CN104789520A

CN104789520A - 利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法及获得的组织工程胰岛

Info

Publication number: CN104789520A
Application number: CN201510103112.4A
Authority: CN
Inventors: 陈晓波; 韩俊领; 韩洪起; 洪敬欣; 靳霞; 胡艳华; 张宇光; 王雪莲
Original assignee: XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2015-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2015-07-22

Abstract

本发明公开了一种利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法及获得的组织工程胰岛，此方法采用来源广泛的脂肪间充质干细胞在胰岛脱细胞基质上培养，使脱细胞基质为脂肪间充质干细胞提供适合生长的三维空间，促进细胞黏附、增殖、分化，并形成一个具有三维结构、并能稳定分泌胰岛素的工程胰岛组织，实现了分泌胰岛素细胞的聚集，提高了细胞利用率，有望促进组织工程法修复胰岛损伤的效果。

Description

利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法及获得的组织工程胰岛

技术领域

本发明涉及组织工程胰岛,尤其是一种利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法及获得的组织工程胰岛。

背景技术

Ⅰ型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病，它是一种自体免疫疾病，主要由T淋巴细胞介导的胰岛β细胞选择性破坏，胰岛素分泌不足，血糖浓度调节失衡，导致高血糖的发生。目前口服降糖药物与外源性胰岛素注射是治疗Ⅰ型糖尿病的主要方法，但无法从根本上彻底治愈糖尿病。胰岛移植是彻底治愈糖尿病的有效方式，但一直面临着供体来源不足与免疫排斥两大关键问题。

脂肪间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向分化为胰岛样细胞、软骨细胞等多种细胞。脂肪间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、对供体部位损伤小、无伦理问题等优势，并已有文献证明脂肪间充质干细胞能诱导分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞，为临床治疗糖尿病提供新的技术方案。但采用直接将诱导分化后的胰岛素分泌细胞注射移植到体内的方式，这些胰岛素分泌细胞会随血液循环到身体各个部位，导致利用细胞率较低，不能针对损伤的胰岛组织进行修复，治疗效果不显著。利用脂肪间充质干细胞作为种子细胞通过在脱细胞基质上制备的类胰岛组织的方法，可以提供充足新型供体、降低异基因供体移植的副反应，提高细胞利用率，来有效的治疗Ⅰ型糖尿病。

脱细胞基质是一种天然生物材料，最初的脱细胞真皮基质是作为一种真皮替代物在烧伤外科、神经外科等领域中尝试应用，随着不断地发展，脱细胞基质发展出了自体、异体以及不同来源的多种种类，但是以胰岛组织作为制备脱细胞基质的原料的研究还很少。与此同时，利用脱细胞基质构建工程组织的过程中存在着，种子细胞在液体培养基里与脱细胞基换液培养过程中损耗种子细胞的缺陷，降低了组织构建的成功率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种以脂肪间充质干细胞为种子细胞，利用胰岛脱细胞基质构建类胰岛组织的方法和获得的组织工程胰岛。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法，包括以下步骤：

(1)将脂肪间充质干细胞离心后获得的细胞以脂肪干细胞培养并传代至P3代备用；

(2)无菌条件下取出鼠胰岛组织，以PBS冲洗至清洗液澄清后浸在PBS中反复冻融裂解组织中的细胞，每个冻融循环包括液氮15min、37℃水浴5min共进行5～7个循环；

(3)将步骤(2)冻融裂解后的组织放入低渗裂解液中，4℃、100rpm震荡消化24h后，以5mlPBS冲洗组织5次后放入到2ml核酸消化液中37℃消化组织4h，得到胰岛脱细胞基质，再以PBS冲洗组织6次后放入-80℃冰箱中备用；

(4)将步骤(3)获得的脱细胞胰岛组织剪切成2-3mm³的小块，以PBS清洗后放入低吸附6孔培养板中，并将步骤(1)获得的P3代脂肪间充质干细胞消化后按照0.5-1.5×10⁶/ml的密度重悬于脂肪间充质干细胞培养基中,并将细胞悬液加入到放入脱细胞基质的细胞培养板中培养24-48h，然后每3天进行半量更换胰岛细胞诱导培养基，诱导培养12天。

所述步骤(1)为：外科手术获得废弃的人脂肪组织，以青/链霉素的磷酸缓冲液PBS冲洗，将脂肪组织剪碎至乳糜状，加入等体积含有2000-3000u/ml的I型胶原酶的PBS于37℃、100转/min震荡消化40～50min，然后以PBS清洗2次，弃上清；以脂肪干细胞培养基重悬脂肪间充质干细胞后，接种到T-75细胞培养瓶中，培养24h后吸弃培养基，以10mlPBS清洗1次，加入15ml新鲜培养基继续培养，并传代至P3代。

