CN111394306A - 一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法 - Google Patents

一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于干细胞培养技术领域，公开了一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法。该方法包括如下步骤：向MSCBM‑NP培养基中加入添加剂EliteGroTM‑Advanced，配制得到完全培养基；添加剂EliteGroTM‑Advanced与MSCBM‑NP培养基的体积比为(1.5～2.5)：100；采用完全培养基将脐带间充质干细胞冲悬，得到细胞悬液；调整细胞悬液中的细胞密度，将细胞悬液接种于细胞培养设备中；将细胞培养设备置于培养箱中培养进行扩增培养。本发明的培养方法能够增加脐带间充质干细胞的细胞增殖速率；在细胞未在孔内长满的前提下，随着培养时间的延长，增殖速率并不会随之下降。

Description

一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的间充质干细胞，其来源于人脐带华通氏胶组织。由于脐带间充质干细胞及其分泌的细胞因子具有抑制炎症的作用，且在特定条件下能分化成多种成体细胞，所以可以应用于临床中急性损伤、慢性炎症、退行性疾病及受损组织的再生修复，用途广泛且用量较大，临床使用对该细胞的大量扩增有迫切需求。
由于脐带间充质干细胞体外扩增速率的限制，进而限制了大规模市场化应用的可行性。找到可以更快、更多扩增脐带间充质干细胞，且同时能保持脐带间充质干细胞的细胞形态和功能，并能符合临床应用条件的培养方法是当前研究的热点。
发明内容
有鉴于此，为了解决目前的脐带间充质干细胞的体外培养方法无法实现更快的培养细胞的问题，本发明提供一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法。
本发明采用如下方案实现：
一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，该方法包括如下步骤：
S1、向MSCBM-NP培养基中加入MSC无血清添加剂EliteGroTM-Advanced，配制得到完全培养基；
所述添加剂EliteGroTM-Advanced与所述MSCBM-NP培养基的体积比为(1.5～2.5)：100；
S2、采用所述S1的完全培养基将脐带间充质干细胞冲悬，得到细胞悬液；
S3、调整所述细胞悬液中的细胞密度，将所述细胞悬液接种于细胞培养设备中；
S4、将所述S3的细胞培养设备置于培养箱中进行脐带间充质干细胞的扩增培养。
其中MSCBM-NP培养基是无酚红MSC基础培养基。
优选的，在所述S1中，所述添加剂EliteGroTM-Advanced与所述MSCBM-NP培养基的体积比为2：100。
优选的，在所述S2中，采用的脐带间充质干细胞为P1代～P6代的脐带间充质干细胞。即说明在具体实验过程中，采用的脐带间充质干细胞可以为P1代的脐带间充质干细胞，也可以为P6代的脐带间充质干细胞，也可以为P2代、P3代、P4代或P5代的脐带间充质干细胞。
优选的，在所述S3中，所述细胞悬液中的细胞密度为1×106～5×106个/mL。
优选的，在所述S3中，所述细胞培养设备为细胞培养板或细胞培养瓶，接种于所述细胞培养板或细胞培养瓶中的细胞密度为0.6×104～1.2×104个/cm2。即说明在具体实验过程中，细胞密度可以为0.6×104；可以为1.2×104个/cm2；还可以为0.9×104个/cm2。
优选的，在所述S4中，所述培养箱为CO2培养箱，培养温度为35℃～38℃，CO2的体积百分浓度为4.5％～5.5％。即说明培养温度可以为35℃；可以为38℃；也可以为36℃；而CO2的体积百分浓度可以为4.5％；可以为5.5％；还可以为5％，另外CO2的体积百分浓度为CO2的体积与培养箱内所有气体总体积的比值。
优选的，培养温度为37℃，CO2的体积百分浓度为5％。
优选的，所述MSCBM-NP培养基购买于Dakewe公司，货号为6114021。
优选的，所述EliteGroTM-Advanced购买于Elite Cell公司，货号为EPA-050。
与现有技术相比，采用上述方案本发明的有益效果为：
本发明的培养方法能够增加脐带间充质干细胞的细胞增殖速率，且在细胞未在孔内长满的前提下，随着培养时间的延长，脐带间充质干细胞的细胞增殖速率并不会随之下降；同时采用本发明方法培养得到的脐带间充质干细胞保持了脐带间充质干细胞的形态，未出现细胞形态发生改变的情况。
附图说明
图1是本发明实施例1-实施例3在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天进行CCK-8细胞活性检测时的吸光柱形图，其中纵坐标为在450nm处的吸光值，横坐标为天数。每一天的柱形图中，从左向右依次代表实施例1、实施例2和实施例3的检测结果；
图2是本发明的实施例3和对照组在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天进行CCK-8细胞活性检测时的吸光柱形图，其中纵坐标为在450nm处的吸光值，横坐标为天数。每一天的柱形图中，从左向右依次代表实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7和对比例8的检测结果；
