JPH03254679A - 新規細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は無血清無蛋白培地で培養できる新規チャイニー
ズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞〉のセルライン、
無血清無蛋白培地に２ヶ列以上増殖継代できかつグルタ
ミン非要求性を有する新規ＣＨＯ細胞に関する。

本発明で得られる細胞は有用蛋白質をコードする遺伝子
を導入する宿主細胞として利用できる。

従来の技術 動物細胞の大量培養はウィルス、ワクチンの製造さらに
は白血球やハイブリドーマからインターフェロンやモノ
クローナル抗体を生産するために利用されている。また
、近年では遺伝子組換え技術の進展に伴い、生体中に存
在する生理活性物質の天然型として蛋白質を生産できる
ことから、動物細胞を宿主とした有用蛋白質の生産が注
目され、大量培養技術の重要性が再認識されてきている
。

動物細胞の大量培養による有用物質生産の問題点の一つ
として、動物細胞の生育には基礎培地に血清を添加しな
ければならないことがあげられる。

血清は高価であるばかりか、多種多様な蛋白質を含むた
め、目的蛋白質の精魁を複雑にする。またロフト毎に品
質が異なり、細胞増殖への影響も大きい。そこで無血清
培地さらには無蛋白培地において増殖可能な細胞の開発
が望まれている。

無血清培地を用いる方法としては、インスリン、トラン
スフェリン、セレンを含有する無血清培地テＣ）（Ｏｉ
ｉｌ胞を培養する方法〔イン　ビ）ｏ　　セルラー　ア
ンド　デベロップメンタルバイオロジ（ｉｎ　　ｖｉｔ
ｒｏ　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　＆　　口ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ＞　　、２１巻、１０号
、５８８頁、１９８５年〕、インスリン、ハイドロコー
チシン、トランスフェリン、上皮細胞成長因子、Ｉ！維
芽細胞成長因子を含有する無血清培地でＨｅ１ａ細胞を
培養する方法〔プロシーディングオブ　ザ　ナショナル
　アカテ゛ミー　オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　［Ｊ、Ｓ、＾１．７
５巻、２号、９０１頁、１９７８年〕、インスリン、ト
ランスフェリン、線維芽細胞成長因子、フィブロネクチ
ン、オレイン酸を含有する無血清培地でＢＨＫ細胞を培
養する方法〔ジャーナル　オブ　セルラーフィジオロジ
ー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　［：ｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｙ）１１４巻、２１５頁、１９８３年つ
が知られている。また無血清培地で生育可能な細胞とし
ては、モノクローナル抗体生産マウスバイブリド−７（
特開昭５８６３３８５号）、インターフェロン生産ヒト
バーキット腫瘍由来ナマルバ細胞の馴化細胞（特開昭６
０６１９０）　、蛋白成長因子としてインスリンのみを
添加した培地で生育するＣＨＯ細胞の馴化細胞（特開昭
６３−１９２３８１）などが知られている。

成長因子の組合せにより種々の細胞の無血清培養が可能
となってきたが、成長因子の中には高価なものもある。

また大量培養による医薬品型造の観点から、成長因子の
中にｒｔｌ！でも異種蛋白が混入していることは好まし
くなく、使用する成長因子は非常に高純度であることが
要求される。

そこで無血清培地で増殖できかつ、無蛋白培地で増殖可
能な細胞が求められている。既に報告されている無血清
馴化細胞を無蛋白培地で培養することは困難で、細胞の
増殖が停止したり細胞生存率が著しく低下したりするた
め、物質の生産効率が良くない。

無蛋白培地で増殖する細胞株としては勝田らによって馴
化された種々の２３株〔メソッズ　インセル　バイオロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）、６巻、１９７３年〕がある。しかしいずれもＣＨ
Ｏ細胞ではなく、しかもグルタミン要求性株である。