所述步骤(3)中低渗裂解液含有质量分数0.02％的Tris/EDTA、体积分数0.5％的Triton-X100和0.174ug/ml的PMSF。

所述步骤(3)中核酸消化液为：每毫升PBS中含有60单位的DNase和1单位的RNase。

所述步骤(2)中鼠胰岛组织来源于大鼠或小鼠的胰岛组织。优选，SD大鼠的胰岛组织。

上述的利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法获得的组织工程胰岛。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：(1)脂肪间充质干细胞来源广泛；(2)增加了脂肪间充质干细胞在脱细胞基质的吸附数量；(3)脱细胞基质微脂肪间充质干细胞提供适合生长的三维空间，促进细胞黏附、增殖、分化；(4)将脂肪干细胞与含有脱细胞基质的诱导分化培养基复合培养，可以形成一个具有三维结构、并能稳定分泌胰岛素的工程胰岛组织；(5)实现了分泌胰岛素细胞的聚集，提高了细胞利用率，有望促进组织工程法修复胰岛损伤的效果。

附图说明

图1a是接种24小时后人脂肪间充质干细胞形态学特征显示图。

图1b是接种72小时后人脂肪间充质干细胞形态学特征显示图。

图2a是人脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的特征性标志鉴定图(对照组)。

图2b是人脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的特征性标志鉴定图(诱导组)。

图3是类胰岛组织分泌胰岛素ELISA结果分析图。

图4是组织工程胰岛的胰岛素分泌图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明提供一种利用间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法。该组织工程胰岛具有三维立体结构，并能够高效分泌胰岛素。

本发明中FBS如无特别说明，均是指体积百分数。本说明书中I型胶原酶如无特别说明，均是指质量百分数。本说明书中BSA如无特别说明，均是指质量百分数。本说明书中使用的其他百分数，如无特别说明，则依从本领域惯常使用的含义。

说明书中所述的常规培养液、常规培养条件，是指本领域技术人员能够根据现有技术确定的适合培养所述细胞的培养液和培养条件。

脱细胞基质是近几年发展起来的天然支架材料，因其去除了组织中的抗原性成分，故具有良好的生物相容性，在组织工程中广泛应用，适合临床应用。

组织工程胰岛的制备方法包括以下步骤：

实施例1：

1.脂肪间充质干细胞的体外分离、培养和扩增

1)外科手术(废弃的)获得人脂肪组织称重7.6g，以含有1000u/ml的青/链霉素的磷酸缓冲液(PBS)冲洗至澄清，再将该脂肪组织剪碎至乳糜状，加入等体积含3000u/ml I型胶原酶的PBS、37℃、100转/min震荡消化45min；

2)消化后以PBS清洗2次，离心5min后弃掉上清，以脂肪干细胞培养基重悬细胞后加入到T-75细胞培养瓶中在细胞培养箱中培养，24h后镜下观察已经有大量细胞贴壁生长，吸弃培养基以10mlPBS清洗1次并加入15ml新鲜培养基继续培养；

3)接种72小时后细胞生长至90％左右，以PBS冲洗细胞2次后以胰酶消化液(含有胰酶5g/L/EDTA 2g/L)消化细胞后按照1：3的比例接种到3个T-75细胞培养瓶中，每瓶加入15ml新鲜的脂肪干细胞培养基继续培养；

4)72小时后细胞生长达到90％左右，以PBS冲洗细胞2次后以胰酶消化液(含有胰酶5g/L/EDTA 2g/L)消化细胞后进行计数，3瓶细胞共收获15.4×10⁶个细胞，如图1a、1b所示脂肪间充质干细胞形态学特征显示图。以细胞冻存液(90％FBS，10％DMSO)按照1*10⁶/ml的浓度冻存细胞，每个冻存管3ml。

2.脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞能力：

1)复苏1支脂肪间充质干细胞，将P3代细胞按照0.5-1.5×10⁶/孔的密度接种到低吸附6孔细胞培养板中，预留1个孔作为对照组加入脂肪间充质培养基，其余两空每孔1.5ml胰岛诱导培养基；

2)72h后诱导孔中的细胞开始成团，轻轻吸弃0.8ml培养基并补加0.8ml新鲜的一道诱导培养基(重复3次此操作)；72h后诱导孔中的细胞已经形成大团，在所有3个空中分别按照1：100加入双硫腙染色母液染色20min，小心吸弃液体加入1ml PBS镜下观察，如图2a、2b所示脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团的特征性标志鉴定图。