图3是实施例3培养第6天得到的P6代的脐带间充质干细胞的生长形态图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，该方法包括如下步骤：
S1、向MSCBM-NP培养基中加入MSC无血清添加剂EliteGroTM-Advanced，配制得到完全培养基；
添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为1.5：100；
MSCBM-NP培养基购买于达科为Dakewe公司，货号为6114021。
EliteGroTM-Advanced购买于Elite Cell公司，货号为EPA-050。
S2、采用S1的完全培养基将P1代的脐带间充质干细胞冲悬，得到细胞悬液；
S3、调整细胞悬液中的细胞密度至约1×106个/mL，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中；接种于96孔细胞板上的细胞密度为0.9×104个/cm2；
细胞贴壁4小时后，96孔板中每孔对应更换完全培养基0.1mL。
S4、将S3的96孔细胞培养板置于CO2培养箱中进行脐带间充质干细胞的扩增培养，培养温度为35℃，CO2的体积百分浓度为4.5％。
实施例2
本实施例提供一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，该方法包括如下步骤：
S1、向MSCBM-NP培养基中加入MSC无血清添加剂EliteGroTM-Advanced，配制得到完全培养基；
添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为2.5：100；
MSCBM-NP培养基购买于达科为Dakewe公司，货号为6114021。
EliteGroTM-Advanced购买于Elite Cell公司，货号为EPA-050。
S2、采用S1的完全培养基将P3代的脐带间充质干细胞冲悬，得到细胞悬液；
S3、调整细胞悬液中的细胞密度至约5×106个/mL，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中；接种于96孔细胞板上的细胞密度为0.9×104个/cm2；
细胞贴壁4小时后，96孔板中每孔对应更换完全培养基0.1mL。
S4、将S3的细96孔细胞培养板置于CO2培养箱中进行脐带间充质干细胞的扩增培养，培养温度为38℃，CO2的体积百分浓度为5.5％。
实施例3
本实施例提供一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，该方法包括如下步骤：
S1、向MSCBM-NP培养基中加入MSC无血清添加剂EliteGroTM-Advanced，配制得到完全培养基；
添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为2：100；
MSCBM-NP培养基购买于达科为Dakewe公司，货号为6114021。
EliteGroTM-Advanced购买于Elite Cell公司，货号为EPA-050。
S2、采用S1的完全培养基将P6代的脐带间充质干细胞冲悬，得到细胞悬液；
S3、调整细胞悬液中的细胞密度至约3×106个/mL，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中；接种于96孔细胞板上的细胞密度为0.9×104个/cm2；
细胞贴壁4小时后，96孔板中每孔对应更换完全培养基0.1mL。
S4、将S3的96孔细胞培养板设备置于CO2培养箱中进行脐带间充质干细胞的扩增培养，培养温度为37℃，CO2的体积百分浓度为5％。
对比例1
对比例1的培养方法与实施例3的不同点仅仅是，对比例1采用的完全培养基中没有添加EliteGroTM-Advanced；
对比例2
对比例2的培养方法与实施例3的不同点仅仅是，对比例2的完全培养基中，添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为1：100；
对比例3
对比例3的培养方法与实施例3的不同点仅仅是，对比例3的完全培养基中，添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为3：100；
对比例4
对比例4的培养方法与实施例3的不同点仅仅是，对比例4的完全培养基中，添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为5：100；
对比例5
对比例5的培养方法与实施例3的不同点仅仅是，对比例5的完全培养基中，添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为8：100；
对比例6
对比例6的培养方法与实施例3的不同点仅仅是，对比例6的完全培养基中，添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为10：100；
对比例7
