CN103087992A - 一种用于软骨损伤修复的改良脂肪干细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明通过基因转导技术诱导脂肪干细胞表达骨形态发生蛋白(BMP-4)或转化生长因子(TGF-β3)，这种性能增强的干细胞具有很好的增殖能力和软骨修复能力，是一种很好的用于软骨损伤修复的工具。考虑到BMP-4和TGF-β3对干细胞的调节和营养作用，本发明通过病毒载体转导的方法让干细胞充分的表达这些营养因子，这些改良的脂肪干细胞和软骨细胞共培养在成软骨诱导培养基中向软骨细胞分化的能力比普通的脂肪干细胞高，产生更多的II型胶原，形成的软骨球更大更致密，同时，移植的干细胞在体内存活周期延长，延长了生长因子和营养因子对损伤部位的修复作用，促进软骨的生长和伤口的较快愈合。
Description
技术领域
本发明涉及用基因技术改造干细胞以提高它的性能及分泌蛋白的表达，并且这种改良后的细胞可以应用于软骨损伤的修复。
背景技术
软骨损伤是比较难以治愈的病变，尤其是浅层性的软骨损伤。多种原因可以造成软骨损伤，如外力冲击、自生免疫性疾病如类风湿性关节炎、老龄化导致的机体退化等。软骨的自我修复能力很弱，即使是很小的软骨缺损也很难愈合。因软骨组织内无血液供应，软骨内基质合成活跃度低。但如果伤口深到软骨下骨层，伤口反而有自我愈合的能力，这是因为软骨下骨内的血液渗透出来形成的血块附带有干细胞，其有可能被激活以促进伤口的愈合。在临床治疗中，可通过钻孔至软骨下层导致出血或微骨折的方式来治疗软骨缺损。
干细胞是一类具有自我复制与更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。干细胞独特的性质使其成为再生医学和疾病治疗的研究热点，理论上干细胞疗法可以治疗包括软骨损伤的组织器官损伤疾病。据美国官方的某个临床试验登记网站显示，与软骨修复相关的干细胞治疗临床试验就有上百个。在科研界，针对干细胞应用于软骨损伤的治疗效果也有不少乐观的报道。
脂肪组织中含有一种具有间充质干细胞特性的细胞群体，被称作脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ASC)，这种细胞具有自我更新和分化能力。大量的文献证实了ASCs不仅能分化成间充质细胞如脂肪、软骨、成骨、肌肉，还能分化成神经、血管来源的细胞。过去10年，脂肪干细胞在器官组织损伤的修复应用中逐渐受到重视。自体脂肪干细胞的使用相比其它来源的间充质干细胞有较好的安全性，因其来源于自体组织，不会出现排异反应，是理想的移植物。虽然针对于干细胞用于软骨损伤修复的研究报道较多，但无论是动物试验还是临床研究，其治疗效果差异很大。可能原因是脂肪干细胞的活性差异所致，治疗前的处理方法、来源部位以及伴随干细胞注射的生长因子的不同均会造成脂肪干细胞的活性差异。
很多关于间充质干细胞在组织修复及填充的临床试验表明，干细胞主要通过两种方式发挥作用：1.分化成目标组织的细胞以替代损伤组织；2.分泌各种生长因子来促进受损部位的修复，包括促进附近干细胞的激活和转化，这个作用方式有时候发挥的作用更大。有研究表明，某些生长因子即使单独使用也有促进软骨自我修复的功能。然而一般情况下，大部分干细胞移植到损伤部位后存活的时间只有1-2周，这表明干细胞发挥作用的时间是比较短的。如果在这段时间内组织的损伤没有修复，干细胞的治疗效果就不能达到。针对这种短效作用的特点，目前临床试验上一般采用多次干细胞治疗的方式或同时添加生长因子来提高干细胞的治疗效果。虽然这些生长因子可以通过注射的方式使用，但是它们的半衰期很短，需要一次性注射量很大或需反复注射来达到理想的作用浓度，这给临床治疗造成不便。考虑让细胞作为载体使其长期稳定表达这些生长因子的方式是比较理想的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于软骨损伤修复的改良脂肪干细胞。
为了能满足临床治疗中软骨修复的要求，脂肪干细胞要具备稳定的活性，并能针对性的促进有软骨修复能力的生长因子和营养因子的分泌。基于大量的相关研究，我们选择让细胞表达TGF-β3或BMP4。TGF-β3属于TGF-β家族，不但能诱导脂肪干细胞成软骨分化，还能提高生长速度。临床研究也表明TGF-β3在促进软骨修复过程中有更多的胶原II和蛋白聚糖产生，作为归巢效应的诱导因子，TGF-β3还可以促进邻近的细胞向伤处迁移，同时TGF-β3本身也可以激活损伤部位附近的间充质干细胞。BMP4属于BMP家族蛋白，同时也属于TGF-β多肽家族，它具有促进脂肪干细胞成软骨分化的功能。研究表明，在脂肪干细胞成软骨分化过程中，BMP4具有促进细胞成团并使之具有软骨细胞形态的作用。此外BMP4还可以促进软骨蛋白形成，实现较快的透明状软骨修复。
为实现上述目的，通过病毒载体转导的方式改良脂肪干细胞。
