉碎因此具有差的细胞活性的细胞、脂肪组织、血液、生理盐水等。由此，可以获得更高纯度的脂肪组织来源的细胞外基质。

步骤B)：将微粉化脂肪组织提取物注入预定形状的模具中

根据本发明的一个实施方案，预定形状的模具可以具有对应于受损或丢失的组织区域的2D或3D形状。具体地，可以使用便携设备诸如手机摄像头、平板摄像头等获取患者受损或丢失的组织区域的二维数据，然后利用该信息转换成受损或缺失的组织区域的三维图像信息，以制造预定形状的模具。此外，可以使用本领域中通常可用的3D扫描仪设备使用患者体内受损或丢失的组织区域的3D数据来制造预定形状的模具。预定形状的模具可以由具有敞开的上部和下部的侧壁形成。由此，注入模具中的脂肪组织提取物可以被有效地冷却和固化。

基于由此获得的关于患者受损或丢失的组织区域的信息，可以使用3D打印设备制造对应于受损或丢失的组织区域的3D模具。至于3D打印机，可以使用本领域可获得的3D打印机。此外，模具可以使注射(或施用)的脂肪组织保持受影响区域特异性的三维形式(即诸如形状、尺寸、深度等三维形式)，并且一旦制造了组织再生贴片，就可以去除模具。可以使用本领域中通常使用的生物相容性聚合物来形成模具。具体地，可以使用PCL制造模具。由于PCL具有低熔点和高柔韧性，其优点在于它可以容易地与制造的组织再生贴片分离。此外，PCL可以使得能够制造符合受影响区域三维形状的最佳模具，并且使用具有与受影响区域三维形状基本相同的形状的模具制造的组织再生贴片可以有效地粘附到受影响区域以帮助恢复。

根据本发明的一个实施方案，在将脂肪组织提取物注入模具时，除脂肪组织提取物外，还可以注入有助于组织再生的生物活性因子。

步骤C)：在-25℃至-10℃的温度冷却向其中注入了脂肪组织提取物的模具。

根据本发明的一个实施方案，步骤C)可以是将注入模具中的脂肪组织提取物冷却并冷冻以使其固化。

根据本发明的一个实施方案，步骤C)可以在-25℃至-10℃的温度的冷却板上进行。可以将冷却板控制在温度范围内以冷冻注入模具中的脂肪组织提取物。冷冻脂肪组织提取物的温度可以基本上等于冷却板的温度。

根据本发明的一个实施方案，其中注入了脂肪组织提取物的模具可以定位在设置在冷却板上的聚氨酯膜上。具体地，模具具有敞开的顶部和底部，并且注入的脂肪组织提取物可以在与冷却板直接接触的同时固化成组织再生贴片。在这种情况下，冷却板与组织再生贴片可能不会脱落，或者在去除组织再生贴片的过程中可能会损坏组织再生贴片。为了防止这种情况，在冷却板上设置聚氨酯膜，并且将脂肪组织提取物施加在聚氨酯膜上，使组织再生贴片冷却后可以很容易地被去除。即，聚氨酯膜可以用作离型膜。

步骤D)：去除模具以获得组织再生贴片。

根据本发明的一个实施方案，步骤D)可以是将模具与其中脂肪组织提取物通过冷却固化的组织再生贴片分离。如此获得的组织再生贴片固化成适合与受影响区域紧密接触的形式，并且还具有在施用于受影响区域时易于操作的优点。

将如上所述制造的组织再生贴片贴附于受影响区域后，其可以用敷料绷带等固定以恢复受影响区域。

根据本发明的一个实施方案，步骤B)至D)可以在无菌气氛下在配备有冷却板的生物打印机中进行。具体地，模具形成、脂肪组织提取物的注射和冷却可以在生物打印机中进行，该生物打印机被控制为与外部环境隔绝并保持内部空间处于无菌状态。在使用这样的生物打印机的情况下，可以将组织再生贴片的制造过程中诸如杂质流入和感染的问题降到最低限度。

根据本发明的一个实施方案，组织再生贴片的厚度可以为至少1mm。具体地，当组织再生贴片的厚度小于1mm时，组织细胞无法再生，因此可能会延迟受影响区域的恢复或待恢复的组织的表面可能变得不均匀。更具体地，组织再生贴片的厚度可以是1mm至10mm、2mm至7mm或2mm至5mm。

根据本发明的一个实施方案，组织再生贴片可以用于治疗人或动物体内丢失或受损的组织。具体地，组织再生贴片可以用于治疗丢失或受损的皮肤组织，并且可以针对人体或动物。更具体地，组织再生贴片可以用于治疗因糖尿病足病的受损的皮肤组织。此外，组织再生贴片可以用于治疗因烧伤而受损的皮肤组织。皮肤组织的治疗可以包括使丢失的皮肤组织恢复或使受损皮肤组织再生。

在下文中，将给出实施例来详细描述本发明。然而，根据本发明的实施例可以修改为各种其它形式，并且本发明的范围不应被解释为限于以下描述的实施方案。提供本说明书的实施例是为了向本领域普通技术人员更完整地解释本发明。

[实施例1]

使用脂肪抽吸术从Otsuka Long-Evans Tokushima fatty(OLETF)糖尿病模型小鼠中收集脂肪组织，然后放置约5分钟后，通过沉淀与脂肪组织混合的生理盐水和血液以去除沉淀物，从而获得脂肪组织。然后，将包含脂肪组织的注射器和新注射器安装在具有孔径为约2.4mm的不锈钢注射器过滤器(Adnizer,SKT-AN-2400,BSL)的连接器的双向入口处，并且通过利用活塞运动使脂肪组织通过过滤器二至三次来进行粉碎，然后去除未通过过滤器的纤维。其后，依次使用孔径为约500μm的注射器过滤器和孔径为约200μm的注射器过滤器粉碎去除了纤维的脂肪组织，并去除未通过过滤器的残留物。接着，进行两次将粉碎的脂肪组织与生理盐水混合并将混合物静置以去除包括细胞和血液的水层的过程，从而获得微粉化脂肪组织提取物。

