CN113337466A - 一种无血清nk分化培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种无血清NK分化培养基及其制备方法，所述培养基以stemspan SFEMⅡ为基础培养基，包括浓度10‑100ng/ml的IL‑2，浓度10‑100ng/ml的SCF，浓度10‑100ng/ml的IL‑7，浓度1‑10ng/ml的IL‑15,浓度5‑50ng/ml的Flt3L，浓度5‑50ng/ml的IL‑3，浓度0.5‑2uM的UM729，将经DPBS清洗的造血干细胞，以10万/ml的接种数接种到培养基中，每隔每隔三天半换液一次，培养至第14天即可。本发明通过优选培养基成分组成与含量，保证了NK细胞的分化，培养基不使用血清降低了污染源，避免了其他细胞作为饲养细胞，使细胞更安全。

Description

一种无血清NK分化培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及培养基制备技术领域，具体涉及一种无血清NK分化培养基及其之制备方法。
背景技术
免疫系统通过识别自我和非我保护机体免受外来病原体的侵袭,同时又通过对自身抗原的免疫耐受来防止自身免疫性疾病的发生.不适当的免疫应答,如对自身抗原产生应答,对外来病原体产生免疫耐受或应答过强,均会对机体造成严重损伤.其中自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。
自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。是人体免疫监视的第一道防线.具有强大的抗肿瘤作用以及良好的安全性。由于它能迅速溶解某些肿瘤细胞，因此开发它的抗癌功能是近年来癌症研究的重点。
近年,兴起的生物免疫疗法治疗肿瘤由于疗效显著,大量的科研人员投身于NK细胞的制备与研发，因此，如何通过体外培养获得满足临床需要的NK细胞已成为近年来学者们研究的热点问题。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种无血清NK分化培养基及其制备方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明一种无血清NK分化培养基，其中：所述培养基以stemspan SFEMⅡ为基础培养基，包括浓度10-100ng/ml的IL-2，浓度10-100ng/ml的SCF，浓度10-100ng/ml的IL-7，浓度1-10ng/ml的IL-15,浓度5-50ng/ml的Flt3L，浓度5-50ng/ml的IL-3，浓度0.5-2uM的UM729。
优选的，所述培养基以stemspan SFEMⅡ为基础培养基，包括所述培养基以stemspan SFEMⅡ为基础培养基，包括浓度20-80ng/ml的IL-2，浓度10-40ng/ml的SCF，浓度10-40ng/ml的IL-7，浓度2-8ng/ml的IL-15,浓度5-20ng/ml的Flt3L，浓度2.5-10ng/ml的IL-3，浓度0.5-2uM的UM729。
优选的，stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度40ng/ml，IL-7浓度为20ng/ml，IL-15浓度为4ng/ml，SCF浓度为20ng/ml，Flt3L浓度为10ng/ml，UM729浓度为1uM。
优选的，stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度20ng/ml，IL-7浓度为10ng/ml，IL-15浓度为2ng/ml，SCF浓度为10ng/ml，Flt3L浓度为5ng/ml，UM729浓度为0.5uM。
优选的，stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度80ng/ml，IL-7浓度为40ng/ml，IL-15浓度为8ng/ml，SCF浓度为40ng/ml，Flt3L浓度为20ng/ml，UM729浓度为2uM。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种无血清NK分化培养基的应用，其特征在于：包括，将经DPBS清洗的造血干细胞，以10万/ml的接种数接种到培养基中，每隔2-4天换液一次，培养至第14天即可。
本发明的有益效果如下：
本发明通过优选培养基成分组成与含量，保证了NK细胞的分化，培养基不使用血清降低了污染源，避免了其他细胞作为饲养细胞，使细胞更安全。
附图说明
图1为实施例1的实验结果图；
图2为实施例2的实验结果图；
图3为实施例3的实验结果图；
图4为阴性对比组的实验结果图；
图5为实施例3去掉IL-15的实验结果图；
图6为实施例3去掉UM729的实验结果图；
图7为实施例3去掉Flt3L的实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
本发明包括一种无血清NK分化培养基成本较高，需要避光保存，其配方如下：
stemspan SFEMⅡ作为基础培养基，IL-2浓度10-100ng/ml，SCF浓度10-100ng/ml，IL-7浓度10-100ng/ml，IL-15浓度1-10ng/ml,Flt3L浓度5-50ng/ml，IL-3浓度5-50ng/ml，UM729浓度0.5-2uM。
使用上述培养基包括如下步骤：接种造血干细胞的数量为10-20万/ml，接种于超低吸附6孔细胞培养板，接种时每孔接种4毫升，每隔三天半换液，至第14天检测分化得到的细胞纯度。
实施例1
本实施例采用的培养液配方以50ml体系为例：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度40ng/ml，IL-7浓度为20ng/ml，IL-15浓度为4ng/ml，SCF浓度为20ng/ml，Flt3L浓度为10ng/ml，IL-3浓度5ng/ml，UM729浓度为1uM。
DPBS清洗3遍造血干细胞接种入分化培养基的接种数为10万/ml；接种于超低吸附6孔细胞培养板，接种时每孔接种4毫升，接种当天记为第0天，每隔三天半换液，至第14天检测分化得到的细胞纯度。
结果见图1。
实施例2