さらに、これらの細胞を培養する際には、培地成分の少
なくとも一つの成分の滅菌にフィルターを用いており、
微生物やウィルスなどの混入を厳密には否定しきれない
。これらの微生物やウィルスなどの混入を防ぐためには
、滅菌手段として加熱蒸煮滅菌を用いることが必要であ
るが、蛋白性成分あるいは栄養源のグルタミンなどが含
まれていると加熱蒸煮滅菌によって熱変性や分解をおこ
してしまうので加熱蒸煮処理を施すことはできない。グ
ルタミン非要求性細胞としては、無蛋白かつグルタミン
不含培地中で増殖する正常ラット肝細胞由来細胞〔トッ
キヨー・ジャーナル・メディカル・サイエンス（Ｄｏｋ
ｋｙｏ　Ｊ、　Ｍｅｄ、　５ｃｉ）、９巻、９７−１０
５頁、１９８２年〕、蛋白質としてインスリン、トラン
スフェリンを必要とするがグルタミン不合培地で増殖す
るナマルバ細胞〔サイトテクノロジー　（Ｃｙ、ｔｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１巻、１５１−１５８頁、１９
８８年〕、血清存在下でグルタミン非要求性にしたＢＨ
Ｋ２１細胞アフリカミドリザルの細胞〔モーデン・アブ
ローチス・トウー・アニマル・セル・テクノロジー　（
Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐ、ｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ａｎｉ
ｍａｌ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）］完全蒸煮
滅菌培地（無蛋白、無グルタミン培地）中で生育するに
５６２に、細胞〔第５回次世代産業基盤技術シンポジウ
ム予稿集、１２９−１４１頁、１９８７年〕が知られて
いる。

しかし、ＣＨＯ細胞の亜株で、無血清無蛋白培地に生育
し、さらにグルタミン不含培地でも生育できるという報
告は知られていない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、無血清無蛋白培地で２ヶ列以上増殖継
代できる新規ＣＨＯ’細吻のセルライン、無血清無蛋白
培地に２ケ月辺上増殖継代できかつグルタミン非要求性
を有する新規ＣＨＯ細胞を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明によれば、無血清無蛋白培地で２ヶ列以上増殖継
代できる新規ＣＨＯ細胞のセルライン、無血清無蛋白培
地に２ヶ列以上増殖継代できかつグルタミン非要求性を
有する新規ＣＨＯＩｌｆｌ胞を提供することができる。

以下に本発明の詳細な説明する。

１）馴化の方法 馴化するための親株としては、チャイニーズ・ＣＨＯ細
胞）由来の細胞で無血清培地に増殖継代困難な細胞であ
れば、いずれの細胞でも用いることができる。好適な例
としては、ＣＨＯ−に１株（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）の亜
株であるＣＨＯ細胞由来のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株
ＣＨＯ細胞ｄ　−ＤＸＢＩＩ株〔プロシーディング　オ
ブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス　（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄＳｃｉ、）ＵＳＡ、７
７巻、４２１６−４２２０頁、１９８０年、デイ−・エ
ヌ・ニー（ＤＮＡ）３巻、２９７−３０８頁、１９８４
年〕があげられる。

ＣＨＯ細胞は本来付着性細胞であるが、馴化させるには
浮遊培養法を利用するのが好ましい。

浮遊培養において、細胞播種濃度は０．５〜８×１０５
個／−程度が好ましく、培養中この濃度を維持すること
が好ましい。また培地のｐＨが６．５以下にならないよ
うに、培地中の栄養源が枯渇しないように、定期的に培
地を交換する必要がある。

培地を交換する時点で細胞数が著しく低下している場合
は、遠心分離や上清除去により濃縮し、逆に細胞数が向
上している場合は希釈して細胞数を調整する。とくに馴
化開始初期は細胞数の著しい低下を伴う場合がある。馴
化期間は２ケ月以上を要する。

ＣＨＯ細胞ｄ−ＤＸＢＩＩ株を例に、具体的な馴化方法
を示す。

１−１）無血清培地への馴化方法 ＣＨＯ細胞ｄ−ＤＸＢＩＩ株を種細胞とし、付着状態で
はほぼ接触阻止の起こる細胞数（４Ｘ１０５個／−）を
、血清の代わりに血清代替物を添加した基礎培地（４０
ｍ）に播種する。これを３７℃で２〜４日間培養する。

その後浮遊状態で生育している細胞を１５０Ｏｒｐｍで
５分間遠心分離し、新鮮基礎培地（４０ｍｆ＋）に再懸
濁する。

このような操作を繰返すことにより、馴化株の生育が安
定し生存率が向上する。馴化株の生存率が、親株を通常
生育可能な培地で培養したときの生存率に近づくまでこ
の馴化操作を２ケ月以上繰返し続ける。

