CN109777773A

CN109777773A - 一种从造血干细胞分化产生nk细胞的方法及其培养基

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Publication number: CN109777773A
Application number: CN201910140579.4A
Authority: CN
Inventors: 顾雨春; 尹乐
Original assignee: Beijing Promise Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Promise Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-05-21

Abstract

本发明公开了一种从造血干细胞分化产生NK细胞的方法。本发明所提供的从造血干细胞分化产生NK细胞的方法包括如下步骤：(a)将造血干细胞接种于NK分化培养基I(NK分化基础培养基+SCF、IL3、IL7、IL15和Flt3‑L)中，进行培养；(b)7天后，采用NK分化培养基II进行半量换液，继续培养；之后每隔5‑7天使用所述NK分化培养基II(NK分化基础培养基+SCF、IL15、IL7和Flt3‑L)进行半量换液，直至培养获得造血干细胞来源的NK细胞。实验证明，本发明方法可以成功从造血干细胞分化产生NK细胞。本发明对于获得高纯度特定基因修饰的NK细胞以及工业化生产具有重要意义。

Description

一种从造血干细胞分化产生NK细胞的方法及其培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从造血干细胞分化产生NK细胞的方法及其培养基。

背景技术

NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞没有T细胞和B细胞所具的受体，不会进行受体的基因重组。但仍具有一些特殊受体，可以活化或抑制其作用。NK细胞与杀死肿瘤细胞有关，可利用分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，摧毁目标细胞。此外，NK细胞可以进行体外扩增，但由于NK细胞自身特点，难以对其进行基因修饰(慢病毒感染效率低)。因此，体外分化获得NK细胞具有重要意义。

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)较易进行基因修饰，基因修饰后的iPS细胞可以分化产生造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSC)，将造血干细胞进一步分化获得的NK细胞即为基因修饰的NK细胞。截止目前，尚无造血干细胞体外分化形成NK细胞的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从造血干细胞(HSC)分化产生NK细胞的方法。

第一方面，本发明要求保护一种从造血干细胞分化产生NK细胞的方法。

本发明所提供的从造血干细胞分化产生NK细胞的方法，可包括如下步骤：

(a)将造血干细胞接种于NK分化培养基I中，培养6-8天(如6天、7天或8天)；

所述NK分化培养基I可为在NK分化基础培养基中加入细胞因子SCF、IL3、IL7、IL15和Flt3-L后得到的培养基；

(b)完成步骤(a)后，采用NK分化培养基II进行半量换液，继续培养；培养期间每隔5-7天(如5天、6天或7天)使用所述NK分化培养基II进行半量换液，直至获得NK细胞(即造血干细胞来源的NK细胞)；

所述NK分化培养基II可为在所述NK分化基础培养基中加入细胞因子SCF、IL15、IL7和Flt3-L后得到的培养基。

所述NK分化基础培养基可包括DMEM高糖培养基、“Ham's F-12 Nutrient Mix，GlutaMAX^TMSupplement培养基”、热灭活人AB血清、L-谷氨酸、2-巯基乙醇、亚硒酸钠、氨基乙醇和L-抗坏血酸。

所述NK分化基础培养基具体可由DMEM高糖培养基、“Ham's F-12 Nutrient Mix，GlutaMAX^TMSupplement培养基”、热灭活人AB血清、L-谷氨酸、2-巯基乙醇、亚硒酸钠、氨基乙醇和L-抗坏血酸组成。