本实施例采用的培养液配方以50ml体系为例：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度20ng/ml，IL-7浓度为10ng/ml，IL-15浓度为2ng/ml，SCF浓度为10ng/ml，Flt3L浓度为5ng/ml，IL-3浓度2.5ng/ml，UM729浓度为0.5uM。
DPBS清洗3遍造血干细胞接种入分化培养基的接种数为10万/ml；接种于超低吸附6孔细胞培养板，接种时每孔接种4毫升，接种当天记为第0天，每隔三天半换液，至第14天检测分化得到的细胞纯度。
结果见图2。
实施例3
本实施例采用的培养液配方以50ml体系为例：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度80ng/ml，IL-7浓度为40ng/ml，IL-15浓度为8ng/ml，SCF浓度为40ng/ml，Flt3L浓度为20ng/ml，IL-3浓度10ng/ml，UM729浓度为2uM。
DPBS清洗3遍造血干细胞接种入分化培养基的接种数为10万/ml；接种于超低吸附6孔细胞培养板，接种时每孔接种4毫升，接种当天记为第0天，每隔三天半换液，至第14天检测分化得到的细胞纯度。
结果见图3。
实施例的结果测试
CD3-CD56+阳性率的检测：取实施例及其对比组最终所得细胞，收集细胞到50mL离心管中1000r/min离心5min，弃上清后用1mL含2％(v/v)血清的PBS重悬，加入抗体CD3-FITC、CD56-APC，4℃孵育30min后用含2％血清的PBS洗一遍。然后以5×106/ml的密度重悬细胞，使用Agilent NovoCyte流式仪细胞仪检测并分析其分化效率。在检测过程中，以普通造血干细胞为阴性组，即未进行NK诱导分化的细胞或者是虽进行分化实验但是并未用流式抗体染色的细胞。
结果实施例1及其对比组测试结果如图1所示，流式细胞分析发现实施例1的CD3-CD56+阳性率上升到83.38％；实施例2的CD3-CD56+阳性率上升到66.81％；实施例3的CD3-CD56+阳性率上升到74.33％；阴性对比组见图4。
对比例1
采用的培养液配方以50ml体系为例：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度80ng/ml，IL-7浓度为40ng/ml，SCF浓度为40ng/ml，Flt3L浓度为20ng/ml，IL-3浓度10ng/ml，UM729浓度为2uM。(配方中去掉IL-15)
DPBS清洗3遍造血干细胞接种入分化培养基的接种数为10万/ml；接种于超低吸附6孔细胞培养板，接种时每孔接种4毫升，接种当天记为第0天，每隔三天半换液，至第14天检测分化得到的细胞纯度。
结果见图5。
对比例2
采用的培养液配方以50ml体系为例：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度80ng/ml，IL-7浓度为40ng/ml，SCF浓度为40ng/ml，Flt3L浓度为20ng/ml，IL-3浓度10ng/ml(配方中去掉UM729)。
DPBS清洗3遍造血干细胞接种入分化培养基的接种数为10万/ml；接种于超低吸附6孔细胞培养板，接种时每孔接种4毫升，接种当天记为第0天，每隔三天半换液，至第14天检测分化得到的细胞纯度。
结果见图6。
对比例3
采用的培养液配方以50ml体系为例：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度80ng/ml，IL-7浓度为40ng/ml，SCF浓度为40ng/ml，UM729浓度为2uM，IL-3浓度10ng/ml。(配方中去掉Flt3L)
DPBS清洗3遍造血干细胞接种入分化培养基的接种数为10万/ml；接种于超低吸附6孔细胞培养板，接种时每孔接种4毫升，接种当天记为第0天，每隔三天半换液，至第14天检测分化得到的细胞纯度。
结果见图7。
对比例1-3测试结果如图5-7所示，流式细胞分析发现对比例1的CD3-CD56+阳性率为21.89％；对比例2的CD3-CD56+阳性率为48.29％；对比例3的CD3-CD56+阳性率为35.9％；阴性对比组见图4，表明了IL-15、UM729以及Flt3L对于NK细胞分化的必要性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种无血清NK分化培养基，其特征在于：所述培养基以stemspan SFEMⅡ为基础培养基，包括浓度10-100ng/ml的IL-2，浓度10-100ng/ml的SCF，浓度10-100ng/ml的IL-7，浓度1-10ng/ml的IL-15,浓度5-50ng/ml的Flt3L，浓度5-50ng/ml的IL-3，浓度0.5-2uM的UM729。
2.如权利要求1所述的无血清NK分化培养基，其特征在于：所述培养基以stemspanSFEMⅡ为基础培养基，包括浓度20-80ng/ml的IL-2，浓度10-40ng/ml的SCF，浓度10-40ng/ml的IL-7，浓度2-8ng/ml的IL-15,浓度5-20ng/ml的Flt3L，浓度2.5-10ng/ml的IL-3，浓度0.5-2uM的UM729。
3.如权利要求1所述的无血清NK分化培养基，其特征在于：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度40ng/ml，IL-7浓度为20ng/ml，IL-15浓度为4ng/ml，SCF浓度为20ng/ml，Flt3L浓度为10ng/ml，UM729浓度为1uM。
4.如权利要求1所述的无血清NK分化培养基，其特征在于：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度20ng/ml，IL-7浓度为10ng/ml，IL-15浓度为2ng/ml，SCF浓度为10ng/ml，Flt3L浓度为5ng/ml，UM729浓度为0.5uM。
5.如权利要求1所述的无血清NK分化培养基，其特征在于：stemspan SFEMⅡ细胞培养基50ml，IL-2浓度80ng/ml，IL-7浓度为40ng/ml，IL-15浓度为8ng/ml，SCF浓度为40ng/ml，Flt3L浓度为20ng/ml，UM729浓度为2uM。
6.权利要求1-5任一项所述的无血清NK分化培养基的应用，其特征在于：包括，将经DPBS清洗的造血干细胞，以10万/ml的接种数接种到培养基中，每隔2-4天换液一次，培养至第14天即可。
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