逆转录病毒的制备方法为：1)BMP-4的逆转录病毒载体的构建：人BMP-4的cDNA通过PCR从相应的噬菌体克隆扩增出来，BMP4-1(CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和BMP4-2(TCCATCGATAGATCTATCCTCAAGGACTGCCTG)引物被用来扩增表达BMP4的构架，cDNA克隆到pBluescript II KS后，通过测序cDNA双链的方法来验证克隆序列；2)表达TGF-β3的逆转录病毒载体的构建：将TGF-β3cDNA从plasmid pTGF-β3(GenBank:NM_009368，ATCC，Manassas，VA)中扩出，克隆到pBluescript II KS，通过测序cDNA双链的方法来验证克隆序列；3)这些载体通过共转染到包装细胞GP-293(CLONTECH，California，USA)的方式被转换成复制缺陷型逆转录病毒，pVSVG表达血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒载体的滴度是
的CFUs/ml。
改良后的脂肪干细胞能选择性的表达TGF-β3或BMP-4生长因子。
表达TGF-β3或BMP-4的脂肪干细胞可以单独使用，也可混合使用。
改良后的脂肪干细胞与软骨细胞共同培养，比例是2∶1。
改良的脂肪干细胞和软骨细胞共培养在成软骨诱导培养基中向软骨细胞分化的能力比普通的脂肪干细胞高，产生更多的II型胶原，形成的软骨球更大更致密，同时，移植的干细胞可以在体内存活周期延长达10周，延长了生长因子和营养因子对损伤部位的修复作用，促进软骨的生长和伤口的较快愈合。
附图说明
图1：脂肪干细胞与软骨细胞共培养形成的软骨块，脂肪干细胞和软骨细胞在成软骨诱导培养基中共培养4周后，进行的切片经过阿尔新蓝染色，结果表明转导后的脂肪干细胞促进形成的软骨块更致密光滑。A)，C)：普通脂肪干细胞和软骨细胞共培养形成的软骨快，A)放大培数100X，B)放大倍数400。B)，D)：BMP+TGF-β3脂肪干细胞和软骨细胞共同培养形成的软骨块，C)放大培数100X，D)放大倍数400。
图2：脂肪干细胞在转导后能持续的显著表达BMP-4和TGF-β3，转导后脂肪干细胞的培养基中BMP-4蛋白水平通过Western Blot方法来估计，TGF-β3由相应的ELISA试剂盒检验(R&D System，Inc.，Minneapolis，Minnesota，USA)，一周后，BMP-4的分泌浓度达到每24小时产生120ng/106细胞，之后继续保持这个水平范围。TGF-β3的浓度达到每24小时产生220ng/106细胞。
图3：转导后的脂肪干细胞和软骨细胞共培养产生的II型胶原有显著增加，4周后，通过qPCR的方法来检测II型胶原的mRNA表达，为了便于在不同样本间进行比较，我们采用mRNA相对于GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的相对表达量，在共培养的条件下，II型胶原表达的更多。
图4：转导后的脂肪干细胞和软骨共培养能促进糖胺聚糖(Glycosaminoglycans)的产生，培养基质的切片去石蜡化后用含1，9-氯化二甲基亚甲基蓝(DMMB)的PBE溶液染色，然后用分光光度测定GAG的含量，经过矫正，在软骨数目相同情况下，与转导后的脂肪干细胞共同培养条件下产生的GAG比与普通脂肪干细胞共同培养高出2-3倍，GAG的含量增加表明了基质含量的增强。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容，所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的授权之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1.人脂肪干细胞的分离和培养
1)在软骨取样前10天左右，从患者大腿或腹部提取大约20ml脂肪，进行脂肪间质血管部分细胞分离和培养传代：无菌条件下取脂肪组织，小心去除附着的纤维和血管，用灭菌的PBS充分洗脱以去除杂质和血细胞[1]。I型胶原蛋白酶(1mg/mL)消化(放入37℃震颤水浴槽中60min)，产物通过100μm的尼龙筛过滤去除杂质，470×g离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及上清液，DMEM培养液(DMEM，Invitrogen；含10％胎牛血清、0.2mM抗坏血酸，100μg·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素)重悬细胞，470×g离心5min。去除上清液，重悬沉淀细胞，在37℃、5％CO2培养箱中孵育。24小时后，用显微镜观察，没贴壁的细胞用PBS洗去，培养液换成Keratinocyte-SFM(Invitrogen，含0.2mM抗坏血酸，0.09mM钙，5ng/mLrEGF，and5％FBS)。细胞生长至75％～90％融合时传代，每2～3d更换培养液。
2)脂肪干细胞培养2周后，进行逆转录病毒转导。
2.软骨细胞的分离培养
1)在征得风湿性关节炎患者同意后，活检期间，通过关节镜手术，从非负重区取一块所需量软骨组织，例如膝关节股骨髁间窝。为了得到纯度高的软骨细胞，没有其它类型细胞的污染，在距离滑膜5mm远的地方取一小块软骨，重100mg左右，大约米粒大小。