所述NK分化基础培养基具体可由体积百分含量为50-60％(如50-56.6％、56.6-60％、50％、60％或56.6％)的DMEM高糖培养基、体积百分含量为25-30％(如25-28.3％、28.3-30％、25％、30％或28.3％)的“Ham's F-12 Nutrient Mix，GlutaMAX^TMSupplement培养基”、体积百分含量为10-20％(如10-15％、15-20％、10％、20％或15％)的热灭活的人AB血清、L-谷氨酸、2-巯基乙醇、亚硒酸钠、氨基乙醇和L-抗坏血酸组成。L-谷氨酸在该培养基中的浓度为1-3mM(如1-2mM、2-3mM、1mM、2mM或3mM)。2-巯基乙醇在该培养基中的浓度为0.5-1.5μM(如0.5-1.0μM、1.0-1.5μM、0.5μM、1.0μM、或1.5μM)。亚硒酸钠在该培养基中的浓度为3-7ng/mL(如3-5ng/mL、5-7ng/mL、3ng/mL、5ng/mL或7ng/mL)。氨基乙醇在该培养基中的浓度为40-60μM(如40-50μM、50-60μM、40μM、50μM或60μM)。L-抗坏血酸在该培养基中的浓度为40-60μg/mL(如40-50μg/mL、50-60μg/mL、40μg/mL、50μg/mL或60μg/mL)。

上述任一所述DMEM高糖培养基、上述任一所述“Ham's F-12 Nutrient Mix，GlutaMAX^TMSupplement培养基”、上述任一所述L-谷氨酸和上述任一所述2-巯基乙醇均可为Thermofisher公司的产品。

上述任一所述热灭活的人AB血清、上述任一所述亚硒酸钠、上述任一所述氨基乙醇和上述任一所述L-抗坏血酸均可为Sigma公司的产品。

进一步地，在所述NK分化培养基I中，所述SCF的浓度可为15-25ng/mL(如15-20ng/mL、20-25ng/mL、15ng/mL、20ng/mL或25ng/mL)。所述IL3的浓度可为3-7ng/mL(如3-5ng/mL、5-7ng/mL、3ng/mL、5ng/mL或7ng/mL)。所述IL7的浓度可为15-25ng/mL(如15-20ng/mL、20-25ng/mL、15ng/mL、20ng/mL或25ng/mL)。所述IL15的浓度可为8-12ng/mL(如8-10ng/mL、10-12ng/mL、8ng/mL、10ng/mL或12ng/mL)。所述Flt3-L的浓度可为8-12ng/mL(如8-10ng/mL、10-12ng/mL、8ng/mL、10ng/mL或12ng/mL)。

进一步地，在所述NK分化培养基II中，所述SCF的浓度可为15-25ng/mL(如15-20ng/mL、20-25ng/mL、15ng/mL、20ng/mL或25ng/mL)。所述IL15的浓度可为8-12ng/mL(如8-10ng/mL、10-12ng/mL、8ng/mL、10ng/mL或12ng/mL)。所述IL7的浓度可为15-25ng/mL(如15-20ng/mL、20-25ng/mL、15ng/mL、20ng/mL或25ng/mL)。所述Flt3-L的浓度可为8-12ng/mL(如8-10ng/mL、10-12ng/mL、8ng/mL、10ng/mL或12ng/mL)。

进一步地，步骤(a)中，所述培养的条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％CO₂(如3-5％CO₂、5-7％CO₂、3％CO₂、5％CO₂或7％CO₂)培养。

进一步地，步骤(b)中，所述培养的条件可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、3-7％CO₂(如3-5％CO₂、5-7％CO₂、3％CO₂、5％CO₂或7％CO₂)培养。

进一步地，步骤(b)中，所述“直至培养获得NK细胞”可为自步骤(a)接种到所述NK分化培养基I中开始计算的第21-28天(如21-24天、24-28天、21天、24天或28天)。

第二方面，本发明要求保护一种培养基。

本发明所提供的培养基可为前文所述的NK分化培养基I或所述的NK分化培养基II。

第三方面，本发明要求保护一种成套培养基。

本发明所提供的成套培养基可包括前文所述的NK分化培养基I和所述的NK分化培养基II。

所述成套培养基具体可由前文所述的NK分化培养基I和所述的NK分化培养基II组成。

第四方面，本发明要求保护前文所述的培养基或所述的成套培养基在从造血干细胞分化产生NK细胞中的应用。

前文任一所述造血干细胞可为x1)或x2)：

x1)iPS细胞分化获得的造血干细胞；

x2)从离体的人源血液分离获得的造血干细胞。

x1)中，所述“iPS细胞分化获得的造血干细胞”具体可为按照STEMdiff^TMHematopoietic Kit(可为STEMCELL公司的产品，Catalog#05310)的操作步骤，将iPS细胞(可为北京呈诺医学科技有限公司的产品)分化为造血干细胞。

