CN110747165A - 一种间充质干细胞无支架三维凝胶的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脂肪干细胞无支架三维凝胶培养体系的培养方法，包含如下步骤：将脂肪间充质干细胞接种于培养皿中，在含抗坏血酸‑2‑磷酸盐（ASC2P）凝胶诱导培养基中进行诱导培养，脂肪间充质干细胞在诱导培养基的作用下分泌胶原，完成细胞间的相互胶连，形成具有一定立体结构的水凝胶状态的脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶。该方法采用自体脂肪作为干细胞的来源，且不添加外来组织构架脂肪干细胞无支架三维凝胶，呈水凝胶状态，能够适应不同形状的软骨损伤，无排异反应，更有利于软骨的再生修复。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞和再生医学领域,具体涉及一种间充质干细胞无支架三维凝胶培养体系的制备方法及应用。
背景技术
间充质干细胞是存在于体内多种组织中的一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。由于具有容易分离扩增、自我更新、多向分化和低免疫原性等特性，而成为了目前组织工程和再生医学中理想的种子细胞，为一些传统药物治疗困难的疾病带来新希望。间充质干细胞在治疗关节炎中获得了良好的效果，不同间充质干细胞的选择与应用受到其来源、体外增殖等因素的限制。
2001 年，Zuk 等从抽脂术废弃的脂肪组织中，分离出脂肪间充质干细胞(adiposemesenchymal stem cells, ADMSCs)。实验研究发现，ADMSCs 在体外培养条件下与BMMSCs具有相类似的生物学特性，但脂肪较骨髓来源更充足，取材方便，对人体造成的创伤也较小，可反复取材，容易分离，获取细胞量大。脂肪组织中所含干细胞的数量不会随着患者年龄的增加而减少，具有强大的自我繁殖、多向分化、跨系或跨胚层发育的可塑性，在体外长期培养的过程中始终保持其多向分化潜能、遗传背景相当稳定、自体体内植入后少有免疫排斥等优势。间充质干细胞从众多种子细胞中脱颖而出，被认为是一种非常理想的组织工程种子细胞，近年来已成为组织工程种子细胞的热点研究对象。
使用间充质干细胞治疗关节炎已有大量的文献和临床支持，获得良好的疗效。在关节炎初期，关节软骨损伤较轻，注射MSCs 可能会通关调节关节腔内免疫环境、表达相关蛋白酶、合成新的软骨，缓解或抑制病情进展。然而，在关节炎病程晚期，软骨损伤较重的情况下，往往需要进行含有支架成分的脂肪干细胞三维结构或人造软骨移植进行关节软骨的补充和修复，而在软骨移植过程中需要将其缝合到原有软骨上，对软骨造成二次损伤，这种损伤并不能够愈合。
发明内容
为了克服现有技术中缺乏适用于培养和定向分化间充质干细胞的三维培养体系的问题，本发明提供了一种间充质干细胞无支架三维凝胶培养方法。该方法采用间充质干细胞，且不添加外来组织骨架，形成的间充质干细胞无支架三维凝胶，呈水凝胶状态，能够适应不同形状的软骨损伤，无排异反应，更有利于软骨的再生修复。此间充质干细胞无支架三维凝胶采用两种植入方式，一种是结合关节镜将间充质干细胞无支架三维凝胶覆盖到损伤软骨表面，另一种是将三维凝胶剪碎到1mm3大小的组织块，直接注射到关节腔。前者准确定位；后者创伤小，无需创伤性手术。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
本发明提供一种间充质干细胞无支架三维凝胶培养体系的培养方法，采用如下步骤：
将间充质干细胞接种于培养皿中，在凝胶诱导培养基中进行诱导培养，间充质干细胞在诱导培养基的作用下分泌胶原，完成细胞间的相互胶连，形成具有一定立体结构的水凝胶状态的间充质干细胞无支架三维凝胶；其中凝胶诱导培养基为达优MSCBM培养基与5%ultroGRO血清替代品，其中添加L-抗坏血酸-2-磷酸盐（ASC2P）。
进一步的，添加物L-抗坏血酸-2-磷酸盐浓度范围150-250µM。
进一步的，无支架三维凝胶的培养条件为5% CO2培养箱、37℃，培养时间为7-14天。
进一步的，间充质干细胞为原代或传代的细胞，细胞代次控制在P5代以内。
进一步的，干细胞铺板密度为3-5×105个细胞每cm2 底面积，6cm皿的底面积为21cm2，共接种6.3-10.5×106个细胞。
进一步的，间充质干细胞的来源为脂肪、骨髓、脐带或脐血。
有益效果
1、本发明间充质干细胞无支架三维凝胶可以采用自体骨髓、脂肪来源，自体来源无排异，脂肪组织采集痛苦小；也可以采用免疫原性低的脐带、脐血来源的间充质干细胞；
2、细胞分泌胶原成分自发胶连成凝胶状态，无外源支架，使间充质干细胞形成具有一定立体结构的水样凝胶状态，应用时无对外源支架的免疫排异；
3、本发明制备的无支架三维凝胶在治疗应有中有以下优势：水凝胶样三维结构能够适应不同形态损伤部位，实现关节腔移植与损伤部位的贴合；由于其无支架结构也可以剪碎后注射，实现对较小损伤部位的修复。本发明的无支架水样三维凝胶应用方法灵活，可根据不同患者的情况灵活选择治疗方法，提高治疗效率。
附图说明
图1为培养7天的水凝胶样脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶形态；
图2为培养14天的质地致密紧实的脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶形态；
图3为水凝胶样三维凝胶治疗猪关节软骨损伤，水凝胶样脂肪间充质无支架凝胶完美贴合在受损部位；
图4为猪受损软骨组织经过脂肪间充质干细胞凝胶8个月治疗后软骨组织修复情况及HE染色结果。
具体实施方式
