CN113789299B - 一种脐血nk细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法 - Google Patents
一种脐血nk细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113789299B CN113789299B CN202111208066.6A CN202111208066A CN113789299B CN 113789299 B CN113789299 B CN 113789299B CN 202111208066 A CN202111208066 A CN 202111208066A CN 113789299 B CN113789299 B CN 113789299B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- vitro
- cord blood
- culture medium
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 21
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 19
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 16
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 16
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 claims description 16
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 8
- BGFHMYJZJZLMHW-UHFFFAOYSA-N 4-[2-[[2-(1-benzothiophen-3-yl)-9-propan-2-ylpurin-6-yl]amino]ethyl]phenol Chemical compound N1=C(C=2C3=CC=CC=C3SC=2)N=C2N(C(C)C)C=NC2=C1NCCC1=CC=C(O)C=C1 BGFHMYJZJZLMHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 7
- 101710132602 Peroxidase 5 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 abstract description 6
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 abstract description 6
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 abstract description 6
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 abstract description 6
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 abstract description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 abstract description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 abstract description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 abstract description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 3
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 3
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 3
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/71—Oxidoreductases (EC 1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
- C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种脐血NK细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法，涉及细胞体外培养技术领域。本发明所述体外增殖培养基不包含动物血清，使用时减少免疫反应，应用更安全。本发明利用所述体外增殖培养基对脐血NK细胞进行体外增殖，操作简单易行，成本低廉，无需包被和分选，不需要滋养层细胞，不含动物源成分，安全性和稳定性好，可用于Ficoll分离的PBMC的直接培养，并得到更多量满足临床使用标准的NK细胞。利用本发明所述体外培养方法制备的NK细胞，CD3‑CD56+细胞表达率高达90％以上，并且高表达NKG2D、NKp30、NKp46等活化性受体，体外杀瘤活性强。
Description
技术领域
本发明属于细胞体外培养技术领域，具体涉及一种脐血NK细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是人体天然免疫系统的效应细胞，是体内监视恶性病变细胞的主要功能细胞。NK细胞依赖细胞表面固有表达的多种活化性和抑制性受体识别病变细胞，起到一线抗感染以及清除恶性转化、衰老和损伤细胞的作用，是人体抗肿瘤的主力军。NK细胞有多种来源，包括外周血(PB)、脐带血(UCB)、诱导多能干细胞和胚胎干细胞。其中脐带血来源的NK细胞被视为一种潜在的“现成”产品，具有多种优势。