所述iPS细胞可为基因修饰后的iPS细胞。如果iPS细胞为基因修饰后的iPS细胞，则采用本发明的方法获得的NK细胞为基因修饰的NK细胞。

实验证明，采用本发明提供的方法可以将造血干细胞分化成NK细胞，且该方法使用的培养基不仅能够使造血干细胞快速高效的分化成NK细胞，而且化学成分确定、无动物源蛋白添加。采用本发明提供的方法可以大规模生产NK细胞(理论上讲也可以生产基因修饰的NK细胞)，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物研发和细胞治疗提供大量细胞来源。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中流式细胞术检测的CD45(纵轴)与CD56(横轴)；

图2为本发明实施例1中流式细胞术检测的TRAIL；

图3为本发明实施例1中流式细胞术检测的CD94；

图4为本发明实施例1中流式细胞术检测的CD335(NKp46)；

图5为本发明实施例1中流式细胞术检测的CD336(NKp44)。

图6为本发明实施例1中流式细胞术检测的CD337(NKp30)。

图7为本发明实施例1中流式细胞术检测的CD3。

图8为本发明实施例1中流式细胞术检测的CD314(NKG2D)

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的造血干细胞(HSC)为iPS细胞分化而成(具体按照STEMdiff^TMHematopoietic Kit的操作步骤进行)或从离体的人源血液分离获得。

STEMdiff^TMHematopoietic Kit为STEMCELL公司的产品，Catalog#05310。iPS细胞为北京呈诺医学科技有限公司的产品。

实施例1、NK细胞的获得和检测

一、NK细胞的获得

1、按表1配制NK分化基础培养基。

表1.NK分化基础培养基

注：“-”表示不存在。

2、将造血干细胞置于NK分化培养基I中培养7天，培养条件为37℃、5％CO2培养。

NK分化培养基I为在表1所示的NK分化基础培养基中加入SCF、IL3、IL7、IL15、Flt3-L后得到的培养基。NK分化培养基I中，SCF的浓度为20ng/mL；IL3的浓度为5ng/mL，IL7的浓度为20ng/mL，IL15的浓度为10ng/mL，Flt3-L的浓度为10ng/mL。

3、完成步骤2后，采用NK分化培养基II进行半量换液，继续培养(培养条件为37℃、5％CO2培养)，培养期间每隔5-7天使用所述NK分化培养基II进行半量换液，直至获得NK细胞，即HSC来源的NK细胞。

获得NK细胞的时间为自造血干细胞接种至NK分化培养基I中开始计算的第21-28天。

NK分化培养基II为在表1所示的NK分化基础培养基中加入SCF、IL15、IL7、Flt3-L后得到的培养基。NK分化培养基II中，SCF的浓度为20ng/mL，IL7的浓度为20ng/mL，IL15的浓度为10ng/mL，Flt3-L的浓度为10ng/mL。

二、检测

待测抗体为“CD45抗体和CD56抗体”、Trail抗体、CD94抗体、NKp46抗体、NKp44抗体、NKp30抗体、CD3抗体或NKG2D抗体。CD45抗体、CD56抗体、Trail抗体、CD94抗体、NKp46抗体、NKp44抗体、NKp30抗体、CD3抗体和NKG2D抗体均为Thermo公司的产品。

CD45、CD56、Trail、CD94、NKp46、NKp44、NKp30和NKG2D均为NK细胞表面标志物，即在NK细胞表面特异表达。CD3不为NK细胞表面标志物，即不在NK细胞表面特异表达。