2)用精细剪刀将其剪成1mm3的小块，用PBS冲洗后置于II型胶原酶(0.15％)中，370C条件下消化20-22小时。用软骨细胞增殖培养基配置胶原酶溶液。该培养基成分是Dulbecco’s ModifiedEagle Medium(DMEM)，并添加10％FBS，1％非必需氨基酸，0.2mM抗坏血酸-2-磷酸(AsAP)，0.4mM脯氨酸，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素。
3)将软骨细胞收集起来，计数，不需要进行平板细胞培养，直接混合准备好的脂肪干细胞共同培养。
3.逆转录病毒制备
1)BMP-4的逆转录病毒载体的构建：人BMP-4的cDNA通过PCR从相应的噬菌体克隆扩增出来，BMP4-1(CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和BMP4-2(TCCATCGATAGATCTATCCTCAAGGACTGCCTG)引物被用来扩增表达BMP4的构架。cDNA克隆到pBluescript II KS后，通过测序cDNA双链的方法来验证克隆序列。
2)表达TGF-β3的逆转录病毒载体的构建：将TGF-β3cDNA从plasmid pTGF-β3(GenBank：NM_009368，ATCC，Manassas，VA)中扩出，克隆到pBluescript II KS，通过测序cDNA双链的方法来验证克隆序列。
3)这些载体通过共转染到包装细胞GP-293(CLONTECH，California，USA)的方式被转换成复制缺陷型逆转录病毒。pVSVG表达血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒载体的滴度，估计是
的CFUs/ml。
4.逆转录病毒转导脂肪干细胞
1)将脂肪干细胞接种于10cm细胞培养皿，5X106cell/皿(总共10ml完全培养基)，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％-80％时即可用于转导。
2)这些细胞分别用逆转录病毒转导。在MOI为5，聚凝胺(polybrene)为8微克/毫升。2周培养后使用。
5.转导后的脂肪干细胞和软骨细胞共培养
将软骨细胞和未感染或感染后的脂肪干细胞进行共同培养，以观察干细胞性能的增强对软骨形成的影响。表达BMP-4和TGF-β3的脂肪干细胞以1∶1比例混合。在共培养体系中，脂肪干细胞和软骨细胞的比例是2∶1。将细胞混合后，500g离心5分钟，形成一个扁平的块状物。在成软骨诱导培养基中进行培养。在相应的时间段取样进行分析。
Claims (6)
1.一种用于软骨损伤修复的改良脂肪干细胞，其特征在于，通过病毒载体转导的方式改良脂肪干细胞。
2.根据权利要求1所述的病毒载体转导方式，其逆转录病毒制备方法为：
1)BMP-4的逆转录病毒载体的构建：人BMP-4的cDNA通过PCR从相应的噬菌体克隆扩增出来，BMP4-1(CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和BMP4-2(TCCATCGATAGATCTATCCTCAAGGACTGCCTG)引物被用来扩增表达BMP4的构架，cDNA克隆到pBluescript II KS后，通过测序cDNA双链的方法来验证克隆序列；
2)表达TGF-β3的逆转录病毒载体的构建：将TGF-β3 cDNA从plasmid pTGF-β3(GenBank:NM_009368，ATCC，Manassas，VA)中扩出，克隆到pBluescript II KS，通过测序cDNA双链的方法来验证克隆序列；
3)这些载体通过共转染到包装细胞GP-293(CLONTECH，California，USA)的方式被转换成复制缺陷型逆转录病毒，pVSVG表达血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒载体的滴度是
的CFUs/ml。
3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞，其特征在于，改良后的脂肪干细胞能选择性的表达TGF-β3或BMP-4生长因子。
4.根据权利要求3所述的脂肪干细胞，其特征在于，表达TGF-4或BMP-7的脂肪干细胞可以单独使用，也可混合使用。
5.根据权利要求1所述的脂肪干细胞，其特征在于，改良后的脂肪干细胞与软骨细胞共同培养，比例是2∶1。
6.根据权利要求4或5所述的脂肪干细胞，其特征在于，改良的脂肪干细胞和软骨细胞共培养在成软骨诱导培养基中向软骨细胞分化的能力比普通的脂肪干细胞高，产生更多的II型胶原，形成的软骨球更大更致密，同时，移植的干细胞可以在体内存活周期延长达10周，延长了生长因子和营养因子对损伤部位的修复作用，促进软骨的生长和伤口的较快愈合。
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