但是NK细胞体外增殖方法相对复杂，生产工艺的简化是大规模应用的首要条件。基于饲养细胞的扩增活化工艺，NK细胞扩增倍数较高(数千至数万倍)，纯度也可达到约90％；但饲养细胞的存在使得临床应用风险增加，同时需更多的产品检定步骤。基于细胞因子、抗体等的无饲养细胞扩增体系， NK细胞扩增倍数可达数千倍，纯度可达约70％，避免了使用饲养细胞的风险；但该生产工艺仍然存在显著的个体差异，包括细胞活化、体内存留时间等。因此，探索NK细胞纯度、数量、产品稳定性、安全性、工艺可操作性俱佳的NK细胞生产工艺仍是人们面临的挑战。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脐血NK细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法，简单、安全稳定且通用性强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脐血NK细胞的体外增殖培养基，所述体外增殖培养基以TheraPEAKTMX-VIVOTM15培养基为基础培养基，还包括重组人白介素-2。
优选的，所述重组人白介素-2的工作浓度为200～2000IU/mL。
本发明还提供了一种脐血NK细胞的体外培养试剂盒，所述试剂盒包括上述体外增殖培养基。
优选的，所述试剂盒还包括脐血NK细胞的活化培养基，所述脐血NK 细胞的活化培养基以CTSTMAIM VTMSFM(RUO)培养基为基础培养基，还包括活化因子；
所述活化因子包括：重组人白介素-2，重组人白介素-15，StemRegenin 1 和重组人过氧化物酶-5(hPRDX5)。
优选的，所述脐血NK细胞的活化培养基中，重组人白介素-2的工作浓度为200～2000IU/mL，重组人白介素-15的工作浓度为10～50ng/ml， StemRegenin 1的工作浓度为1～10μM，重组人过氧化物酶-5(hPRDX5)的工作浓度为1～50μM。
本发明还提供了一种脐血NK细胞的体外增殖方法，包括以下步骤：将从脐血中分离的单个核细胞经活化后，利用上述体外增殖培养基进行体外增殖培养；
所述体外增殖培养包括在37℃，5％CO2饱和湿度环境中进行体外增殖培养。
优选的，所述活化后的单个核细胞在所述体外增殖培养基中的浓度为 (1～5)×106个/mL。
优选的，所述体外增殖培养过程中，每隔2～3天补充一次新鲜的体外增殖培养基，同时调整细胞密度为(1～5)×106个/mL，培养10～15天。
优选的，所述活化的方法包括：将所述单个核细胞接种到上述体外培养试剂盒的脐血NK细胞的活化培养基中进行活化。
优选的，所述活化时单个核细胞的接种密度为(1～5)×106个/mL，在 37℃，5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天。
有益效果：本发明提供了一种脐血NK细胞的体外增殖培养基，不包含动物血清，使用时减少免疫反应，应用更安全。本发明利用所述体外增殖培养基对脐血NK细胞进行体外增殖，操作简单易行，成本低廉，无需包被和分选，不需要滋养层细胞，不含动物源成分，安全性和稳定性好，可用于 Ficoll分离的PBMC的直接培养，并得到更多量满足临床使用标准的NK细胞。利用本发明所述体外培养方法制备的NK细胞，CD3-CD56+细胞表达率高达90％以上，并且高表达NKG2D、NKp30、NKp46等活化性受体，体外杀瘤活性强。
附图说明
图1为培养前和培养14天后流式细胞术检测NK细胞纯度；
图2为NK细胞表达CD16和NKG2D、NKp30和NKp44活化性受体情况。
具体实施方式
本发明提供了一种脐血NK细胞的体外增殖培养基，所述体外增殖培养基以TheraPEAKTMX-VIVOTM15培养基为基础培养基，还包括重组人白介素-2。
本发明所述TheraPEAKTMX-VIVOTM15培养基优选购自美国LONZA。本发明所述重组人白介素-2(购自北京双鹭药业股份有限公司)的工作浓度优选为200～2000IU/mL，更优选为500～1500IU/mL，最优选为1000IU/mL。
本发明还提供了一种脐血NK细胞的体外培养试剂盒，所述试剂盒包括上述体外增殖培养基。
本发明所述试剂盒优选还包括脐血NK细胞的活化培养基，所述脐血 NK细胞的活化培养基优选以CTSTMAIM VTMSFM(RUO)培养基为基础培养基，还包括活化因子；所述活化因子优选包括：重组人白介素-2，重组人白介素-15(购自PeproTech)，StemRegenin 1(购自Selleck)和重组人过氧化物酶-5(hPRDX5，公开于CN110105442A)。
在本发明中，所述CTSTMAIM VTMSFM(RUO)培养基为无血清淋巴细胞培养基，优选购自Thermo Fisher Scientific公司。
本发明所述活化培养基中，所述重组人白介素-2的工作浓度优选为 200～2000IU/mL，更优选为500～1500IU/mL，最优选为1000IU/mL。本发明所述活化培养基中，所述重组人白介素-15的工作浓度优选为10～50ng/ml，更优选为20～30ng/mL，最优选为25ng/mL。本发明所述活化培养基中，所述StemRegenin 1的工作浓度优选为1～10μM，更优选为2μM。本发明所述活化培养基中，所述重组人过氧化物酶-5(hPRDX5)的工作浓度优选为1～50μM，更优选为5～20μM，最优选为10μM。
本发明还提供了一种脐血NK细胞的体外增殖方法，包括以下步骤：将从脐血中分离的单个核细胞经活化后，利用上述体外增殖培养基进行体外增殖培养；
所述体外增殖培养包括在37℃，5％CO2饱和湿度环境中进行体外增殖培养。
本发明对所述单个核细胞的分离方法并没有特殊限定，优选利用Ficoll 进行分离即可。本发明所述活化的方法优选包括：将所述单个核细胞接种到上述体外培养试剂盒的脐血NK细胞的活化培养基中进行活化，所述活化时单个核细胞的接种密度优选为(1～5)×106个/mL，更优选为2×106个/mL，在37℃，5％CO2饱和湿度环境中培养1～5天。