使用流式细胞术对NK细胞表面标志物进行检测，具体步骤如下：

1、取步骤一中3得到的NK细胞，加入PBS缓冲液重悬，得到NK细胞的悬浮液。

2、取步骤1得到的NK细胞的悬浮液，加入待测抗体，室温避光孵育20分钟(期间每隔5分钟混匀一次)；然后用PBS缓冲液洗涤2次(目的为除去未结合的抗体)。

3、完成步骤2后，加入500μL PBS缓冲液重悬，然后采用流式细胞仪检测。

CD45抗体和CD56抗体的检测结果见图1。结果表明，100％的NK细胞表面均表达CD56和CD45。

Trail抗体的检测结果见图2。结果表明，25.2％的NK细胞表面均表达Trail。

CD94抗体的检测结果见图3。结果表明，97.9％的NK细胞表面均表达CD94。

NKp46抗体的检测结果见图4。结果表明，99.1％的NK细胞表面均表达NKp46。

NKp44抗体的检测结果见图5。结果表明，93.9％的NK细胞表面均表达NKp44。

NKp30抗体的检测结果见图6。结果表明，97.8％的NK细胞表面均表达NKp30。

CD3抗体的检测结果见图7。结果表明，0.1％的NK细胞表面表达蛋白CD3。

NKG2D抗体的检测结果见图8。结果表明，99.0％的NK细胞表面均表达NKG2D。

上述结果表明，步骤一的方法可以高效的将造血干细胞分化为NK细胞。

Claims

1.一种从造血干细胞分化产生NK细胞的方法，包括如下步骤：

(a)将造血干细胞接种于NK分化培养基I中，培养6-8天；

所述NK分化培养基I为在NK分化基础培养基中加入细胞因子SCF、IL3、IL7、IL15和Flt3-L后得到的培养基；

(b)完成步骤(a)后，采用NK分化培养基II进行半量换液，继续培养；培养期间每隔5-7天使用所述NK分化培养基II进行半量换液，直至获得NK细胞；

所述NK分化培养基II为在所述NK分化基础培养基中加入细胞因子SCF、IL15、IL7和Flt3-L后得到的培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述NK分化基础培养基包括DMEM高糖培养基、“Ham's F-12Nutrient Mix，GlutaMAXTMSupplement培养基”、热灭活人AB血清、L-谷氨酸、2-巯基乙醇、亚硒酸钠、氨基乙醇和L-抗坏血酸。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

在所述NK分化培养基I中，所述SCF的浓度为15-25ng/mL；所述IL3的浓度为3-7ng/mL；所述IL7的浓度为15-25ng/mL；所述IL15的浓度为8-12ng/mL；所述Flt3-L的浓度为8-12ng/mL；和/或

在所述NK分化培养基II中，所述SCF的浓度为15-25ng/mL；所述IL15的浓度为8-12ng/mL；所述IL7的浓度为15-25ng/mL；所述Flt3-L的浓度为8-12ng/mL。

4.根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：

步骤(a)中，所述培养的条件为35-39℃、3-7％CO₂培养；和/或

步骤(b)中，所述培养的条件为35-39℃、3-7％CO₂培养。

5.根据权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述“直至培养获得NK细胞”为自步骤(a)接种到所述NK分化培养基I中开始计算的第21-28天。

6.培养基，其特征在于：所述培养基为权利要求1至5中任一所述NK分化培养基I或所述NK分化培养基II。

7.成套培养基，其特征在于：所述成套培养基包括权利要求1至5中任一所述NK分化培养基I和所述的NK分化培养基II。

8.如权利要求7所述成套培养基，其特征在于：所述成套培养基由权利要求1至5中任一所述NK分化培养基I和所述的NK分化培养基II组成。

9.权利要求6所述的培养基、或、权利要求7或8所述成套培养基在从造血干细胞分化产生NK细胞中的应用。

10.如权利要求1至5任一所述的方法或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述造血干细胞为x1)或x2)：

x1)iPS细胞分化获得的造血干细胞；

x2)从离体的人源血液分离获得的造血干细胞。