去除OLETF糖尿病模型小鼠背部的皮肤组织后，将与去除的皮肤组织形状相匹配的模具放置在3D生物打印机(INVIVO博士,ROKIT Healthcare)中的冷却板上，并使用3D生物打印机将微粉化的脂肪组织提取物注入模具中。将冷却板的温度设置为约-15℃，并将微粉化的脂肪组织提取物冷冻以制备组织再生贴片。

将制造的组织再生贴片贴附于OLETF糖尿病模型小鼠的受影响区域后，施用敷料。图1是依次示出了根据实施方案的组织再生贴片的制造方法和将组织再生贴片施用到受影响区域的照片。

[比较例1]

将实施例1中的OLETF糖尿病模型小鼠背部区域的皮肤组织去除，并且仅施用敷料。

[比较例2]

将实施例1中的OLETF糖尿病模型小鼠背部的皮肤组织去除后，将如实施例1制备的微粉化脂肪组织提取物直接施用到受影响区域并施用敷料。

对于实施例1和比较例1和2中在施用敷料后第3、7和12天的受影响区域尺寸(面积)，使用Image J(美国国立卫生研究院，Rockville，MA)测量，并且图表结果显示在图2中。在图2中，比较例1表示为“仅伤口”，比较例2表示为“脂肪，RT”，实施例1表示为“脂肪，-15℃”。根据图2的结果，与比较例1、2相比，在实施例1的情况下，确认了受影响区域的面积尺寸恢复得更快。具体地，比较例1中恢复的受影响区域的面积的平均值为71.7％，比较例2中恢复的受影响区域的面积的平均值为82.3％，并且实施例1中恢复的受影响区域的面积的平均值为94.6％。在实施例1的情况下，与未进行附加治疗的比较例1相比，受影响区域的恢复提高了约23％，并且与施用简单粉碎的脂肪组织提取物的比较例2相比，受影响区域的恢复提高了约13％。

此外，通过CD31免疫组织化学染色研究了实施例1和比较例1和2的血管生成效果。具体地，在敷料处理后第12天从受影响区域选取血管密度最高的3个部位，在光学显微镜下400倍视野对血管数计数，以获得每个视野的平均值。此时排除具有可容纳6-8个红细胞的较大直径的血管和具有厚肌层的血管。通过将每组视为一个血管来计算单个血管内皮细胞或没有管腔的内皮细胞亚群。

图3示出了实施例1、比较例1和2中恢复的受影响区域中新生血管的结果。在图3中，比较例1表示为“仅伤口”，比较例2表示为“脂肪，RT”，实施例1表示为“脂肪，-15℃”，并且新生血管用箭头表示。此外，图4是图3的结果图。具体地，对于微血管的数量，每400倍光学显微镜视野观察到在比较例1中为平均10(±1)个，在比较例2中为11.6(±2.4)个，并且在实施例1中为30.3(±2.7)个；并且各组间差异是统计学显著的(p<0.05)。根据3和图4，在施用自体脂肪组织提取物的比较例2和实施例1中，与比较例1相比，确认了新生血管的观察良好。此外，在将脂肪组织提取物制成用于受影响区域的组织再生贴片并施用的实施例1的情况下，与直接施用脂肪组织提取物的比较例1相比，确认观察到超多两倍的新生血管，并且皮肤组织的恢复得到很大改善。

[参考例]

以与实施例1相同的方式制造组织再生贴片，但将冷却板的温度设置为-20℃。

图5是使用扫描型电子显微镜观察到的参考例的组织再生贴片的图像。根据图5，在-15℃冷冻的实施例1的情况下，确认脂肪形式与0℃的对照的脂肪形式相似，并且在-20℃冷冻的参考例的情况下确认形式明显不同。实验结果表明，当组织再生贴片中的脂肪变化量相对较小时，受影响区域的恢复力较高，因此确认优选将冷却板的温度设置在-10℃至-20℃的范围内。

Claims (11)

1.一种制造组织再生贴片的方法，包括：

A)制备微粉化脂肪组织提取物；

B)将所述微粉化脂肪组织提取物注入预定形状的模具中；

C)在-25℃至-10℃的温度冷却向其中注入了脂肪组织提取物的所述模具；和

D)去除所述模具以获得组织再生贴片。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤A)包括依次使用a1)孔径为2mm至5mm的第一过滤器、孔径为400μm至800μm的第二过滤器和孔径为150μm至250μm的第三过滤器分阶段粉碎脂肪组织的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中还包括步骤a2)将经所述第三过滤器微粉化的脂肪组织与生理盐水混合并将混合物静置，并且在相分离成水相层和有机相层后，去除所述水相层。

4.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a1)中，通过使所述脂肪组织在每个过滤器中往复运动至少两次来粉碎所述脂肪组织。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织是自体脂肪组织。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定形状的模具具有对应于受损或丢失的组织区域的2D或3D形状。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤C)在-25℃至-10℃的温度的冷却板上进行。

8.根据权利要求7所述的方法，其中将向其中注入了所述脂肪组织提取物的所述模具定位在设置在所述冷却板上的聚氨酯膜上。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤B)至D)在无菌气氛下在配备有冷却板的生物打印机中进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织再生贴片的厚度为至少1mm。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织再生贴片用于治疗受损或丢失的皮肤组织。

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