本发明在进行上述活化时，优选将所述单个核细胞接种至CTSTMAIM VTMSFM(RUO)培养基中，而后添加活化因子至工作浓度，进行所述活化，经活化1～5天后，收集细胞液。
本发明将经所述活化后的单个核细胞接种至体外增殖培养基中进行体外增殖培养，所述接种优选包括将所述活化后的单个核细胞接种至 TheraPEAKTMX-VIVOTM15培养基中，优选调整密度为(1～5)×106个/mL，更优选调整至2×106个/mL；然后添加重组人白介素-2至工作浓度。本发明在进行所述体外增殖培养时，优选每隔2～3天补充一次新鲜的体外增殖培养基，同时调整细胞密度为(1～5)×106个/mL，培养10～15天，收获得到脐血NK细胞。
本发明对体外培养得到的NK细胞进行检测，其CD3-CD56+细胞表达率高达90％以上，并且高表达NKG2D、NKp30、NKp46等活化性受体，体外杀瘤活性强。
下面结合实施例对本发明提供的一种脐血NK细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
体外扩增培养人脐血来源的NK细胞
1、分离脐血单个核细胞
①对装有脐带血的血袋经过消毒处理后，吸出脐带血，加入到50mL离心管中进行离心(2000r/min，20min，升速为5，降速为5)。
②离心完成后，将上层的血浆弃去，注意保留血浆与红细胞之间的细胞层。之后用等量的PBS溶液对离心管中的脐带血进行重悬。混合均匀后，取重悬后脐带血一半体积的淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque solution，Ficoll，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)加入到新的50mL离心管内。将重悬后的脐带血缓缓加入到Ficoll表面，保持接触面的稳定。之后对离心管进行离心(2000r/min，20min，升速为2，降速为2)。
③离心完成后，能够清晰看到Ficoll层与血浆层之间的白膜，这一部分即为单个核细胞。通过吸管将中间层的白膜全部吸出，置于新的离心管中，用PBS溶液对细胞稀释至体积为50mL，离心(1500r/min，5min)，共用 PBS反复洗涤3次。
2、NK细胞活化培养
活化培养脐血NK细胞：用无血清淋巴细胞培养基CTSTMAIM VTMSFM (RUO)(购自Thermo Fisher Scientific公司)，调整脐血单个核细胞密度为2 ×106个/mL，再添加1000IU/mL重组人白介素-2，25ng/ml重组人白介素-15， 2μM StemRegenin 1和10μM重组人过氧化物酶-5(hPRDX5)，在37℃，5％CO2饱和湿度环境中培养5天，收集细胞液。
3、NK细胞增殖培养
增殖培养脐血NK细胞：从活化的细胞液中获取细胞，用TheraPEAKTM X-VIVOTM15细胞培养基(购自美国LONZA)，调整细胞密度为2×106个 /mL，再加入1000IU/mL重组人白介素-2，在37℃，5％CO2饱和湿度环境中培养，每隔2天补充含有重组人白介素-2的新鲜培养基并调整细胞密度为 2*106/mL，培养10天，收获得到脐血NK细胞。
实施例2
脐血NK细胞的检测
1、采用实施例1的方法对脐血单个核细胞进行体外扩增培养，用 Countstar的细胞自动计数仪进行细胞计数，结果如表1和表2所示，脐血细胞14天内平均扩增了305.13倍，但是利用本发明所述体外培养试剂盒和体外培养方法，相同时间内脐血NK细胞平均扩增了5767.37倍。
表1脐血细胞的总体数量和扩增倍数(20ml脐血量)
表2脐血NK细胞的绝对数量和扩增倍数(20ml脐血量)
2、流式细胞仪检测NK细胞纯度
结果如表3所示，利用本发明所述体外培养试剂盒和体外培养方法，14 天体外培养后，脐血NK细胞纯度平均可达96.77％。
表3脐血NK细胞纯度
| 样本1 | 样本2 | 样本3 | |
| 0天脐血NK细胞纯度 | 5.18％ | 5.45％ | 4.47％ |
| 14天脐血NK细胞纯度 | 97.93％ | 96.51％ | 95.88％ |
3、NK细胞表型鉴定
计数NK细胞密度，取1×106个细胞1000rpm离心5min，弃上清，用2ml PBS重悬细胞，离心弃上清。用PBS重悬细胞，设置对照管和试验管，分别加入CD56抗体、CD3抗体、CD16抗体、NKG2D、NKp44和NKp30 抗体(抗体均购自Biolegend)。4℃避光孵育20min，分别加入2ml PBS 洗涤细胞，洗去多余的抗体。最后用200μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪上机检测。
NK细胞表型为CD3-CD56+，单个核细胞经诱导培养后，CD3-CD56+细胞由培养前的5.18％增加到培养后的97.93％，如图1所示，图1中A为培养前单个核细胞的流式细胞术检测结果，图1中B为单个核细胞培养14d后的流式细胞术检测结果。该结果表明，单个核细胞已基本诱导成NK细胞。并且几乎所有NK细胞都表达CD16及活化性受体NKp44、NKp30和NKG2D(图2中A、B、C和D)。
4、LDH法测定脐带血NK细胞的杀伤活性
采用LDH释放法检测NK细胞对K562和HGC-27的杀伤活性。首先，通过预实验确定靶细胞的最佳细胞量为1×104/孔，调整细胞浓度后吸取100 μl用培养基稀释过的细胞悬液至96孔板中。过夜预培养后换成新的100μl 培养基，进行后续操作。按照不同效靶比调节NK细胞浓度，在对应的孔中加入100μl含有NK细胞的培养基，在37℃CO2培养箱内培养3.5h，在高对照孔中加入20μl Lysis Buffer后，在低对照孔和背景Blank孔中加入20 μl培养基，在37℃CO2培养箱内培养30min。96孔板离心2min(250×g)，使悬浮细胞沉淀。从每个孔中吸取100μl上清液至新的96孔板中。在每个孔中加入100μl Working Solution后，在避光、室温的条件下培养20min。在每孔中加入50μl Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度。细胞损伤率(％)＝[(A-C)/(B-C)]×100，每孔各做三个复孔，取平均值，其中：