3.大鼠胰岛组织脱细胞基质的制备：

1)无菌条件下解剖麻醉的大鼠取出胰岛组织3.2g，以大量PBS冲洗(含有1000u/ml庆大霉素)至清洗液澄清；

2)将组织浸在PBS中反复冻融裂解组织中的细胞，每个冻融循环包括液氮15min、37℃水浴5min共进行6个循环；

3)将冻融裂解后的组织放入低渗裂解液中(裂解成份包括：0.02％Tris/EDTA、0.5％的Triton-X100、0.174ug/ml的PMSF)，4℃、100rpm震荡消化24h；

4)以5mlPBS冲洗组织5次后放入到2ml核酸消化液中(每毫升PBS中含有60单位的DNase和1单位的RNase)37℃消化组织4h；以PBS冲洗组织6次后放入-80℃冰箱中备用，如图2a所示脱细胞基质特征图。

4.接种脂肪间充质干细胞至脱细胞基质上并诱导分化成胰岛细胞：

1)将脱细胞后的胰岛组织剪切成2-3mm³的小方块，以PBS清洗后取3-5块放入低吸附6孔培养板中的1.5ml-2ml脂肪间充质干细胞培养基中，按照0.5-1.5×10⁶/ml的密度接种脂肪间充质干细胞，细胞培养箱中培养48h后镜下观察部分细胞已经在脱细胞基质上生长，取出1块基质以0.1ug/ml的吖啶橙染液染色并在荧光显微镜下观察确定细胞已经在基质表面及内部生长；

2)取出所有基质块以PBS清洗2次后平均分成两份，一份加入到新鲜的1.5ml脂肪间充质干细胞培养基中培养；另一份放入1.5ml胰岛诱导培养基中诱导培养；

3)培养过程按照每3天更换0.7ml新鲜培养基诱导12天后，可见组织工程胰岛，如图3所示工程胰岛特征图。通过ELISA方法检测两组培养基中的胰岛素含量，检测方法：a.以胰岛素标准品(1816ug/ml)按照倍比稀释的方法制作(1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1.32000)制作标准曲线，再加上对照组和实验组共计8组每组平行3个孔；b.各取100ul加入96孔板中，8组共计24孔4℃包被过夜；c.弃掉包被液以200ul PBS清洗3次后每孔加入200ul 5％BSA封闭2h；d.弃掉封闭液，以200ul PBS清洗3次后每孔加入200ul的鼠抗人胰岛素抗体(浓度为1ug/ml)室温震荡孵育1h；e.弃掉上清以200ul含有0.05％的Tween-20的PBS清洗5次后每孔加入200ul羊抗鼠Ig-G-HRP抗体(浓度0.1ug/ml)室温震荡孵育1h；f.弃掉上清以200ul含有0.05％的Tween-20的PBS清洗5次后每孔加入A/B底物显色液各50ul后室温震荡孵育30min；g.每孔加入50ul终止液后马上在酶标仪上检测各个孔在450nm和630nm的吸光值；h.数据处理并制作标准曲线并计算出培养基中的胰岛素浓度，经计算标准品在1/2000稀释比例时已经接近上限，所以放弃1/1000的稀释比例组。最终结果：对照组只有本底吸光值；实验组通过计算胰岛素浓度为10.84u/L。如图4所示组织工程胰岛的胰岛素分泌图。这充分证明通过实验获得了具有组织工程胰岛。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法，其特征在于，所述步骤(1)为：外科手术获得废弃的人脂肪组织，以青/链霉素的磷酸缓冲液PBS冲洗，将脂肪组织剪碎至乳糜状，加入等体积含有2000-3000u/ml的I型胶原酶的PBS于37℃、100转/min震荡消化40～50min，然后以PBS清洗2次，弃上清；以脂肪干细胞培养基重悬脂肪间充质干细胞后，接种到T-75细胞培养瓶中，培养24h后吸弃培养基，以10mlPBS清洗1次，加入15ml新鲜培养基继续培养，并传代至P3代。

3.根据权利要求1所述的利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法，其特征在于，所述步骤(3)中低渗裂解液含有质量分数0.02％的Tris/EDTA、体积分数0.5％的Triton-X100和0.174ug/ml的PMSF。

4.根据权利要求1所述的利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法，其特征在于，所述步骤(3)中核酸消化液为：每毫升PBS中含有60单位的DNase和1单位的RNase。

5.根据权利要求1所述的利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法，其特征在于，所述步骤(2)中鼠胰岛组织来源于大鼠或小鼠的胰岛组织。

6.根据权利要求5所述的利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法，其特征在于，所述步骤(2)中鼠胰岛组织来源于SD大鼠的胰岛组织。

7.如权利要求1-6任一项所述的利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法获得的组织工程胰岛。