对比例7的培养方法与实施例3的不同点仅仅是，对比例7的完全培养基中，添加剂EliteGroTM-Advanced与MSCBM-NP培养基的体积比为20：100；
对比例8
对比例8的培养方法与实施例3的不同点是，对比例8采用如下的传统的完全培养基，标记为Lonza；
向Ultraculture培养基中加入血清替代品UltroserTM G，配制得到传统的完全培养基，标记为Lonza；
UltroserTM G与Ultraculture培养基的体积比为2：100；
Ultraculture培养基商购于Lonza公司，货号为12-725F。
UltroserTM G商购于pall公司，货号为15950-017。
实验过程：
实验组：包括实施例1、实施例2和实施例3；
对照组：包括对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7和对比例8。
为了保证实验结果的准确性，所以实验组和对照组中每组各3个复孔；
接种后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天分别进行CCK-8细胞活性检测并记录结果。通过计算应加入细胞量，在每孔中加入相应的细胞悬液。通过酶标仪检测波长为450nm的吸光值，并统计不同复孔的结果，从而绘制细胞增殖活性图，如图1和图2所示。
CCK-8检测的450nm处的吸光值越大，则说明细胞活性越强，细胞增殖数量越多，相同时间内的细胞增殖速率也就越大。从图1的结果可以看出，在细胞还未在孔内长满的前提下，实验组的脐带间充质干细胞在第1天到第4天，细胞增殖速率逐渐增加，而从第4天到第6天，细胞增殖速率趋于平稳。
另外，从图3可以看出，采用实施例3的培养方法，第6天培养得到的P6代的脐带间充质干细胞的形态没有发生改变，即保持了脐带间充质干细胞的细胞形态。
从图2的结果可以看出，在第1天时，除了对比例7的细胞增殖速率明显低于其他各组外，实施例3与其他各组对比例的细胞增殖速率差距不大。
在细胞还未在孔内长满的前提下，从第2天到第4天，实施例3的细胞增殖速率显著的增加，且实施例3的细胞增殖速率明显高于对比例1-对比例8，甚至是对比例8的2倍。
在细胞还未在孔内长满的前提下，从第4天到第6天，实施例3的细胞增殖速率趋于平稳，而其他对比例的细胞增殖速率却趋于下降。
综上所述，实施例的培养方法能够增加脐带间充质干细胞的细胞增殖速率，且在细胞未在孔内长满的前提下，随着培养时间的延长，脐带间充质干细胞的细胞增殖速率并不会随之下降；同时采用实施例的方法培养得到的脐带间充质干细胞保持了脐带间充质干细胞的形态，未出现细胞形态发生改变的情况。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、向MSCBM-NP培养基中加入MSC无血清添加剂EliteGroTM-Advanced，配制得到完全培养基；
所述添加剂EliteGroTM-Advanced与所述MSCBM-NP培养基的体积比为(1.5～2.5)：100；
S2、采用所述S1的完全培养基将脐带间充质干细胞冲悬，得到细胞悬液；
S3、调整所述细胞悬液中的细胞密度，将所述细胞悬液接种于细胞培养设备中；
S4、将所述S3的细胞培养设备置于培养箱中进行脐带间充质干细胞的扩增培养。
2.如权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，在所述S1中，所述添加剂EliteGroTM-Advanced与所述MSCBM-NP培养基的体积比为2：100。
3.如权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，在所述S2中，采用的脐带间充质干细胞为P1代～P6代的脐带间充质干细胞。
4.如权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，在所述S3中，所述细胞悬液中的细胞密度为1×106～5×106个/mL。
5.如权利要求4所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，在所述S3中，所述细胞培养设备为细胞培养板或细胞培养瓶，接种于所述细胞培养板或细胞培养瓶中的细胞密度为0.6×104～1.2×104个/cm2。
6.如权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，在所述S4中，所述培养箱为CO2培养箱，培养温度为35℃～38℃，CO2的体积百分浓度为4.5％～5.5％。
7.如权利要求6所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，培养温度为37℃，CO2的体积百分浓度为5％。
8.如权利要求1-7任一项所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，所述MSCBM-NP培养基购买于Dakewe公司，货号为6114021。
9.如权利要求1-7任一项所述的提高脐带间充质干细胞的体外扩增速率的培养方法，其特征在于，所述EliteGroTM-Advanced购买于Elite Cell公司，货号为EPA-050。
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