A：样品的吸光度(样品孔-样品Blank孔)；
B：高对照的吸光度(高对照孔-高对照Blank孔)；
C：低对照的吸光度(低对照孔-背景Blank孔)。
结果如表4所示。
表4脐血NK细胞对K562和HGC-27的杀伤能力
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种脐血NK细胞的体外增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：将从脐血中分离的单个核细胞经活化后，利用体外增殖培养基进行体外增殖培养；
所述分离的方法为利用Ficoll进行分离；
所述体外增殖培养包括在37℃，5％CO2饱和湿度环境中进行体外增殖培养；
所述体外增殖培养基由TheraPEAKTMX-VIVOTM15培养基和重组人白介素-2组成；所述重组人白介素-2的工作浓度为1000IU/mL；
所述活化后的单个核细胞在所述体外增殖培养基中的浓度为2×106个/mL；
所述体外增殖培养过程中，每隔2天补充一次新鲜的体外增殖培养基，同时调整细胞密度为2×106个/mL，培养10天；
所述活化的方法包括：将所述单个核细胞接种到脐血NK细胞的活化培养基中进行活化；所述脐血NK细胞的活化培养基由CTSTMAIM VTMSFM(RUO)培养基和活化因子组成；所述活化因子为：重组人白介素-2，重组人白介素-15，StemRegenin 1和重组人过氧化物酶-5；所述脐血NK细胞的活化培养基中，重组人白介素-2的工作浓度为1000IU/mL，重组人白介素-15的工作浓度为25ng/ml，StemRegenin 1的工作浓度为2μM，重组人过氧化物酶-5的工作浓度为10μM；
所述活化时单个核细胞的接种密度为2×106个/mL，在37℃，5％CO2饱和湿度环境中培养5天。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111208066.6A CN113789299B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种脐血nk细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法 |
| US17/671,312 US20230123462A1 (en) | 2021-10-18 | 2022-02-14 | In vitro proliferation medium, in vitro culture kit and in vitro proliferation culture method of umbilical cord blood (ucb)-derived natural killer (nk) cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111208066.6A CN113789299B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种脐血nk细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113789299A CN113789299A (zh) | 2021-12-14 |
| CN113789299B true CN113789299B (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=78878023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111208066.6A Active CN113789299B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种脐血nk细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230123462A1 (zh) |
| CN (1) | CN113789299B (zh) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017046142A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Stichting Katholieke Universiteit | IMPROVED METHOD FOR EX VIVO EXPANSION CD34+HSPCs INTO NK CELLS USING AN ARYL HYDROCARBON RECEPTOR ANTAGONIST |
| WO2017133175A1 (en) * | 2016-02-04 | 2017-08-10 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Engineered mammalian cells for cancer therapy |
| CN107058223A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-08-18 | 湖南惠益森细胞基因工程有限公司 | 一种用于免疫细胞培养的培养液 |
| CN107384859A (zh) * | 2017-09-05 | 2017-11-24 | 四川新生命干细胞科技股份有限公司 | 一种高纯度nk细胞的分离培养方法 |
| WO2020124256A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Stemcell Technologies Canada Inc. | Media and methods for differentiating natural killer cells |