为了进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点和精神，通过下面的实施例和对比例对本发明的上述内容在作进一步的详细说明。但是，不应该将此理解为本发明上述主体范围仅仅局限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例 1
脂肪间充质干细胞的分离传代及无支架三维凝胶诱导，实验操作具体描述如下：
1、脂肪间充质干细胞细胞分离传代培养：固体脂肪将脂肪上面的筋膜、皮肤、血管等组织剔除，并将脂肪块清洗干净，用剪刀将其剪碎。之后将剪碎的脂肪或者抽脂手术的液体脂肪转移至250mL离心管中，向其中加入适量盐水，用吸管吹打10-20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出，如此反复2-3次，直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止。向含有脂肪组织的离心管中以体积比1:1的比例加入浓度为0.1%的I型胶原酶/PBS消化液中；将离心管密封置于37℃恒温摇床中，以90rpm振荡消化60min；用移液管吸出离心管中的下层液体，通过100µm滤网过滤到一个新的50mL离心管中，离心收集基质细胞。以3×106个细胞/mL的密度接种在含5%ultroGRO无血清添加剂的MSCBM培养基中，将培养瓶放入37℃ 5%CO2培养箱中；培养最初3-4d，保持培养瓶物理静止。第4天后观察细胞贴壁情况对细胞进行换液，以后每周两次。待细胞生长至约80%汇合时进行细胞传代培养。
2、脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶诱导培养：获得P5代以内的脂肪间充质干细胞，调整间充质干细胞铺板密度为4×105/cm2 ，6cm培养皿的底面积为21 cm2，共8.2×106个细胞，接种于6cm培养皿中。添加含5%ultroGRO血清替代品、200uM ASC2P的达优MSCBM培养基的凝胶诱导培养基，于37℃、5% CO2培养箱，培养7天获得水凝胶养无支架三维凝胶，培养14天获得质地致密紧实的无支架三维凝胶。
实施例2
脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶治疗软骨损伤，实验操作具体描述如下
1、动物模型制备：肌肉注射30mg盐酸开他敏和6mg甲苯噻嗪混合液每千克体重麻醉实验猪。常规剃毛、消毒、铺无菌巾。裸露股骨内侧髁处软骨，在上侧软骨处打眼直径 5mm 深度 2mm。
2、实验分组：9只实验猪左腿股骨为空白对照，缺损后不进行治疗；在右腿股骨缺损后进行干细胞凝胶移植。
3、治疗：将脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶移植到损伤软骨处，凝胶具有一定粘附能力，且其水样性状能够自动填满整个缺损处并固定在缺损处；将关节复位，固定猪后肢制动 7 天，之后正常豢养。
4、结果观察：于术后6个月取实验猪的软骨部分，HE染色可见9只实验猪的左腿对照组软骨损伤均较深，右腿经过脂肪干凝胶治疗均恢复良好。
以其中一只动物为例进行HE染色结果描述。图4.A为软骨修复情况，可见a1对照组软骨损伤较深，a2经过脂肪干凝胶治疗有一定程度恢复。B为缺损部位HE染色，脂肪干凝胶治疗组修复程度是缺损深度的50%。C.表层位置两组表面都有一层很薄的纤维肉芽组织，平行交错排列胶原纤维束呈嗜酸性，被染成红色。D.凝胶组(d2)，中层位置，由纤维肉芽组织逐渐变为透明软骨，沿箭头方向，细胞由少变多，由小变大，说明软骨细胞由幼稚转变为成熟，属于外加生长，或软骨膜下生长。对照组(d1)，中层位置少量纤维束，多为类骨质，其间仍可见残存肉芽组织中的大量血管。E.最深层，对照组e1含有大量纤维的类骨质，未见软骨囊，未见透明软骨；凝胶组e2软骨囊呈强嗜碱性，深蓝色软骨囊里面有软骨细胞，这里的软骨细胞分裂增殖属于间质生长。
Claims (7)
1.一种间充质干细胞无支架三维凝胶培养体系的培养方法，其特征在于，采用如下步骤：将间充质干细胞接种于含有凝胶诱导培养基的培养皿中培养形成间充质干细胞无支架三维凝胶；其中凝胶诱导培养基为MSCBM培养基，添加血清替代品与 L-抗坏血酸-2-磷酸盐。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述血清替代品的添加量为培养体系总体积的5%；所述L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为150-250µM。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述将脂肪间充质干细胞接种于含有凝胶诱导培养基的培养皿中培养的培养条件为37℃、5% CO2培养箱，培养时间为7-14天。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源为脂肪、脐带、脐血或骨髓，所述间充质干细胞为原代或传代的细胞；细胞代次为P5代以内。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述干细胞铺板密度为4×105个细胞内cm2 底面积，6cm皿的底面积为21 cm2，共接种8.2×106个细胞。
6.一种权利要求1-5任一项所述培养方法制备的间充质干细胞无支架三维凝胶。
7.一种权利要求6所述的将间充质干细胞无支架三维凝胶植入方法，其特征在于，将所述无支架三维凝胶覆盖到缺损软骨表面，或将无支架三维凝胶注射到关节腔内。
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Cited By (2)
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