基礎培地としては、動物細胞培養に用いられる一般的な
培地を使用することができる。たとえばＲＰＭＩ−１６
４０、肝Ｍ１ダルベツコＭＢＭ　、ハムＦ１２、ハムＦ
ＩＯ，０Ｍ１６０．０Ｍ１７０　　（極東製薬社製）、
ダルベツコＭＥＭおよびハムＦ１２のｌ：ｌ混合培地、
ＲＰＭＩ−１６４０、ダルベツコＭＥＭおよびハムＦ１
２の２＝１：ｌ混合培地などをあげることができる。

血清代替物として、トランスフェリン０．１〜１１００
ｕ／ｒｎｔｒ、好ましくは１〜１０ｇ／ｄ、インスリン
０．１〜１００　ｇ／ｍｆｆ、好ましくは１〜１０ｕｇ
／−１葉酸０．１〜１００■／ｍ＆、好ましくは１〜１
０■／ｍｌ、亜セレン酸０．１〜１００　ｘｌＯ−’Ｍ
　、好ましくは１〜ｌ０ＸＩＯ−’Ｍ１ペポールＢ−１
８８（東邦千葉化学工業社製）０．００１〜１０％、好
ましくは０．０１−１％、ジメチル−αまたはβ−シク
ロデキストリン　（東進ケミカル社製）１　ｕｇ−１０
ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００　ｇ／ｍ＋、ポリ
エチレングリコール２０００００．０１−１０％、好ま
しくは０．０１〜０１％を組み合わせて用いる。

さらに添加物として、ヘペス緩衝液ｌ〜３００ｎ＋Ｍ、
好ましくは５〜２５ｍＭ、グルタミン０．５〜１０ｍＭ
、好ましくは１〜５ｒｒＩＭ、硫酸第一鉄０．１〜１０
０　ｔｔＭ　。

好ましくは５〜５０μＭ　、　ＭＥＭ用非用層必須アミ
ノ酸混合液０〜２５ｍＣ／１００　ｒｒｉ、好ましくは
１〜１０−７１００−を組み合わせて用いる。

このようにして無血清培地で生育可能なＣＨＯ細胞を得
ることができる。得られた細胞をＣＨＯ細胞ＫＪＭ−１
株と命名する。

ＣＨＯ細胞Ｋ　Ｊ　Ｍ　−１株は接着非依存性を有し、
無血清培地に浮遊状態で生育可能である。

１−２）無血清無蛋白培地への馴化方法光に得られた無
血膚馴化ＣＨＯ細１］ａＫＪＭ−１株を種細胞とし、４
Ｘ１０５個／ｍｌ程度の細胞密度で、１−１）で使用し
た無血清培地からトランスフェリンおよびインスリンを
除いた組成からなる無血清無蛋白培地（４０ｍ）に播種
する。これを３７℃で２〜４日間培養する。その後浮遊
状態で生育している細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心
分離し、上記の新鮮培地（４０ｍ）に再懸濁する。

このような操作を繰返すことにより、馴化株の生育が安
定し生存率が向上する。馴化株の生存率が親株を通常生
育可能な培地で培養したときの生存率に近づくまでこの
馴化操作を２ケ月以上繰返し続ける。

基礎培地、血清代替物およびその他の添加物はトランス
フェリンおよびインスリンを除き、前記したものと同じ
ものを用いることができる。

このよウハして無血清無蛋白培地で２ケ月以上生育可能
なＣＨＯ細胞を得ることができる。得られた細胞をＣＨ
Ｏ細胞ＫＪＭ−ＩＰＦ株と命名する。

２）グルタミン非要求性の付与 得られた無血清無蛋白馴化ＣＨＯ細胞ＫＪＭＩＦＦ株を
、１−２）で使用した無血清無蛋白培地組成のグルタミ
ンの代わりに過剰のグルタミン酸を添加した培地で培養
することにより、ＣＨＯ細胞ＫＪＭ−ＩＰＦ株にグルタ
ミン非要求性を付与することができる。

過剰のグルタミン酸とは、一般的な培地に含有されてい
るグルタミン酸含量の１０〜３０倍程度で程度、とくに
２０倍程度を培地に含有させるのが好ましい。

実施例３においては、グルタミンの代わりにグルタミン
と同当量のグルタミン酸（一般的に培地に含有されてい
るグルタミン酸の２０倍〉を含有させた。

このようにして無血清無蛋白培地で２ケ月以上生育可能
でかつグルタミン非要求性を有するＣＨＯ細胞を得るこ
とができる。得られた細胞をＣＨＯ細胞ＫＪＴ−１株と
命名する。

ＣＨＯ細胞ＫＪＴ−１株は、ブダペスト条約に基づき平
底２年２月２７日付で工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研条寄第２７７６号（ＦＥＲＭＢＰ−２７７６＞
とじて寄託されている。

ＣＨＯ細胞ＫＪＴ−１株の完全蒸煮滅菌培地での生育及
びグルタミン非要求性の確認については、直接的な証明
方法として培養液中のグルタミンをアミノ酸自動分析機
ＪＬＣ−２００Δ（日本電子社魁〉によって分析する方
法がある。あらかじめ含まれていない成分であるグルタ
ミンを培養土清中に検出することもあるが、ＣＨＯ細胞
ＫＪＴ１株を培養して得られた培養液を分析した結果、
グルタミンの含有は確認されなかった。間接的な証明方
法としては、ＣＨＯ細胞ＫＪＴ−１株の増殖曲線とグル
タミン合成酵素の誘導によって証明する方法がある。

これらの結果により、蒸煮滅菌した培地にはグルタミン
がまったく含有されず、ＣＨＯ細胞ＫＪＴ−１株がグル
タミンをまったく含有しない培地でも生育可能であるこ
とが証明される。

以下に本発明の実施例および参考例を示す。

実施例１ 無血清培地馴化株の育成 ハムＦ１２を基礎培地として、トランスフェリン１０ｇ
／ｄ、インスリン１０ｇ／ｄ、葉酸１０■／−１亜セレ
ンｌｉｅ　１．２５Ｘ　１０−”Ｍ　、ペポールＢ−１
８８０，１％、ヘペス緩衝液７．５　ｍＭ、グルタミン
２　ｍＭ、硫酸第一鉄ｌＯμＭ　、ＭＥＭ用非必須アミ
ノ酸混合液１０ａｆ／１００−および重曹０．１５％を
加えた無血清培地（以下、培地ａという。）４０−を７
５ｃｍ’の培養フラスコへ入れ、そこへＣＨＯ細胞ｄ−
ＤＸＢＩ　１株（血膚依存性）を４×１０５個／−程度
の細胞密度で播種した。

３７℃で３日間静置培養した後、浮遊状態で生育してく
る細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して集め、前
記と同じ組成からなる新鮮無血清培地４０−に再懸濁し
た。

細胞は継代するにしたがって生存率が低下した。

培養を開始してから７日目には生存率は７％まで低下し
たが、そのまま継代培養を繰り返すことにより細胞の生
存率が向上した。培養を開始してから２ケ月後には生存
率８０％以上に回復し、細胞数もｌＸｌ０’個／−程度
まで増殖可能となった。

以後、培養を開始してから１７ケ月以上安定した増殖を
示している。

このようにして無血清培地馴化株であるＣＨＯ細胞ＫＪ
Ｍ−１株が得られた。

実施例２ 無血清無蛋白培地馴化株の育成 ハムＦ１２を基礎培地とし、亜セレン酸１．２５Ｘ　１
０−”Ｍ、ペポールＢ−１８８０，１％、ヘベス緩衝液
７．５ｍＭ、グルタミン２ｍＭ、硫酸第一鉄１０μＭ％
ＭＥＭ用非必須アミノ酸混合液１０ｍ１／１００ｍおよ
び重曹０．１５％を添加した無血清無蛋白培地（以下、
培地すという。）４０ｄを７５ｃｍ’の培養フラスコへ
入れ、そこへＣＨＯ細胞ＫＪＭ−１株を４Ｘ１０’個／
−程度の細胞密度で播種した。３７℃で３日間静置培養
した後、浮遊状態で生育している細胞を１５０Ｏｒｐｍ
で５分間遠心分離して集め、前記と同じ組成からなる新
鮮無血清無蛋白培地４０−に再懸濁した。

細胞は継代するにしたがって生存率が低下した。

培養を開始してから７日目には生存率は２０％まで低下
したが、そのまま継代培養を繰り返すことにより細胞の
生存率が向上した。培養を開始してから２ケ月後には、
生存率８０％以上に回復し、細胞数もＬＸ　１０’個／
−程度まで増殖可能となった。

このようにして無血清無蛋白培地馴化株であるＣＨＯ細
胞ＫＪＭ−ＩＰＦ株が得られた。

実施例３ グルタミン非要求性の付与 実施例２で用いた無血清無蛋白培地組成のグルタミン２
ｍＭの代わりにグルタミン酸４ｍＭを加えた培地（４０
ｍ）に、実施例２で得られたＣＨＯ細胞ＫＪＭ−ＩＰＦ
株を播種し、３７℃で３日間培養した。

このようにして無血清無蛋白培地に２ケ月以上増ａｍ代
できかつグルタミン非要求性を有するＣＨＯ細胞ＫＪＴ
−１株が得られた。

参考例１ グルタミン非要求性の付与の確認 ハムＦ１２を基礎培地とし、亜セレン＃１．２５Ｘ　１
０−＠Ｍ、ペポールＢ−１８８０，１％、ヘペス緩衝液
７．５ｍＭ、硫Ｉｉ２第一鉄１０ｕＭ、グルタミン酸４
ｍＭ、ＭＥＭ用非必須アミノＷＩ！混合液１０ａ２／１
００ｍを添加した無血清無蛋白培地４０−を蒸煮滅菌し
、さらに使用時に別途蒸煮滅菌した重曹を０．１５％に
なるように添加した培地（以下培地Ｃという。）で、Ｃ
ＨＯ細胞ＫＪＴ１株を３７℃で培養した。

その結果を第３図に示す。

参考例２ 細胞内グルタミン合成酵素活性の比較 培地ＣでＣＨＯ細胞ｄ−ＤＸＢＩＩ株およびＣＨＯ細胞
ＫＪＴ−１株をそれぞれ３７℃で４日間培養した。

培地すを濾過滅菌した培地でＣＨＯ細胞ｄ−ＤＸＢＩＩ
株オヨびＣＨＯ細胞ＫＪＭ−ＩＰＦ株をそれぞれ３７℃
で４日間培養した。

培養後それぞれの細胞内のグルタミン合成酵素活性を比
較した。結果を第１表に示す。

発明の効果 本発明によれば、無血清無蛋白培地で２ヶ列以上増殖継
代できる新規ＣＨＯ細胞のセルラインおよび無血清無蛋
白培地に２ケ月以上堆殖継代できかつグルタミン非要求
性を有する新規ＣＨＯ細胞を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＣＨＯ細胞ＫＪＭ−１株を３７℃下、培地ａ
で培養したときの細胞増殖曲線およびＣＨＯ細胞ｄ−Ｄ
ＸＢＩＩ株を３７℃下、培地ａ組成中トランスフェリン
およびインスリンの代わりに５％牛脂児血清を添加した
培地で培養したときの増殖曲線を示す。図中、白丸実線
はＣＨＯ細胞ＫＪＭ−１株、黒丸実線はＣＨＯ細胞ｄ−
ＤＸＢ１１株の増殖曲線である。 第２図は、ＣＨＯ細胞ＫＪＭ−ＩＰＦ株を３７℃下、培
地すで培養したときの増殖曲線を示す。 第３図は、ＣＨＯ細胞ＫＪＴ−１株を３７℃下、培地Ｃ
で培養したときの増殖曲線を示す。 いずれの図も縦軸は生細胞数（ＩＸ　１０’ｃｅｌｌｓ
／ｄ）、横軸は培養日数を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）血清および蛋白を含有しない培地（以下、無血清
   無蛋白培地という。）で２ヶ月以上増殖継代できる新規
   チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）のセ
   ルライン。（２）無血清無蛋白培地に２ヶ列以上増殖継
   代できかつグルタミン非要求性を有する新規ＣＨＯ細胞
   。 （３）無血清無蛋白培地が完全蒸煮滅菌された培地であ
   る請求項（２）記載の新規ＣＨＯ細胞。