| US20210260115A1 (en) * | 2020-02-21 | 2021-08-26 | FullHope Biomedical Co., Ltd. | Modified natural killer cells, pharmaceutical composition, manufacturing method thereof, and method of using the same |
| CN113293132A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-24 | 江苏豪科生物工程有限公司 | 一种nk细胞体外扩增体系及培养方法 |
-
2021
- 2021-10-18 CN CN202111208066.6A patent/CN113789299B/zh active Active
-
2022
- 2022-02-14 US US17/671,312 patent/US20230123462A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230123462A1 (en) | 2023-04-20 |
| CN113789299A (zh) | 2021-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112626018A (zh) | 一种高纯度的同种异体nk细胞培养基以及体外扩增方法 | |
| CN112608896A (zh) | 一种nk细胞的培养方法及其应用 | |
| CN111944754A (zh) | 一种自然杀伤细胞的培养方法 | |
| CN109456940A (zh) | 得到nk细胞或树突细胞的方法 | |
| JPH08511935A (ja) | 選択的細胞増殖 | |
| El-Sahrigy et al. | Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial | |
| CN113789299B (zh) | 一种脐血nk细胞的体外增殖培养基、体外培养试剂盒和体外培养方法 | |
| CN104109653A (zh) | 利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血dnt细胞的方法 | |
| CN111172110B (zh) | 一种脐带血cik细胞的培养方法 | |
| CN113564117A (zh) | 一种冻存脐带血来源调节性t细胞体外扩增优化方法 | |
| CN110938595B (zh) | 一种高效体外培养脐血cik细胞的培养基及培养方法 | |
| CN113549595A (zh) | 基于外周血的nk细胞体外培养方法 | |
| CN114507640B (zh) | 一种高增殖能力和高细胞毒性cik细胞的培养方法及其应用 | |
| CN111548994A (zh) | 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法 | |
| CN113481157B (zh) | 特异性抗病毒过继免疫细胞的优化制备方法 | |
| CN108148805B (zh) | 一种人Tscm细胞及其制备方法和应用 | |
| CN115197909B (zh) | 一种nk细胞的体外培养方法 | |
| CN111154721B (zh) | Nk细胞扩增方法 | |
| CN112300992B (zh) | 一种nk细胞培养液及多级激活nk细胞的培养方法 | |
| CN109576220B (zh) | 一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激nk细胞扩增的方法 | |
| CN110964695A (zh) | 一种细胞株及其增殖检测rhIL-12体外活性的方法 | |
| CN111088227A (zh) | 一种细胞分离培养液和t细胞分离培养的方法 | |
| CN105219710B (zh) | 一种高杀伤活性的免疫细胞群的培养方法 | |
| CN113881633B (zh) | 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法 | |
| CN114990061B (zh) | 一种诱导扩增中央记忆性t细胞的培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220507 Address after: 100050 Tiantan Xili 1, Dongcheng District, Beijing Applicant after: INSTITUTE OF MEDICINAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES Address before: 102488 no.86-a3764, Wanxing Road, Changyang, Fangshan District, Beijing Applicant before: Zhuoerkang (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20221010 Address after: 570100 - 1073, 1st Floor, D2 District, Fuxing City, 32 Binhai Street, Longhua District, Haikou, Hainan Applicant after: Xinlu Cell Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd. Address before: 100050 Tiantan Xili 1, Dongcheng District, Beijing Applicant before: INSTITUTE OF MEDICINAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |